염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)과 염색질의 상호 작용 분석

분말 및 태그 시퀀싱을 이용한 COMIN 상호작용 분석은 게놈 전체의 COMIN 장거리 COMIN 상호작용을 분석하는 방법입니다. 간단히 말해, 우리는 이를 magic share pad라고 부릅니다. 이 방법은 많은 분자생물학적 단계가 포함되어 있어 복잡할 수 있습니다.

따라서 이어지는 비디오에서는 염색질 면역침전(ChIP)과 ChAI-PET 분석을 위한 라이브러리 구축의 주요 단계를 보여드리겠습니다. ChIP로 알려진 염색질 면역침전은 ChAI-PET 라이브러리를 구축하는 첫 번째 중요한 단계입니다. 이 과정에서 세포 배양물로부터 얻은 염색질 샘플을 가교 결합시키고, 초음파 처리 및 면역침전시킵니다.

그 후 칩 DNA의 개별 분주액을 바코드가 지정된 하프 링커(half linker)에 연결하고 근접 결합(proximity ligation)을 수행합니다. 제한 효소 소화를 통해 펫(Pets)을 분리하고, 코팅된 자성 비드로 정제한 뒤, 차세대 염기서열 분석(NGS)을 위한 어댑터에 연결합니다. 키메라 체어 펫(Chimeric chair pets)은 AB 링커 구성과 태그 플랭킹(tag flanking)을 통해 식별합니다.

중앙 링커 서열을 읽어내어 게놈에 매핑합니다. 본 영상에서는 유방암 세포주 MCF7을 사용하여 저희 실험실에서 일상적으로 사용하는 표준 ChIP 프로토콜을 보여드리겠습니다. 저희 데이터에 따르면, 특정 항체를 통한 ChIP 농축도가 높을수록 더 나은 ChIP-seq 데이터를 얻을 수 있습니다. 따라서 ChIP 프로토콜의 최적화와 qPCR을 통한 농축 검증을 강력히 권장합니다.

ChIP-seq 라이브러리 구축을 진행하기 전, 가교 결합 전 약 2,000만 개의 세포가 포함된 500 cm² 조직 배양 접시에서 CF7 세포를 약 75%의 밀도로 배양합니다. 성장 배지를 제거하고 따뜻한 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 실온의 로테이터에서 갓 제조한 1.5 mM EGS로 45분 동안 세포를 고정합니다. 최종 농도가 1%가 되도록 37% formaldehyde를 첨가하고 20분 동안 배양합니다.

가교 효율은 매우 중요하며, 세포주와 대상 단백질에 따라 달라집니다. 가교제 농도, 배양 시간 및 온도를 최적화해야 합니다. 최종 농도가 200 millimolar인 glycine으로 10분 동안 가교제를 퀀칭하십시오.

켄칭된 가교제를 제거하고 차가운 PBS로 2회 세척합니다. 냉장 벤치탑 원심분리기를 사용하여 펠렛 세포를 긁어내어 세포를 부유시킵니다. 이제 펠렛은 세포 용해를 위한 준비가 되었습니다. 또는 펠렛을 -80°C에서 냉동 보관하십시오. 세포 펠렛이 냉동된 경우, 세포 용해를 진행하기 전에 얼음 위에서 해동하십시오. 펠렛을 0.1% SDS 용해 버퍼로 재현탁합니다.

냉장 원심분리기를 사용하여 4°C에서 튜브를 회전시킨 후, 상층액을 제거하고 세포 용해 과정을 반복합니다. 크로마틴 단편화 전에 가교된 크로마틴을 방출하기 위해 핵 용해를 수행합니다. 핵막이 없으면 가교된 크로마틴을 더 완화된 조건에서 초음파 처리할 수 있습니다.

1% SDS 용해 버퍼(lysis Buffer) 내의 Reus Band 핵 펠릿(nuclear palette)을 재현탁합니다. 현탁액을 고속 원심분리 튜브로 옮깁니다. 4°C에서 튜브를 회전시킵니다.

원심분리를 통해 핵 잔해물을 제거합니다. 크로마틴 펠렛은 다음과 같은 모습이어야 합니다. P 1000 피펫 팁을 사용하여 펠렛을 조각내어 분쇄하고 0.1% SDS 용해 버퍼(lysis Buffer)로 2회 세척합니다.

냉장 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 튜브를 회전시킵니다. 이제 핵 펠렛을 초음파 처리할 준비가 되었습니다. 또는, -80 °C에서 펠렛을 동결시킵니다.

펠릿을 투명 튜브로 옮깁니다. 펠릿에 0.1% SDS 용해 버퍼를 추가하고 모든 기포를 제거합니다. 과열을 방지하기 위해 초음파 처리 전 과정 동안 샘플을 차갑게 유지하십시오. 버퍼 부피, 프로브 깊이, 초음파 강도, 사이클 횟수 및 가교 정도와 같은 다양한 조건이 초음파 처리 효율에 영향을 미칠 수 있습니다.

Proteinase K를 사용하여 크로마틴의 가교를 해제하고 분주한 후, 아가로스 겔 전기영동을 수행하십시오. 단편화 효율을 검증하고 200에서 600 bp 사이의 원하는 DNA 크기 범위를 얻기 위해 최적화하는 것이 권장됩니다. 원심분리를 통해 세포 데브리를 제거하십시오.

이제 크로마틴을 자기 비드로 사전 정제(pre-clear)할 준비가 되었습니다. 또는 충분한 양의 크로마틴이 수집될 때까지 -80 °C에서 보관하며 중단할 수 있습니다. ChIP를 시작하려면 비드 세척 완충액으로 비드를 3회 세척하십시오. 이번 세척과 향후 자기 단백질 비드를 사용하는 모든 세척 과정은 다음 단계로 구성됩니다.

초음파 처리된 크로마틴을 미리 세척한 비드에 추가하고 별도의 튜브에서 4°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 미리 세척한 비드를 항체로 코팅하고 4°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 항체가 코팅된 비드를 비드 세척 완충액으로 2회 세척합니다.

근접 결찰(proximity ligation)을 위한 기질의 높은 복잡성은 필연적으로 상당한 비특이적 노이즈를 유발하며, 이는 시퀀싱 비용을 증가시킵니다. 복잡성과 배경 노이즈 수준을 낮추는 것 외에도, 본 연구에서는 전사 조절에 관여하는 크로마틴 상호작용을 식별하기 위해 마우스 RNA polymerase two 단클론 항체를 사용하였습니다.

이를 통해 활성 프로모터와 그에 해당하는 조절 영역을 조사할 수 있으며, 효율적이고 잠재적으로 협력적인 전사를 이해할 수 있습니다. 항체 코팅 비드에서 세척 버퍼를 제거합니다. 사전 정제된 크로마틴을 항체 코팅 비드와 혼합하고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 결합되지 않은 크로마틴을 제거하기 위해 비드를 일련의 세척 과정에 노출시킨 뒤, TE 버퍼로 비드를 재현탁하여 정량 및 농축 확인을 위한 소량을 분주합니다. PAD 및 TAG 시퀀싱을 이용한 크로마틴 상호작용 분석은 고차원 크로마틴 구조의 상호작용을 대규모로 de novo 분석하기 위해 개발된 기술입니다.

염색질 면역침전법(chromatin immunoprecipitation)으로 농축된 DNA 단편들은 근접 결찰(proximity ligation)을 통해 포획됩니다. 패드 및 태그(pad and tag) 전략이 CHI PET 라이브러리 구축에 적용되며, 구축된 라이브러리는 고처리량 차세대 염기서열 분석 기술로 시퀀싱됩니다. 본 영상에서는 CHI PET 라이브러리 구축의 핵심적인 실험적 측면들을 보여드리겠습니다.

라이브러리 제작의 전반부 과정은 DNA 단편이 결합된 protein A 또는 G 비드를 조작하여 효소와 완충염을 제거하는 단계입니다. 각 효소 반응 후, 세척 단계마다 부드러운 원심분리와 탭핑(flicking) 동작을 수행하십시오. 비드가 자성 입자에 배치되었을 때 포집률을 최대화하기 위해 상층액을 여러 번 피펫팅하십시오.

반응 혼합물 내에 비드가 포함된 모든 배양 단계용 농축기입니다. 마스터 믹스를 미리 준비하고, 비드가 균질하게 재현탁된 후 마지막에 효소를 첨가하십시오. 전체 배양 과정 동안 비드가 잘 섞이도록 유지하십시오. 하프 링커 올리고뉴클레오타이드는 4개의 뉴클레오타이드로 구성된 내부 바코드와 type II S 제한 효소 MME I의 인식 부위가 포함되도록 설계되었습니다.

C 염색질 복합체의 결합된 DNA 단편에 하프 링커(half linker)를 라이게이션하면, 상호작용하는 DNA 단편들이 완전한 링커 서열로 연결됩니다. 이러한 하프 링커는 비특이적 라이게이션 생성물에서 유래한 heterodimer ab 링커 서열 또는 특이적 라이게이션 생성물에서 유래한 homodimer AA 또는 BB 링커 서열을 생성합니다. 따라서 서로 다른 뉴클레오타이드 바코드를 가진 두 개의 하프 링커를 사용하면, 서로 다른 실험이나 반복 실험을 구분할 수 있을 뿐만 아니라 서로 다른 칩 복합체 간의 비특이적 키메라 라이게이션 비율을 모니터링할 수 있습니다.

반응을 얼음 위에서 준비하고-half linker를 얼음 위에서 천천히 녹이는 것이 중요합니다. half linker를 물과 잘 혼합한 후, ligase 버퍼가 포함된 PEG와 혼합하십시오. 재현탁하기 전에 마스터 믹스가 충분히 섞였는지 확인하십시오.

half linker와 chip DNA 단편이 충분히 혼합되어 half linker의 연결(concatenation)을 방지한 후에만 chip DNA에 T4 DNA ligase를 첨가하십시오. 튜브를 파라필름으로 밀봉하고 16 °C에서 회전시키며 하룻밤 동안 배양합니다. 그 후 SDS가 포함된 EB 버퍼를 추가하여 비드에서 온전한 염색질 복합체(chromatin complexes)를 용출시킵니다. SDS 농도를 낮추기 위해 Triton X 100을 사용하여 SDS를 소거합니다. 염색질 복합체의 원형화는 두 개의 half linker가 상호작용 접합부에서 연결되어 완전한 링커 서열을 생성함으로써 촉진됩니다. 서로 다른 DNA-단백질 복합체 간의 결합을 최소화하기 위해 매우 희석된 조건에서 용출된 염색질 복합체를 연결하십시오. 용출된 염색질 복합체가 반응 혼합물 내에서 충분히 희석된 후에만 T4 DNA ligase를 첨가하십시오. 역가교(reverse cross-linking) 후, 페놀-클로로포름 추출을 통해 DNA 결합 단백질을 제거하여 원형화된 DNA 단편을 정제하십시오. 쉬운 분리를 위해 KaiGen phase lock 젤 시스템을 사용하십시오.

페놀 추출 후, 펠릿의 질량과 가시성을 높이기 위해 glyco blue A DNA carrier를 사용합니다. Half linker 올리고뉴클레오타이드는 측면의 MM E one 인식 부위를 포함하고 있습니다. MM E one은 Type two S 제한 효소로, 표적 결합 부위의 하류 18 및 20 base pair 지점을 절단하여 크로마틴 단편의 짧은 태그를 생성하며, 이를 통해 pets로 약칭되는 PET tag linker tag 구조체를 생성합니다.

또한, 스트렙타비딘(streptavidin) 코팅 자성 비드를 통해 pet 구조물을 정제할 수 있도록 각 하프 링커(half linker)를 비오틴으로 수식합니다. MME 단일 소화를 수행하여 태그 링커 구조물을 유리시킵니다. 스트렙타비딘 비드에 선택적으로 결합시켜 pet을 정제하고, 고처리량 시퀀싱을 위해 pet 구조물을 어댑터와 연결합니다.

fusion DNA polymerase를 사용하여 CHI PET 라이브러리 퓨전을 증폭합니다. DNA polymerase는 높은 정확도와 효율로 템플릿을 생성하는 데 사용됩니다. PCR 반응액을 냉장 상태에서 준비하고, 마지막에 fusion DNA polymerase를 첨가합니다.

해당 효소는 dNTP가 없을 때 프라이머를 분해할 수 있는 3'에서 5' 엑소뉴클리에이스 활성을 나타냅니다. CRISPR 라이브러리가 성공적으로 구축되었다면, 약 223 base pairs의 뚜렷하고 명확한 밴드가 나타나야 합니다. 겔에서 223 base pair 밴드를 절취할 때 비특이적 밴드가 포함되지 않도록 주의하고, 절취한 밴드를 Gel Crush 프로토콜을 사용하여 정제하십시오.

고처리량 시퀀싱을 수행하기 전, DNA 1000 키트를 사용한 Agilent 2, 100 bioanalyzer로 품질 검사를 수행하십시오. 본 연구에서는 게놈 전반의 크로마틴 상호작용을 편향 없이 검출하기 위한 CHI PET 절차를 입증하였습니다. CHI PET 데이터의 품질은 사용된 칩 항체의 효율성과 시퀀싱 깊이에 따라 달라집니다.

여기서는 상호작용 매핑을 위해 1,800만에서 2,000만 개의 리드를 사용합니다. 이 특정 프로토콜은 인간 게놈에서 에스트로겐 수용체 및 RNA 중합효소에 의해 결합된 염색질 상호작용 네트워크를 성공적으로 규명하는 데 사용되었습니다. 우리는 이 분석법이 전 게놈 맥락에서 전사 생물학의 3차원 구조에 관한 향후 연구에 강력한 도구가 될 것으로 기대합니다.

이 영상이 여러분께 유용하기를 바랍니다. 시청해 주셔서 감사합니다.I.