의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis Biofilms

이 절차의 전반적인 목표는 모델 유기체의 생물막에서 분화하는 특수 세포의 뚜렷한 하위 집단을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 B 미묘한 염색체에 전사 리포터를 삽입함으로써 수행됩니다. 이러한 리포터는 연구 대상 세포의 하위 집단에서만 독점적으로 발현됩니다.

다음 단계는 생물막 유도 매체인 Ms GG gg에서 B를 미묘하게 성장시켜 생물막의 발달을 촉진하는 것입니다. 생물막이 형성된 후 생물막의 세포는 분산되고 파라 포름알데히드로 고정됩니다. 절차의 마지막 단계는 형광, 현미경 검사 및 유세포 분석을 사용하여 미생물 군집의 단일 세포에서 방출되는 형광 신호를 검출

궁극적으로, 그 결과는 세포가 어떻게 생산하고 분비하도록 분화되었는지를 보여준다. 생물막을 구성하는 세포외 기질(extracellular matrix)은 기질 생산자의 하위 집단(subpopulation)의 분화를 담당하는 신호 분자인 계면활성제를 분비하는 세포와는 다른 하위 집단입니다. 마이크로레이 분석의 Vita Ities 분석을 사용한 전사 발현의 정량화와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 단일 세포 수준에서 유전자 발현을 모니터링하고 특정 유전자를 발현하는 데 특화된 세포의 특히 작은 세포 집단을 시각화

이러한 유전자 발현은 전체 개체군을 분석할 때 검출되지 않습니다. 통합 플라스미드는 B 미묘한 것을 표지하는 데 사용되며 여기에 예가 나와 있습니다. PTAA, tass의 생산을 담당하는 유전자의 프로모터.

매트릭스 단백질은 제한 부위 ECO R 1 및 Hindi 3을 사용하여 벡터로 복제됩니다. CFP 리포터 유전자의 발현은 이제 ptap A의 제어하에 B를 표지하는 절차를 시작하고, 미묘한 효소 분해에 의해 통합 플라스미드를 선형화합니다. 권장되는 제한 효소는 통합 플라스미드가 준비되었을 때 섭씨 37도에서 5시간 동안 역량 유도 배지에서 세포를 성장시켜 B 미묘한 균주 1 68에서 자연 능력을 유도하는 XH oh 1입니다.

유능한 B 미묘한 세포의 배양액에 선형화된 플라스미드를 첨가하고 2시간 후 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양한 후 한천의 세포를 스펙트 마이신으로 플레이트화하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. B 미묘한 염색체에는 Amy, E, E 및 LAC A의 두 개의 중성 유전자좌가 있으며, 이는 생물막의 발달에 영향을 미치지 않고 리포터 융합을 통합하는 데 사용할 수 있습니다. 선형화된 PKM 0 0 8 플라스미드는 이중 재조합에 의해 B 미묘한 게놈에 통합됩니다.

다음 단계는 표지된 균주에서 SPP 1파지 형질도입 프로토콜을 사용하여 생물막을 형성할 수 있는 균주로 리포터를 전송하는 것입니다. 이 비디오에서는 프로토콜의 중요한 단계만 표시됩니다. 공여체 균주 1 68을 성장시켜 배양액이 유리관에서 100 마이크로 리터의 희석 된 파지 스톡에 200 마이크로 리터의 세포에서 초기 고정상에 도달 할 때까지 섭씨 37 도의 TY 배지에서 리포터 융합을 보유한다.

그리고 섭씨 37도에서 15분 동안 서 있습니다. 다음으로, 뜨거운 TY 부드러운 한천을 튜브에 피펫으로 넣고 와류로 완전히 혼합합니다. 신선한 TY 플레이트에 부드럽게 펴 바르고 섭씨 37도에서 8-16시간 동안 배양하여 파지 헤일로가 생성되도록 합니다.

파지 헤일로를 수집하려면 플레이트에 3ml의 TY 배지를 추가하고 유리 피펫을 사용하여 상단 한천을 분해합니다. 한천 현탁액을 15ml 팔콘 튜브로 옮깁니다. 한천을 부드럽게 부수고 1000G에서 15분 동안 원심분리합니다.

상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 포인트 22 미크론 주사기 필터를 통해 상층액을 통과시킵니다. 이 상등액을 사용하여 TY 배지에서 성장한 수용 균주의 배양액을 감염시킵니다.

10 밀리리터를 희석한 배양액 10 밀리리터에 상등액 30 마이크로리터를 첨가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 그 후 5, 000 RPM에서 7 분 동안 원심 분리기를 resus는 펠릿을 200 마이크로 리터의 TY 매체에 현탁시키고 SPECT 마이신과 10 밀리 몰이 들어있는 플레이트에 펴 바릅니다. 구연산나트륨.

섭씨 37도에서 12-36시간 동안 배양합니다. 군체를 선택하고 섭씨 37도의 액체 LB에서 밤새 성장시킵니다. 마지막으로, 고체 생물막 유도 배지에서 하룻밤 배양의 3마이크로리터를 발견합니다.

세포가 섭씨 30도에서 72시간 동안 자라도록 합니다. 3일간의 성장 후, Ms.GG 한천 표면에 형성된 생물막은 한천 표면에 복잡한 형태학적 구조를 발달시킬 것입니다. 이 절차를 시작하려면 이쑤시개나 핀셋을 사용하여 MSGG 한천 표면에서 생물막을 제거합니다.

생물막의 일관성은 한천 표면에서 벗겨질 수 있어야 합니다. 한 조각으로 3 ml의 PBS 완충액에 생물막을 놓고 생물막을 약하게 분산시킵니다. 출력 3과 진폭 0.7초로 12개의 펄스를 수행하여 단일 세포 분석 전에 샘플을 고정합니다.

Resus는 300마이크로리터의 세포 현탁액을 1밀리리터, 4% 파라폼 알데히드 용액에 현탁시키고 실온에서 정확히 7분 동안 배양합니다. 7분 고정 후 PBS 버퍼에서 세포를 세 번 세척합니다. 마지막으로, 형광 현미경 검사 전에 300마이크로리터의 PBS 완충액에 세포를 재현탁합니다.

슬라이드 위에 0.8%agros의 200마이크로리터를 피펫팅하고 다른 슬라이드로 조심스럽게 덮어 현미경 슬라이드를 준비합니다. 2분 후 상단 슬라이드를 부드럽게 제거하여 하단 지점의 슬라이드에 부착된 아그로스 층을 얻습니다. 2 마이크로 리터의 고정 된 세포를 agros 층의 표면에 놓고 현미경 커버 유리로 덮습니다.

샘플을 형광 현미경의 스테이지에 놓습니다. 실험을 위해 선택한 조건에서 형광을 보이지 않는 음성 대조군에 따라 여기 기간을 설정합니다. 노출은 50에서 200밀리초 사이여야 합니다.

형광 이미지와 각 시야에 대한 명시야 이미지를 획득합니다. 유세포 분석을 위해 세포를 준비하려면 약한 초음파 처리로 고정된 세포의 샘플을 분산시킵니다. 출력 5와 진폭 0.7초로 12펄스를 두 번 연속으로 수행하여 세포 용해를 일으키지 않고 덩어리를 단일 세포로 분산시킵니다.

광학 현미경으로 세포 분산의 효율성을 확인합니다. 다음으로, PBS 버퍼에서 샘플 1을 100으로 희석합니다. BD fax canto two 유세포 분석기는 YFP 형광에 대한 분석을 위해 사용됩니다.

5 30 30 필터와 결합된 488나노미터의 레이저 여기(Laser excitation)가 CFP 형광에 사용됩니다. 4 0 8 40 필터와 결합 된 405 나노 미터의 레이저 여기가 사용되며 두 개의 negative control로 유세포 분석기를 보정합니다. 현탁액에 세포가 없는 PBS 버퍼 샘플은 유세포 분석기가 감지한 입자의 크기에 대한 음성 대조군 역할을 해야 합니다.

형광 리포터가 없는 샘플은 흐름의 형광 감도에 대한 음성 대조군 역할을 해야 합니다. 검체 측정량 후에, 각 표본을 위한 유세포 분석기에 있는 형광성 리포터로 레테르를 붙인 표본을 두고십시오, 303 사이 흐름율, 초당 000의 사건을 적어도 50 의 000의 사건을 분석하십시오. B Subtles가 생물막 유도 배지의 플레이트에서 자랄 때, MSGG 생물막 형성은 섭씨 30도에서 3일 배양 후 관찰됩니다.

생물막은 뚜렷하게 참여하는 세포 하위 집단을 나타내는 복잡한 형태학적 구조를 보여줍니다. 예를 들어, 세포외 기질과 생물막의 생산은 군체 표면에 주름을 형성합니다. 이 그림은 형광 현미경 검사법을 사용하여 표지된 단일 균주에서 세포 분화를 시각화하는 예를 보여줍니다.

이 균주는 형광 리포터 Ptap, 파란색으로 착색된 세포를 생산하는 기질의 하위 모집단에서 발현되는 CFP를 보유하고 있습니다. 이 하위 집단은 생물막을 구성하는 세포외 기질을 생성하고 분비합니다. 다음 이미지는 리포터 Ptap, A CFP 및 추가 리포터 P Surfactin YFP를 품고 있는 이중 표지 균주를 형광 현미경으로 시각화한 결과입니다.

이 두 번째 리포터는 신호 분자 계면활성제(surfactin)를 분비하는 세포의 하위 집단을 모니터링할 수 있으며, 이는 매트릭스 생산자의 분화를 위해 신호 캐스케이드(signaling cascade)를 트리거합니다. 여기서, 매트릭스 생산자는 파란색으로 거짓 착색된 반면, 계면활성제 생산자는 노란색으로 거짓 착색되며, 이는 리포터 ptap을 품고 있는 단일 표지된 균주를 사용한 2D 유세포 분석 결과입니다. YFB가 여기에 나와 있습니다.

형광 단백질 유전자가 없는 처리되지 않은 대조군 균주는 ptap을 보유하는 낮은 상대 형광 세포를 가진 단일 집단을 보여주었습니다. 비생물막 유도 조건에서의 YFP는 매트릭스 생산자의 하위 집단을 구별하지 않았으며, 전체 집단도 낮은 상대 형광을 보였다. 대조적으로, 생물막 유도 조건에서, 높은 상대 형광을 가진 세포의 하위 집단은 낮은 상대 형광의 오른쪽에 있는 어깨로 검출되었습니다.

3D 유세포 분석에서 얻은 피크 결과가 여기에 나와 있습니다. 모니터링된 채널의 형광 신호는 YFP의 경우 X축에, CFP의 경우 Y축에 표시되며, 왼쪽 상단 패널에는 배경 형광에 대한 대조군으로 형광 단백질 유전자가 없는 균주가 표시됩니다. 오른쪽 상단 패널에서는 노란색으로 표시된 YFP 형광 채널에서 계면활성제 생산자의 하위 모집단을 검출하기 위해 표지된 단일 균주를 사용했습니다.

왼쪽 하단 패널에서는 다른 단일 라벨링된 균주를 사용하여 매트릭스 생산자의 하위 모집단을 검출했습니다. 파란색 프레임의 CFP 형광 채널에서 이중 표지된 균주를 사용하여 매트릭스 생산자와 계면활성제 생산자의 하위 모집단을 모니터링하고 결과를 제시합니다. 이 오른쪽 하단 패널에서.

높은 수준의 형광 리포터를 발현하는 세포의 두 개의 하위 집단이 검출됩니다. 각 집단은 특화된 세포의 두 하위 집단 사이에 기자의 발현에 중복이 없음을 보여주는 프레임이 있습니다. 이 최종 그림은 3D 유세포 분석에 의한 매트릭스 생산자와 식인종의 하위 모집단의 정량화를 보여줍니다.

오른쪽 상단 패널에서는 단일 표지된 균주를 사용하여 식인종의 하위 개체군을 감지했습니다. 노란색으로 둘러싸인 YFP 형광 채널에서 이 식인종의 하위 집단은 매트릭스 생산자의 하위 집단과 조정적으로 구별되는 것으로 설명되었습니다. 왼쪽 하단 패널에서 매트릭스 생산자의 하위 모집단은 CFP 형광 채널의 다른 단일 표지된 균주에서 검출됩니다.

파란색 프레임으로 표시된 오른쪽 하단 패널의 이중 표지된 균주의 결과는 녹색으로 프레임된 CFP의 YFP를 모두 발현하는 형광 세포의 단일 하위 모집단을 보여주었습니다. 두 리포터의 동시 발현은 두 세포 분화 경로가 동일한 하위 모집단에서 좌표 활성화됨을 나타냅니다. 이 동영상을 시청한 후에는 형광 현미경 검사 또는 유세포 분석과 같은 세포 집단의 세포 분석을 사용하여 미생물 생물막을 구성하는 세포의 뚜렷한 하위 집단을 시각화하고 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.