염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)과 염색질의 상호 작용 분석

파우더 및 태그 염기서열분석을 이용한 COMIN 상호작용 분석은 유전체 와이드 코민 장거리 코민 상호작용 분석을 위한 방법입니다. 요컨대, 우리는 이것을 매직 쉐어 패드라고 부릅니다. 이 방법은 많은 분자 생물학 단계를 포함하며 복잡할 수 있습니다.

따라서 다음 비디오 테이프에서는 com, 면역 면역 침전 및 의자의 라이브러리 건설과 관련된 몇 가지 주요 단계를 보여 드리겠습니다. 칩으로 알려진 PET 분석 염색질 면역침전은 의자 애완 동물 라이브러리를 구성하는 첫 번째 중요한 단계입니다. 여기서, 세포 배양에서 추출한 염색질 샘플은 가교 결합되어 초음파 처리되고 면역 침전됩니다.

그런 다음 칩 DNA의 별도 분취액을 바코드가 부착된 하프 링커에 연결하고 근접 결찰을 수행합니다. 애완 동물은 제한 소화에 의해 방출되고, 코팅된 마그네틱 비드에서 정제되고, 차세대 염기서열분석을 위해 어댑터에 리게이트됩니다. 키메라 의자 애완 동물은 AB 링커 구성 및 태그 플랭크를 통해 식별됩니다.

중앙 링커 염기서열(central linker sequence)을 판독하여 게놈에 매핑합니다. 이 비디오에서는 실험실에서 황동 암 세포주 MCF 7에 대해 일상적으로 사용되는 표준 칩 프로토콜을 보여줄 것입니다.우리의 데이터에서 특정 항체로 더 높은 칩 농축을 통해 더 나은 의자 애완 동물 데이터를 얻을 수 있습니다. 따라서 칩 프로토콜의 최적화와 QPCR에 의한 강화 검증을 강력히 권장합니다.

PET Library Construction CF의 의장으로 진행하기 전에, 약 2,000만 개의 세포가 포함된 500cm 정사각형 조직 배양 접시에서 7개의 세포를 약 75% co-fluency로 배양한 후 가교를 합니다. 성장 배지를 버리고 세포를 두 번 세척하십시오. 따뜻한 PBS로 갓 준비한 1.5 밀리몰 EGS로 세포를 실온에서 45분 동안 고정하고 37% 포름알데히드를 최종 농도 1%로 만들고 20분 동안 배양합니다.

가교 효율은 매우 중요하며 세포주와 관심 단백질에 따라 다릅니다. 가교 결합, 농도, 배양 시간 및 온도를 최적화해야 합니다. 최종 농도 200 millimolar glycine으로 크로스 링커를 10분 동안 담금질합니다.

담금질된 크로스 링커를 폐기하고 냉장 탁상용 원심분리기로 팔레트 셀을 긁어내어 차가운 PBS 호버 셀로 두 번 세척하면 팔레트가 이제 세포 용해 준비가 된 것입니다. 또는 섭씨 영하 80도에서 미각을 동결합니다. 세포 구개(cell palate)가 얼어붙은 경우, 0.1%SDS 용해 완충액(lysis Buffer)으로 세포 용해 재입천장을 진행하기 전에 얼음에서 해동합니다.

냉장 원심분리기로 튜브를 섭씨 4도에서 회전시키고 상층액을 버리고 세포 용해를 반복합니다. 일단 핵 용해가 수행되어 염색질 단편화 전에 가교 염색질을 방출합니다. 핵막이 없기 때문에 가교 염색질이 더 부드러운 조건에서 초음파 처리 될 수 있습니다.

1%SDS 용해 버퍼의 Reus Band 핵 팔레트. 서스펜션을 고속 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 섭씨 4도로 회전시킵니다.

원심분리를 통해 핵 파편을 제거합니다. 색채 팔레트는 다음과 같아야 합니다. P 1000 파이퍼 팁을 사용하여 팔레트를 여러 조각으로 나누고 0.1% SDS 용해 버퍼로 두 번 세척합니다.

냉장 원심분리기로 튜브를 섭씨 4도 입천장으로 회전시킵니다. 핵구개는 이제 초음파 처리 준비가 되었습니다. 또는 섭씨 영하 80도에서 미각을 동결합니다.

입천장을 투명한 튜브로 옮기기 0.1%SDS 용해를 추가하고 입천장에 완충하며 모든 거품을 제거합니다. 과열을 방지하기 위해 초음파 처리 내내 샘플을 차갑게 유지하십시오. 버퍼 부피, 프로브 깊이, 초음파 처리 강도, 사이클 수 및 가교 정도와 같은 다양한 조건은 초음파 처리 효율에 영향을 미칠 수 있습니다.

proteinase K를 사용하여 염색질의 가교 결합 및 부분 표본을 역시키고 aros gel을 실행합니다. 단편화 효율을 검증하려면 200에서 600 사이의 원하는 DNA 크기 범위를 얻기 위해 최적화하는 것이 좋습니다. 염기쌍은 원심분리로 세포 dri를 제거합니다.

이제 염색질은 마그네틱 비드로 미리 투명화할 준비가 되었습니다. 또는 충분한 염색질이 수집될 때까지 섭씨 영하 80도에서 정지합니다. 칩을 시작하려면 비드 세척 버퍼로 비드를 세 번 세척하고 자성 단백질 비드를 포함하는 이번 세척과 향후 세척은 다음 단계로 구성됩니다.

미리 세척된 비드에 초음파 처리된 염색질을 추가하고 별도의 튜브에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 미리 세척된 비드에 항체를 코팅하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 항체 코팅된 비드를 비드 세척 버퍼로 두 번 세척합니다.

근접 결찰을 위한 기질의 높은 복잡성은 필연적으로 상당한 비특이적 노이즈를 유발하여 염기서열분석 비용을 증가시킵니다. 복잡성과 배경 소음의 수준을 줄이는 것 외에도. 우리는 전사 조절과 관련된 염색질 상호 작용을 식별하기 위해 마우스 RNA 중합효소 2 단클론 항체를 사용했습니다.

이를 통해 활성 프로모터와 해당 조절 영역을 조사할 수 있으며, 이를 통해 효율적이고 협력적인 전사를 이해할 수 있습니다. 사전 세척된 염색질과 항체 코팅된 비드가 결합된 항체 코팅 비드에서 세척 버퍼를 버리고 하룻밤 배양 후 섭씨 4도에서 밤새 배양한 후, TE 버퍼 분취액에서 결합되지 않은 염색질 모래 비드를 제거하기 위해 비드를 일련의 세척 과정을 거칩니다. 패드 및 태그 염기서열분석을 사용한 정량적 및 농축 검사 염색질 상호작용 분석을 위한 소량은 상호 작용하는 고차 염색질 구조의 대규모 de novo 분석을 위해 개발된 기술입니다.

염색질 면역침전(chromatin immunopreciteation)에 의해 농축된 DNA 단편은 근접 결찰(proximity ligation)에 의해 포착됩니다. 패드 및 태그 전략은 CHI PET 라이브러리의 구축에 적용되며, 이는 고처리량 차세대 염기서열분석 기술에 의해 염기서열분석됩니다. 이 비디오에서는 CHI PET 라이브러리 구축의 중요한 실험 측면을 보여줍니다.

라이브러리 구성의 전반부는 DNA 단편이 결합되어 있는 단백질 A 또는 G 비트를 조작하여 효소와 완충 염을 제거하는 것입니다. 각 효소 반응 후에는 각 세척 단계에 대해 부드러운 원심분리와 플릭 동작을 사용하십시오. 자성 입자에 놓았을 때 비드의 포획을 최대화하기 위해 상층액을 여러 번 피펫팅합니다.

반응 혼합물에 비드를 포함하는 모든 배양 단계를 위한 농축기. 사전에 마스터 믹스를 준비하고 비드가 균질하게 재현탁된 후 마지막으로 효소를 첨가하십시오.전체 배양 동안 비드가 잘 혼합되었는지 확인하십시오. Half linker oligo nucleotide는 4개의 뉴클레오티드로 구성된 내부 바코드와 type 2 S 제한 효소 MME one에 대한 인식 부위로 설계되었습니다.

하프 링커를 C 크로매틱 복합체의 테더링된 DNA 단편에 연결시킨 후, 상호 작용하는 DNA 단편은 완전한 링커 서열에 의해 연결됩니다. 이러한 하프 링커는 비특이적 결찰 산물에서 파생된 이종이량체 ab 링커로 서열을 생성하거나 특정 결찰 산물에서 파생된 호모다이머, AA 또는 BB 링커가 있는 서열을 생성합니다. 따라서 뉴클레오티드 바코드가 다른 두 개의 하프 링커를 사용하면 서로 다른 실험 또는 복제의 사양을 지정할 수 있을 뿐만 아니라 서로 다른 칩 복합체 간의 비특이적 키메라 결찰 속도를 모니터링할 수 있습니다.

얼음 위에서 반응을 설정하는 것이 중요합니다 그리고 얼음 위에서 하프 링커를 부드럽게 해동합니다. 하프 링커를 물과 잘 결합한 다음 리가제 완충액이 포함된 PEG와 잘 결합합니다. 재사용하기 전에 마스터 믹스가 잘 혼합되었는지 확인하십시오.

칩 DNA를 중단하고, 하프 링커와 칩 DNA 단편이 잘 혼합된 후에만 T 4개의 DNA 리가제를 추가하고, 하프 링커의 연결을 방지하기 위해 튜브를 퍼퓸으로 밀봉하고, 회전과 함께 섭씨 16도에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 온전한 크로마틴 복합체를 용리된 DNA에 완충액 EB에서 SDS를 첨가하여 비드를 암시하여 Triton X 100에서 SDS 농도를 낮추고 염색질 복합체의 모든 SDS 순환화를 소멸시키며, 두 개의 하프 링커의 접합에 의해 촉진되어 상호 작용 접합에서 완전한 링커 서열을 생성합니다. 용출된 염색체 복합체가 반응 혼합물에서 잘 희석된 후에만 T 4 DNA 리가제에서 서로 다른 DNA 단백질 복합체 간의 결찰을 최소화하기 위해 극도로 희석된 조건에서 염색질 복합체를 용리합니다 역 가교 후 DNA 관련 단백질을 제거하려면 페닐 클로로포름 추출을 사용하여 원형화된 DNA 단편을 정제하고 KaiGen 위상 잠금 겔 시스템을 사용하여 쉽게 분리할 수 있습니다.

페닐 추출 후 글리코 블루 A DNA 운반체를 사용하여 입천장의 질량과 가시성을 높입니다. 하프 링커 올리고 뉴클레오티드는 측면 MM E one 인식 부위를 포함합니다. MM E one A Type two S 제한 효소는 타겟 결합 부위의 하류에서 18 및 20 염기쌍을 절단하여 염색질 단편의 짧은 태그를 생성하여 PET 태그 링커 태그 구조를 생성하며 pet로 약칭됩니다.

또한 각 하프 링커는 비오틴으로 변형되어 스트렙타비딘 코팅된 마그네틱 비드로 PET 구조체를 정제할 수 있습니다. MME one digestion을 수행하여 태그 Linker 구조를 해제합니다. 끈으로 묶인 Aden 비드에 선택적으로 결합하여 반려동물을 정제하고, 고처리량 염기서열분석을 위해 반려동물 구조물을 어댑터로 접합합니다.

융합 DNA 중합효소를 사용하여 CHI PET Library Fusion을 증폭할 수 있습니다. DNA 중합효소는 높은 정확도와 효율성으로 템플릿을 생성하는 데 사용됩니다. PCR 반응을 차갑게 설정하고 융합 DNA 중합효소를 마지막에 추가합니다.

효소는 DN Tps가 없을 때 프라이머를 분해할 수 있는 5개의 프라임 엑소뉴클레아제 활성을 나타내기 때문입니다. 의자 애완 동물 라이브러리가 성공적으로 구성되면 약 223개의 염기쌍으로 구성된 두드러지고 잘 정의된 밴드가 있어야 합니다. 겔에서 223 염기쌍 밴드를 절제할 때 비특이적 밴드를 피하고 Gel Crush 프로토콜을 사용하여 절제된 밴드를 정제합니다.

고처리량 염기서열분석 전에 DNA 1000 키트와 함께 Agilent 2, 100 bioanalyzer를 사용하여 품질 검사를 수행합니다. 우리는 게놈 전체 염색질 상호 작용의 편향되지 않은 검출을 위한 CHI PET 절차를 시연했습니다. CHI PET 데이터의 품질은 사용된 칩 항체의 효과와 염기서열분석 깊이에 따라 달라집니다.

여기서는 상호 작용 매핑을 위해 1,800만에서 2,000만 개의 읽기를 사용합니다. 이 특정 프로토콜은 인간 게놈에서 에스트로겐 수용체와 RNA 중합효소에 의해 결합된 염색질 상호 작용 네트워크를 성공적으로 특성화하는 데 사용되었습니다. 우리는 이 분석법이 전체 게놈 맥락에서 전사 생물학의 3차원 구조 이후 향후 연구를 위한 강력한 도구가 될 것으로 예상합니다.

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