신생아 쥐 뇌 조직의 혼합 Glial 세포 배양의 기본 Microglia 격리

두뇌의 세포 이질에서 기본 microglia를 분리하는 것은 생리적 및 병리 학적 조건에 모두 자신의 역할을 조사하는 것이 필수적이다. 이 프로토콜은 기계적인 고립과 높은 수율과 높은 순도를 제공 혼합 세포 배양 기술에 대한 실용적 기본 microglial 세포에 대해 설명

이 절차의 전반적인 목표는 신생아 쥐의 뇌에서 1차 미세아교세포 배양을 준비하는 것입니다. 이것은 먼저 뇌를 분리하고 수막을 제거함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 뇌를 균질화하고 혼합 신경교 배양을 T 75 플라스크에 도금하는 것입니다.

다음으로, 플라스크는 성상교세포 단층이 합류점에 도달할 때까지 10-14일 동안 배양합니다. 마지막 단계는 플라스크를 흔들어 성상세포 단층 위에서 자라는 미세아교세포를 방출하여 미세아교세포를 정제하는 배양을 하는 것입니다. 궁극적으로, 고순도 1차 미세아교세포는 후속 시험관 내 단일 세포 배양 및 공동 배양 분석에 사용할 수 있습니다.

Perico gradient 방법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 공칭 기계적 파괴가 미세아교세포 기능 장애 또는 활성화를 최소화하고 초기 준비 후 몇 주 동안 실험을 위한 미세아교세포를 생성할 수 있다는 것입니다. 저는 Dr.Clifton Dau 가드 연구실의 대학원생인 Tammy Tero와 함께 이 절차를 시연할 것입니다. 이 프로토콜 동안 달성된 고순도 미세아교세포 배양은 병리학적 질병 상태뿐만 아니라 정상적인 생리학적 조건에서 미세아교세포 기능을 연구하기 위한 시험관 내 실험에 사용할 수 있습니다.

미세아교세포, 조직 손상에 대한 반응성 및 염증성 자극은 신경학적 손상 및 신경퇴행성 질환 상태와 직접적인 관련이 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 1차 미세아교세포 배양에서 섬유아세포 오염을 줄이기 위해 적시에 뇌 조직에서 수막을 제거하는 방법에 익숙하지 않기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 또한, 플라스크를 흔들고 미세아교세포 배양을 취급하는 동안 성상세포 단층을 손상시키지 않도록 주의해야 합니다.

절차를 준비하기 위해 Chi Livi는 L 15 매체에서 섭씨 4도까지 L 15 매체를 준비하고 L 15 매체를 포함하는 60 x 15mm 페트리 접시를 준비하고 얼음 위에 놓습니다. 배양 배지를 섭씨 37도로 가열하고 모든 수술 도구가 멸균되었는지 확인합니다. 날카로운 가위로 P 1에서 P 5 마리의 새끼 쥐의 목을 베고 머리를 70 % 에탄올에 떨어 뜨립니다.

새끼 쥐 5마리의 머리를 채취한 후 머리를 식염수로 옮깁니다. 귀 위의 두개골 양쪽을 조심스럽게 절개하여 각 머리에서 전체 뇌를 제거하고 뇌를 꺼내 얼음 위의 L 15 매체가 들어 있는 페트리 문제 중 하나에 넣습니다. 처음 5개의 뇌가 얼음 위의 L 15로 이식되면 모든 뇌를 채취했을 때 다음 5마리의 새끼도 동일한 방식으로 처리할 수 있습니다.

집게로 수막의 가장자리를 부드럽게 잡고 아래에 있는 피질에서 조심스럽게 벗겨내어 수막을 제거합니다. 수막을 철저히 제거하고 가능한 한 빨리 제거하는 것이 중요합니다. 수막을 제거한 후 각 뇌를 얼음 위에 올려 L 15 배지의 신선한 페트리 접시에 옮깁니다.

10ml 피펫을 사용하여 플레이트의 뇌 조직과 배지를 멸균된 50ml 원추형 튜브로 흡인합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 2, 500RCF에서 원심분리기를 합니다. 원심분리 흡입 후.

그런 다음 supinate는 멸균 10ml 피펫을 Reese에게 사용합니다. 펠릿을 4-5 밀리리터의 새로운 L 15 배지에 현탁시키고 배지와 조직을 위아래로 10회 피펫팅합니다. 그런 다음 100미크론 공극 세포 여과기를 새 50ml 원뿔형 튜브에 놓습니다.

멸균 5ml 피펫을 사용하여 조직 현탁액을 위아래로 피펫팅한 다음 피펫을 세포 스트레이너로 플러시한 상태에서 셀 스트레이너를 통해 물질을 원뿔형 튜브로 분주합니다. 4-5ml의 신선한 냉각 L 15 매체로 여과기를 헹굽니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 2, 500 RCF를 원심분리하십시오.

처리된 각 새끼 쥐에 대해 각 플라스크에 12ml의 전쟁 전 배양 배지를 추가하여 멸균 T 75 플라스크를 준비합니다. 다음으로, 펠렛화된 세포로부터 sup natant를 흡인시킨 후, 세포 펠렛에 5-6ml의 배양 배지를 첨가하고, 10ml 피펫으로 10회 위아래로 피펫을 합니다. 그런 다음 동일한 부피의 세포 현탁액을 각 T 75 플라스크로 옮깁니다.

섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 1-3주 동안 플라스크를 배양하여 초기 도금 후 처음 5일 동안 세포가 방해받지 않고 앉아있도록 합니다. 5일 후, 각 플라스크의 컨디셔닝된 배지를 12ml의 새 배지로 교체하여 합류점을 달성합니다. 이것은 세포가 부착되는 플라스크의 바닥을 건드리지 않고 매우 조심스럽게 수행되어야 합니다.

혼합된 신경교세포(glial) 배양이 완전히 합류하면 인큐베이터에서 플라스크를 꺼냅니다. 플라스크 캡을 파라메트로 덮어 주변 공기와 가스가 교환되는 것을 방지하고 플라스크를 100RPS 및 섭씨 37도로 설정된 진탕 인큐베이터에 한 시간이 경과한 후 한 시간 동안 배치한 다음 10ml 피펫을 사용하여 성상세포층을 파괴하지 않고 플라스크에서 배지를 수집하고 50ml 원뿔형 튜브로 분배합니다. 플라스크에 새 배지를 추가하고 인큐베이터로 돌아갑니다.

2, 500 RCF에 4 섭씨 온도의 5 분 동안 관을 원심 분리한 후에, supinate를 흡인하고 microglia plating 매체의 1 밀리리터에 있는 세포를 다시 중단하십시오. 그런 다음 인간 유세포 분석기와 표준 절차를 사용하여 세포를 계수합니다. 세포의 수가 결정되면 적절한 부피의 미세아교세포 도금 매체를 추가하여 세포를 만듭니다.

밀리리터 플레이트당 5개의 세포에 2 곱하기 10의 농도가 실험에 적합하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 미세아교세포가 하룻밤 동안 부착될 수 있도록 합니다. 이 세포는 빨간색으로 나타나는 미세아교세포 마커인 IBA one에 특이적인 항체로 면역염색되었습니다.

빨간색으로 나타나는 새로운 NA 신경 마커에 대한 항체를 사용한 면역 염색의 이 현미경 이미지에서 입증된 바와 같이 신경 세포로 배양물의 오염이 최소화됩니다. 슬라이드는 모든 세포핵을 파란색으로 염색하기 위해 DPI로 염색된 카운터입니다. 이 이미지는 GFAP 및 성상교세포 마커를 사용한 면역 염색을 보여줍니다.

성상세포가 녹색으로 나타납니다. 여기에서 우리는 희소돌기아교세포 마커인 CC one에 특이적인 항체로 염색된 미세아교세포 배양 면역의 이미지를 볼 수 있습니다. 희소돌기아교세포가 빨간색으로 나타납니다.

이 히스토그램은 각 세포 유형의 정량화 결과를 보여줍니다. 도금된 미세아교세포 배양액이 순도 90% 이상임을 알 수 있습니다. 이 형광 현미경 이미지는 IBA ONE에 대한 면역 염색된 미세아교세포 배양을 보여줍니다.

빨간색 부분은 형광 표지된 라텍스 비드입니다. 여기에 표시된 미세아교세포 배양액은 밀리리터 리포 다당류당 1나노그램으로 처리되었으며, 미세아교세포가 형광 표지된 라텍스 비드를 식세포작용(phagocytosis)하는 것을 볼 수 있습니다. 여기에서 phagocytosis assay의 결과는 히스토그램으로 표시됩니다.

LPS 치료 후 증가된 식세포작용이 나타납니다. 이 그림은 LPS를 첨가한 후 미세아교세포 배양에서 산화질소 생산도 증가한다는 것을 보여줍니다. 마지막으로, 직접 또는 트랜스웰 삽입 분리된 미세아교세포 뉴런 배양물은 젖산 탈수소효소 방출로 측정된 바와 같이 LPS로 배양 후 세포 사멸 증가에 취약합니다.이 기술의 첫 번째 부분을 마스터하면 T 75로 도금할 때까지 플라스크를 1시간 30분 안에 완료할 수 있으며 전체 절차는 2주 이내에 완료할 수 있습니다.

이 프로토콜을 최적화하는 동안 고려해야 할 또 다른 사항은 기간을 결정하는 것입니다. 혼합된 신경교세포 배양은 고순도 배양물의 확립에 따라 도금을 위해 1차 미세아교세포를 분리하기 전에 유지되어야 합니다. 이 절차를 사용하여 미세아교세포 기능을 질소산화물 생성, 사이토카인 및 케모카인 방출의 체외 측정으로 평가할 수 있을 뿐만 아니라 위상 활성을 모두 일상적인 실험실 분석을 사용하여 측정하고 측정할 수 있습니다.

따라서 이 절차의 개발로 신경과학 분야의 연구자들은 균일한 세포 환경에서 미세아교세포 활성을 탐구하고 다양한 신경학적 조건에서 그 역할을 조사할 수 있는 능력을 갖게 되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신생아 쥐의 뇌에서 1차 미세아교세포 배양을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 먼저 뇌를 분리하고 수막을 제거한 다음 뇌를 균질화하고 플라스크로 도금한 다음 성상세포 단층이 합류할 때까지 10-14일 동안 플라스크를 배양합니다.

마지막 단계는 플라스크를 흔들어 성상세포 단층(astrocyte monolayer) 위에서 자라는 미세아교세포(microglia)를 방출하여 미세아교세포(microglia)를 정제하는 것입니다.