Name: 보통 인간의 뇌에 용해와 불용성 PRP의 Oligomers의 절연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 학습하세요 정상 인간 뇌 조직에서 가용성 및 불용성 프리온 단백질을 분리하는 방법을. 초고속 원심분리와 크로마토그래피 기법을 활용하여 신경퇴행성 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 정상적인 뇌 샘플을 제공하는 인간의 뇌와 척수 리소스 센터 (로스 앤젤레스, CA)에 감사하고 있습니다. 이 연구는 McGregor 재단의 지원과 대통령의 잉여 자금 기금 (케이스 웨스턴 리저브 대학)과 국립 보건원 (NIH) R01NS062787, CJD 재단, 연합 BioSecure뿐만 아니라 대학 노화에 센터와 건강에 의해 지원되었다 .

1. 뇌 Homogenate 및 세제 용해 (S2)과 불용성 (P2) 분수의 작성 <ol><li> 100 MG 냉동 인간의 뇌 조직을 타고 (10 MM 트리스, 150 MM NaCl, 0.5 % Nonidet P-40 (NP-40), 0.5 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4) 100 μl 용해 버퍼를 추가합니다. </li><li> 무선 모터에 의해 구동 유봉을 사용하여 얼음에 균질화,이 중 20 5 분에 드라이 아이스에 고정하고 모터에 의해 먼저하고 손에 의해 구동 유봉을 사용하여 다시 균질화, 300 μl 또는 800 μl 용해 버퍼를 (추가 % 또는 10 % 총 뇌 homogenate, 각각). </li><li> 4에 10 분 ° C가 benchtop 원심 분리기를 사용하여 표면에 뜨는 (S1)를 수집하는 1,000 XG에서 20 % 또는 10 % 총 뇌 homogenate를 원심 분리기. </li><li> 4 ° C.에 1 시간에 SW55 로터의 35,000 RPM (100,000 XG) (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날, 풀러 턴, CA)에서 10 % S1을 Ultracentrifuge 깨끗한 튜브에 세제 - 수용성 일부를 포함 supernatants을 (S2) 전송합니다. 세제 - 불용성 포함 된 알약을 Resuspend5 배 농축 준비 - 100 μl 또는 10을 200 μl 용해 버퍼 분율 (P2). </li><li> PK - 소화를 들어, S2 및 P2 분수 모두 1 시간에 37 ° C에서 50 μg / ML에서 PK의 동일한 양으로 샘플을 품다. 5 mm와 PK의 소화를 종료 할 SDS 샘플 버퍼 (3 % SDS, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 4 %의 β-메르 캅토 에탄올, 10 % 글리세롤, 50 MM 트리스, 산도 6.8)의 동일한 볼륨의 최종 농도에 phenylmethylsulfonyl 불소를 추가합니다. 10 분의 샘플을 삶아하고 5 분 동안 실온에서 그들을 냉각. 그들은 서양이 blotting에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 2. 자당의 단계 기울기의 속도 침강 <ol><li> 얼음에 30 분을위한 H 2 O 2 %의 sarkosyl의 동일한 볼륨으로 450 μl 20 % S1을 품다. </li><li> 0.5 ML 60 % 각각, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 및 최대 5 ML 용량 Beckman 튜브에 10 %의 자당을 추가합니다. </li><li> 10-60%의 자당의 단계 그라디언트의 상단에 S1의 0.4 ML를로드합니다. </li><li> 4에 원심 분리기4 번 1 시간에 8,000 RPM (200,000 XG, SW55 로터), ° C. </li><li> 각 관의 상단에서 283 μl 일부를 수집하여 총 12 분수를 구하십시오. </li><li> 새로운 Eppendorf 튜브에 각 분획의 20 μl을 타고 10 분에 20 μl 샘플 버퍼, 그리고 종기를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 동네에서 4 분을위한 멋진 샘플, 1 분, 소용돌이를 1,000 XG에 원심 분리기. 미리 캐스트 젤에 샘플을로드합니다. </li></ol> 3. 크기 제외 크로마토 그래피 <ol><li> PRP 분자의 oligomeric 상태를 결정하기 위해 1 개 30cm 항목의 Superdex 200 HR의 구슬을 (Pharmacia, 웁살라, 스웨덴)을 사용합니다. </li><li> 알부민 Dextran 블루 (2,000 kDa), thyroglobulin (669 kDa), apoferritin (443 kDa), β-아밀라아제 (200 kDa), 알코올 탈수소 효소 (150 kDa)를 포함 세븐 분자 질량 마커 (시그마, 세인트 루이스, MI) ( 66 kDa) 및 탄소 anhydrase (29 kDa)는 200 μl 샘플 볼륨에 시그마에서 권장하는 농도에 독립적으로로드됩니다. </li><li> 푸른 dext의 용출 볼륨실행은 제품 지침에 의해 제공되는 공극 부피 (V 0 = 8.45 ML)과 총 부피 (V t = 24 ML)를 결정하는 데 사용됩니다. 피크 용출 볼륨 (V 전자)은 크로마토 그램 및 부분 retentions에서 계산됩니다. - / (V t - V 0) K AV = (V 0 V E) : K AV, 파티션 계수는 (샘플 동작을 정의) 방정식을 사용하여 계산됩니다. 보정 곡선은 표준 8 로그 MW에 대한 단백질 표준의 K AV를 모의에 의해 결정됩니다. </li><li> 다른 FPLC 분수에서 가져온 다양한 PRP 종의 분자량 (MW)은 다양한 표준의 겔 여과로 생성 교정 곡선에 따라 평가됩니다. </li><li> 각 실행에 대한 칼럼으로 1 % sarkosyl을 포함 용해 버퍼에 200 μl S1를 삽입. </li><li> 크로마토 그래피는 0.25 ML / 분, 분수의 유량에 FPLC 시스템 (GE 헬스 케어)에 수행됩니다S 0.25 ML의 각 분획 수집기를 (Amersham Biosciences, RediFrac)를 사용하여 수집하고 있습니다. </li><li> 2 시간에 -20 ° C에서 0.5 ML 사전 차가운 메탄올과 0.125 ML 각 일부를 품다. </li><li> 4에 30 분 ° C benchtop microcentrifuge에 대한 13,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 표면에 뜨는을 취소하고 실내 온도에 시원한 10 분에 대한 끓고 위에서 언급 한 것처럼 20 μl SDS 샘플 버퍼에 펠렛을 resuspend, 사전 캐스트 젤에 그들을로드합니다. </li></ol> 4. g5p에서 PRP의 캡처 <ol><li> g5p 분자 (100 μg (주) 주시기 포츠머스, 영국의 대학에서 Drs. 제프 Kneale와 요한이 McGeehan 제공) 7 복합입니다 X 10 8 tosyl 1 ML에 100 μg의 g5p 350 μl g5p 비즈를 잠복기가 자기 구슬을 활성화 20 시간에 37 ° C에서의 인산염 버퍼 생리 (PBS). 외부 자기 힘으로 Eppendorf 튜브의 측벽에 g5p - 구슬을 유치하고 모든 솔루션을 제거합니다. PBS 1 ML 포함하는으로 구슬을 씻으십시오0.1 % 소 세 번이나 (BSA) 혈청 알부민. </li><li> 비 특정 바인딩을 차단하는 5 시간에 0.2 M 트리스 - HCL, 37에서 0.1 % BSA를 포함하는 산도 7.4 ° C의 1 ML에 g5p - 복합 구슬을 배양 한 후 PBS 1 ML은에 0.1 % BSA를 포함하는으로 구슬을 씻어 세 번 위에서 언급 한. 솔루션을 제거하고 구슬로 PBS 1 ML를 추가합니다. 준비된 g5p 비즈는 4 ° C.에서 최소한 3 개월 동안 안정적 </li><li> g5p의 PRP의 캡처 바인딩 버퍼 1 ML 60 μl g5p 복합 구슬 (10 μg 단백질 / 6 X 10 7 구슬) (3 % 십대 초반 - 20, 3 % NP-100 μl S1 분수 또는 P2를 잠복기에 의해 수행된다 PBS, 산도 7.5 40). </li><li> 상온에서 3 시간에 대한 지속적인 회전 부화 후, PRP - 포함 g5p 비즈는 솔루션의 모든 언 바운드 분자 쉽게 제거 수, 외부 자기 힘으로 Eppendorf 튜브의 측벽에 매료됩니다. </li><li> 세탁 버퍼에 세 세차 (2 % 십대 초반 - 2​​0 PBS의 2% NP-40, pH를 7에 따라0.5), g5p 비즈는 95에서 수집하고 가열 된 SDS 샘플 버퍼에 5 분 (3 % SDS, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 % 글리세롤, 50 MM 트리스 - HCL, pH를 6.8)에 대한 ° C. </li><li> 상온에서 5 분 동안 샘플을 냉각 한 후, 샘플은 실온에서 5 분 1,000 XG에서 centrifuged 있습니다. supernatants 서양이 blotting에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 5. Blotting 서양 <ol><li> 로드 샘플 ~ 80 분 150 V 15 % 트리스 - HCL 기준 사전 주조 젤 (바이오 RAD)에 SDS 샘플 버퍼에 끓여. </li><li> 젤의 단백질은 70V에서 2 시간에 PVDF으로 전송됩니다. </li><li> 5 %의 우유에서 세포막을 차단 한 후 트리스 버퍼 생리 0.01 %를 포함하는 십대 초반 - 2​​0 (TBS-T)는 멤브레인은 1E4 (1, 기본 단클론 또는 polyclonal 항체 3F4 (1:40,000)로 실온에서 2 시간에 incubated 아르 : 1,000), 안티-N 8 (1:6,000), 또는 안티-C PRP 분자를 프로빙을위한 8 (1:6,000). </li><li> 에 HRP-복합 양 안티 - 마우스 IgG와 부화에 따라1:3000, 또는 당나귀 반 토끼 IgG는 1:3,000에서 PRP 밴드는 제조업체의 프로토콜에 따라, ECL 플러스를 사용하는 코닥 필름에 시각화 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 PRP C의 대부분 S2 분율 (그림 1)에서 발견되었습니다 있지만 산발적 CJD 샘플에 비해 iPrP C의 작은 금액은 정상적인 뇌에 P2 분수에 감지되었습니다. 전체 길이와 N-말기립니다 종을 포함한 총 PRP의 약 5~25% 이전에 8 iPrP 계정 지적 있습니다. 자당 단계 기울기 침강을 사용하여 분석이 아닌 CJD 뇌에서 PRP C의 대부분은 1-3 상단 분수에서 발견되었습니다 동안, PRP 소량도 일반적으로 대형 집계 할 8 (그림 포함 된 바닥 분수 9-11에서 발견 된 것으로 밝혀 2). PRP SC 종의 다양한 울렸다단량체의 ING는 큰 집계에 작은 oligomers는 Creutzfeldt-야콥 병 (그림 3A)와 뇌 겔 여과에 의해 분리되었다. 그러나, 2000 kDa보다 분자량 더있는 큰 응집체의 작은 금액도 일반 뇌의 불용성 분수 (그림 3C)에 감지되었습니다. 또한, dimers 및 PRP C의 tetramers은 불용성 분수에서뿐만 아니라 가용성 분수 (그림 3B 및 3C)에 감지되지 않았습니다. PK와 PNGase 치료 후 g5p에서 수집 한 PRP는 PrP97-105 8에 대한 1E4 항체를 감지되었습니다. 세 PK 방지 핵심 조각이라고한다 PRP * 20, PRP * 19 및 PRP는 * 7 각각 ~ 20 kDa, ~ 19 kDa과 ~ 7 kDa, (그림 4, 왼쪽 패널)에 이주, 감지되었습니다.주세요 1E4 항체가 순서 지문을 가진 합성 펩타이드와 사전 incubated되었을 때 그러나, 더 PRP가 감지되지 않았습니다1E4에 의해 감지 대역 PRP 조각임을 나타내는 1E4 에피토프 (그림 4, 중, 패널)에 ICAL. 또한, 항-C 항체가 ~ 18 kDa에서 이전 두 개의 서로 다른 PRP 조각을 공개 (PRP * 18) 및 PRP뿐만 아니라 ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), * 20 (그림 4, 오른쪽 패널). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig1.jpg" /> 그림 1. iPrP C와 iPrP SC의 감지. 1 시간에 37 ° C에서 총 반응 량의 1 / 10시 PNGase의 F 치료 후 단백질, 전체 길이 또는 N-말기 (S2 및 P2) 수용성과 불용성 분수에 PRP 종립니다 절연에서 glycans를 제거하는 일반 제어 (CTL)와 산발적 CJD (sCJD)에서 뇌 샘플에 ultracentrifugation에 의해 PrP23-40 (중간 패널)에 대해 PrP106-112 (왼쪽 패널), 안티-N에 대한 3F4로 발견되었고 PRP에 대한 안티 - C220-231 (오른쪽 패널). 큰 금액은 S2에있는 반면 CTL 샘플에서 PRP의 작은 금액은, P2에서 검출된다. 대조적으로, 더 PRP는 sCJD 샘플에 S2보다 P2에서 검출된다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig2.jpg" /> 그림 2. 자당의 그라디언트 단계에서 PRP의 침강. 1에서 비 CJD 뇌 샘플 S1 11 개별 분수에 PRP는 서양이 3F4로 blotting에 의해 발견되었다. PRP C의 대부분은 1-3 위로 분수에서 감지되었지만, PRP 소량도 바닥 분수 9-11에서 관찰되었다. 또한, 상단과 하단에서 PRP의 구간 패턴이 다릅니다 아래 분수에서 발견 PRP가 지배적 낮은 밴드가 있으며 상단 분수에서 발견 PRP는 지배적 인 위 밴드가 있습니다. PK-처리 PRP SC는 얼룩의 오른쪽에있는 컨트롤로로드했습니다. <iMG ALT = &quot;그림 3&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/3788/3788fig3.jpg&quot;/&gt; 그림 3. 수용성과 불용성 PRP C의 oligomers의 감지. 보통 인간의 두뇌에서 수용성과 불용성 PRP의 C는 ultracentrifugation으로 구분하고 각각, 젤 여과를 받게되었다. 개인 분수의 분자 크기는 분자 질량 마커의 그룹을 실행하여 측정 하였다. sCJD 뇌 샘플에서 (A) PRP SC 종. PRP 종의 두 인구가 감지되었습니다 겔 여과 분수 49 - 분수 27-33 큰 집계를 포함하는 반면 65, 단량체 작은 oligomers가 포함되어 있습니다. 일반 컨트롤 용해 분율 (S2) (B)와 불용성 분율 (P2) (C)에서 PRP C 종가 감지되었습니다. PRP는 3F4 항체를 탐지되었습니다. Dimers (분수 55)과 PRP의 tetramers (일부 51) P2에서뿐만 아니라 정상적인 뇌 sampl의 S2에서뿐만 아니라 발견되었습니다에스 (B와 C). 대형 집계는 일반 샘플 (C)의 P2에서 발견되었습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig4.jpg" /> 그림 4. 보통 인간의 두뇌에서 g5p 강화 준비의 다양한 PK 방지 iPrP 조각의 탐지. g5p이 풍부한 샘플은 서양 (왼쪽 패널), 1E4는 1E4 에피토프 (가운데 패널)에 동일한 순서를 가진 합성 펩타이드와 1E4 사전 incubated과 프로빙 blotting 이전에 PK 및 PNGase의 F로 치료하고, 반 C (한 오른쪽 패널). 1E4 세 PK 방지 PRP 조각이 칭했다 감지 PRP * 20, PRP * 19 및 PRP * 7 (왼쪽 패널). 펩타이드와 1E4 차단 후, 더 PRP 해상도는 1E4로 감지 대역 PRP 조각임을 나타냅니다 (가운데 패널) 발견되지 않았습니다. 안티-C는 두 또한 PK 방지 PRP 조각이 칭했다 공개 PRP * 18 PRP-CTF12 /13, PRP의 * 20을 기입해야합니다.

<ol><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions.+Proc%5BTitle%5D)+AND+%22Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li>
<li>Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li>
<li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li>
<li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li>
<li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+%28SAF%29+has+the+same+size%2C+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+%28PrP%29%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li>
<li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li>
<li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+prions+lying+in+wait%3A+a+two-hit+model+of+prion%2Famyloid+formation+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li>
<li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li>
<li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li>
<li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li>
<li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li>
<li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variably+protease-sensitive+prionopathy%3A+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li>
<li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li>
<li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G. Characterization of prion proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZou%2C+WQ+%22Methods+in+Molecular+Biology-Neurogenetics%3A+Methods+and+Protocols%22">Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols</a>. Potter, N. T. , Humana Press Inc. Totowa. 305-314 (2002).</li>
<li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에보고 된 접근 방식의 조합은 정상적인 인간의 뇌에서 지속적으로 불용성 PRP C 집계 및 가용성 PRP C의 oligomers를 분리합니다. 1 시간 100,000 XG의 Ultracentrifugation는 널리 가용성 PRP C 14 일부터 불용성 PRP SC의 분리에 사용 된 고전적인 방법입니다. 가,주의 중 하나를 효율적이지만 원심 분리 한 후 (S2) 표면에 뜨는 당기는 동안 오염을 방지하는 것입니다. iPrP C의 젤 프로필 PRP C의 구별이기 때문에 P2 분수에서 검색된 PRP는 S2의 오염으로 인한 않을 수도 있습니다. 자당 기울기 침강 분석들은 밀도, 크기 및 모양 15 일 기준으로 다양한 PRP SC 종을 분리하는 데 사용되었습니다. 우리는 분수 (12)는 이러한 비율은 설명 할 수없는 할 수 있습니다 몇 가지 입자가 포함 된 것으로 나타났습니다....

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> Phenylmethylsulfonyl 불소 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P7626 </td><td> 2 - 프로 파놀에서 72 MM </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P2308 </td><td> H 2 O 2 MG / ML </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> LE-80K, SW55 로터를 Ultracentrifuge </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> 부품 번호 365668, 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR 비즈 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> 악타 FPLC 시스템 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> 분자량 마커 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> MWGF200 </td><td> 다양 </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 자성 비즈 </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3F4 항체 </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> 1E4 항체 </td><td> 세포 과학 </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> 준비 젤 15% 트리스 - HCL 사전 주조 젤 </td><td> 바이오 RAD </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

보통 인간의 뇌에 용해와 불용성 prp의 oligomers의 절연

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

prion 질환의 pathogenesis에 중심 이벤트가 병원성 이소 형 PRP SC 하나에 호스트 인코딩 세포 prion 단백질 PRP C의 전환을 포함한다. PRP SC는 세제 - 불용성 응집체를 형성하고 PK 2-6로 부분적으로 강한 반면 PRP C는 세제 - 용해와 proteinase K (PK) - 소화에 민감합니다. PRP SC에 PRP C의 변환은 단백질의 β-시트 구조로 α-나선형의 conformational 변화를 포함하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나, 생체 경로에있는이 아직 제대로 이해된다. 임시 내생 PRP SC, 중급 PRP * 또는 &quot;자동 prion&quot;는 감염되지 않은 뇌 7에서 확인되지 않았습니다. biophysical 및 생화학 방법의 조합을 사용하여, 우리는 감염되지 않은 포유류의 두뇌와 neuronal 양식에서 불용성 PRP C 집계를 (지정 iPrP C) 확인세포 8, 9. 여기, 우리는 세제 버퍼, 자당 단계 기울기 침강, 크기 제외 크로마토 그래피, 특히 구조적으로 변경 PRP 양식 10, PK-치료에 바인딩 유전자 5 단백질 (g5p)로 iPrP 농축에 ultracentrifugation을 포함한 이러한 방법에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 이러한 접근 방식의 조합은 불용성 PRP SC와 PRP C 합산뿐만 아니라 정상적인 인간의 뇌에서 용해 PRP C의 oligomers뿐만 아니라를 분리합니다. 프로토콜은 감염된 두뇌와 감염되지 않은 뇌의 iPrP C에서 PRP SC를 모두 분리하는 데 사용되었습니다 여기에 설명 된 이후, 사람들은 물리 기능, neurotoxicity, 두 isoforms 사이의 감염의 차이를 비교 할 수있는 기회를 제공. 이러한 연구는 크게 전염성 proteinaceous 병원균의 우리의 이해를 향상됩니다. iPrP C의 생리학과 pathophysiology는 현재 불분명합니다. 특히, 새로 이드entified 인간 prion 질환은 단백 분해 효소에 민감한 prionopathy variably이라고한다, 우리는 iPrP C 11, 12과 immunoreactive 행동과 분열을 공유하는 PRP SC를 발견했다. 또한, 우리는 최근 iPrP C는 알츠하이머 병 13 아밀로이드-β 단백질과 상호 작용의 주요 수종입니다 보여 주었다. 같은 연구에서,이 방법은 다른 neurodegenerative 장애에 관여하지 않는 prion 단백질 응집체에 자신의 응용 프로그램을 제안, 알츠하이머 병 13 Abeta 집계 및 oligomers를 분리하는 데 사용되었습니다.

세포 prion 단백질의 새로운 종 (PRP<sup&gt; C</sup&gt;) 최근 여기에 설명 된 방법을 사용하여 감염되지 않은 인간의 뇌에서 발견되었습니다. 그들 중 일부는 인간의 두뇌에서 다른 misfolded 단백질 응집체를 분리에 유용합니다 동안 이러한 방법은 다양한 PRP 종을 분리하는 데 사용할 수 있습니다.

보통 인간의 뇌에 용해와 불용성 PRP의 Oligomers의 절연

프리온 질환의 병인에서 핵심적인 사건은 숙주가 인코딩하는 세포 프리온 단백질인 PrPC가 병원성 동형 단백질로 전환되는 것입니다...

본 절차의 목적은 정상 인간 뇌의 모든 인대에서 수용성 및 불용성 프리온 단백질 또는 PRP를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 인간 뇌 조직을 균질화하고 분획을 분리함으로써 수행됩니다. 다음으로 수크로스 단계별 구배를 이용한 속도 침강법을 실시합니다.그다음 크기 배제 크로마토그래피를 수행합니다. 마지막으로, PRP를 gene five protein 또는 G five P로 캡처합니다. 결과적으로, 자당 단계 구배 초원심분리, 크기 배제 크로마토그래피 및 G five P를 이용한 PRP 캡처를 통해 정상 인간 뇌로부터 수용성 및 불용성 PRP 또는 리가먼트를 분리할 수 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 크로이츠펠트-야콥병, 보바운틴 뇌병증 및 임상적 소모성 질환을 포함하여 프리온 질환 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 프리온 질환뿐만 아니라 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 다른 질환에 대해서도 수용성 및 불용성 단백질 응집체의 분리에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.일반적으로 이러한 방법에 익숙하지 않은 개인들은 모든 실험 단계가 중요하며 세심한 주의가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. SEC Fi의 깊이 조절과 G five P를 이용한 PRP 캡처 단계는 설명하기 어렵고 정밀한 조작 없이는 제대로 수행되지 않을 수 있으므로, 이에 대한 비디오 시연이 매우 중요합니다. 뇌 균질액을 준비하려면, 전동 페스틀을 사용하여 100 mg의 냉동 뇌 조직에 100 µL의 용해 버퍼를 추가하는 것으로 시작하십시오. 얼음 위에서 조직을 균질화하고, 드라이아이스 위에서 5분 동안 냉동시킨 후 다시 한번 균질화하십시오.용해 버퍼(lysis buffer)를 각각 300 µL 또는 800 µL 첨가하여 20% 또는 10% 전뇌 균질액(total brain homogenate)을 제조합니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 균질액을 4°C에서 1000 G로 10분 동안 원심분리합니다. S SW 55 로터 원심분리기를 사용하여 SNA를 수집하고, S1 분획을 4°C에서 35,000 RPM으로 1시간 동안 원심분리합니다.상층액을 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 웨스턴 블롯용 샘플을 준비하기 위해 세제 불용성 펠릿을 용해 버퍼(lysis buffer)에 현탁합니다. S2 및 P2 분획을 50 µg/mL의 proteinase K와 함께 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.5 mM PMSF와 SDS 샘플 버퍼를 첨가하여 소화를 중단시킵니다. 샘플을 10분 동안 끓인 후 실온에서 5분 동안 방치합니다. 속도 침강법(velocity sedimentation)을 수행하려면, 먼저 20% S1 분획 450 µL와 동일한 부피의 2% Sarco X 수용액을 5 mL 원심분리 튜브에 넣고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 60, 30, 25, 20, 15, 10% sucrose를 각각 0.5 mL씩 첨가합니다. 배양된 S1 0.4 mL를 10-60% sucrose 상단에 로딩합니다.SW 55 로터를 사용하여 4°C에서 48,000 RPM으로 1시간 동안 튜브 상단부터 단계 구배 원심분리를 수행합니다. 283 µL씩 12개의 동일한 분획을 수집합니다. 각 분획에서 20 µL를 취해 동일한 부피의 SDS 샘플 버퍼와 혼합합니다.SDS-PAGE 겔 샘플을 준비합니다. 샘플을 10분 동안 끓인 다음, 4분간 방치합니다. 샘플을 1000 G에서 1분 동안 원심분리합니다.그다음, 프리캐스트 젤 크기 배제-크로마토그래피 겔에 로딩하기 전에 볼텍싱합니다. 크로마토그래피는 PRP 분자의 올리고머 상태를 결정하는 데 사용됩니다. 먼저 SUEx 200 HR 비드가 충전된 1 x 30 컬럼에 7가지 개별 분자량 마커를 각각 200 µL씩 로딩하는 것으로 시작합니다.Blue dextran의 용리 부피를 void 부피로 사용하십시오. 크로마토그램과 분획 보유량으로부터 VE의 피크 용리 부피를 계산하십시오. 식 KAV = (V - V zero) / (VT - V zero)를 사용하여 분배 계수 KAV를 계산하십시오.검정 곡선을 생성하려면, 단백질 표준물질의 KAV를 표준물질의 분자량 로그 값에 대해 도식화하십시오. 다음으로, 0.25 milliliters per minute의 유속으로 S one 200 microliters를 컬럼에 주입하십시오.컬럼을 1%cile 용해 버퍼로 세척하고, 분획 수집기를 사용하여 0.25 mL씩 분획을 용출합니다. 각 분획에서 125 µL를 취해 -20 °C에서 미리 냉각시킨 메탄올 500 µL와 함께 2시간 동안 배양합니다. 샘플을 4 °C에서 13,000 G로 30분 동안 원심 분리합니다.Reese, 20 µL의 SDS 샘플 버퍼로 펠렛을 재현탁하고 10분 동안 가열하십시오. 실온까지 식힌 후 15% polyacrylamide 젤에서 분리하십시오. 표준 곡선을 사용하여 G5P 분자를 자성 비드에 결합시키기 위해 회수된 다양한 PRP 종의 분자량을 추정하십시오.100 µg의 G5P를 350 µL의 TOCI 활성화 자성 비드와 함께 1 mL의 PBS에 넣고 37 °C에서 20시간 동안 배양합니다. 외부 자석을 사용하여 G5P 비드를 Eppendorf 튜브 벽면으로 유도한 후 용액을 제거합니다. 비특이적 결합을 차단하기 위해 1 mL의 0.1% BSA 함유 PBS로 비드를 3회 세척합니다.G5P 접합 비드를 0.1% BSA가 포함된 0.2 M Tris-HCl (pH 7.4) 1 mL에서 37°C로 5시간 동안 배양합니다. 그 후 비드를 3회 세척합니다. 마지막 세척액을 제거하고 PRP 분리를 위해 PBS 1 mL를 추가합니다. S1 또는 P2 100 µL를 결합 버퍼 1 mL 내의 G5B 접합 비드 60 µL와 함께 실온에서 3시간 동안 지속적으로 회전시키며 배양합니다.튜브를 자석 위에 놓습니다. 용액을 제거하고 세척 완충액으로 비즈를 3회 세척합니다. 마지막 세척액을 제거하고 SDS 시료 완충액을 첨가합니다.비드를 95°C에서 5분 동안 가열합니다. 샘플을 15% precast 젤에 로딩하고 약 80분 동안 150V에서 전기영동을 수행합니다. 멤브레인을 5% milk/TBST로 블로킹한 후, 단백질을 PVDF 멤브레인으로 70V에서 2시간 동안 전사합니다.PRP 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 3F4, 1E4, anti-N 또는 anti-C 항체를 사용합니다. HRP 접합 2차 항체로 배양한 후, 제조사의 지침에 따라 멤브레인을 화학 발광 용액으로 배양하고 여기에서 보는 것과 같이 필름에 노출시킵니다. 산발성 크로이츠펠트-야코프 병(CJD) 샘플과 비교했을 때, 정상 뇌의 P2 분획에서 소량의 불용성 세포 PRP가 검출되었습니다.하지만 대부분은 S 2 분획에서 회수되었습니다. 불용성 PRP는 전체 PRP의 약 5~25%를 차지하며, 여기에는 전장 및 말단 절단 종이 포함됩니다. 수크로스 단계 구배 침전법을 이용한 분석 결과, 비 CJD 뇌에서 유래한 PRPC의 대부분은 상단 분획에서 회수된 반면, 평소에 거대 응집체가 포함되는 하단 분획 9-11에서도 소량의 PRP가 검출되었습니다. 단량체부터 다양한 병원성 PRP 또는 PRP SC 종들이 존재합니다.CRUT 밸브 야쿱병이 있는 뇌에서 겔 여과법을 통해 더 작은 리간드와 더 큰 응집체를 분리하였습니다. 놀랍게도, 분자량이 2000 kilodaltons 이상인 더 큰 응집체의 소량이 정상 뇌의 불용성 분획에서도 검출되었습니다. 또한, PRPC의 이량체와 사량체는 불용성 분획뿐만 아니라 불용성 분획에서도 검출되었습니다.PK 및 PNGase 처리 후, G5P에 의해 캡처된 PRP를 PRP 97 1 0 5 3에 대한 1E4 항체로 검출하였다. PRP*20, PRP*19 및 PRP*7로 명명된 PK 내성 코어 단편들이 각각 20 kDa, 19 kDa 및 7 kDa에서 이동하는 것이 검출되었다.하지만 one E four 항체를 one E four 에피토프와 동일한 서열을 가진 합성 펩타이드와 함께 사전 배양했을 때는 PRP가 검출되지 않았으며, 이는 one E four에 의해 검출된 밴드들이 PRP 단편임을 나타냅니다. anti C 항체는 약 18 kilodaltons와 약 12 to 13 kilodaltons에서 이동하는 두 가지 서로 다른 PRP 단편을 검출했습니다. PRP ETE 20 Once 방법 외에도.이 기술은 적절히 수행될 경우 4일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 하부 인간 뇌의 발달 이후 수용성 및 불용성 PRP 폴리머를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 뇌 내 PIP 확인 정보를 탐색하기 위해 prion의 운명에 관한 연구의 기틀을 마련했습니다.

isolation-soluble-insoluble-prp-oligomers-normal-human

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 비아밀로이드 단백질의 밀도 구배 원심분리 및 분해를 사용하여 마우스 뇌 조직 추출물에서 아밀로이드 원섬유를 분리하는 프로토콜을 보여줍니다.

뇌 조직 추출물에서 아밀로이드 섬유의 분리

이 비디오는 냉동된 사후 인간 뇌 조직에서 세제 불용성 단백질 응집체를 분리하고 농축하는 과정을 설명합니다. 이는 균질화, 세제 처리, 초음파 처리 및 초원심분리를 포함한 주요 단계를 보여주어 불용성 응집체를 분리하고 정제합니다. 마지막 단계는 추가 분석을 위해 요소 완충액에서 응집체를 용해하는 것입니다.

Isolation of Detergent-Insoluble Protein Aggregates From Human Postmortem Brain Tissue

인간과 쥐의 뇌 조직을위한 요소 / 티오 / SDS 버퍼를 사용하는 일반적인 단백질 추출 프로토콜은 허용 2D-DIGE 미니 2DE의 면역 블롯에 의해 그들의 연속 특성에 의한 단백질의 indentification. 이 방법은 인간의 조직 검사 및 실험 모델에서 더 많은 재현성 및 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 하나를 할 수 있습니다.

합의 뇌 유래 단백질, 2D-DIGE 미니 2DE 면역 블롯을 모두 사용하여 인간과 쥐과 뇌 프로테옴 연구를 위해 추출 프로토콜

여기에서는 사후 인간 뇌 조직에서 점점 더 불용성/응집된 알파-시누클레인(α-syn)을 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세제 강도가 증가하는 완충액과 고속 초원심분리 기술을 통해 병든 조직과 그렇지 않은 조직에서 α-syn 응집의 다양한 특성을 검사할 수 있습니다.

파킨슨 뇌에서, 수용성 알파 시누 클레인의 순차 추출

여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다.

뇌막 분획 화 :<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localization 평가 방법

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 약식된 분류 프로토콜 설명 되어 있습니다.

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축

메서드는 마우스 두뇌와 셀 문화에서 불용 해 성과 녹는 돌연변이 huntingtin 종의 분류에 대 한 설명 되어 있습니다. 설명 하는 메서드는 특성화 및 정량화 huntingtin 단백질 플럭스와 단백질 항상성 질병 병 인에 고 섭의 존재를 분석...

가용성과 불용 성 Huntingtin의 해상도 대 한 분류

인간의 뇌 조직에서 분리 된 뇌 모세 혈관 장벽 기능 생리 및 병 태 생리 조건에서 공부 하는 전 임상 모델으로 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관을 분리 하는 최적화 된 프로토콜을 제시.

신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관의 절연

여기, 쥐 뇌 microvessels의 격리에 대 한 고 막 샘플의 준비에 대 한 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 허용 단백질와 개별 동물에서 항복 하는 풍부한 microvessel 생산의 명확한 장점이 있습니다. 샘플은 다음 뇌 microvascular 내 피에 강력한 단백질 분석에 사용할 수 있습니다.

신선 하 게 고립 된 쥐 두뇌 Microvessels에서 막 샘플을 준비 하는 간단 하 고 재현할 수 방법

질량 분광법 기반 프로테오믹 분석을 통한 이 생화학적 정제 방법은 아밀로이드 피브릴 코어의 강력한 특성화를 용이하게 하며, 이는 알츠하이머병 예방을 위한 표적의 식별을 가속화할 수 있다.

뇌에서 아밀로이드 피브릴 코어의 생화학 적 정제 및 프로테오믹 특성화

학습하세요 정상 인간 뇌 조직에서 가용성 및 불용성 프리온 단백질을 분리하는 방법을. 초고속 원심분리와 크로마토그래피 기법을 활용하여 신경퇴행성 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

보통 인간의 뇌에 용해와 불용성 PRP의 Oligomers의 절연

더 많은 동영상 탐색