Name: 성인 마우스 Utricle 및 아데노 바이러스 - 매개 지원하는 세포 감염의 해부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 학습하세요 성인 마우스 utricle 해부 및 아데노바이러스를 이용한 지지세포 감염 방법을 통해 내이 균형 기관 연구를 수행하는 기법입니다. 이 방법은 모발세포 재생 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 난청과 기타 통신 장애의 국립 연구소의 교내 연구 부문에 의해 지원되었다. 추가 지원이 NIDCD 5R01 DC007613에 의해 제공되었다.

1. Utricle의 해부와 문화 <ol><li> 승인된 프로토콜과 목을 벨을 사용하는 성인 (4 세 주 이상) 마우스를 안락사. </li><li> 머리 양쪽에 외부 유스 타키 오관을 자르지하고 코를 향해 전진 피부를 당기십시오. 뒤에서 앞으로 머리를 이등분하고 골질 미로를 표시하는 방법으로 양측의 두뇌를 제거합니다. </li><li> 멀리 뼈다귀 달팽이관에서 두개골을 손질하고 해부 현미경을 갖춘 조직 문화 후드에 골질 미로를 (bulla 포함) 전송 (참고 : 아데노 바이러스 작업 클래스 II 생물 학적 안전 캐비닛에서 수행되어야한다). </li><li> 후드에서 멸균 해부 미디어를 포함하는 35mm 조직 배양 접시 (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (그림 1A) 각 달팽이관을 전송. </li><li> 청각 bulla가 여전히 그대로있다면 (그것은 bulla과 정점 사이에 작은 이미지를 삽입하여 총 해부 동안 bulla를 제거하는 것이 가능달팽이관)는 bulla를 (그림 1B) 부수 (하나 # 3와 하나 # 5) 2 포셉을 사용합니다. </li><li> 꼭대기,베이스, ossicles, 타원형 및 원형 창문 VIIIth의 신경 뿌리, 반원의 운하 (그림 1 C, D) : 골질 달팽이관 준비의 랜드마크를 식별합니다. </li><li> 타원형 및 원형 창문 꼭대기는 접시와 VIIIth 신경 뿌리의 하단에있는 그러한가 직면하고, 위로 향하게 중간 측면과 함께 접시에 내이 (内耳)를 놓습니다. 반원의 운하 (그림 1D)의 지역에서 # 3 집게를 사용하여 준비를 잡아. </li><li> # 11 칼날이 장착된 메스를 사용하여 신경 루트 (그림 1D)에 바로 혀끝의 달팽이관의 꼭대기를 잘라. </li><li> 절단 부분이 위로 향하게되어 있도록 준비를 켭니다. 준비 (그림 1E)를 안정화하기 위해 핸들로서 앞부분은 반원의 운하를 사용하십시오. </li><li> # 5 포셉 사용하여 아래 modiolus에서 달팽이관을 제거기지. 달팽이관의 후크 영역이 아래로 밝혀졌 시점에서, saccule을 드러낸 뼈의 나선 얇은 판 (그림 1 층)의 마지막 골질 선반을 드는데 (깨진 # 55 포셉의 절반) 미세 탐침을 사용합니다. 그냥 saccule 아래에 중요 상징입니다 등골의 footplate입니다. utricle는 등골에 footplate (그림 1G)에 바로 인접해 있으며, 그것은 뼈로 둘러싸여 있습니다. 멀리 utricle의 1 / 3에 대해 밝히지만큼 뼈 칩에 탐침을 사용하십시오. 조심스럽게 # 55 포셉 (그림 1H)를 사용 utricle를 제거합니다. utricle가 골질 준비에서 가져온되기 때문에이 절차는 일반적으로 색소 지붕 상피의 제거집니다. utricle가 그대로 지붕 상피로 제거하는 경우 다만, 지붕은 # 55 포셉를 사용하여 제거할 수 있습니다. </li><li> 아데노 바이러스 감염 Utricles (또는 라이브 이미징 실험)를 해부 (사전 감염까지) 동안 제거 otoconia 있어야합니다.이 경우에는 해부 미디어 가득한과 편협한 바늘 (보통 26-28 게이지)가 장착되어 있습니다 luer 잠금 주사기를 사용합니다. # 55 포셉 (그림 1I)을 사용하여 가장자리 utricle 잡아. 아래로 가리키는 바늘의 베벨과 utricle 가까운 바늘 팁을 가져와. 미디어 otoconia를 (그림 1J) 날린 해부의 스트림을 사용합니다. 또는 otoconia는 속눈썹 도구 (테드 펠라 주식 # 113)을 사용하여 그들을 솔질하여 제거할 수 있습니다. adenoviral 감염을 받아야 할 수 없습니다 Utricles 그대로 otoconia (쉽게 사후 수정 otoconia 제거를 위해 아래 참조)과 함께 24 잘 조직 배양 플레이트에 정상적으로 자유 부동 교양입니다. </li><li> 모든 utricles가를 해부하고 나면 멸균 문화 미디어로 해부 미디어를 변경 DMEM F12은 (Gibco # 11320) 5% FBS 및 50 U / ML 페니실린 G (시그마)로 보충. </li><li> Utricles는 37 ° C 5 % CO 2에서 배양해 있습니다. 문화 mainta 될 경우이상 48 시간 ined, 문화 미디어의 절반은 매일 변경해야합니다. 문화가 일주일 이상 지속됩니다. </li></ol> 2. 지원 셀의 아데노 바이러스 감염 중요 : 아데노 바이러스로 작업하는 것은 Biosafety 레벨 2 (BSL2) 절차 및 인증이 필요합니다. 지도와 BSL2 절차에 대한 교육에 대한 기관 Biosafety 담당관에게 문의하십시오. <ol><li> (아무 혈청) 위의 해부 미디어의 utricles 해부. 위와 같이 otoconia를 제거합니다. </li><li> 감염 준비가되면 각각의 잘으로 한 utricle (세포까지)를 전송 Nunc 15 μL 혈청이없는 DMEM F12을 (혈청 바이러스를 inactivate 수 있기 때문에 이것은 중요하다)이 포함된 미니 트레이 (피셔 # 12-565-68) . 이 전송은 1.5 mm microcurette (# 10082-1​​5 파인 과학 도구에서)와 쉽습니다. </li><li> 우리 AD-GFP 삭제 바이러스 E1 및 E3 유전자와 transg 운전 인간 CMV 프로 모터와 혈청형 5에너지 (GFP). 이 바이러스 벡터 BioLabs (필라델피아, PA로부터 얻은 것입니다 <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a> ). 주식 바이러스는 1.0-4.0 × 10 10 PFU / ML의 titers에서 제공합니다. 잘 utricle (그림 1L)를 포함하는 각 주식 바이러스 0.5-2 μl를 추가합니다. 사용되는 실제 금액은 바이러스와 주식 titer에 따라 다릅니다. 우리는 보통 1.0-4.0 × 10 7 PFU 각 utricle를 감염. </li><li> 문화 utricles 바이러스가 들어있는 37에서 미디어를 ° C / 5 % 2 시간 동안 CO 2. 2 시간 후에, 혈청과 문화 미디어를 포함하는 24 잘 조직 배양 플레이트로 다시 utricles을 전송. 37 ° C / 5% CO 2에서 하룻밤 문화 utricles. </li><li> Utricles는 라이브 이미징 실험 다음날 사용될 수도 있고, 그들은 (아래) 헤어 세포 immunochemistry에 대해 해결할 수 있습니다. transgene 발현 24 시간 이후 감염에 낮으면 시간이 지남에 따라 바이러스성 transgene 발현 증가는, 그래서 수 있습니다혈청 함유 미디어 추가 24시간 문화 세포의 유익. 네가 머리 세포 독성을 보게되면, 사용된 바이러스의 양을 줄일 수 있습니다. </li></ol> 3. Utricle 고정, Otoconia 제거 및 Immunochemistry <ol><li> 문화 시대 말기에, 적당한 온도에서 3시간 하나를 4 % paraformaldehyde에 utricles를 수정 (락 플랫폼에서) 또는 4에서 하룻밤 ° C. 0.1 M (1X) 소렌슨의 인산 버퍼 산도 7.4의 워시 제품 utricles (3 회, 15 분 각각). 이러한 단계는 24 잘 조직 배양 플레이트에 수행됩니다. </li><li> Otoconia 제거 : 참고 : Otoconia은 (단계 위의 1.11 참조) 아데노 바이러스 감염하기 전에 제거해야합니다. 그러나, 감염 수 없습니다 utricles는 여전히 그대로 otoconia 함께 배양해하고 해결할 수 있습니다. 이 경우 고정 후 otoconia를 제거하려면 여기에 설명된 단계를 사용하십시오. 모든 남아있는 색소 지붕의 상피에 대한 utricles을 검사합니다. 조심스럽게 두 명이 # 55 f를 사용하여 남아있는 지붕의 상피를 제거orceps. otoconia를 제거하려면 750-1000 μl 칼 - 예 decalcifier (피셔 # CS510-1D)와 소렌슨의 인산 버퍼를 교체하십시오. 일분 40 초 (2 분 초과하지 않는)에 utricles에 칼 - 예 둡니다. 0.1 M 소렌슨의 인산염 완충액 및 세척 (5 회, 5 분마다)와 칼 - 예를 교체하십시오. </li><li> 10 분 동안 나트륨 borohydride에 utricles을 (시그마 # 452882, 탈이온수 1 %) 품다. 0.1 M 소렌슨의 인산염 완충액 (5 회, 5 분마다)에 utricles 씻으십시오. </li><li> 솔루션을 차단 관련 플레이스 utricles (PBS + 2% 소 혈청 알부민 + 0.8 % 정상 염소 혈청 + 0.4 % 트리톤 X-100) 락 플랫폼에서 실온에서 3 시간 동안. </li><li> 일차 항체를 추가하고 4에서 하룻밤 품어 ° C. 솔루션 라벨 모두에게 세포를 차단에서 1:100에서 안티 - 마이 오신 7A (프로 테우스 중 Biosciences 발달 연구 하이 브리 도마 은행의 # 25-6790 또는 # MYO7A 138-1). 별도 striolar 및 비 striolar 세포 레이블을 지정하기 위해 이중 라벨 protoco을 사용한그리고 polyclonal 안티 calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, 미국, 1:200), 단클론 항 calmodulin (1:150 시그마 C # 3545)와구나. 이차 항체는 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국에서 보통 알렉사 형석 복합 이차 항체) 솔루션을 차단에서 1:500 희석하고 요동 플랫폼에서 상온에서 어둠 속에서 4 시간 동안 incubated됩니다. </li><li> Fluoromount-G을 (남부 생명 공학, 버밍엄, AL, 미국)를 사용하여 유리 슬라이드에 마운트 utricles. </li></ol> 4. 대표 결과 이 방법은 전체 유지 사용 배양해 Utricles하면 세포와지지 세포 (그림 2) 모두에 대해 보완합니다. 건강한 문화 헤어드라 전지 7A - 긍정 마이 오신되는 얇은 세포질 지역으로 둘러싸인 둥근 핵 프로파일을 표시합니다 (그림 2, 상단 패널). 지원 전지 (안티 Sox2으로 표시) 작은 더 밀도가 높은 세포 (그림 2, 하단 패널)보다 포장. ADEnovirus는 utricle에서 지원하는 세포의 25-50%를 감염하고, 어떤 세포는 (그림 2, AD-GFP 패널)에 감염되지 않습니다. 그것은 바이러스 titer가 너무 높은 경우 머리카락 세포 사망이 가능하므로 각 아데노 바이러스의 최적의 작업 titer가, 경험적으로 결정되어야함을 지적한다. 또한, 기계적 손상 (절개 중에 발생한)의 지역은 바이러스의 대량 소요됩니다. 기계적 손상이 지역은 GFP 발현 및 누락 세포 중 매우 높은 수준으로 세포의 지속적인 라인을 통해 쉽게 구별할 수 있습니다. 이것은 손상되지 않은 문화의 세포 (그림 2) 지원에 흩어진 GFP 발현와는 대조적이다. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="그림 1"/> 1 그림. 절개를 Utricle. :. 청각 bulla (AB) B :. bulla 두 튼튼한 집게를 사용하여 깨지는 경우 C : 나폴레옹 달팽이관 (RW = 둥근 창, S =. stapedial 동맥, C = 달팽이관, ST = 등골) D :.. 메스 블레이드 (SB)를 VIIIth 뇌신경 (8 일 N) ASC = 앞부분은 반원의 운하를 이메일로 혀끝의 달팽이관의 꼭대기을 차단하는 데 사용됩니다 : 준비는 가장 바깥쪽 뼈 (화살표)의 앞부분은 반원의 운하 (ASC)와 다른에 삽입 하나 포크로 # 3 집게를 사용하여 단단히 개최됩니다. 막의 미로는 집게를 사용하여 제거됩니다 F는 :. 막의 미로는 제거를 통해 뼈의 나선 얇은 판의 기저 차례 후크 지역 근처에서 볼 수 있습니다. 미세 프로브 선반을 세운 자세하고 (화살표)를 제거하려면이 골질 선반 아래에 삽입되는 G는 :. saccule을 제거 후, utricle (U)은 등골에 footplate (SF)에 바로 인접 볼 H :. Utricle는 (U ) # 55 포셉 (화살표)를 사용하여 제거됩니다 SF = 등골의 footplate는 I :.. otoconia과 Utricle (O) 부분 삭제D 감각 상피 (SE) 표시 아래는 J :. Otoconia (O)는 26 게이지 바늘로 장착되어 주사기에 의해 전달되는 미디어 스트림을 사용하여 utricle에서 제거됩니다. 바늘 (S)의 그림자 이미지의 하단에 표시됩니다 K :.. Adenoviral 감염 : Utricle은 otoconia 제거하고 감각 상피 (SE) 볼 L 각 utricle (U)가 미니를 잘 개인에 배치됩니다 - 트레이. 지원 세포가 잘 (P는 = Pipet 팁)에 바이러스를 pipetting하여 아데노 바이러스에 감염됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 세포를 지원하는 아데노 바이러스 - 매개 감염. Utricles는 녹색 형광 단백질의 아데노 운전 표현 (AD-GFP)에 감염되었다. 헤어 셀 층 한 utricle 같은 지역에서 지원하는 세포 계층의 공촛점 이미지가 표시됩니다. 모발 세포는 마이 오신의 7A에 대해 항체로 분류하고 있습니다(마젠타). 지원 전지 Sox2 (적색)에 대한 항체로 분류하고 있습니다. 개략도 utricle 감각 상피와 세포의 위치 (HC) 및 지원 세포 (SC)의 구조를 보여줍니다. (U) 위턱과 아래턱에 표시된 공촛점 (광) 섹션의 위치는 (L) 패널은 배선의 점선 라인으로 표시됩니다. 어퍼 패널 : 머리카락 세포 핵의 수준에서 찍은 공촛점 이미지에서, AD-GFP 신호가 세포 사이의 공간에 나타나고 머리카락 세포 마커 마이 오신의 7A와 중복되지 않습니다. 로어 패널 : 지원하는 세포 핵의 수준에서 공촛점 섹션에서 광고-GFP 신호가 지원하는 세포 마커 삭스-2와 colocalizes. 셀만을 지원 GFP 발현 및 머리카락 세포의 AD-GFP 감염 결과는 감염됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. Adenoviral 감염 세포 또는 지원하는 세포의 죽음을 초래하지 않습니다. UT는ricles은 4 × 10 8 PFU / ML에서 AD-GFP에 감염되었다. Utricles는 마이 오신의 7A (헤어 세포 마커)와 Sox2 (세포 마커를 지원하는)에 대한 항체로 분류되었다. 헤어 셀 및 지원 셀 카운트는 제어 utricles 및 광고-GFP 감염 utricles위한 있었 읍니다.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

감각 세포는 노화, 소음 외상, 그리고 aminoglycoside의 항생제와 antineoplastic 에이전트 cisplatin을 포함 ototoxic 약물에 대한 노출을 포함하여 스트레스의 다양한 의한 죽음에 감염될 수 있습니다. 영구적인 청력 손실 및 / 또는 균형 장애의 포유 동물 털 세포 사망 결과입니다. 체외 모델 시스템에서 세포와 분자 메커니즘 밑에있는 머리 세포 죽음뿐만 아니라, 머리카락 세포 사망을 방지하거나 반대를 대상으로 이러한 결정을 목표로 연구를위한 중요한 도구입니다 . 성인 포유류에서 달팽이 세포와는 달리, utricle의 세포는 문화에 잘 남아있다. Utricle 머리 전지는 노출에서 달팽이 세포에 독성이있는 동일한 치료 약물 및 ototoxic 헤어 세포 죽음과 생존 utricular와 달팽이 모두 세포 12-18위한 유사 근간 세포의 메커니즘에 대한 죽음에 민감합니다. 또한, 언제 utricle 모델 시스템에서 얻어진 데이터를 처리할 수 있습니다생체내에서...

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Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; 시약</strong</td&gt;<td<strong&gt; 회사 소개</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 번호</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 중형 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12,350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11,320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 파인 포셉 (# 55)</td&gt;<td&gt; 파인 과학 도구</td&gt;<td&gt; 11255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 파인 포셉 (# 5)</td&gt;<td&gt; 파인 과학 도구</td&gt;<td&gt; 11252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 포셉 (# 3)</td&gt;<td&gt; 파인 과학 도구</td&gt;<td&gt; 11231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 페니실린 G</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 태아 소 혈청</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-1​​39</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc 미니 트레이</td&gt;<td&gt; 피셔</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 아데노 바이러스-GFP</td&gt;<td&gt; 벡터 Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 칼 - 전 decalcifier</td&gt;<td&gt; 피셔</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 나트륨 borohydride</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; 452,882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 안티 - 마이 오신 7A (polyclonal)</td&gt;<td&gt; 프로 테우스 Biosciences</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 안티 - 마이 오신 7A (단클론)</td&gt;<td&gt; 발달 연구 하이 브리 도마 은행</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 안티 Calmodulin</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 안티 Calbindin</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; 남부 바이오 어소 시에이츠</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; 표 1</strong&gt;. utricle 문화와 아데노 바이러스 감염에 사용되는 시약 및 도구.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; *주의 : AD-GFP는 일반적으로 1x10의 주식 titer에서 벡터 Biolabs에 의해 제공됩니다<sup&gt; 10</sup&gt; PFU / ML. 우리는 1.2 × 10의 titer에서 재고 바이러스를 제공하기 위해 사용자 정의 증폭을 요청<sup&gt; 11</sup&gt; PFU / ML.</p&gt;

성인 마우스 utricle 및 아데노 바이러스 - 매개 지원하는 세포 감염의 해부

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

청력 손실 및 밸런스 교란은 주로 내이 (内耳)의 수용체 세포가 mechanosensory 세포의 죽음으로 인해 발생합니다. 만족스럽게 포유 동물 세포를 대표하는 어떤 세포 라인이 없기 때문에, 세포에 대한 연구는 주요 장기 배양에 의존합니다. 성인 쥐 (그림 1) 1-6에서 utricles의 장기 문화를 활용하여 성숙한 포유 동물 세포의 체외 모델 시스템에서 최고의 특성화. utricle은 vestibular 기관이며, utricle의 세포는 청각 기관, Corti의 기관에있는 세포의 구조와 기능 모두에서 비슷합니다. 성인 마우스 utricle 준비는 생존, 항상성, 이들 세포의 죽음을 조절 분자 신호의 연구에 대한 성숙한 감각 상피를 나타냅니다. 포유 동물 달팽이 세포는 불치병에 차별하고 그들이 길 잃었을 때 다시 생성되지 않습니다. 비 이맘에서malian 척추 동물, 청각 혹은 vestibular 머리카락 세포 사망은 청력과 균형 기능을 7, 8을 복원 강력한 재생이옵니다. 모발 세포 재생은 감각 상피 9, 10 세포의 basolateral 표면에 문의 glia 같은 지원 세포에 의해 매개된다. 지원 세포는 머리카락 세포의 생존과 사망 11 중요한 중재자입니다. 우리는 최근 아데노 바이러스를 사용하여 교양 utricles에 세포를 지원하는 감염 기법을 개발했습니다. CMV 프로 모터의 제어하에 GFP를 포함하는 transgene을 전달하기 위해 아데노 바이러스 타입 5 (dE1/E3)를 사용, 우리는 구체적으로 그 아데노 바이러스를 찾아 효율적으로 지원하는 세포를 감염. 세포 감염 효율을 지원하는 것은 약 25-50%이며, 세포는 (그림 2) 감염되지 않습니다. 중요한 것은 우리가 세포를 지원하는 adenoviral 감염 세포 또는 지원하는 세포에 독성을 초래하지 않는 것을 발견, 같은 광고-GFP INF에있는 셀 카운트ected utricles가 아닌 감염된 utricles (그림 3)에있는 것과 같습니다. 따라서 교양 utricles 셀을 지원 아데노 바이러스 - 매개 유전자 표현이 머리 세포 생존, 죽음, 그리고 중생의 중재자로서 세포를 지원하는 역할을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.

Mechanosensory 세포는 내이 (内耳)의 수용체 세포입니다. 최고의 특성화<em&gt; 체외에서</em성숙한 포유 동물 세포 중&gt; 모델 시스템은 어른 생쥐에서 utricles의 장기 문화를 활용합니다. 우리는 성인 마우스 utricle의 절개를 제시하고, 우리는 교양 utricles에 세포를 지원하는 아데노 바이러스 - 매개 감염을 보여줍니다.

성인 마우스 Utricle 및 아데노 바이러스 - 매개 지원하는 세포 감염의 해부

청력 손실과 균형 장애는 흔히 내이의 수용기 세포인 기계적 감각 유모 세포의 사멸로 인해 발생합니다. 이러한 ...

본 프레젠테이션은 성체 마우스의 구형낭 전체 기관 배양 절차를 시연합니다. 또한, 배양된 구형낭의 지지 세포를 감염시키기 위한 아데노바이러스의 사용법도 함께 시연할 예정입니다. 이는 먼저 내이에서 구형낭을 조심스럽게 박리함으로써 수행됩니다.두 번째 단계는 지붕 상피를 제거하는 것입니다. 다음으로, 감각 상피를 온전히 남겨둔 채 이석을 제거합니다. 마지막 단계는 아데노바이러스를 사용하여 구형낭의 지지 세포를 감염시키는 것입니다.이러한 기술들은 성숙한 포유류의 유모 세포와 지지 세포를 조사하기 위해 설계된 매우 다양한 실험에 사용될 수 있습니다. 인비트로(In vitro). 내이의 감각 수용기 세포는 유모 세포라고 불리며, 이 세포들은 소리 에너지나 머리의 움직임을 뇌로 전달되는 신경 입력으로 변환하는 역할을 담당합니다.청력 손실은 흔히 이러한 감각모세포의 사멸로 인해 발생합니다. 감각모세포 사멸의 근저에 있는 메커니즘을 연구하기 위해서는 인비트로(in vitro) 모델 시스템을 갖추는 것이 매우 유용합니다. 본 영상에서 시연할 방법은 성체 마우스의 구형낭 전체 기관 배양법을 이용합니다.난형낭은 내이의 전정기관이며, 난형낭의 유모세포는 코르티기관(organ of Corti)이라 불리는 청각기관의 유모세포와 유사합니다. 난형낭 표본은 성숙한 포유류의 유모세포와 지지세포 연구를 위해 가장 잘 규명된 모델 시스템입니다. 또한, 본 영상에서는 저희 연구실에서 최근 개발한 아데노바이러스를 이용해 난형낭의 지지세포를 감염시키는 방법을 시연하겠습니다.아데노바이러스 기법을 통해 모세포의 생존, 사멸 및 재생의 매개체로서 지지 세포의 역할을 조사할 수 있습니다. 본 연구실에서는 이러한 기법을 사용하여 두 가지 주요 질문을 해결하고자 합니다. 첫째, 스트레스를 받는 모세포의 최종적인 생존 또는 사멸을 결정하는 세포 및 분자 신호는 무엇인가?둘째로, 청력 손실을 예방하거나 되돌리기 위한 임상 치료법을 개발하는 데 이 정보를 어떻게 활용할 수 있을까요? 제 실험실의 생물학자인 Lindsey Maye가 이러한 기술들을 시연하겠습니다. 조직이 작고 약하며, 특히 이석과 지붕 상피를 제거하는 단계에서 기계적 손상을 입기 매우 쉽기 때문에 난형낭 절제술의 시각적 시연이 중요합니다.기관에서 승인된 동물 실험 및 사용 프로토콜에 따라 성체 마우스를 안락사시키고 참수시킨 후, 두개골을 후두부에서 주둥이 방향으로 이분하고 양측 반구에서 뇌를 제거하여 골미로를 노출시킵니다. 다음으로, 골와우에서 두개골 부분을 잘라내고 골미로를 멸균 배지(1 99)가 담긴 35 millimeter 조직 배양 접시로 옮깁니다. 만약 고실포가 여전히 온전한 상태라면, 튼튼한 핀셋 두 개를 사용하여 고실포를 파쇄합니다.서술된 프로토콜에 재현된 이미지에서 볼 수 있듯이, apex base, acles, oval 및 round window, 제8 뇌신경근 및 반고리관을 포함한 골격 표본의 랜드마크를 확인하십시오. 이등골이 접시 바닥에 위치하고 제8 뇌신경근이 위를 향하도록 접시 내에서 표본의 방향을 잡으십시오. 포셉을 사용하여 반고리관 부위의 표본을 잡고, 11번 칼날이 장착된 메스로 신경근 바로 위쪽의 cochlea apex 부분을 절단하십시오. 전반고리관을 손잡이처럼 사용하여 표본을 고정하고, 절단된 부분이 위를 향하도록 표본을 회전시키십시오.이제 5번 핀셋을 사용하여 모디우스(modius)부터 기저부까지 와우(cochlea)를 제거합니다. 그런 다음 55번 핀셋 한 쌍의 절반으로 만든 미세 프로브를 사용하여 골성 나선판(osseous spiral lamina)의 마지막 골성 선반을 들어 올립니다. 그렇게 하면 그 아래에 있는 전정창(stapes footplate)이 드러납니다.이 이미지는 sf로 표시된 등골 족판(stapes footplate)을 보여주며, 이는 등골 족판과 바로 인접해 있는 U로 표시된 난형낭(utricle)의 위치를 확인하는 데 중요한 지표가 됩니다. 미세 프로브(fine probe)를 사용하여 난형낭의 약 3분의 1이 드러날 때까지 뼈를 충분히 깎아냅니다. 그 다음 55번 포셉(forceps)을 사용하여 난형낭의 가장자리 아주 가까운 곳이나 신경근 부위를 잡아 조심스럽게 제거합니다.색소성 지붕 상피가 여전히 난형낭에 붙어 있다면 미세 핀셋을 사용하여 이를 제거하십시오. 난형낭을 아데노바이러스 감염에 사용하려면 이를 위해 이석을 제거해야 합니다. 주사기에 해부 배지를 채우고 26 또는 28 gauge 바늘을 장착하십시오.55번 포셉으로 난형낭(utricle)의 가장자리를 잡고, 배지 흐름을 이용하여 이석(otoconia)을 고정합니다. 또는 속눈썹 도구를 사용하여 이석을 제거할 수도 있습니다. 모든 난형낭의 박리가 완료되면, 박리용 배지를 멸균 배양 배지로 교체하고 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에 넣습니다.모든 아데노바이러스 절차는 생물안전등급 2(biosafety level two) 예방 수칙에 따라 수행됩니다. 감염 준비가 되면, 마이크로 큐렛을 사용하여 구형낭 유모세포를 15 µL의 무혈청 D-M-E-M-F 12가 담긴 미니 트레이의 웰 하나로 옮깁니다. 구형낭 배양물이 담긴 웰에 1~4 × 10⁷ plaque forming units의 아데노바이러스를 첨가합니다.U-trickles와 바이러스 함유 배지를 습윤 챔버 내 37°C, 5% carbon dioxide 조건에서 2시간 동안 반응시킵니다. 2시간 후, U-trickles를 혈청이 포함된 배지가 들어있는 24-well 조직 배양 플레이트로 옮깁니다. 옮겨진 U-trickles는 다시 37°C, 5% carbon dioxide 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.U trickles는 다음 날 살아있는 상태의 이미징 실험에 사용하거나, 면역화학 분석을 위해 고정할 수 있습니다. U trickles는 상온에서 3시간 동안 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 록킹 플랫폼 위에서 4%Para aldehyde로 고정합니다. 그다음, 0.1 molar sorensens phosphate buffer로 utricle을 15분씩 3회 세척합니다.아데노바이러스 감염을 위해 이석(otoconia)을 제거하지 않았다면, 이 단계에서 난형낭(utricle)을 calx decalcify에 1~2분 동안 담가 이석을 제거한 후 0.1 M sorens 및 인산염 완충액으로 세척하십시오. 그 다음 난형낭을 블로킹 용액에 담가 실온에서 3시간 동안 반응시킵니다. 블로킹 단계가 끝나면 1차 항체를 블로킹 용액으로 희석하십시오. 이를 난형낭이 들어 있는 플레이트에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 이석낭(utricle)을 인산 완충액으로 세척합니다. 그 다음 차단 용액에 희석한 2차 항체를 첨가하고, 빛이 차단된 실온의 로킹 플랫폼(rocking platform)에서 4시간 동안 배양합니다. 마지막으로, Flora Mount G를 사용하여 이석낭을 유리 슬라이드에 고정합니다. 이 공초점 이미지들은 녹색 형광 단백질의 발현을 유도하는 아데노바이러스에 감염된 하나의 이석낭 내 동일 영역에서 모세포 층과 지지세포 층을 보여줍니다.모요신 7A(myosin seven A)에 대한 항체로 모세포를 염색하면 자홍색으로 나타납니다. 지지 세포는 소스 2(socks, two)에 대한 항체로 염색하여 여기에서 빨간색으로 나타납니다. 아데노바이러스 GFP가 모세포가 아닌 지지 세포에 국소화되는 것을 확인할 수 있습니다.이 그래프는 4 × 10⁸ PFU/mL 농도의 adenovirus GFP를 이용한 아데노바이러스 감염이 유모세포나 지지세포의 사멸을 초래하지 않음을 보여줍니다. 해부 과정이 숙련되면, 동물 한 마리에서 얻은 양쪽 와우를 10~15분 이내에 배양할 수 있습니다.하지만, 본 절차를 수행할 때는 충분한 시간을 갖고 절차 이후 조직을 다룰 때 주의하는 것이 중요합니다. 지지 세포와 유모 세포의 사멸, 생존 및 재생에 관한 문제를 해결하기 위해 생체 공초점 이미징, 면역 조직 화학, R-T-P-C-R 및 Western blotting과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 난형낭을 해부하고 아데노바이러스를 사용하여 지지 세포를 감염시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.바이러스를 다루는 작업은 위험할 수 있으며 생물안전 수준 2(biosafety level two) 주의 사항을 항상 준수하며 이러한 절차를 수행해야 함을 유의하십시오.

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이 보고서에서 organotypic 문화와 지 루트 마우스 파생 중추의 해리 주 문화의 장점 다양 한 메커니즘 neuroplasticity, 상호 작용 신경 폐해와 관련 된 조사를 강조 표시 됩니다. neuroinflammation, 그리고 바이러스 성 감염에 응답입니다.

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여기는 청각 및 vestibular 함수에 최소 손상 반원의 운하를 통해 성인 및 신생아 쥐의 내 귀에 로컬 약물 전달 수 있는 canalostomy 절차에 설명 합니다. 이 메서드는 마우스 내가 바이러스 성 벡터, 제약, 그리고 작은 분자를 접종을 사용할 수 있습니다.

성인 및 신생아 쥐의 내 귀에 로컬 약물 전달에 대 한 외과 접근으로 Canalostomy

Murine utricle에 달팽이 관의 3 차원 organotypic 문화 광학, 콜라겐 보존 타고 난 조직 형태를 젤 취소 조정 매트릭스 강성의 기계적 자극에 대 한 허용 및 바이러스 중재 유전자 납품을 허용.

Vestibular 및 청각 감각 기관의 3 차원 Organotypic 문화

이 프로토콜은 관심있는 유전자에 결실을 품고 있는 마우스 비뇨생식기 오가노이드의 생성 및 특성화의 과정을 기술한다. 상기 방법은 마우스 비뇨생식기 세포 수확, CMV 프로모터로 Cre 발현을 유도하는 아데노바이러스를 이용한 생체외 형질도입, 및 시험관내 및 생체외 특성화를 포함한다.

Ex Vivo 마우스 자궁 세포에서 아데노바이러스-Cre 매개 유전자 결실의 오가노이드 모델

다량의 재조합 아데노바이러스의 생성에 대한 방법이 기재되어 있으며, 이는 이식유전자의 발현 또는 내인성 유전자 산물의 하향조절을 허용하는 천연 설치류 요로상피를 형질도입하는 데 사용될 수 있습니다.

아데노바이러스 매개 형질도입을 이용한 천연 방광 요로상피에서의 형질전환 유전자의 발현

선조체 혈관은 달팽이관 내 전위 생성에 필수적입니다. 여기에서 우리는 단일 핵 시퀀싱 또는 면역 염색을 위한 성인 마우스 stria vascularis의 해부를 제시합니다.

단일 핵 시퀀싱 또는 면역염색을 위한 성인 마우스 줄무늬 혈관의 해부

학습하세요 성인 마우스 utricle 해부 및 아데노바이러스를 이용한 지지세포 감염 방법을 통해 내이 균형 기관 연구를 수행하는 기법입니다. 이 방법은 모발세포 재생 메커니즘 연구에 활용됩니다.

성인 마우스 Utricle 및 아데노 바이러스 - 매개 지원하는 세포 감염의 해부

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