보통 인간의 뇌에 용해와 불용성 PRP의 Oligomers의 절연

본 절차의 목적은 정상 인간 뇌의 모든 인대에서 수용성 및 불용성 프리온 단백질 또는 PRP를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 인간 뇌 조직을 균질화하고 분획을 분리함으로써 수행됩니다. 다음으로 수크로스 단계별 구배를 이용한 속도 침강법을 실시합니다.

그다음 크기 배제 크로마토그래피를 수행합니다. 마지막으로, PRP를 gene five protein 또는 G five P로 캡처합니다. 결과적으로, 자당 단계 구배 초원심분리, 크기 배제 크로마토그래피 및 G five P를 이용한 PRP 캡처를 통해 정상 인간 뇌로부터 수용성 및 불용성 PRP 또는 리가먼트를 분리할 수 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 크로이츠펠트-야콥병, 보바운틴 뇌병증 및 임상적 소모성 질환을 포함하여 프리온 질환 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 프리온 질환뿐만 아니라 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 다른 질환에 대해서도 수용성 및 불용성 단백질 응집체의 분리에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

일반적으로 이러한 방법에 익숙하지 않은 개인들은 모든 실험 단계가 중요하며 세심한 주의가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. SEC Fi의 깊이 조절과 G five P를 이용한 PRP 캡처 단계는 설명하기 어렵고 정밀한 조작 없이는 제대로 수행되지 않을 수 있으므로, 이에 대한 비디오 시연이 매우 중요합니다. 뇌 균질액을 준비하려면, 전동 페스틀을 사용하여 100 mg의 냉동 뇌 조직에 100 µL의 용해 버퍼를 추가하는 것으로 시작하십시오. 얼음 위에서 조직을 균질화하고, 드라이아이스 위에서 5분 동안 냉동시킨 후 다시 한번 균질화하십시오.

용해 버퍼(lysis buffer)를 각각 300 µL 또는 800 µL 첨가하여 20% 또는 10% 전뇌 균질액(total brain homogenate)을 제조합니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 균질액을 4°C에서 1000 G로 10분 동안 원심분리합니다. S SW 55 로터 원심분리기를 사용하여 SNA를 수집하고, S1 분획을 4°C에서 35,000 RPM으로 1시간 동안 원심분리합니다.

상층액을 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 웨스턴 블롯용 샘플을 준비하기 위해 세제 불용성 펠릿을 용해 버퍼(lysis buffer)에 현탁합니다. S2 및 P2 분획을 50 µg/mL의 proteinase K와 함께 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.

5 mM PMSF와 SDS 샘플 버퍼를 첨가하여 소화를 중단시킵니다. 샘플을 10분 동안 끓인 후 실온에서 5분 동안 방치합니다. 속도 침강법(velocity sedimentation)을 수행하려면, 먼저 20% S1 분획 450 µL와 동일한 부피의 2% Sarco X 수용액을 5 mL 원심분리 튜브에 넣고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 60, 30, 25, 20, 15, 10% sucrose를 각각 0.5 mL씩 첨가합니다. 배양된 S1 0.4 mL를 10-60% sucrose 상단에 로딩합니다.

SW 55 로터를 사용하여 4°C에서 48,000 RPM으로 1시간 동안 튜브 상단부터 단계 구배 원심분리를 수행합니다. 283 µL씩 12개의 동일한 분획을 수집합니다. 각 분획에서 20 µL를 취해 동일한 부피의 SDS 샘플 버퍼와 혼합합니다.

SDS-PAGE 겔 샘플을 준비합니다. 샘플을 10분 동안 끓인 다음, 4분간 방치합니다. 샘플을 1000 G에서 1분 동안 원심분리합니다.

그다음, 프리캐스트 젤 크기 배제-크로마토그래피 겔에 로딩하기 전에 볼텍싱합니다. 크로마토그래피는 PRP 분자의 올리고머 상태를 결정하는 데 사용됩니다. 먼저 SUEx 200 HR 비드가 충전된 1 x 30 컬럼에 7가지 개별 분자량 마커를 각각 200 µL씩 로딩하는 것으로 시작합니다.

Blue dextran의 용리 부피를 void 부피로 사용하십시오. 크로마토그램과 분획 보유량으로부터 VE의 피크 용리 부피를 계산하십시오. 식 KAV = (V - V zero) / (VT - V zero)를 사용하여 분배 계수 KAV를 계산하십시오.

검정 곡선을 생성하려면, 단백질 표준물질의 KAV를 표준물질의 분자량 로그 값에 대해 도식화하십시오. 다음으로, 0.25 milliliters per minute의 유속으로 S one 200 microliters를 컬럼에 주입하십시오.

컬럼을 1%cile 용해 버퍼로 세척하고, 분획 수집기를 사용하여 0.25 mL씩 분획을 용출합니다. 각 분획에서 125 µL를 취해 -20 °C에서 미리 냉각시킨 메탄올 500 µL와 함께 2시간 동안 배양합니다. 샘플을 4 °C에서 13,000 G로 30분 동안 원심 분리합니다.

Reese, 20 µL의 SDS 샘플 버퍼로 펠렛을 재현탁하고 10분 동안 가열하십시오. 실온까지 식힌 후 15% polyacrylamide 젤에서 분리하십시오. 표준 곡선을 사용하여 G5P 분자를 자성 비드에 결합시키기 위해 회수된 다양한 PRP 종의 분자량을 추정하십시오.

100 µg의 G5P를 350 µL의 TOCI 활성화 자성 비드와 함께 1 mL의 PBS에 넣고 37 °C에서 20시간 동안 배양합니다. 외부 자석을 사용하여 G5P 비드를 Eppendorf 튜브 벽면으로 유도한 후 용액을 제거합니다. 비특이적 결합을 차단하기 위해 1 mL의 0.1% BSA 함유 PBS로 비드를 3회 세척합니다.

G5P 접합 비드를 0.1% BSA가 포함된 0.2 M Tris-HCl (pH 7.4) 1 mL에서 37°C로 5시간 동안 배양합니다. 그 후 비드를 3회 세척합니다. 마지막 세척액을 제거하고 PRP 분리를 위해 PBS 1 mL를 추가합니다. S1 또는 P2 100 µL를 결합 버퍼 1 mL 내의 G5B 접합 비드 60 µL와 함께 실온에서 3시간 동안 지속적으로 회전시키며 배양합니다.

튜브를 자석 위에 놓습니다. 용액을 제거하고 세척 완충액으로 비즈를 3회 세척합니다. 마지막 세척액을 제거하고 SDS 시료 완충액을 첨가합니다.

비드를 95°C에서 5분 동안 가열합니다. 샘플을 15% precast 젤에 로딩하고 약 80분 동안 150V에서 전기영동을 수행합니다. 멤브레인을 5% milk/TBST로 블로킹한 후, 단백질을 PVDF 멤브레인으로 70V에서 2시간 동안 전사합니다.

PRP 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 3F4, 1E4, anti-N 또는 anti-C 항체를 사용합니다. HRP 접합 2차 항체로 배양한 후, 제조사의 지침에 따라 멤브레인을 화학 발광 용액으로 배양하고 여기에서 보는 것과 같이 필름에 노출시킵니다. 산발성 크로이츠펠트-야코프 병(CJD) 샘플과 비교했을 때, 정상 뇌의 P2 분획에서 소량의 불용성 세포 PRP가 검출되었습니다.

하지만 대부분은 S 2 분획에서 회수되었습니다. 불용성 PRP는 전체 PRP의 약 5~25%를 차지하며, 여기에는 전장 및 말단 절단 종이 포함됩니다. 수크로스 단계 구배 침전법을 이용한 분석 결과, 비 CJD 뇌에서 유래한 PRPC의 대부분은 상단 분획에서 회수된 반면, 평소에 거대 응집체가 포함되는 하단 분획 9-11에서도 소량의 PRP가 검출되었습니다. 단량체부터 다양한 병원성 PRP 또는 PRP SC 종들이 존재합니다.

CRUT 밸브 야쿱병이 있는 뇌에서 겔 여과법을 통해 더 작은 리간드와 더 큰 응집체를 분리하였습니다. 놀랍게도, 분자량이 2000 kilodaltons 이상인 더 큰 응집체의 소량이 정상 뇌의 불용성 분획에서도 검출되었습니다. 또한, PRPC의 이량체와 사량체는 불용성 분획뿐만 아니라 불용성 분획에서도 검출되었습니다.

PK 및 PNGase 처리 후, G5P에 의해 캡처된 PRP를 PRP 97 1 0 5 3에 대한 1E4 항체로 검출하였다. PRP*20, PRP*19 및 PRP*7로 명명된 PK 내성 코어 단편들이 각각 20 kDa, 19 kDa 및 7 kDa에서 이동하는 것이 검출되었다.

하지만 one E four 항체를 one E four 에피토프와 동일한 서열을 가진 합성 펩타이드와 함께 사전 배양했을 때는 PRP가 검출되지 않았으며, 이는 one E four에 의해 검출된 밴드들이 PRP 단편임을 나타냅니다. anti C 항체는 약 18 kilodaltons와 약 12 to 13 kilodaltons에서 이동하는 두 가지 서로 다른 PRP 단편을 검출했습니다. PRP ETE 20 Once 방법 외에도.

이 기술은 적절히 수행될 경우 4일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 하부 인간 뇌의 발달 이후 수용성 및 불용성 PRP 폴리머를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 뇌 내 PIP 확인 정보를 탐색하기 위해 prion의 운명에 관한 연구의 기틀을 마련했습니다.