의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis Biofilms

이 실험 절차의 전반적인 목표는 모델 생물인 bacillus subtles의 바이오필름에서 분화되는 특수 세포의 뚜렷한 하위 집단들을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 B subtles의 염색체에 전사 리포터를 삽입합니다. 이러한 리포터는 연구 대상이 되는 세포 하위 집단에서만 선택적으로 발현됩니다.

다음 단계는 바이오필름 유도 배지인 Ms GG gg에서 B subtles를 배양하여 바이오필름의 형성을 촉진하는 것입니다. 바이오필름이 형성된 후, 바이오필름 내의 세포들을 분산시키고 para formaldehyde로 고정합니다. 절차의 마지막 단계는 형광 현미경과 유세포 분석기를 사용하여 미생물 군집의 단일 세포에서 방출되는 형광 신호를 검출하는 것입니다.

궁극적으로, 이 결과는 세포가 생산 및 분비를 위해 어떻게 전문화되는지를 보여줍니다. 바이오필름을 구성하는 세포외 기질을 생성하는 세포들은 계면활성제를 분비하는 세포들과는 다른 하위 집단이며, 이 계면활성제는 기질 생성 하위 집단의 분화를 유도하는 신호 분자입니다. Viability 분석이나 마이크로어레이 분석을 이용한 전사 발현 정량화와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 단일 세포 수준에서 유전자 발현을 모니터링할 수 있으며 특정 유전자를 발현하도록 전문화된 특히 작은 규모의 세포 집단을 시각화할 수 있다는 점입니다.

전체 집단을 분석할 때는 이러한 유전자 발현이 검출되지 않습니다. B subtles를 표지하기 위해 통합 플라스미드가 사용되며, 그 예가 여기에 제시되어 있습니다. PTAA는 tass 생산을 담당하는 유전자들의 프로모터입니다.

제한 효소 부위 ECO R one 및 Hindi three를 사용하여 매트릭스 단백질을 벡터에 클로닝합니다. 이제 CFP 리포터 유전자의 발현은 ptap A의 조절을 받습니다. B. subtiles 표지를 위한 절차를 시작하려면, 효소 소화를 통해 통합 플라스미드를 선형화합니다. 권장되는 제한 효소는 XH oh one입니다. 통합 플라스미드가 준비되면, B. subtiles 균주 1 68 세포를 역능 유도 배지에서 37 °C로 5시간 동안 배양하여 자연적 형질전환 능력을 유도합니다.

선형화된 플라스미드를 컴피턴트 B subtlest 세포 배양액에 첨가하고 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후, 세포를 spect mycin이 함유된 한천 배지에 도말하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. B subtles 염색체에는 biofilm의 발달에 영향을 주지 않고 리포터 퓨전을 통합시킬 수 있는 두 개의 중립적 궤적(loci)인 Amy, E, E 및 LAC A가 있습니다. 선형화된 PKM 0 0 8 플라스미드는 이중 재조합을 통해 B subtles의 게놈에 통합됩니다.

다음 단계는 SPP 1 파지 형질 도입 프로토콜을 사용하여 표지된 균주로부터 리포터를 바이오필름을 형성할 수 있는 균주로 옮기는 것입니다. 본 영상에서는 프로토콜의 주요 단계만 보여줍니다. 리포터 융합 단백질을 보유한 공여 균주 1 68을 TY 배지에서 37°C로 배양하여 배양액이 초기 정지기에 도달할 때까지 키운 후, 유리 튜브에 200 µL의 세포와 100 µL의 희석된 파지 스톡을 넣습니다.

그리고 37 °C에서 15분 동안 방치합니다. 다음으로, 가열된 TY soft agar를 튜브에 피펫팅하고 볼텍싱하여 충분히 혼합합니다. 이를 새로운 TY 플레이트에 부드럽게 도말한 후 37 °C에서 8~16시간 동안 배양하여 파지 halo가 형성되도록 합니다.

파지 halo를 수집하려면, 플레이트에 TY 배지 3 mL를 넣고 유리 피펫을 사용하여 상층 한천을 깨뜨립니다. 한천 현탁액을 15 mL 팔콘 튜브로 옮깁니다. 부드럽게 볼텍싱하여 한천을 분쇄한 후, 1000 G에서 15분 동안 원심분리합니다.

상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 상층액을 22 micron 시린지 필터로 여과합니다. 이 상층액을 사용하여 TY 배지에서 배양한 수용 균주 배양액을 감염시킵니다.

1/10로 희석한 배양액 10 mL에 상층액 30 µL를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그 후 5,000 RPM에서 7분 동안 원심분리하고, 펠렛을 200 µL의 TY 배지로 재현탁하여 10 mM 소듐 시트레이트가 포함된 SPECTmycin 플레이트에 도말합니다.

37°C에서 12~36시간 동안 배양합니다. 콜로니를 선택하여 37°C의 액체 LB 배지에서 하룻밤 동안 배양합니다. 마지막으로, 하룻밤 동안 배양한 배양액 3µL를 고체 바이오필름 유도 배지에 스팟팅합니다.

세포를 30°C에서 72시간 동안 배양합니다. 3일간의 배양 후, Ms.GG agar 표면에 형성된 바이오필름은 agar 표면에서 복잡한 형태학적 구조를 발달시킵니다. 이 절차를 시작하려면 이쑤시개나 핀셋을 사용하여 MSGG agar 표면에서 바이오필름을 제거하십시오.

바이오필름의 점도는 한천 표면에서 벗겨낼 수 있을 정도여야 합니다. 바이오필름을 한 조각으로 떼어 3 mL의 PBS 완충액에 넣고, 가볍게 분산시킵니다. 단일 세포 분석 전 샘플을 고정하기 위해 출력 3, 진폭 0.7초로 12회 펄스를 가합니다.

세포 현탁액 300 µL를 4% 파라포름알데히드 용액 1 mL에 재현탁하고 상온에서 정확히 7분 동안 배양합니다. 7분간의 고정 후, PBS 버퍼로 세포를 3회 세척합니다. 마지막으로 형광 현미경 관찰 전, 세포를 300 µL의 PBS 버퍼에 재현탁합니다.

슬라이드 위에 0.8% agros 200 µL를 피펫팅하고 다른 슬라이드로 조심스럽게 덮어 현미경 슬라이드를 준비합니다. 2분 후, 위쪽 슬라이드를 조심스럽게 제거하여 하단 슬라이드 지점에 부착된 agros 층을 얻습니다. agros 층 표면에 고정된 세포 2 µL를 분주하고 현미경 커버 글라스로 덮습니다.

시료를 형광 현미경의 스테이지 위에 놓습니다. 실험을 위해 선택한 조건에서 형광이 나타나지 않는 음성 대조군에 맞추어 여기 시간을 설정합니다. 노출 시간은 50에서 200 milliseconds 사이여야 합니다.

각 시야(field of view)에 대해 형광 이미지와 명시야 이미지를 모두 획득합니다. 유세포 분석을 위해 세포를 준비하려면, 가벼운 초음파 처리를 통해 고정된 세포 샘플을 분산시킵니다. 세포 용해를 일으키지 않으면서 덩어리를 단일 세포로 분산시키기 위해, 출력 5, 진폭 0.7초 설정으로 12회 펄스를 두 차례 반복 실시합니다.

광학 현미경으로 세포 분산 효율을 확인합니다. 다음으로, 샘플을 PBS 버퍼로 1:100 비율로 희석합니다. YFP 형광 분석을 위해 BD FACS Canto II 유세포 분석기를 사용합니다.

CFP 형광 분석을 위해 488 nm 레이저 여기와 530/30 필터를 사용합니다. 405 nm 레이저 여기와 408/40 필터를 사용하며, 두 가지 음성 대조군을 이용해 유세포 분석기를 보정합니다. 세포가 현탁되지 않은 PBS 버퍼 샘플을 유세포 분석기에서 감지되는 입자 크기의 음성 대조군으로 사용해야 합니다.

형광 리포터가 없는 샘플을 유세포 분석기의 형광 민감도에 대한 음성 대조군으로 사용해야 합니다. 보정 후, 각 샘플에 대해 형광 리포터로 표지된 샘플을 유세포 분석기에 넣고, 초당 303,000 이벤트 사이의 유속으로 최소 50,000 이벤트를 분석하십시오. B Subtles가 바이오필름 유도 배지 플레이트에서 성장할 때, 30 °C에서 3일 동안 배양한 후 MSGG 바이오필름 형성이 관찰됩니다.

바이오필름은 참여하는 세포 하위 집단이 뚜렷함을 나타내는 복잡한 형태학적 구조를 보여줍니다. 예를 들어, 세포외 기질과 바이오필름의 생성은 콜로니 표면에 주름 형성을 유도합니다. 이 그림은 형광 현미경을 사용하여 단일 표지 균주에서 세포 분화가 시각화된 사례를 보여줍니다.

이 균주는 형광 리포터 Ptap, A CFP를 보유하고 있으며, 이는 파란색으로 표시된 매트릭스 생성 세포의 하위 집단에서 발현됩니다. 이 하위 집단은 바이오필름을 구성하는 세포외 매트릭스를 생성하고 분비합니다. 다음 이미지는 리포터 Ptap, A CFP와 추가 리포터 P Surfactin YFP를 모두 보유한 이중 표지 균주를 형광 현미경으로 시각화한 결과입니다.

이 두 번째 리포터는 매트릭스 생성 세포의 분화를 유도하는 신호 전달 분자인 surfactin을 분비하는 세포 하위 집단을 모니터링할 수 있게 합니다. 여기서는 리포터 ptap를 보유한 단일 표지 균주를 사용한 2D 유세포 분석 결과로, 매트릭스 생성 세포는 파란색으로, surfactant 생성 세포는 노란색으로 가색 표시되었습니다. YFB가 여기에 제시되어 있습니다.

형광 단백질 유전자가 없는 처리되지 않은 대조군 균주는 ptap을 보유한 세포들이 낮은 상대 형광값을 갖는 단일 집단을 나타냈습니다. 바이오필름 비유도 조건에서의 YFP는 기질 생성 서브팝퓰레이션을 구분하지 못했으며, 전체 집단 또한 낮은 상대 형광값을 보였습니다. 이와 대조적으로, 바이오필름 유도 조건에서는 낮은 상대 형광값의 오른쪽에 숄더(shoulder) 형태로 높은 상대 형광값을 가진 세포 서브팝퓰레이션이 검출되었습니다.

3D 유세포 분석을 통해 얻은 피크 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 모니터링된 채널의 형광 신호는 X축에는 YFP, Y axis에는 CFP가 나타나 있으며, 왼쪽 상단 패널은 배경 형광에 대한 대조군으로서 형광 단백질 유전자가 없는 균주를 보여줍니다. 오른쪽 상단 패널에서는 노란색 틀로 표시된 YFP 형광 채널 내에서 서팩틴(surfactin) 생성 서브팝퓰레이션을 검출하기 위해 단일 표지 균주를 사용하였습니다.

왼쪽 하단 패널에서는 매트릭스 생성 서브팝플레이션을 검출하기 위해 다른 단일 표지 균주가 사용되었습니다. 파란색 틀로 표시된 CFP 형광 채널에서는 이중 표지 균주를 사용하여 매트릭스 생성 및 계면활성제 생성 서브팝플레이션을 모니터링하며, 그 결과가 오른쪽 하단 패널에 제시되어 있습니다.

형광 리포터를 높게 발현하는 두 개의 세포 하위 집단이 검출됩니다. 각 집단이 틀로 표시되어 전문화된 두 하위 집단의 세포들 사이에서 리포터 발현의 중첩이 없음을 보여줍니다. 이 마지막 그림은 3D 유세포 분석을 통해 정량화한 기질 생성 세포와 카니발 세포의 하위 집단을 보여줍니다.

우측 상단 패널에서는 단일 표지 균주를 사용하여 카니발(cannibal) 하위 집단을 검출하였습니다. 노란색 테두리의 YFP 형광 채널에서, 이 카니발 하위 집단은 매트릭스 생산자(matrix producer) 하위 집단과 협조적으로 구분되는 것으로 설명되었습니다. 좌측 하단 패널에서는 또 다른 단일 표지 균주의 CFP 형광 채널을 통해 매트릭스 생산자 하위 집단이 검출됩니다.

파란색 테두리로 표시된 오른쪽 하단 패널의 이중 표지 균주 결과는 녹색 테두리로 표시된 CFP와 YFP를 모두 발현하는 형광 세포의 단일 하위 집단을 보여주었습니다. 두 리포터의 동시 발현은 동일한 하위 집단에서 두 가지 세포 분화 경로가 협력적으로 활성화되었음을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 형광 현미경이나 유세포 분석기와 같은 세포 집단 분석법을 사용하여 미생물 바이오필름을 구성하는 서로 다른 세포 하위 집단을 시각화하고 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.