Name: 염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)과 염색질의 상호 작용 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: 학습하세요 ChIA-PET 기법을 통해 염색질 상호작용을 분석하고 전사 규제 메커니즘을 규명하는 방법을. 이 프로토콜은 차세대 염기서열분석을 활용하여 유전자 발현의 복잡한 조절 네트워크를 이해하는 데 필수적인 도구입니다.

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저자는 싱가포르의 * 스타에 의해 지원됩니다. 또한, MJF는 과학 국립 원정대와 리 Kuan 흔히 묘지에 심는 상록수 포스트 박사 원정대의 여성에 대한 * STAR 국가 과학 장학금, 로레알에 의해 지원됩니다. YR은 NIH 인코딩 기금 (R01 HG004456-01와 R01 HG003521-01)에 의해 지원됩니다. 저자는 또한 비디오 편집 및 대한 부인 미셸 테오에 대한 양 Siti 라힘, 장면 촬영을 위해 특정 켈빈 씨 Issey 씨가 장 카이 시앙 씨는 Sherwin Gan 8 픽셀 프로덕션, 싱가포르의 videography 팀을 인정 성우.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

ChIA-PET는 전사 조절에 장기적인 상호 작용을 파악하기 위해 개발된 방법입니다. ChIA-PET 라이브러리의 품질을 결정하는 중요한 요인 중 하나는 칩 재료의 품질입니다. 동영상에 표시된 프로토콜은 세포를 상호 연결 EGS와 포름 알데히드의 사용을 포함합니다. 긴 스페이서 팔을 베어링 두 번째 가교 시약과 함께 포름 알데히드의 사용은 혼자 3,11,15 포름 알데히드에 의해 구속 수없는 단백질의 바인딩에 도움이 될 수 있습니다. 우리는 강력한 구속력 사이트와 원거리 상호 작용 9를 증명하고있다이 방법으로 도서관을 건립했습니다. 그러나, 교차 연결 및 칩 조건 관심의 각 요소에 최적화된되어야하고, 가교 너무 많이는 sonication하여 조각의 어려움을 초래하므로 그렇지 과잉 crosslink 중요하게, 그리고 아마도 가짜 염색질 상호 작용을 초래할 수 . 염색질 상호 작용ChIA-PET으로 식별이 같은 형광에 원위치 하이브리드화 4와 같은 다른 방법에 의해 검증되어야한다. 우리는 염색질 소재의 100 NG의 최소 권장합니다. 우리는 염색질 소재의 50 NG에서 양질의 라이브러리를 구축했지만, 우리는 시작 물질의 다량이 허용하는 나쁜 자들이 미만 16 PCR주기,이를 최소화 amplicons과 각 도서관의 중복과 ChIA-PET 라이브러리의 건설. 이것은 낮은 중복되므로 시퀀싱의 적은 차선과보다 포괄적인 염색질 상호 작용지도를함으로써, 높은 고유의 매핑 태그와도 사용할 데이터의 높은 비율로 상호. 각 튜브에있는 구슬의 최종 포장 부피는 각각 자석과 세파 로스 구슬 50 μl, 100 μl 있어야합니다. 포장 비드 볼륨이 명시된보다 작으면 DNA 베어링 구슬의 손실을 최소화하기 위해 유사하게 사전 허가 빈 자성이나 세파 로스 구슬과 최소 포장 볼륨 가져후속 단계들. 잘라 버렸군 오프 팁 또는 대형 코어 팁은 세파 로스 구슬을 pipetting 동안 사용해야합니다. 다음과 같은 수정은 이전에 다음 ID로 출판 ChIA-PET 프로토콜 다섯 따라 통합되었다. 첫째, 자기 G 비즈는 세차장 중에 샘플의 손실을 최소화하기 위해 사용되었습니다. 또한, 우리는 스스로 출혈도 잡았 반 linkers 또는 / 및 어댑터의 amplicons로 100 BP 138 BP의 대략적인 크기가 아닌 특정 밴드를 발견. 따라서, 우리는 PCR 증폭하는 동안이 아닌 특정 대역을 최소화하기 위해 biotinylated 반 linkers 및 454 GS20 어댑터의 농도를 감소. 근접 내고 볼륨은 이후 정제 단계 중에 샘플의 손실을 최소화하고 또한 시약 비용을 절감 50 ML에서 10 ML로 축소되었다. 우리는 또한 streptavidin 비즈에서 ChIA - 애완 동물의 DNA 최대한의 캡처를 보장하기 위해 구슬로 ChIA-PET DNA를 고정하기 위해 배양 시간이 증가하였습니다. 근접 내고 단계 동안, 키메라 ligations THAt는 필연적 아닌 구체적이고 랜덤 방식으로 생성되는 생체내 염색질의 상호 작용에 진실을 대표하지 않습니다. 따라서, 어떤 ChIA-PET 실험에서 데이터의 품질을 평가하기 위해 chimerism의 비율은 특정 염기 바코드 TAAG 및 ATGT 5 두 개의 다른 반 linkers의 사용으로 추정된다. 높은 처리량 시퀀싱 후 ChIA-PET 시퀀스가 먼저 8을 구분할 수 특정 내고 제품 및 불특정 내고 제품에서 파생된 링커 바코드 조성과 시퀀스에 대해 분석하고 있습니다. 알려진 chimeras의 비율 (즉, heterodimers 순이 linkers)는 우리 내부에 MCF-7 RNA 중합 효소 II의 ChIA-PET 라이브러리 미만 15 % 제시. ChIA-PET 시퀀스가​​ 연속적으로, 즉 두 종류, 자기 내고 애완 동물과 인터 내고 애완 동물로 분류됩니다. 상호 내고 애완 동물이 전에서 파생되는 동안 셀프 내고 애완 동물은 염색질 조각 자체 circularization의 결합에서 얻은됩니다서로 다른 두 가지의 DNA 조각 사이 nter-내고 있습니다. 후자 그러면 동일한 염색체 (intrachromosomal 상호 내고 애완 동물)에 또는 둘 다 태그가 두 개의 다른 염색체 (interchromosomal 상호 내고 애완 동물)에 매핑됩니다 각 태그의 게놈 거리에 따라 세 가지 범주로 하위 나눈 값입니다. 우리는 서로 다른 범주에게 8 해결할 ChIA-PET 도구 소프트웨어 패키지를 개발했습니다. 이것은 라이브러리에있는 DNA 조각을 기준으로합니다. 일반적으로, 작은 칩 조각은 높은 해상도를 제공하고 4킬로바이트에 관한 이러한 RNA 중합 효소 II의 ChIA-PET 라이브러리에 대해 차단됩니다. 또한, 실제 염색질 상호 작용은 상호 작용 클러스터에서 상호 결합 애완 동물의 수를 세어 랜덤 노이즈로부터 구별할 수 있으며, 즉, 높은 PET 개수의 클러스터가 실제 염색질 상호 작용 8이라는 높은 확률을 가지고 있다고합니다 . 우리의 잘못된 반응을 필터링하려면무작위로 우연히 간 내고 애완 동물을 형성할 수 매우 풍부 앵커에서 상승, 통계 분석 프레임 워크는 또한 두 앵커 8 사이의 상호 결합 애완 동물을 무작위로 형성 용도에 대한 상세한 설명이 공식화되었습니다. 결론적으로 ChIA-PET 기술은 세계적인 규모 염색질 상호 작용 네트워크를 매핑 수 있습니다. ChIA-PET의 칩 구현은 도서관 복잡 배경 잡음의 감소 수 있습니다. 또한,이 칩은 특정 전사 인자 5과 관련된 구체적인 염색질 상호 작용 시험있게 염색질 상호 작용에 특이성을 추가합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 4~20% 구배 TBE 겔 </td><td> Invitrogen </td><td> EC6225BOX </td><td> B, 6.3 단계 </td></tr><tr><td> PEG 5 X T4의 DNA Ligase 버퍼 </td><td> Invitrogen </td><td> 46300018 </td><td> b 단계, 2.2 </td></tr><tr><td> 6% TBE 겔 </td><td> Invitrogen </td><td> EC6263BOX </td><td> B, 6.8 단계 </td></tr><tr><td> 애질런트 DNA 분석 100 </td><td> 애질런트 테크놀로지 </td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3"> b 단계, 7.1 </td></tr><tr><td> 애질런트 고감도의 DNA 분석 </td><td> 애질런트 테크놀로지 </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> 애질런트 Bioanalyzer 2100 </td><td> 애질런트 테크놀로지 </td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> (스핀-X) 튜브 필터 원심 분리기 </td><td> 코닝 &lt;/ TD&gt; <td> CLS8160 </td><td> 단계 B, 3.7 및 6.9 </td></tr><tr><td> 다크 리더 Transilluminator </td><td> 클레어 화학 연구 </td><td> DR46B </td><td> B, 6.8 단계 </td></tr><tr><td> 디지털 Sonifier 세포 장애 </td><td> 브랜 </td><td> 450D-0101063591 </td><td> , 4.3 단계 </td></tr><tr><td> DynaMag-2 자석 (마그네틱 입자 농축기) </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td> 단계를 닦고 모든 자석 구슬을 위해,, 7.6.1 단계 B를 단계 </td></tr><tr><td> DynaMag-15 자석 (마그네틱 입자 농축기) </td><td> Invitrogen </td><td> 123.01D </td><td> , 5, 6 단계 </td></tr><tr><td> DynaMag-PCR (마그네틱 입자 농축기) </td><td> Invitrogen </td><td> 49-2025 </td><td> B, 6.5 단계 </td></tr><tr><td> 대장균의 DNA의 중합 효소 I </td><td> 코 </td><td> M0209 </td><td> B, 5.6 단계 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion </td><td> AM9516 </TD&gt; <td> , 7.6.1 단계 B, 4.3 및 6.5 단계 </td></tr><tr><td> Illumina cBot 클러스터 발전 시스템 </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td> 단계 B, 7.4 </td></tr><tr><td> Illumina 게놈 분석기 IIx </td><td> Illumina </td><td> SY-301-1301 </td><td> 단계 B, 7.5 </td></tr><tr><td> Illumina PE primers </td><td> Illumina </td><td> PE-102-1004 </td><td> 단계 B, 5.4 (필요한 경우) </td></tr><tr><td> Intelli-믹서 </td><td> Palico 생명 공학 </td><td> RM-2L </td><td> , 회전 어떤 incubations를 B 단계 </td></tr><tr><td> LightCycler 480 리얼 타임 PCR 시스템 </td><td> 로슈 </td><td> 04 640 268 001 </td><td> , 7.5.3 b 단계, 7.3 단계 </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNA SYBR 녹색 나는 MasterMix </td><td> 로슈 </td><td> 03 752 186 001 </td><td> 단계 B, 7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280 Streptavidin Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 11206D </td><td> B, 5.2 단계 </td></tr> &lt;TR&gt; <td> 마그네틱 (Dynabeads) 단백질 G </td><td> Invitrogen </td><td> 100.03D </td><td> , 5.1.1 및 5.2.1 단계 </td></tr><tr><td> 고밀도 (2ml)을 MaXtract </td><td> Qiagen </td><td> 129,056 </td><td> , 7.6.1 단계 </td></tr><tr><td> 고밀도 (50ml)을 MaXtract </td><td> Qiagen </td><td> 129,073 </td><td> 단계 B, 4.2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> 코 </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td> RNase 한 Ribonuclease </td><td> Promega </td><td> M426C </td><td> 단계 B, 4.8 </td></tr><tr><td> RNA 중합 효소 II (8WG16) 단클론 항체 </td><td> Covance </td><td> MMS-126R </td><td> , 5.2.4 단계 </td></tr><tr><td> 오크 릿지의 원심 분리기 튜브 (폴리 프로필렌) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td> , 3.1 단계 </td></tr><tr><td> 오크 릿지의 원심 분리기 튜브 (테플론 FEP) </td><td> Nalgene </td><td> 3114-0050 </td><td> 단계 B, 4.3 </td></tr><tr><td> Phus이온 하이 피델리티 마스터 믹스 </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> B, 6 단계 </td></tr><tr><td> Picogreen (양의-IT) dsDNA 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> P11495 </td><td> , 7.5.2 단계 </td></tr><tr><td> 폴리스티렌 라운드 히프 테스트 튜브 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352,057 </td><td> , 4.1 단계 </td></tr><tr><td> 테아제 억제제 칵테일 알약 (완료, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료) </td><td> 로슈 </td><td> 11873580001 </td><td> 1.6 이후 단계 </td></tr><tr><td> Proteinase K 솔루션 (20mg/ml) </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> 7.6.1, 4.4 단계 b 단계, 4.1 </td></tr><tr><td> T4의 DNA Ligase </td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td> 단계 B, 2.2, 3.9 및 5.4 </td></tr><tr><td> T4 DNA Ligase 버퍼 (코) </td><td> 코 </td><td> B0202S </td><td> b 단계, 3.3 및 3.9 </td></tr><tr><td> T4의 DNA 중합 효소 </td><td> Promega </td><td> M4215 </td><td>b 단계, 1.2 </td></tr><tr><td> T4의 DNA 폴리 뉴클레오 타이드의 키나제 </td><td> 코 </td><td> M0201 </td><td> B, 3.3 단계 </td></tr><tr><td> TruSeq SBS 키트 V5-GA </td><td> Illumina </td><td> FC-104-5001 </td><td> Illumina 게놈 분석기 IIx 시스템 Regents </td></tr><tr><td> TruSeq PE 클러스터 키트 V2-cBot-GA </td><td> Illumina </td><td> PE-300-2001 </td><td> Illumina cBot 클러스터 발전 시스템과 함께 사용 될 </td></tr><tr><td> SYBR 녹색 전 </td><td> Invitrogen </td><td> S-7585 </td><td> b 단계, 6.3 및 6.8 </td></tr><tr><td> XCell SureLock 미니 셀 전기 영동 시스템 </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td> b 단계, 6.3 및 6.8 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td colspan="2"> 순서 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinylated 반 linkers (200ng/μl) </td><td> 상단 </td><td> 5 &#39;GG CCG CGA / iBiodT / ATC TTA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole 규모의 HPLC 정화 내부 비오틴 DT (9) </td></tr><tr><td> 봇 </td><td> 5 &#39;GTT GGA TAA GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole 스케일 HPLC 정화 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinylated 반 linkers B (200ng/μl) </td><td> 상단 </td><td> 5 &#39;GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole 규모의 HPLC 정화 내부 비오틴 DT (9) </td></tr><tr><td> 봇 </td><td> 5 &#39;GTT GGA ATG 두드리는 ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole 스케일 HPLC 정화 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 비 biotinylated 반 linkers (200ng/μl) </td><td> 상단 </td><td> 5 &#39;GGC CGC GAT GGA TCC ATC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole 규모 PCR 학년 </td></tr><tr><td> 봇 </td><td> 5 &#39;GTT GGA TCC GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole 규모 PCR 학년 </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 아답터 (200ng/μl) </td><td> 상단 </td><td> 5 &#39;CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCC CATCTG TTC CCT CCC TGT CTC AGN N 3 &#39; </td><td> 250 nmole 규모 PCR 학년 </td></tr><tr><td> 봇 </td><td> 5&#39;CTG AGA 배속 GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG 배속 GGA TGA GAT GG 3 &#39; </td><td> 250 nmole 규모 PCR 학년 </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 아답터 B (200ng/μl) </td><td> 상단 </td><td> 5 &#39;CTG AGA CAC GCA ACA GGG GAT AGG CAA GGC ACA 배속 GGG ATA GG 3&#39; </td><td> 250 nmole 규모 PCR 학년 </td></tr><tr><td> 봇 </td><td> 5 &#39;CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AGN N 3&#39; </td><td> 250 nmole 규모 PCR 학년 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Illumina-NN 어댑터 </td><td> 상단 </td><td> 5 &#39;ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC 3&#39; </td><td> 250 nmole 규모 HPLC 정화는 단계 B, 5.4 참조 </td></tr><tr><td> 봇 </td><td> 5 &#39;phos - GAT CGG AAG AGC GGT GCA TCA GGA ATG CCG AG 3&#39; </td><td> 250 nmole 규모 HPLC 정제는 5 &#39;최종 단계 B가 5.4 참조 Phosphorylated </td></tr><tr><td> Illumina 1-454 (전진) 프라이머 (10 μm의) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC 개그 ATC 전술 ACC CTA TCC CCT TGC GTG CTT G 3&#39; </td><td> 250 nmole 규모 PCR 학년 </td></tr><tr><td> Illumina 2-454 (리버스) 프라이머 (10 μm의) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCC ATC TCA TCC CTG C​​GT GTC 3&#39; </td><td> 250 nmole 규모 PCR 학년 </td></tr><tr><td> qPCR의 프라이머 1.1 (10 μm의) </td><td colspan="2"> 5 &#39;3 시요 AAT GAT ACG GCG ACC ACC 개그&#39; </td><td> 10nmole 규모 PCR 학년 </td></tr><tr><td> qPCR의 프라이머 2.1 (10 μm의) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA 3&#39; </td><td> 10nmole 규모 PCR 학년 </td></tr><tr><td> Illumina 3-454 시퀀싱 프라이머 (100 μm의) </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TCC CAT CTG TTC CCT CCC TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole 스케일 HPLC 정화 </td></tr><tr><td> Illumina 4-454 시퀀싱 프라이머 (100 μm의) </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole 규모HPLC 정화 </td></tr></tbody></table> 통합의 DNA 기술 (IDT)와 같은 방식으로 linkers 및 어댑터를 준비부터 oligos 및 어댑터의 테이블. 주문 oligos 이전에 10 설명했다. 하프 linkers 및 어댑터는 -20 ° C.에서 몇 달 동안 미리 준비하고 저장될 수 있습니다

염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (chia-pet)과 염색질의 상호 작용 분석

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes은 마이크론 크기의 핵 대 7 내부의 고차원 conformations, 2, 12, 도입, 3 차원 구조로 구성됩니다. 이러한 아키텍처는 무작위 아닌 유전자 발기인 및 규제 요소 13 사이의 상호 작용을 포함. 구체적인 규제 시퀀스에 전사 요소의 바인딩은 전송 규제와 조정 1, 14 네트워크에 대해 제공합니다. 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)에 의한 염색질 상호 작용 분석은 이러한 고차원 염색질 구조에게 5,6를 식별할 수 있도록 개발되었습니다. 세포 고정하고 상호 작용하는 loci는 공유 결합의 DNA-단백질 상호 링크에 의해 점령된다. 불특정 노이즈를 최소화하고 복잡성을 줄일뿐만 아니라, 염색질 상호 작용 분석의 특이성을 높이기 위해 위해 염색질 immunoprecipitation (칩)은 근접 내고 전에 관심 염색질 조각을 풍부하게하기 위해 특정 단백질 요인에 대해 사용됩니다. 하프 linkers 관련된 내고 그 후 개별적인 염색질의 단지 내에 함께 곁에의 DNA 조각의 쌍 사이에 공유 결합 링크를 형성하고 있습니다. 하프 linkers의 측면 Mm​​eI 제한 효소 사이트는 MmeI는 소화시 이점 끝 태그 - 링커 - 태그 구조 (애완 동물)의 추출이 가능하다는 특징을 가지고있다. 하프 linkers는 biotinylated하므로 이러한 PET 구조는 streptavidin-자석 구슬을 사용하여 정화하고 있습니다. 정화 애완 동물 차세대 시퀀싱 어댑터와 상호 작용하는 조각의 카탈로그 같은 Illumina 게놈 분석기와 같은 차세대 sequencers 통해 생성된과 출혈도 잡았있다. 매핑 및 생물 정보학 분석은 다음 여덟 사이트 칩 농축 바인딩 및 칩 농축 염색질 상호 작용을 파악하기 위해 수행됩니다. 우리는 칩의 품질 ChIA-PET 라이브러리의 결과에 중요한 역할을 담당로서 특히 ChIA-PET 프로토콜, 칩의 준비의 중요한 측면을 설명하는 동영상을 제작했습니다. 프로토콜은 것처럼오래만이 중요한 단계는 비디오에 표시됩니다.

이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)에 의한 염색질 상호 작용 분석을위한 방법입니다<em&gt; 드 노보</emtranscriptional 제어의 이해를위한 염색질의 상호 작용&gt; 감지,.

염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)과 염색질의 상호 작용 분석

게놈은 3차원 구조로 조직되어 있으며, 마이크론 크기의 핵 공간 내부에서 고차 구조를 형성합니다 7, 2, 12. 이러한 ...

분말 및 태그 시퀀싱을 이용한 COMIN 상호작용 분석은 게놈 전체의 COMIN 장거리 COMIN 상호작용을 분석하는 방법입니다. 간단히 말해, 우리는 이를 magic share pad라고 부릅니다. 이 방법은 많은 분자생물학적 단계가 포함되어 있어 복잡할 수 있습니다.따라서 이어지는 비디오에서는 염색질 면역침전(ChIP)과 ChAI-PET 분석을 위한 라이브러리 구축의 주요 단계를 보여드리겠습니다. ChIP로 알려진 염색질 면역침전은 ChAI-PET 라이브러리를 구축하는 첫 번째 중요한 단계입니다. 이 과정에서 세포 배양물로부터 얻은 염색질 샘플을 가교 결합시키고, 초음파 처리 및 면역침전시킵니다.그 후 칩 DNA의 개별 분주액을 바코드가 지정된 하프 링커(half linker)에 연결하고 근접 결합(proximity ligation)을 수행합니다. 제한 효소 소화를 통해 펫(Pets)을 분리하고, 코팅된 자성 비드로 정제한 뒤, 차세대 염기서열 분석(NGS)을 위한 어댑터에 연결합니다. 키메라 체어 펫(Chimeric chair pets)은 AB 링커 구성과 태그 플랭킹(tag flanking)을 통해 식별합니다.중앙 링커 서열을 읽어내어 게놈에 매핑합니다. 본 영상에서는 유방암 세포주 MCF7을 사용하여 저희 실험실에서 일상적으로 사용하는 표준 ChIP 프로토콜을 보여드리겠습니다. 저희 데이터에 따르면, 특정 항체를 통한 ChIP 농축도가 높을수록 더 나은 ChIP-seq 데이터를 얻을 수 있습니다. 따라서 ChIP 프로토콜의 최적화와 qPCR을 통한 농축 검증을 강력히 권장합니다.ChIP-seq 라이브러리 구축을 진행하기 전, 가교 결합 전 약 2,000만 개의 세포가 포함된 500 cm² 조직 배양 접시에서 CF7 세포를 약 75%의 밀도로 배양합니다. 성장 배지를 제거하고 따뜻한 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 실온의 로테이터에서 갓 제조한 1.5 mM EGS로 45분 동안 세포를 고정합니다. 최종 농도가 1%가 되도록 37% formaldehyde를 첨가하고 20분 동안 배양합니다.가교 효율은 매우 중요하며, 세포주와 대상 단백질에 따라 달라집니다. 가교제 농도, 배양 시간 및 온도를 최적화해야 합니다. 최종 농도가 200 millimolar인 glycine으로 10분 동안 가교제를 퀀칭하십시오.켄칭된 가교제를 제거하고 차가운 PBS로 2회 세척합니다. 냉장 벤치탑 원심분리기를 사용하여 펠렛 세포를 긁어내어 세포를 부유시킵니다. 이제 펠렛은 세포 용해를 위한 준비가 되었습니다. 또는 펠렛을 -80°C에서 냉동 보관하십시오. 세포 펠렛이 냉동된 경우, 세포 용해를 진행하기 전에 얼음 위에서 해동하십시오. 펠렛을 0.1% SDS 용해 버퍼로 재현탁합니다.냉장 원심분리기를 사용하여 4°C에서 튜브를 회전시킨 후, 상층액을 제거하고 세포 용해 과정을 반복합니다. 크로마틴 단편화 전에 가교된 크로마틴을 방출하기 위해 핵 용해를 수행합니다. 핵막이 없으면 가교된 크로마틴을 더 완화된 조건에서 초음파 처리할 수 있습니다.1% SDS 용해 버퍼(lysis Buffer) 내의 Reus Band 핵 펠릿(nuclear palette)을 재현탁합니다. 현탁액을 고속 원심분리 튜브로 옮깁니다. 4°C에서 튜브를 회전시킵니다.원심분리를 통해 핵 잔해물을 제거합니다. 크로마틴 펠렛은 다음과 같은 모습이어야 합니다. P 1000 피펫 팁을 사용하여 펠렛을 조각내어 분쇄하고 0.1% SDS 용해 버퍼(lysis Buffer)로 2회 세척합니다.냉장 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 튜브를 회전시킵니다. 이제 핵 펠렛을 초음파 처리할 준비가 되었습니다. 또는, -80 °C에서 펠렛을 동결시킵니다.펠릿을 투명 튜브로 옮깁니다. 펠릿에 0.1% SDS 용해 버퍼를 추가하고 모든 기포를 제거합니다. 과열을 방지하기 위해 초음파 처리 전 과정 동안 샘플을 차갑게 유지하십시오. 버퍼 부피, 프로브 깊이, 초음파 강도, 사이클 횟수 및 가교 정도와 같은 다양한 조건이 초음파 처리 효율에 영향을 미칠 수 있습니다.Proteinase K를 사용하여 크로마틴의 가교를 해제하고 분주한 후, 아가로스 겔 전기영동을 수행하십시오. 단편화 효율을 검증하고 200에서 600 bp 사이의 원하는 DNA 크기 범위를 얻기 위해 최적화하는 것이 권장됩니다. 원심분리를 통해 세포 데브리를 제거하십시오.이제 크로마틴을 자기 비드로 사전 정제(pre-clear)할 준비가 되었습니다. 또는 충분한 양의 크로마틴이 수집될 때까지 -80 °C에서 보관하며 중단할 수 있습니다. ChIP를 시작하려면 비드 세척 완충액으로 비드를 3회 세척하십시오. 이번 세척과 향후 자기 단백질 비드를 사용하는 모든 세척 과정은 다음 단계로 구성됩니다.초음파 처리된 크로마틴을 미리 세척한 비드에 추가하고 별도의 튜브에서 4°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 미리 세척한 비드를 항체로 코팅하고 4°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 항체가 코팅된 비드를 비드 세척 완충액으로 2회 세척합니다.근접 결찰(proximity ligation)을 위한 기질의 높은 복잡성은 필연적으로 상당한 비특이적 노이즈를 유발하며, 이는 시퀀싱 비용을 증가시킵니다. 복잡성과 배경 노이즈 수준을 낮추는 것 외에도, 본 연구에서는 전사 조절에 관여하는 크로마틴 상호작용을 식별하기 위해 마우스 RNA polymerase two 단클론 항체를 사용하였습니다.이를 통해 활성 프로모터와 그에 해당하는 조절 영역을 조사할 수 있으며, 효율적이고 잠재적으로 협력적인 전사를 이해할 수 있습니다. 항체 코팅 비드에서 세척 버퍼를 제거합니다. 사전 정제된 크로마틴을 항체 코팅 비드와 혼합하고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 결합되지 않은 크로마틴을 제거하기 위해 비드를 일련의 세척 과정에 노출시킨 뒤, TE 버퍼로 비드를 재현탁하여 정량 및 농축 확인을 위한 소량을 분주합니다. PAD 및 TAG 시퀀싱을 이용한 크로마틴 상호작용 분석은 고차원 크로마틴 구조의 상호작용을 대규모로 de novo 분석하기 위해 개발된 기술입니다.염색질 면역침전법(chromatin immunoprecipitation)으로 농축된 DNA 단편들은 근접 결찰(proximity ligation)을 통해 포획됩니다. 패드 및 태그(pad and tag) 전략이 CHI PET 라이브러리 구축에 적용되며, 구축된 라이브러리는 고처리량 차세대 염기서열 분석 기술로 시퀀싱됩니다. 본 영상에서는 CHI PET 라이브러리 구축의 핵심적인 실험적 측면들을 보여드리겠습니다.라이브러리 제작의 전반부 과정은 DNA 단편이 결합된 protein A 또는 G 비드를 조작하여 효소와 완충염을 제거하는 단계입니다. 각 효소 반응 후, 세척 단계마다 부드러운 원심분리와 탭핑(flicking) 동작을 수행하십시오. 비드가 자성 입자에 배치되었을 때 포집률을 최대화하기 위해 상층액을 여러 번 피펫팅하십시오.반응 혼합물 내에 비드가 포함된 모든 배양 단계용 농축기입니다. 마스터 믹스를 미리 준비하고, 비드가 균질하게 재현탁된 후 마지막에 효소를 첨가하십시오. 전체 배양 과정 동안 비드가 잘 섞이도록 유지하십시오. 하프 링커 올리고뉴클레오타이드는 4개의 뉴클레오타이드로 구성된 내부 바코드와 type II S 제한 효소 MME I의 인식 부위가 포함되도록 설계되었습니다.C 염색질 복합체의 결합된 DNA 단편에 하프 링커(half linker)를 라이게이션하면, 상호작용하는 DNA 단편들이 완전한 링커 서열로 연결됩니다. 이러한 하프 링커는 비특이적 라이게이션 생성물에서 유래한 heterodimer ab 링커 서열 또는 특이적 라이게이션 생성물에서 유래한 homodimer AA 또는 BB 링커 서열을 생성합니다. 따라서 서로 다른 뉴클레오타이드 바코드를 가진 두 개의 하프 링커를 사용하면, 서로 다른 실험이나 반복 실험을 구분할 수 있을 뿐만 아니라 서로 다른 칩 복합체 간의 비특이적 키메라 라이게이션 비율을 모니터링할 수 있습니다.반응을 얼음 위에서 준비하고-half linker를 얼음 위에서 천천히 녹이는 것이 중요합니다. half linker를 물과 잘 혼합한 후, ligase 버퍼가 포함된 PEG와 혼합하십시오. 재현탁하기 전에 마스터 믹스가 충분히 섞였는지 확인하십시오.half linker와 chip DNA 단편이 충분히 혼합되어 half linker의 연결(concatenation)을 방지한 후에만 chip DNA에 T4 DNA ligase를 첨가하십시오. 튜브를 파라필름으로 밀봉하고 16 °C에서 회전시키며 하룻밤 동안 배양합니다. 그 후 SDS가 포함된 EB 버퍼를 추가하여 비드에서 온전한 염색질 복합체(chromatin complexes)를 용출시킵니다. SDS 농도를 낮추기 위해 Triton X 100을 사용하여 SDS를 소거합니다. 염색질 복합체의 원형화는 두 개의 half linker가 상호작용 접합부에서 연결되어 완전한 링커 서열을 생성함으로써 촉진됩니다. 서로 다른 DNA-단백질 복합체 간의 결합을 최소화하기 위해 매우 희석된 조건에서 용출된 염색질 복합체를 연결하십시오. 용출된 염색질 복합체가 반응 혼합물 내에서 충분히 희석된 후에만 T4 DNA ligase를 첨가하십시오. 역가교(reverse cross-linking) 후, 페놀-클로로포름 추출을 통해 DNA 결합 단백질을 제거하여 원형화된 DNA 단편을 정제하십시오. 쉬운 분리를 위해 KaiGen phase lock 젤 시스템을 사용하십시오.페놀 추출 후, 펠릿의 질량과 가시성을 높이기 위해 glyco blue A DNA carrier를 사용합니다. Half linker 올리고뉴클레오타이드는 측면의 MM E one 인식 부위를 포함하고 있습니다. MM E one은 Type two S 제한 효소로, 표적 결합 부위의 하류 18 및 20 base pair 지점을 절단하여 크로마틴 단편의 짧은 태그를 생성하며, 이를 통해 pets로 약칭되는 PET tag linker tag 구조체를 생성합니다.또한, 스트렙타비딘(streptavidin) 코팅 자성 비드를 통해 pet 구조물을 정제할 수 있도록 각 하프 링커(half linker)를 비오틴으로 수식합니다. MME 단일 소화를 수행하여 태그 링커 구조물을 유리시킵니다. 스트렙타비딘 비드에 선택적으로 결합시켜 pet을 정제하고, 고처리량 시퀀싱을 위해 pet 구조물을 어댑터와 연결합니다.fusion DNA polymerase를 사용하여 CHI PET 라이브러리 퓨전을 증폭합니다. DNA polymerase는 높은 정확도와 효율로 템플릿을 생성하는 데 사용됩니다. PCR 반응액을 냉장 상태에서 준비하고, 마지막에 fusion DNA polymerase를 첨가합니다.해당 효소는 dNTP가 없을 때 프라이머를 분해할 수 있는 3'에서 5' 엑소뉴클리에이스 활성을 나타냅니다. CRISPR 라이브러리가 성공적으로 구축되었다면, 약 223 base pairs의 뚜렷하고 명확한 밴드가 나타나야 합니다. 겔에서 223 base pair 밴드를 절취할 때 비특이적 밴드가 포함되지 않도록 주의하고, 절취한 밴드를 Gel Crush 프로토콜을 사용하여 정제하십시오.고처리량 시퀀싱을 수행하기 전, DNA 1000 키트를 사용한 Agilent 2, 100 bioanalyzer로 품질 검사를 수행하십시오. 본 연구에서는 게놈 전반의 크로마틴 상호작용을 편향 없이 검출하기 위한 CHI PET 절차를 입증하였습니다. CHI PET 데이터의 품질은 사용된 칩 항체의 효율성과 시퀀싱 깊이에 따라 달라집니다.여기서는 상호작용 매핑을 위해 1,800만에서 2,000만 개의 리드를 사용합니다. 이 특정 프로토콜은 인간 게놈에서 에스트로겐 수용체 및 RNA 중합효소에 의해 결합된 염색질 상호작용 네트워크를 성공적으로 규명하는 데 사용되었습니다. 우리는 이 분석법이 전 게놈 맥락에서 전사 생물학의 3차원 구조에 관한 향후 연구에 강력한 도구가 될 것으로 기대합니다.이 영상이 여러분께 유용하기를 바랍니다. 시청해 주셔서 감사합니다.I.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

염색질의 immunoprecipitation과 매우 높은 처리량 시퀀싱 (칩 SEQ)의 조합은 특정 조직이나 세포주에서 단백질 DNA 상호 작용을 파악하고 매핑 할 수 있습니다. 설명은 예를 들어 전사 인자 TCF7L2 경험을 사용하여 다음 순서를위한 고품질 칩 템플릿을 생성하는 방법이다.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

방법 염색질 규제 및 염색질 상태의 문제는 생체 내에서 유전자가 세포 운명 결정이 배아에서 어떻게 만들어 지는지 초기에 대한 우리의 이해의 열쇠입니다 영향을 미칩니다. 칩 서열 번호 - 글로벌 수준입니다 Xenopus의 배아 여기 설명에서 크로 마틴의 기능을 조사하기 가장 인기있는 방법.

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em칩 서열 번호&gt; 태아

염색질 면역 침전은 DNA가 생체 내에서 애기 단백질의 결합 부위의 식별을위한 강력한 기술이다. 이 절차는 염색질 가교과 분열, 관심의 단백질에 선택적 항체와 면역과 결합 된 DNA의 qPCR에 분석을 포함한다. 우리는 애기 장대 식물에 최적화 된 간단한 칩 분석에 대해 설명합니다.

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

우리는 micrococcal nuclease (MNase) 융합 단백질로 게놈 전체 단백질 바인딩 사이트를 매핑하기위한 염색질 immunoprecipitation (ChIP) - 직교 방식 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq)와 결합 염색질 내생 절단을 설명합니다.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

여기, 우리는 최적화 된 높은 처리량 칩 시퀀싱 프로토콜 및 냉동된 종양 조직 및 세포에서 게놈 넓은 chromatin 상태 패턴의 결정에 대 한 전산 분석 파이프라인을 설명합니다.

종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

여기, 우리는 칩 Seq를 수행 하는 방법을 설명 및 CARIP-Seq, 다음-세대 시퀀싱, 라이브러리 준비 등 글로벌 epigenomic 및 chromatin 관련 RNA 생성 하 ES 세포에 지도.

CARIP-Seq와 칩 Seq: Chromatin 관련 된 RNAs 및 배아 줄기 세포에 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 방법

유전자와 규제 요소 간의 물리적 상호 작용의 식별 도전 이지만 염색체 구조 캡처 방법에 의해 촉진 되었습니다. 4 C-seq 프로토콜이 수정이 PCR 템플릿-증폭을 최소화 하 여 PCR 바이어스를 완화 하 고 또한 금지 효소 다이제스트 단계를 통합 하 여 읽기의 mappability을 극대화.

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

탠덤 chromatin 위한 단계별 프로토콜 설명 immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 셀 형식 관련 게놈 넓은 히스톤 수정의 분석을 가능 하 게.

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

게놈 전반에 걸친 단백질 결합 위치의 정확한 결정은 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 외핵증 소화(ChIP-exo)를 사용한 크로마틴-면역침전DNA를 치료하는 게놈 매핑 방법을 설명하고 있으며, 이어서 고처리량 시퀀싱을 한다. 이 방법은 포유류 뉴런에서 근거리 쌍 매핑 해상도 및 높은 신호 대 잡음 비와 단백질 DNA 상호 작용을 검출합니다.

크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑

여기서는 30 μL 벌레 펠릿만을 사용하여 L4 단계 Caenorhabditis elegans 전체충에 구현할 수 있는 빠르고 간단한 ATAC-seq 프로토콜을 제시합니다.

Caenorhabditis Elegans L4 유충 전체에서의 염색질 접근성 프로파일링

여기서는 RNA 관련 염색질-DNA 상호작용을 포착하여 RNA 관련 3차원 게놈 조직을 매핑하는 프로토콜을 제시합니다.

RNA 연관 염색질 DNA-DNA 상호작용법

학습하세요 ChIA-PET 기법을 통해 염색질 상호작용을 분석하고 전사 규제 메커니즘을 규명하는 방법을. 이 프로토콜은 차세대 염기서열분석을 활용하여 유전자 발현의 복잡한 조절 네트워크를 이해하는 데 필수적인 도구입니다.

염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)과 염색질의 상호 작용 분석

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