기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

본 실험 절차의 전체적인 목적은 일차 T 세포로부터 인간 조절 T 세포를 생성하는 것입니다. 먼저, 인간 혈액 샘플에서 말초혈액 단핵구를 분리합니다. 그 다음, PBMC 혼합물에서 CD4 양성 T 세포를 정제하여 배양합니다.

6일 후, 유세포 분석기를 사용하여 세포를 나이브(naive), 기억(memory), 작동(effector) 및 유도 조절 T 세포 서브셋으로 분리하고 억제 분석(suppressor assays)을 수행합니다. 이 세포들을 이용하여 본 방법이 억제 활성을 가진 인간 조절 T 세포를 생성함을 입증합니다. 마우스 세포를 이용한 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 본 인간 세포 기반 방법이 생리학적 및 임상적 관련성이 더 높으며, 단일 공여 내에서 조절 T 세포(tregs)를 다른 세포 집단과 비교할 수 있다는 점입니다.

개체 내 변동성 제거. 이 방법은 기존 T 세포와 조절 세포 간의 전환을 조절하는 조절 이벤트는 무엇인지, 또는 조절 세포에 특이적인 신호 전달 및 전사 이벤트는 무엇인지와 같이 조절 세포 분야의 핵심적인 질문에 답할 수 있습니다. 조절 세포가 면역 항상성 유지에 수행하는 중요한 역할 때문에, 이 기술의 함의는 자가면역 질환, 염증성 질환 및 암 치료까지 확장됩니다.

일반적으로 이 기술은 사용되는 기법이 다양하고 일부 단계에서 최적의 세포 배양 조건을 위한 범위가 매우 좁기 때문에 처음 접하는 사람들에게는 어렵게 느껴질 수 있습니다. 이 방법은 Treg 발달에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, T-세포 계통 분화의 가소성을 모니터링하거나 T-세포 밀리 유도가 이를 유도하거나 방지하는 능력을 분석하는 데에도 사용될 수 있습니다. Treg 발달 절차를 시연할 사람은 Andrea McCool과 대학원생인 Marie Catherine Ranier, Gavin Ellis, 그리고 Catalina Vale Ortega입니다.

40~60 mL의 B Buffy coat에서 인간 말초혈액 단핵세포를 분리하는 것으로 이 절차를 시작하십시오. Buffy coat를 희석하기 위해, 이를 150 mL의 멸균 PBS가 담긴 오토클레이브용 500 mL 유리병으로 옮깁니다. 그런 다음 멸균 PBS를 더 추가하여 최종 부피를 250 mL로 맞춥니다. 다음으로, 10개의 50 mL 원심분리관에 각각 20 mL의 lympho prep solution을 채웁니다.

그런 다음, Lympho prep 용액 위에 희석된 buffy coat 25 milliliters를 조심스럽게 층분리하여 얹습니다. 이때 Lympho prep 용액이 섞이지 않도록 주의하십시오. 튜브를 상온에서 500 times G로 30분 동안 원심분리합니다. 림프구 층이 흐트러지지 않도록 원심분리기의 브레이크 기능을 반드시 끄십시오.

원심분리가 끝나면, PBM CS는 림프구 준비물과 혈장 배지 층 사이의 인터페이스에 위치하게 되며, 여기서 이를 수집합니다. PBMC가 포함된 버피코트(buffy coat) 층을 약 1 mL 정도 덮을 때까지 혈장 배지를 흡입하여 제거합니다. 10 mL 피펫을 사용하여 PBMC를 새로운 50 mL 튜브로 옮깁니다.

PBS로 세포를 두 번 세척한 후, 차가운 RPMI 50 milliliters에 다시 현탁하고 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 농도가 결정된 후 일반적인 회수량은 8 × 10⁸에서 1 × 10⁹ p BMCs입니다. 2% FBS와 1 millimolar EDTA가 포함된 PBS에서 p BMCs의 최종 농도가 5 × 10⁷ per milliliter가 되도록 다시 현탁합니다. 현탁된 세포를 새로운 14 milliliter 폴리프로필렌 라운드 바텀 튜브로 옮깁니다.

다음으로, EAs 키트를 사용하여 관심 세포를 음성 선택합니다. 키트에 제공된 T 세포 농축 칵테일에는 사량체 항체 복합체가 포함되어 있으며, 이 복합체는 한쪽에는 항-덱스트린 항체가, 다른 쪽에는 원치 않는 세포 표면 항원에 대한 항체가 결합되어 있습니다. 칵테일을 세포에 첨가하면 사량체 항체 복합체가 원치 않는 세포들을 서로 연결합니다.

그 다음 덱스트란 코팅 자성 입자를 첨가하면, 이 입자들이 4량체 항체 복합체에 결합하여 원치 않는 세포와 자성 입자를 연결합니다. 이어서 자석을 이용하여 원치 않는 세포를 표적 세포로부터 분리하고, 분리된 표적 세포를 수집하여 CD4 양성 T 세포를 단리합니다. 1 × 10⁸ ~ 4.25 × 10⁸개의 PBMC를 15 mL 원추형 튜브에 피펫으로 분주합니다. 그런 다음 PBMC 1 mL당 50 µL의 인간 CD4 양성 T 세포 농축 항체 칵테일을 첨가합니다.

실온에서 10분 동안 혼합 및 배양합니다. 자성 입자가 용액 전체에 균일하게 분포되도록 혼합합니다. pbmc 1 mL당 100 µL의 자성 입자를 추가합니다.

피펫팅을 2~3회 조심스럽게 하여 혼합한 후, 상온에서 10분 동안 배양합니다. FBS와 EDTA가 포함된 PBS를 추가하여 튜브당 최종 부피를 10 milliliters로 맞춘 뒤, 피펫팅을 2~3회 조심스럽게 하여 혼합합니다. 그다음, 캡을 열지 않은 상태의 튜브를 cept magnet에 넣고 튜브가 자석에 고정된 상태로 5분 동안 둡니다.

더 나은 회수율을 위해 관심 세포를 분리하려면 액체를 새 50 milliliter 튜브에 붓습니다. 튜브에 P-B-S-F-B-S-E-D-T-A를 추가하여 혼합하고 샘플을 다시 자석에 놓는 과정을 반복합니다. 세포가 분리되면 세포 수를 측정한 후, 실온에서 500 times G로 5분 동안 원심분리합니다.

세포 펠렛을 분화 배지에 재부유하여 2 × 10⁶ cells/mL 농도로 맞춥니다. 그 다음, 조절 T 세포를 유도하기 위해 비디오의 다음 섹션에 설명된 대로 배양을 진행합니다. anti-CD3가 코팅된 6-well 조직 배양 플레이트를 37 °C에서 예열합니다.

플레이트가 따뜻해지면 웰에서 PBS를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 각 웰에 CD four 양성 농축 세포 현탁액 4 mL를 첨가합니다. 배지의 증발을 줄이기 위해 비어 있는 웰은 PBS로 채웁니다. 이후 3일 동안 배양합니다.

플레이트를 500 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 그 후 플레이트 바닥의 세포가 흐트러지지 않도록 주의하며 배지의 절반을 제거하고 신선한 배지로 교체한 뒤 2~3일 더 배양합니다. 이제 세포를 다음 섹션에서 설명하는 유세포 분석기 기반 세포 분리(fluorescence activated cells sorting)로 분리하거나, 이후에 설명할 억제 분석(suppression assay)의 표적 세포로 사용할 수 있습니다. 2~3일이 지나면 세포와 적절한 보정 대조군을 준비하여 유세포 분석 기반 분리를 수행합니다. 유도된 조절 나이브 T 세포와 기억 T 세포를 분리하기 위해, 동봉된 문서에 설명된 대로 분리할 세포를 anti CD 25 pe, anti CD 45 RA PE SCI five 및 anti CD 1 27 A PC로 염색합니다.

또한 FACS 분석을 위해 적절한 보정 대조군(compensation controls)에 항체를 반드시 추가하십시오. 염색 후 세척 완충액을 사용하여 세포를 1×10⁷ cells/mL 농도로 재부유시킨 다음, 세포 1 mL당 1.5 µL의 DNAse I을 첨가하고 40 µm 나일론 세포 스트레이너로 세포를 여과하십시오. 여과된 세포를 5 mL 라운드 바텀 폴리프로필렌 튜브에 튜브당 최대 3.5 mL가 넘지 않도록 옮기십시오.

보정 대조군 세포를 300 µL의 세척 완충액에 재현탁합니다. PE A PC 및 PE sci-fi 필터에 의한 교차 검출을 최소화하도록 유세포 분석기의 보정 값을 설정합니다. 분리된 조절 T 세포가 T 세포 증식을 억제할 수 있는지 평가하기 위해, 1 mL의 신생 송아지 혈청이 담긴 5 mL 원형 바닥 폴리스티렌 튜브로 조절 T 세포, 나이브 T 세포 및 기억 T 세포를 분리하도록 게이트를 설정합니다.

여기에서는 억제 분석(suppression assay)을 수행합니다. 분리되지 않은 CD4 양성 농축 세포가 표적 세포로 작용하게 됩니다. 이 세포들에는 CD25 양성 유도 조절 T 세포가 포함되지 않아야 합니다.

제조사의 지침에 따라 세포 추적 키트를 사용하여 표적 세포를 CFSE로 라벨링하되, 세포 1 mL당 5 M 스톡 솔루션 2 µL 대신 1 µL를 사용하십시오. 다음으로, 마이크로 원심분리 튜브에서 빠른 원심분리를 통해 총 세포 수와 동일한 수의 Treg 억제 검사 비드를 펠렛화합니다. 비드를 RPMI로 한 번 세척하고 원심분리 후 다시 펠렛화하십시오.

RPMI를 흡입하여 제거하고, 96-웰 라운드 바텀 조직 배양 플레이트의 웰당 8 µL의 억제 분석 배지를 사용하여 적절한 농도로 재부유시킵니다. CFSE 염색된 표적 세포 8 µL를 추가합니다. 비드와 분리 정제된 편향 세포를 확인하여 신선한 억제 분석 용액의 최종 부피를 맞춥니다.

200 µL의 배지. 모든 조건은 3반복으로 플레이팅합니다. 대조군을 준비하려면 suppressor assay 배지 92 µL에 CFSE 염색 세포 100 µL, inspector beads 8 µL, 그리고 염색되지 않은 신선한 세포 1 × 10⁵개를 첨가합니다.

처음 두 개의 대조군 웰에 웰당 배지를 넣습니다. 그런 다음 92 µL의 억제제 분석 배지가 담긴 웰에 CFSE 염색 세포 100 µL와 염색되지 않은 신선한 세포 1×10⁵개를 추가합니다. 나머지 두 개의 대조군 웰에도 웰당 배지를 넣습니다.

플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 암조건의 인큐베이터에 5일 동안 보관하십시오. 피펫팅을 통해 각 웰에서 세포를 수집하여 5 mL 라운드 바텀 폴리스티렌 튜브에 넣으십시오. 4 °C에서 500 ×g로 5분 동안 세포를 원심분리하십시오.

배지를 흡입하여 제거하고 300 µL의 차가운 Fox washing buffer로 세포를 재부유합니다. 유도된 조절 T 세포 분화 과정을 모니터링하기 위해, 정제된 인간 일차 CD4+ CD25- T 세포를 iTreg 배지에서 배양하였습니다. 0, 1, 3, 5일차에 채취한 시료를 유세포 분석기로 분석하여 CD45RA, FoxP3, CTLA4 및 CD25 마커의 발현을 평가했습니다. 이 유사색 점 도표(pseudocolor dot plots)에서 볼 수 있듯이, 5일의 기간 동안 세포는 TGF-β와 IL-2가 존재하는 환경에서 CD3 교차결합에 반응하여 체외에서 증식하고 분화하며, 최종적으로 CD45RA- FoxP3high CTLA4high CD25high 프로파일을 나타냅니다. 이는 일반 T 세포 전구체로부터 유도 조절 T 세포(iTreg)가 발달했음을 나타냅니다. 생성된 iTreg의 T 세포 증식 억제 능력을 상대적으로 평가하기 위해,

이 히스토그램에서 볼 수 있듯이, CFSE가 표지된 세포를 분류된 naive memory 및 iTreg 세포와 함께 treg suppression inspector beads와 함께 배양하였습니다. CD25 high, CD45RA negative, CD127 negative인 저분화 유도 조절 T 세포는 5일간의 배양 후 조절 억제 능력을 획득한 유일한 하위 집합입니다.

이는 이 시스템에서 생성된 세포가 일시적으로 FOX P3와 CD25를 발현할 수 있지만 면역 억제 기능은 없는 활성화된 일반 T 세포가 아니라, 표현형과 기능 모두 억제성 조절 T 세포임을 나타냅니다. 유도된 조절 T 세포의 존재는 CD4 양성 T 세포의 증식을 완전히 억제합니다. 수치는 CFSE 표지 세포 중 분열이 일어난 세포의 백분율을 나타내며, 이는 T 세포 정제 하위 집합에서도 동일하게 적용됨을 확인하기 위한 것입니다.

인간 일차 나이브 T세포와 메모리 T세포를 CFSE로 염색한 후 Treg 배지에서 배양하였습니다. 5일 후, 세포의 표현형을 분석하고 세포 분열 속도를 추정하였습니다. 여기서는 나이브 T세포 풀과 메모리 T세포 풀로부터 5일간의 배양을 통해 Treg을 유도하였습니다.

표준 IT reg 배지에서 CFSE 염색을 실시한 초기 세포의 결과는 나이브(naive) T 세포와 메모리(memory) T 세포 모두 여러 번의 세포 분열을 거친 후에만 조절 T 세포로 분화함을 보여줍니다. CFSE 염색 프로파일을 비교해 보면, 5일간의 배양 기간 동안 유도된 조절 T 세포가 가장 활발하게 증식하는 세포임을 확인할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 단일 공여자로부터 얻은 나이브, 메모리 또는 전체 T 세포 집단으로부터 유도된 TX를 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 본 절차를 수행할 때 이를 참고하시기 바랍니다.

전 과정에서 무균 상태를 유지하고, 본 절차를 수행하는 동안 CFSE가 빛에 노출되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 방법이 개발된 이후, 조절 T 세포와 일반 T 세포 간의 세포 분열 속도, 특정 사이토카인 합성 및 이온 채널 이용의 차이와 같은 다른 의문점들을 해결하기 위해 기능 분석법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 면역학 분야의 연구자들이 인체 환자의 자가면역 질환 및 기타 treg 관련 병리 현상을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

인혈을 다루는 작업은 매우 위험하므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 적절한 혈액 은행 검사와 올바른 폐기 처리와 같은 예방 조치를 항상 준수해야 함을 잊지 마십시오.