Name: 기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 배우세요 인간 혈액에서 기본 T 세포를 분리하여 규제 T 세포를 생성하는 방법을. 단일 기증자 내에서 Treg와 다른 T 세포 아형을 비교하여 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

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<p class="jove_content"&gt; 저자 유동세포계측법 분석 및 정렬와의 도움 제니퍼 이상하고 그렉 Bauman 감사하고 싶습니다. 이 작품은 FM으로 NCRR에서 NIH 그랜트 번호 2P20 RR020171 의해 켄터키 시작 자금의 대학에 의해 지원되었다; GIE는 대통령 대학원 원정대와 켄터키 기회의 원정 지원을 인정한다.</p

1. 버피 코트에서 사람 말초혈 Mononuclear 전지 (PBMCs)의 분리 <ol><li> 병원이나 인근의 혈액 센터 위치에서 버피 코트 하나의 단위를 취득. 우리의 혈액 센터는 정상적인 혈액 기증자로부터 얻은 단위당 버피 코트 40-60 대한 ML 우리에게 제공합니다. </li><li> 버피 코트를 희석하기 위해 멸균 PBS를 포함하는 autoclaved 500 ML 유리 병으로 혈액을 붓고. PBS + 버피 코트의 최종 부피 250 ML이어야합니다. </li><li> 20 ML의 Lymphoprep 솔루션으로 각 열 50 ML 원뿔 튜브를 입력합니다. </li><li> 부드럽게 Lymphoprep 솔루션을 방해하지 않도록주의되는 희석 버피 코트의 25 ML과 Lymphoprep 솔루션을 입혀라. </li><li> 500 X g에서 실온에서 30 분간 튜브를 봐. 림프구 분율을 방해하지 않는만큼, 원심의 브레이크를 해제해야합니다. </li><li> 피펫으로 Lymphoprep 및 플라즈마 - 중간 계층 간의 인터페이스에서 PBMCs를 수집합니다. 약 1 ML까지 플라즈마 - 중간 오프를 기음아직 PBMCs을 포함 버피 코트 레이어를 다룹니다. 새로운 50 ML 관에 PBMCs를 전송하는 10 ML의 피펫을 사용합니다. </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻어 후 hemocytometer 의지에 대한 차가운 RPMI의 50 ML에 세포를 resuspend. 1 X 10 9 PBMCs - 일반적인 복구는 8 × 10 8이다. </li></ol> 이 절차는 혈액의 작은 볼륨 크기를 줄일 수 있습니다. 전체 혈액 샘플의 희석은 PBS에 1시 1분입니다. 2. 총 CD4의 자기 부정적 선택 + T 세포, CD4 + CD45RA + 나이브 T의 셀 또는 CD4 + CD45RO + EasySep 농축 키트를 사용하여 PBMCs에서 메모리 T 세포 (줄기 세포 기술) 4.25 X 10 8 PBMCs ~ 1 × 10 8시 따라야 할 단계. <ol><li> 2퍼센트 FBS 및 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 PBS에서 ML 당 5 × 10 7의 최종 농도로 Resuspend의 PBMCs. 신선한 14 ML의 폴리 프로필렌 원형 바닥 튜브에 세포를 이동합니다. <ol clasS = &quot;lalpha&quot;&gt; <li> 총 인간의 CD4 + T 세포가 부정적인 선택에 의한의 분리 : 인간의 CD4 + T 세포 농축 항체의 칵테일 (PBMCs의 ML 당 50 μL), 믹스와 실온에서 10 분간 부화를 추가합니다. </li><li> 부정적인 선택에 의해 인간 나이브 T 세포의 격리가 : PBMC의 세포 현탁액, 믹스 ML 당 방지 CD45RO 항체의 50 μL를 추가하고 실온에서 15 분 동안 품어. 10 분간 상온에서 키트 (PBMCs의 당 ML 50 μL), 믹스와 부화와 함께 제공되는 농축 칵테일을 추가합니다. </li><li> 부정적인 선택에 의해 인간의 기억 T 세포의 격리는 : 인간 메모리 CD4 + 항체의 T 세포 농축 칵테일 (PBMCs의 ML 당 50 μL), 믹스를 추가하고 실온에서 10 분 동안 품어. </li></ol></li><li> 동등 솔루션 전반에 걸쳐 그들을 배포할 잘 자성 입자를 섞는다. 나이브 키트에서 와동하지 nanoparticles 해. </li><li> 자성 입자를 (100 총 CD4위한 PBMCs의 ML 당 μL +와 나이브 T 세포 선택, 메모리 T 세포 선정 PBMCs의 ML 당 50 μL) 추가합니다. 부드럽게 나이브 T 세포 선택을위한 10 분 또는 메모리 또는 총 CD4 + T 세포의 선택 5 분 동안 상온에서 3 배 및 부화를 pipetting하여 섞는다. </li><li> PBS가 튜브 당 10 ML에 볼륨을 가져 2퍼센트 FBS와 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 추가합니다. 부드럽게 총 CD4 + T 세포, 순진 및 메모리 하위 집합 각각에 대해 5, 10 또는 2.5 분 실버 EasySep 자석으로 uncapped 튜브를 삽입하기 전에 3 배를 pipetting하여 섞는다. </li><li> 여전히 EasySep 자석의 튜브를 통해 관심있는 세포를 분리하기 위해 새로운 50 ML 튜브에 액체를 부어. </li><li> 단계 2.5 나은 복구를 위해 2.6을 반복합니다. </li></ol> 3. 세포 배양 조건 규제 T 세포를 유도해야 <ol><li> 에 의한 1 단계와 2 단계, 코트 조직 배양 플레이트 전날 먼저 (안티 인 경우에는 3 번 CD 항체를 diluting멸균 PBS 1 μg / ML의 농도에 OKT3 클론). 6 잘 접시는 PBS의 2 ML + 잘마다 안티 인 경우에는 3 번 CD를 추가할 경우, 12도 접시 1 ML을 추가 또는 24도 접시 당 500 μL 잘 추가하십시오. 코팅 번호판 4시 ° C에서 사용할 때까지 유지. </li><li> RPMI-1640 2.06 밀리 권총을 미리 보충 Glutamax - 전 25 MM 10 % 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS), 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신 및 50 μm의 β-메르 캅 토 에탄올을 추가하여 편광 매체를 준비합니다 HEPES 버퍼. 다음, 2 NG / ML TGF-β와 5 NG / ML IL-2를 추가합니다. 여기, 한 리간드 또는 미디어에 관심 억제제를 추가할 수 있습니다. 2 X 10 6 세포 / 편광 매체 ML의 농도에서 2 단계의 세포를 Resuspend. </li><li> 37 미리 따뜻한 접시 ° C와 세포를 추가하기 전에 안티 인 경우에는 3 번 CD-코팅 우물의 PBS를 기음. 6 잘 접시, 24 잘 접시 12 잘 접시 또는 세포의 1 ML에 대한 세포의 2 ML에 대해 4 ML 당 우물의 세포 현탁액을 추가합니다. 의 증발을 줄이기 위해 PBS와 빈 우물을 채워미디어. 37 ° C / 5% CO 2에서 3 일 동안 알을 품다. </li><li> 3 일 게시물 도금에서, 500 X g에서 5 분간 원심에서 접시를 돌리다. 접시의 바닥에 T 세포를 방해하지 않고, 미디어의 절반을 제거하고 새로운 미디어로 바꿉니다. 우물이 세포 (3 × 10 6 / ML 이상의 농도)로 초만원 된 경우 또는, 동등하게 다른 반 인 경우에는 3 번 CD 코팅 강판으로 볼륨을 분리하고 원래의 볼륨으로 다시 새로운 매체를 추가하십시오. 37 ° C / 5% CO 2에 두명 게 세 일 동안 알을 품다. </li></ol> 4. T 세포의 세 인구의 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS) <ol><li> 멸균 PBS에 0.​​5 % (W / V) 소 혈청 알부민 (BSA)과 2 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하여 버퍼를 세척 FACS를 준비합니다. 4에 플레이스 버퍼 ° C 감기 얻으려고 말야. </li><li> 잘 세포 배양에서 세포를 제거하고 전체 세포 회복을 위해 PBS의 2 ML 각 우물을 린스. 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브에있는 모든 세포를 놓고 10 500 XG에 원심 분리기분 4에 ° C. </li><li> 세포 밀도를 결정하는 hemocytometer에 세포를 세어보세요. </li><li> 장소 3-5 보상 컨트롤에 대한 각자 5 ML 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브의 튜브 회 × 10 5 세포. 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브, 튜브 당 더 이상 35 이상 X 10 6 세포에 남아있는 세포를 놓습니다. </li><li> 4 ° C와 대기음 미디어에서 5 분 동안 세포를 내려 봐. 1 X 10 6 세포마다 추위 세척 버퍼의 90 μL으로 정렬되는 세포를 Resuspend. 감기 세척 버퍼 보상 제어 튜브의 100 μL에 Resuspend. </li><li> 정렬되는 셀, 안티 CD25-PE 2 μL, 안티 CD45RA-PE-Cy5 3 μL 및 1 회 안티 CD127-APC의 1 μL X 10 6 세포를 결합. 네 번째 튜브에 방지 CD127-APC의 세 번째 튜브 and1 μL로 PE-Cy5 - 최초의 보상 제어 튜브, 두 번째 튜브에 안티 CD25-PE 2 μL, 안티 CD45RA 3 μL에 아무런 항체를 추가 없습니다. 어둠 속에서 45 분 동안 얼음에있는 모든 튜브를 품어. </li><li&gt;는 정렬되는 셀 및 보상 제어 튜브 1 ML에서 차가운 세척 버퍼의 10 ML을 추가합니다. 4에서 5 분 500 XG에서 모든 세포를 원심 ° C. </li><li> 버퍼를 세척의 ML 당 1 X 10 7 세포의 농도에서 버퍼와 resuspend 세포를 기음. 40 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 필터링하기 전에 세포의 ML 당 DNase II 1.5 μL를 추가합니다. 관 당 더 이상 3.5 이상 ML 여러 다섯 ML의 원형 바닥 폴리 프로필렌 튜브에 세포를 이동합니다. 버퍼를 닦고 300 μL로 보상 제어 세포를 Resuspend. </li><li> PE, APC와 PE-Cy5 필터에 의해 교차 검출을 최소화하기 위해 MoFlo 흐름 cytometer에 대한 보상을 설정합니다. 한 ML 갓 태어난 송아지의 혈청을 포함하는 5 ML 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브로 T 세포, 순진 (CD25-CD45RA +)와 메모리 (CD25 - - CD45RA) - iTregs을 (세포가 CD25 하이 CD127 -/LOW CD45RA) 정렬 게이트를 설정합니다. </li></ol> 5. 억제 분석 <ol><li> suppr 만들기ession 분석의 100 U / 페니실린의 ML, 스트렙토 마이신 100 μg / ML, 5 NG / ML IL-2 및 TGF-β에 AIM-V의 2 NG / ML를 추가하여 미디어. </li><li> 분석의 날, heterologous CD4 +와 같은 1 단계와 2 단계에 표시된 버피 코트에서 T 세포를 정화. 이것은 억압 분석의 대상 세포되며 그림 2 주 0에서 볼 수 있듯이, CD25 + Treg 세포를 포함하지 않습니다. </li><li> 세포 대신에 2 μL의 ML 당 5 밀리미터 주식 솔루션의 1 μL를 사용을 제외한 제조 업체의 지침에 따라 같은 CellTrace 키트와 라벨 세포. 직접 빛으로부터 밖으로 유지할 수있다는 것은, 5 밀리미터 주식 솔루션을 만들기 위해 CFSE 중 하나를 유리병에 CellTrace 키트가 제공 DMSO 18 μL를 추가합니다. 1 X 10 6 세포 / ML의 최종 농도로 prewarmed PBS + 0.1 % (W / V) BSA의 대상 세포의 필수 수를 (1 × 10 7 최대) Resuspend. 세포의 ML 당 5 밀리미터 CFSE 1 μL를 추가 및 5 minut 위해 37 ° C의 물을 욕조에 품어네;. 염색법을 끄다 5 분 동안 얼음에 품어 10 % FBS와 완전 얼음 차가운 RPMI 5 볼륨을 추가합니다. 추위 전체 RPMI 및 resuspend 1 회 이상 전지 × 10 억제 분석 매체의 100 μL 당 5 세포. 씻으십시오 </li><li> Treg 억제 감독관 구슬은 2 X 10 7 구슬 / ML의 주식 농도에 있습니다. 구슬의 펠렛 숫자 eppendorf 튜브에 빨리 원심 분리하여 실험 당 세포의 총 수를 같음. RPMI하고 다시 펠렛과 함께 한 구슬을 씻는다. RPMI의 흡인 후 resuspend 비즈 일이 잘되어 당 구슬의 해당 금액은 억제 분석 매체의 8 μL에 있다고. </li><li> 96 잘 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에, 원하는 대상에 CFSE 묻은 세포 (1 × 10 5 세포 / ML), 경위 비즈와 신선한 억제 분석 미디어의 편광과 정렬된 세포 (1 × 10 5 세포 / ML)을 추가 (CFSE의 스테인드) : 200 μL의 최종 볼륨에서 효과기 (정렬)의 비율. 모든 조건은 tripli에서 설정합니다cates. </li><li> 물론 당 92 μL 억제 검정 매체에 CFSE의 스테인드 세포 100 μL, 경위 비즈 8 μL 신선한, 흠없는 세포 1 × 10 5를 추가하여 두 제어 조건의 첫 번째를 준비합니다. 위와 같은 세포 구성 요소지만, 감독관 비즈를 Treg 않고 두 번째 컨트롤을 준비합니다. </li><li> 5 일 동안 37 ° C / 5% CO 2로 알루미늄 호일과 부화에 커버 플레이트. </li><li> 어둠에서 5 ML 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브의 pipetting과 장소에 의해 각각의 우물에서 세포를 수집합니다. 4 ° C, 기음 미디어에서 5 분 500 XG에 세포를 원심 분리기, 그리고 4 단계에서 버퍼를 닦고 300 μL 추운 FACS에 resuspend. 처음 3 X 10 4 CFSE + 세포 퀘스트 소프트웨어와 히스토그램에서 대상 세포를 대표하는 라이브 림프구 게이트에서 이벤트를 분석. </li></ol> 6. 대표 결과 흐름 cytometric pseudocolor의 예 5 일간의 시간을 기 이상의 플롯을 점rse 모니터링 iTreg 차별이 FoxP3과 CD25의 공동 표현 상대를 기반으로, CTLA-4 및 CD45RA는 그림 2에서 볼 수 있습니다. 그림 3의 히스토그램은 iTregs (CD25 하이 CD45RA - CD127 -/LOW 세포)가 정렬되는 성공적인 억압 분석 보여줍니다. 규제 / 억제 능력을 인수했다고 5 일 문화의 유일한 부분 집합이다를 그림 4는 Tregs의 유도를 보여줍니다 나이브 T 세포 풀 (상단 패널) 및 표준 iTreg 매체에서 5 일간의 문화 이후에 메모리 T 세포 풀 (하단 패널)에서. 초기의 세포 CFSE의 염색법 역시 순진 (오른쪽 위 패널) 또는 메모리 T 세포 (하단 오른쪽 패널) 만 세포 분열 몇 라운드 후 iTregs (최고 FoxP3 - 표현 세포)로 구분 것을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig1.jpg" /> 그림 1. 실험 절차의 도식. PBMCs ART 세포 - + CD25 CD4의 자기 부정적인 선택을하기 전에 기울기 원심 분리를 통해 인간의 말초 혈액 중에 분리 5. 문화 5-6일 후, 세포는 FACS를 받아야하고 진압하는 활동을 측정하는 heterologous CFSE 분류 대상 세포와 공동 incubated됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig2.jpg" /> 그림 2 죄를 씻고 인간의 기본 CD4 + CD25 -. T 세포가 매체를 iTreg에서 배양해 있습니다. 세포가 나누어지는가 CD45RA, FoxP3, CTLA-4와 CD25 마커의 진행 상황을 모니터링하는 단지 격리 (매일 0) 이후 및 일 1, 3 및 세포 배양 5에서 수집됩니다. iTreg 프로필 CD45RA에 해당 - FoxP3 안녕하세요, CTLA-4와 CD25 안녕 안녕하세요 (인 - 그래프 창에 강조). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig3.jpg" /> 그림 3. + CFSE 라 CD4 투석을beled 세포 (1 × 10 5 / 잘가) 정렬 순진, 메모리 또는 iTreg 세포의 면전에서 억제 경감 구슬을 Treg 함께 배양해있다 (3 × 10 4 /도).에게 5 일 후에 세포가 수확되고 스테인드 세포 CFSE 프로필이 유동세포계측법에 의해 분석됩니다. iTreg 세포의 존재는 완전히 CD4의 확산 + T 세포를 abolishes. 숫자 본부받은 CFSE-라벨이 세포의 비율을 나타내는입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig4.jpg" /> 그림 4 인간의 기본 순진 죄를 씻고. (CD4 + CD25가을 - CD45RA +)와 메모리 (CD4 + CD25 - CD45RO +) T 세포가 CFSE와 매체 iTreg의 교양 물들일 수 있습니다. 5 일 후에 세포 phenotyped과 세포 분열 속도가 예상됩니다. 다른 이름으로 그림 2에 표시된 두 집합에서 차별 iTreg 집합은 해당CD45RA - CD25 안녕 FoxP3 하이와 CTLA-4 안녕하세요 (후자이 보이지 않음). 비교 CFSE의 염색법 프로필은 5 일 문화 중 가장 proliferative 세포로 iTregs를 (여기서는 가장 높은 표현 FoxP3 T 세포 등)를 확인하실 수 있습니다.

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저자가 공개하는 게 없다.

Treg 전송, 그들의 효율적인 생성 및 안정적인 유지 보수 방법을 autoimmunity 그래프트 거절 및 다른 면역 또는 염증 - 매개 질환을 퇴치에 엄청난 치료 가능성을 가지고 있지만 아직 개발되지 않았습니다. 인간의 T 세포를 순환만이 1-5%는 Tregs가로서 자신의 제어 확장과 차별화는 병원에 Tregs의 구현의 주요 억지력으로 소수를 극복. 우리가 TGN1412 재판 13 일부터 배운대로 반면에, 그것은 심히 분자 이벤트를 이해하기 위해 과학적으로 그리고 윤리적으로 필요한 모든 치료 처방을 구현하기 전에 조정 인간 T 세포의 운명 결정니다. 차별 iTreg이 방법을 통해 순진, 메모리, 이펙터 T 세포 iTregs의 결과로 인구는 유전자 발현이나 하나의 인간의 말초 혈액 기증자로부터 파생 세포의 인구 사이의 기능 비교를 용이하게합니다. 우리 손으로 정렬 세포가되었습니다microarray 및 주요 신호 이벤트를 검토 서부 blots의 유전자 변화를 측정하기 qRT-PCR 분석에 비해, 또는 패치에...

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td> 축 - 방패 </td><td> 1,114,547 </td><td> 실온에서 보관 </td></tr><tr><td> 냉장 벤치 - 탑 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td><td></td></tr><tr><td> 밝은 라인 Hemocytometer </td><td> Hausser 과학 </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep 인간 CD4 + T 세포 강화 키트 </td><td> 셀 기술을 막기 </td><td> 19,052 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep 인간 메모리 CD4 + T 세포 강화 키트 </td><td> 셀 기술을 막기 </td><td> 19,157 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep 인간 나이브 CD4 + T 세포 강화 키트 </td><td> 셀 기술을 막기 </td><td> 19,155 </td><td></td></tr><tr><td> 빅 쉬운 EasySep 매기그물 </td><td> 셀 기술을 막기 </td><td> 18,001 </td><td> 은화 </td></tr><tr><td> 5 ML 라운드 히프 폴리스티렌 튜브 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,008 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML의 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브 </td><td> VWR </td><td> 89004-368 </td><td></td></tr><tr><td> 14 ML의 폴리 프로필렌은 라운드 - 어쨌든 튜브 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,059 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ML의 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브 </td><td> VWR </td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 안티 인 경우에는 3 번 CD 항체 </td><td> 바이오 엑스 셀 </td><td> BE0001-2 </td><td> 클론 : OKT3 </td></tr><tr><td> 24 자 셀 폴리스티렌 문화 플레이트 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 353,047 </td><td></td></tr><tr><td> 96 자 라운드 히프 조직 배양 플레이트 </td><td> Grenier 바이오 원 </td><td> 650,180 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-I와 HEPES 버퍼와 RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 72,400 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 16,000 </td><td></td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> 시그마 </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> TGF-β1 재조합 인간 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8348-62 </td><td></td></tr><tr><td> 재조합 인간 IL-2 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8029-63 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 (BSA) </td><td> MP Biomedicals 주식 회사 </td><td> 810,531 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Amresco </td><td> E177 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 안티 인간 CD25-PE </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-024 </td><td> 클론 : 4E3 </td></tr><tr><td> 마우스 안티 인간 CD45RA-PE-Cy5 </td><td> eBioscience </td><td> 15-0458-42 </td><td> 클론 : HI100 </td></tr><tr><td> 마우스 안티 인간 CD127-APC </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-094-890 </td><td> 클론 : MB15-18C9 </td></tr><tr><td> DNase II </td><td> MP Biomedicals 주식 회사 </td><td> 190,370 </td><td></td></tr><tr><td> MoFlo 흐름 Cytometer </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FlowJo 소프트웨어 </td><td> 트리 스타 주식 회사 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 세포 퀘스트 프로 소프트웨어 </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 갓 태어난 송아지 고기 세럼 </td><td> Gibco </td><td> 16,010 </td><td></td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Gibco </td><td> 25,030 </td><td></td></tr><tr><td> AIM-V </td><td> Gibco </td><td> 0,870,112 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrace의 CFSE의 세포 증식 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> C34554 </td><td></td></tr><tr><td> 억제 검사기 비즈를 Treg </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-909 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td> 15,140 </td><td></td></tr><tr><td> 40 μm의 나일론 셀 스트레인어 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,340 </td><td></td></tr></table>

기본 인적 나이브 및 메모리 t의 세포로부터 유도된 규제 t 세포의 생성

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

면역 CD4 + 규제 T 세포 (Tregs)의 개발과 유지 보수 및 인체에 대한 자신과 공생 항원의 광대한 양의 immunologic의 항상성 유지에 필요한 말초 관용에 기여한다. Tregs 및 염증성 종래의 T 세포 사이의 균형을 Perturbations는 immunopathology이나 암이 발생할 수 있습니다. Tregs의 치료 주사는 대장염 1, 유형 I 당뇨병 2, 류마티스 관절염 및 이식편 대 숙주 질환, 인간 대 마우스 Treg 생물학 5 4 몇 가지 근본적인 차이점 murine 모델에 효과있는 것으로 표시되었지만 지금까지 임상 사용을 배제하고있다. 충분한 숫자, 순도, 안정성 및 치료 Tregs의 유도 특이성의 부족들이 전직 생체내 확장 6 조건을 최적화할 수있는 인간 Treg 개발의 역동적인 플랫폼을 necessitated. 여기 D4 단계로 세분 수있는 단일 인간의 말초 혈액 기증자로부터 유도된 Tregs (iTregs)의 차별 화를위한 방법 방접원을 그리다 : 말초 혈액 mononuclear 세포, CD4의 자기 선택 + T 세포의 절연, 체외 세포 배양 및 형광의 활성화 T 세포 하위 집합의 셀 정렬 (FACS). Treg 서명 전사 인자의 forkhead 상자 P3 (FoxP3)는 인간 7의 활성화 유발 전사 인자이며 다른 독특한 마커 존재 마커 조합 패널 억제 활동과 T 세포를 식별하는 데 사용해야하기 때문에. 문화에 6 일이나하면 Google 시스템에서 세포 나이브 T 세포, CD25 및 CD45RA들의 상대적인 표현을 기반으로 메모리 T 세포 또는 iTregs로 demarcated 수 있습니다. 메모리와 나이브 T 세포가 다른보고 편광 요구 사항 및 plasticities 8을 가지고로서 CD45RA +와 CD45RO로 초기 T 세포 인구의 사전 분류 + 하위 집합 수 B전자는 이러한 불일치를 검사하기 위해 사용됩니다. 다른 사람과 일치하는, 우리의 CD25 안녕 CD45RA - FoxP3 9 iTregs 명시적 높은 수준의, GITR 및 CTLA-4 11 CD127 12 낮은 수준. 각 인구의 FACS 따라 결과 세포 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE) - 라벨 T 세포 autologous의 확산을 병신하는 상대적 능력을 평가하고 억압 분석에 사용할 수 있습니다.

우리는 한 인간의 혈액 기증자로부터 규제, 메모리 및 나이브 T 세포를 생성하는 방법을 설명합니다. 편광 Tregs 그때도 여기에 설명된 억제 분석을 포함한 유전자 균질성와 유전 및 기능 다양한 어플 리케이션의 다른 하위 집합을 비교할 수 있습니다.

기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

면역 억제성 CD4+ 조절 T 세포(Tregs)의 발달과 유지는 ... 상태를 유지하는 데 필요한 말초 내성의 형성에 기여합니다.

본 실험 절차의 전체적인 목적은 일차 T 세포로부터 인간 조절 T 세포를 생성하는 것입니다. 먼저, 인간 혈액 샘플에서 말초혈액 단핵구를 분리합니다. 그 다음, PBMC 혼합물에서 CD4 양성 T 세포를 정제하여 배양합니다.6일 후, 유세포 분석기를 사용하여 세포를 나이브(naive), 기억(memory), 작동(effector) 및 유도 조절 T 세포 서브셋으로 분리하고 억제 분석(suppressor assays)을 수행합니다. 이 세포들을 이용하여 본 방법이 억제 활성을 가진 인간 조절 T 세포를 생성함을 입증합니다. 마우스 세포를 이용한 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 본 인간 세포 기반 방법이 생리학적 및 임상적 관련성이 더 높으며, 단일 공여 내에서 조절 T 세포(tregs)를 다른 세포 집단과 비교할 수 있다는 점입니다.개체 내 변동성 제거. 이 방법은 기존 T 세포와 조절 세포 간의 전환을 조절하는 조절 이벤트는 무엇인지, 또는 조절 세포에 특이적인 신호 전달 및 전사 이벤트는 무엇인지와 같이 조절 세포 분야의 핵심적인 질문에 답할 수 있습니다. 조절 세포가 면역 항상성 유지에 수행하는 중요한 역할 때문에, 이 기술의 함의는 자가면역 질환, 염증성 질환 및 암 치료까지 확장됩니다.일반적으로 이 기술은 사용되는 기법이 다양하고 일부 단계에서 최적의 세포 배양 조건을 위한 범위가 매우 좁기 때문에 처음 접하는 사람들에게는 어렵게 느껴질 수 있습니다. 이 방법은 Treg 발달에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, T-세포 계통 분화의 가소성을 모니터링하거나 T-세포 밀리 유도가 이를 유도하거나 방지하는 능력을 분석하는 데에도 사용될 수 있습니다. Treg 발달 절차를 시연할 사람은 Andrea McCool과 대학원생인 Marie Catherine Ranier, Gavin Ellis, 그리고 Catalina Vale Ortega입니다.40~60 mL의 B Buffy coat에서 인간 말초혈액 단핵세포를 분리하는 것으로 이 절차를 시작하십시오. Buffy coat를 희석하기 위해, 이를 150 mL의 멸균 PBS가 담긴 오토클레이브용 500 mL 유리병으로 옮깁니다. 그런 다음 멸균 PBS를 더 추가하여 최종 부피를 250 mL로 맞춥니다. 다음으로, 10개의 50 mL 원심분리관에 각각 20 mL의 lympho prep solution을 채웁니다.그런 다음, Lympho prep 용액 위에 희석된 buffy coat 25 milliliters를 조심스럽게 층분리하여 얹습니다. 이때 Lympho prep 용액이 섞이지 않도록 주의하십시오. 튜브를 상온에서 500 times G로 30분 동안 원심분리합니다. 림프구 층이 흐트러지지 않도록 원심분리기의 브레이크 기능을 반드시 끄십시오.원심분리가 끝나면, PBM CS는 림프구 준비물과 혈장 배지 층 사이의 인터페이스에 위치하게 되며, 여기서 이를 수집합니다. PBMC가 포함된 버피코트(buffy coat) 층을 약 1 mL 정도 덮을 때까지 혈장 배지를 흡입하여 제거합니다. 10 mL 피펫을 사용하여 PBMC를 새로운 50 mL 튜브로 옮깁니다.PBS로 세포를 두 번 세척한 후, 차가운 RPMI 50 milliliters에 다시 현탁하고 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 농도가 결정된 후 일반적인 회수량은 8 × 10⁸에서 1 × 10⁹ p BMCs입니다. 2% FBS와 1 millimolar EDTA가 포함된 PBS에서 p BMCs의 최종 농도가 5 × 10⁷ per milliliter가 되도록 다시 현탁합니다. 현탁된 세포를 새로운 14 milliliter 폴리프로필렌 라운드 바텀 튜브로 옮깁니다.다음으로, EAs 키트를 사용하여 관심 세포를 음성 선택합니다. 키트에 제공된 T 세포 농축 칵테일에는 사량체 항체 복합체가 포함되어 있으며, 이 복합체는 한쪽에는 항-덱스트린 항체가, 다른 쪽에는 원치 않는 세포 표면 항원에 대한 항체가 결합되어 있습니다. 칵테일을 세포에 첨가하면 사량체 항체 복합체가 원치 않는 세포들을 서로 연결합니다.그 다음 덱스트란 코팅 자성 입자를 첨가하면, 이 입자들이 4량체 항체 복합체에 결합하여 원치 않는 세포와 자성 입자를 연결합니다. 이어서 자석을 이용하여 원치 않는 세포를 표적 세포로부터 분리하고, 분리된 표적 세포를 수집하여 CD4 양성 T 세포를 단리합니다. 1 × 10⁸ ~ 4.25 × 10⁸개의 PBMC를 15 mL 원추형 튜브에 피펫으로 분주합니다. 그런 다음 PBMC 1 mL당 50 µL의 인간 CD4 양성 T 세포 농축 항체 칵테일을 첨가합니다.실온에서 10분 동안 혼합 및 배양합니다. 자성 입자가 용액 전체에 균일하게 분포되도록 혼합합니다. pbmc 1 mL당 100 µL의 자성 입자를 추가합니다.피펫팅을 2~3회 조심스럽게 하여 혼합한 후, 상온에서 10분 동안 배양합니다. FBS와 EDTA가 포함된 PBS를 추가하여 튜브당 최종 부피를 10 milliliters로 맞춘 뒤, 피펫팅을 2~3회 조심스럽게 하여 혼합합니다. 그다음, 캡을 열지 않은 상태의 튜브를 cept magnet에 넣고 튜브가 자석에 고정된 상태로 5분 동안 둡니다.더 나은 회수율을 위해 관심 세포를 분리하려면 액체를 새 50 milliliter 튜브에 붓습니다. 튜브에 P-B-S-F-B-S-E-D-T-A를 추가하여 혼합하고 샘플을 다시 자석에 놓는 과정을 반복합니다. 세포가 분리되면 세포 수를 측정한 후, 실온에서 500 times G로 5분 동안 원심분리합니다.세포 펠렛을 분화 배지에 재부유하여 2 × 10⁶ cells/mL 농도로 맞춥니다. 그 다음, 조절 T 세포를 유도하기 위해 비디오의 다음 섹션에 설명된 대로 배양을 진행합니다. anti-CD3가 코팅된 6-well 조직 배양 플레이트를 37 °C에서 예열합니다.플레이트가 따뜻해지면 웰에서 PBS를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 각 웰에 CD four 양성 농축 세포 현탁액 4 mL를 첨가합니다. 배지의 증발을 줄이기 위해 비어 있는 웰은 PBS로 채웁니다. 이후 3일 동안 배양합니다.플레이트를 500 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 그 후 플레이트 바닥의 세포가 흐트러지지 않도록 주의하며 배지의 절반을 제거하고 신선한 배지로 교체한 뒤 2~3일 더 배양합니다. 이제 세포를 다음 섹션에서 설명하는 유세포 분석기 기반 세포 분리(fluorescence activated cells sorting)로 분리하거나, 이후에 설명할 억제 분석(suppression assay)의 표적 세포로 사용할 수 있습니다. 2~3일이 지나면 세포와 적절한 보정 대조군을 준비하여 유세포 분석 기반 분리를 수행합니다. 유도된 조절 나이브 T 세포와 기억 T 세포를 분리하기 위해, 동봉된 문서에 설명된 대로 분리할 세포를 anti CD 25 pe, anti CD 45 RA PE SCI five 및 anti CD 1 27 A PC로 염색합니다.또한 FACS 분석을 위해 적절한 보정 대조군(compensation controls)에 항체를 반드시 추가하십시오. 염색 후 세척 완충액을 사용하여 세포를 1×10⁷ cells/mL 농도로 재부유시킨 다음, 세포 1 mL당 1.5 µL의 DNAse I을 첨가하고 40 µm 나일론 세포 스트레이너로 세포를 여과하십시오. 여과된 세포를 5 mL 라운드 바텀 폴리프로필렌 튜브에 튜브당 최대 3.5 mL가 넘지 않도록 옮기십시오.보정 대조군 세포를 300 µL의 세척 완충액에 재현탁합니다. PE A PC 및 PE sci-fi 필터에 의한 교차 검출을 최소화하도록 유세포 분석기의 보정 값을 설정합니다. 분리된 조절 T 세포가 T 세포 증식을 억제할 수 있는지 평가하기 위해, 1 mL의 신생 송아지 혈청이 담긴 5 mL 원형 바닥 폴리스티렌 튜브로 조절 T 세포, 나이브 T 세포 및 기억 T 세포를 분리하도록 게이트를 설정합니다.여기에서는 억제 분석(suppression assay)을 수행합니다. 분리되지 않은 CD4 양성 농축 세포가 표적 세포로 작용하게 됩니다. 이 세포들에는 CD25 양성 유도 조절 T 세포가 포함되지 않아야 합니다.제조사의 지침에 따라 세포 추적 키트를 사용하여 표적 세포를 CFSE로 라벨링하되, 세포 1 mL당 5 M 스톡 솔루션 2 µL 대신 1 µL를 사용하십시오. 다음으로, 마이크로 원심분리 튜브에서 빠른 원심분리를 통해 총 세포 수와 동일한 수의 Treg 억제 검사 비드를 펠렛화합니다. 비드를 RPMI로 한 번 세척하고 원심분리 후 다시 펠렛화하십시오.RPMI를 흡입하여 제거하고, 96-웰 라운드 바텀 조직 배양 플레이트의 웰당 8 µL의 억제 분석 배지를 사용하여 적절한 농도로 재부유시킵니다. CFSE 염색된 표적 세포 8 µL를 추가합니다. 비드와 분리 정제된 편향 세포를 확인하여 신선한 억제 분석 용액의 최종 부피를 맞춥니다.200 µL의 배지. 모든 조건은 3반복으로 플레이팅합니다. 대조군을 준비하려면 suppressor assay 배지 92 µL에 CFSE 염색 세포 100 µL, inspector beads 8 µL, 그리고 염색되지 않은 신선한 세포 1 × 10⁵개를 첨가합니다.처음 두 개의 대조군 웰에 웰당 배지를 넣습니다. 그런 다음 92 µL의 억제제 분석 배지가 담긴 웰에 CFSE 염색 세포 100 µL와 염색되지 않은 신선한 세포 1×10⁵개를 추가합니다. 나머지 두 개의 대조군 웰에도 웰당 배지를 넣습니다.플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 암조건의 인큐베이터에 5일 동안 보관하십시오. 피펫팅을 통해 각 웰에서 세포를 수집하여 5 mL 라운드 바텀 폴리스티렌 튜브에 넣으십시오. 4 °C에서 500 ×g로 5분 동안 세포를 원심분리하십시오.배지를 흡입하여 제거하고 300 µL의 차가운 Fox washing buffer로 세포를 재부유합니다. 유도된 조절 T 세포 분화 과정을 모니터링하기 위해, 정제된 인간 일차 CD4+ CD25- T 세포를 iTreg 배지에서 배양하였습니다. 0, 1, 3, 5일차에 채취한 시료를 유세포 분석기로 분석하여 CD45RA, FoxP3, CTLA4 및 CD25 마커의 발현을 평가했습니다. 이 유사색 점 도표(pseudocolor dot plots)에서 볼 수 있듯이, 5일의 기간 동안 세포는 TGF-β와 IL-2가 존재하는 환경에서 CD3 교차결합에 반응하여 체외에서 증식하고 분화하며, 최종적으로 CD45RA- FoxP3high CTLA4high CD25high 프로파일을 나타냅니다. 이는 일반 T 세포 전구체로부터 유도 조절 T 세포(iTreg)가 발달했음을 나타냅니다. 생성된 iTreg의 T 세포 증식 억제 능력을 상대적으로 평가하기 위해,이 히스토그램에서 볼 수 있듯이, CFSE가 표지된 세포를 분류된 naive memory 및 iTreg 세포와 함께 treg suppression inspector beads와 함께 배양하였습니다. CD25 high, CD45RA negative, CD127 negative인 저분화 유도 조절 T 세포는 5일간의 배양 후 조절 억제 능력을 획득한 유일한 하위 집합입니다.이는 이 시스템에서 생성된 세포가 일시적으로 FOX P3와 CD25를 발현할 수 있지만 면역 억제 기능은 없는 활성화된 일반 T 세포가 아니라, 표현형과 기능 모두 억제성 조절 T 세포임을 나타냅니다. 유도된 조절 T 세포의 존재는 CD4 양성 T 세포의 증식을 완전히 억제합니다. 수치는 CFSE 표지 세포 중 분열이 일어난 세포의 백분율을 나타내며, 이는 T 세포 정제 하위 집합에서도 동일하게 적용됨을 확인하기 위한 것입니다.인간 일차 나이브 T세포와 메모리 T세포를 CFSE로 염색한 후 Treg 배지에서 배양하였습니다. 5일 후, 세포의 표현형을 분석하고 세포 분열 속도를 추정하였습니다. 여기서는 나이브 T세포 풀과 메모리 T세포 풀로부터 5일간의 배양을 통해 Treg을 유도하였습니다.표준 IT reg 배지에서 CFSE 염색을 실시한 초기 세포의 결과는 나이브(naive) T 세포와 메모리(memory) T 세포 모두 여러 번의 세포 분열을 거친 후에만 조절 T 세포로 분화함을 보여줍니다. CFSE 염색 프로파일을 비교해 보면, 5일간의 배양 기간 동안 유도된 조절 T 세포가 가장 활발하게 증식하는 세포임을 확인할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 단일 공여자로부터 얻은 나이브, 메모리 또는 전체 T 세포 집단으로부터 유도된 TX를 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 본 절차를 수행할 때 이를 참고하시기 바랍니다.전 과정에서 무균 상태를 유지하고, 본 절차를 수행하는 동안 CFSE가 빛에 노출되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 방법이 개발된 이후, 조절 T 세포와 일반 T 세포 간의 세포 분열 속도, 특정 사이토카인 합성 및 이온 채널 이용의 차이와 같은 다른 의문점들을 해결하기 위해 기능 분석법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 면역학 분야의 연구자들이 인체 환자의 자가면역 질환 및 기타 treg 관련 병리 현상을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.인혈을 다루는 작업은 매우 위험하므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 적절한 혈액 은행 검사와 올바른 폐기 처리와 같은 예방 조치를 항상 준수해야 함을 잊지 마십시오.

generation-induced-regulatory-t-cells-from-primary-human-nave-memory

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 종양 항원 특이적 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 CD8αβ+ T 세포를 생성하는 분석을 보여줍니다. 종양 항원 특이적 iPSC는 기질 세포 단층에서 성장하며 조혈전구세포(HPC)로 분화됩니다. HPC는 분화 배지를 사용하여 CD4+, CD8+, 이중 양성 T 세포로 분화됩니다. 그런 다음 이러한 세포를 자극하여 CD8을 발현하는 단일 양성 T 세포를 생성합니다.

유도 만능 줄기 세포에서 단일 양성 CD8 T 세포 생성

CD4+ 조절 T 세포는 강력한 면역 조절제이며 면역 항상성에서 중요한 기능을 수행합니다. 말초 혈액에서 이러한 세포가 부족하기 때문에 특히 HIV-1 감염과 관련하여 기능 연구가 어렵습니다. 여기에서는 HIV-1에 감염된 개인의 말초 혈액에서 기능적 CD4+ Tregs를 분리하고 확장하는 방법을 설명합니다.

새로운 도구는 HIV-1에 감염된 개인으로부터 규제 T 세포를 확장하려면

순진 CD4 콕 사키 아데노 바이러스 수용체의 유전자 발현과 T 세포에 아데노 바이러스 유전자 전달은 규제 T 세포 분화의 분자 분석을...

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

이 논문은 정의된 동종항원에 특이적으로 반응하는 인간 T 세포 클론의 생성 및 증식 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 펩타이드-MHC 리간드에 특이적인 인간 T 세포를 클로닝하는 데 적용할 수 있습니다.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

순진한 CD4+ T cell은 활성화 시점의 환경에 따라 다양한 subset으로 분극화합니다.  naive CD4+ T cell을 다양한 effector subset으로 분화하는 것은 T cell receptor stimuli 및 specific cytokine signal의 추가를 통해 in vitro에서 달성할 수 있습니다.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

이 프로토콜은 체외 나이브 CD4 + T 세포로부터 재생 가능한 생성 유도 인간 T 조절 세포 (iTregs)의 표현형을 설명한다. Foxp3의 유도를위한 다른 프로토콜은 각각의 프로토콜로 얻은 특정 iTreg의 표현형 연구를 허용합니다.

TGF-β 함유 프로토콜을 사용하여 나이브 CD4 + T 세포에서 인간의 CD4 + Foxp3의 + 유도 규제 T 세포 (iTregs)의 체외 분화

본 문서에서는 3차원(3D) 흉선 배양 시스템에 의해 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 흉선 이주자(iTE)를 생성하는 새로운 방법을 설명한다. iTE는 증식, 기억 형성 및 종양 억제 능력을 가진 순진한 T 세포와 밀접하게 관련된 T 세포의 균질한 서브세트이다.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

이 문서에서는 OP9/DLL1 공동 배양 시스템을 사용하여 기능성 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 CD8αβ+ 단일 양성 T 세포를 생성하는 방법을 설명한다.

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

여기에 제시된 것은 줄기세포 유래 바이러스 항원(Ag)-특이적 T 림프구의 입양세포 전달(ACT)을 이용하여 마우스에서 B형 간염 바이러스(HBV) 복제의 효과적인 억제를 위한 프로토콜이다. 이 절차는 HBV 감염의 잠재적인 ACT 기지를 둔 면역 요법을 위해 적응될 수 있습니다.

줄기 세포 유래 바이러스 Ag 특이적 T 림프구는 마우스에서 HBV 복제를 억제

이 프로토콜은 인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포(CAR Tregs)를 생성하고 테스트하기 위한 간소화된 워크플로우를 제공합니다.

인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포의 생성

배우세요 인간 혈액에서 기본 T 세포를 분리하여 규제 T 세포를 생성하는 방법을. 단일 기증자 내에서 Treg와 다른 T 세포 아형을 비교하여 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

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