신생아 쥐 뇌 조직의 혼합 Glial 세포 배양의 기본 Microglia 격리

이 실험 절차의 전반적인 목적은 신생 쥐의 뇌로부터 일차 미세아교세포 배양물을 준비하는 것입니다. 이는 우선 뇌를 분리하고 뇌막을 제거함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 뇌 조직을 균질화하고 혼합 글리아 배양물을 T 75 플라스크에 분주하는 것입니다.

다음으로, 성상교세포 단층이 합류(confluence) 상태에 도달할 때까지 플라스크를 10~14일 동안 배양합니다. 마지막 단계로 플라스크를 흔들어 성상교세포 단층 위에서 성장하고 있는 미세아교세포를 분리하면, 정제된 미세아교세포 배양물을 얻을 수 있습니다. 최종적으로 이렇게 얻은 고순도의 일차 미세아교세포는 후속 in vitro 단일 세포 배양 및 공동 배양 분석에 사용할 수 있습니다.

Perico 구배법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 기계적 파쇄를 최소화하여 미세아교세포의 기능 장애나 활성화를 줄일 수 있으며, 초기 준비 후 수 주 동안 실험용 미세아교세포를 생성할 수 있다는 점입니다. 저는 Clifton Dau guard 박사님 연구실의 대학원생인 Tammy Tero와 함께 이 절차를 시연하겠습니다. 이 프로토콜을 통해 얻은 고순도의 미세아교세포 배양물은 정상적인 생리적 조건뿐만 아니라 병리적 질환 상태에서의 미세아교세포 기능을 연구하기 위한 in vitro 실험에 사용될 수 있습니다.

조직 손상 및 염증성 자극에 대한 미세아교세포(Microglia)의 반응성은 신경 손상 및 신경퇴행성 질환 상태와 직접적인 관련이 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 일차 미세아교세포 배양 시 섬유아세포 오염을 줄이기 위해 뇌 조직에서 뇌수막을 신속하게 제거하는 방법에 서툴러 어려움을 겪을 수 있습니다. 또한, 플라스크를 흔들거나 미세아교세포 배양물을 다룰 때 성상교세포 단일층(astrocyte monolayer)이 손상되지 않도록 주의해야 합니다.

절차를 준비하기 위해, L 15 배지를 4°C로 냉각하여 L 15 배지가 담긴 60 x 15 mm 페트리 접시를 준비하고 얼음에 놓습니다. 배양 배지를 37°C로 가온하고 모든 수술 도구가 멸균되었는지 확인합니다. 날카로운 가위로 P1~P5 단계의 쥐 새끼의 머리를 절단한 후, 머리를 70% 에탄올에 넣습니다.

새끼 쥐 5마리의 머리를 수집한 후, 이를 생리식염수로 옮깁니다. 양쪽 귀 윗부분의 두개골 양측을 조심스럽게 절개하여 각 머리에서 전뇌를 분리한 다음, 얼음 위에 놓인 L 15 배지가 들어 있는 Petri 접시 중 하나로 뇌를 꺼내 옮깁니다. 처음 5개의 뇌를 얼음 위 L 15 배지로 옮기고 나면, 모든 뇌가 수집될 때까지 다음 5마리의 새끼 쥐도 동일한 방식으로 처리할 수 있습니다.

포셉으로 뇌수막 시트의 가장자리를 살며시 잡고 하부 피질에서 조심스럽게 벗겨내어 뇌수막을 제거합니다. 뇌수막을 철저하게, 그리고 가능한 한 빠르게 제거하는 것이 중요합니다. 뇌수막을 제거한 후, 각 뇌를 얼음 위에 놓인 L 15 배지가 담긴 새 페트리 접시에 옮깁니다.

10 mL 피펫을 사용하여 플레이트에서 뇌 조직과 배지를 흡입하여 멸균된 50 mL 원심분리관(conical tube)으로 옮깁니다. 그다지 4°C에서 2,500 RCF로 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 흡입하여 제거합니다.

그 다음 멸균된 10 milliliter 피펫을 사용하여 펠렛을 회수합니다. 4~5 milliliters의 신선한 L 15 배지에 펠렛을 현탁하고, 배지와 조직을 10회 정도 피펫팅하여 섞어줍니다. 다음으로 신선한 50 milliliter 원추형 튜브 위에 100 micron 공극의 셀 스트레이너를 배치합니다.

멸균된 5 mL 피펫을 사용하여 조직 현탁액을 위아래로 피펫팅한 다음, 피펫을 세포 스트레이너에 밀착시켜 재료를 세포 스트레이너를 통해 원추형 튜브로 분주합니다. 스트레이너를 4~5 mL의 신선하고 차가운 L 15 배지로 헹굽니다. 그런 다음 4 °C에서 5분 동안 2,500 RCF로 원심분리합니다.

처리된 각 쥐 새끼 뇌당, T 75 플라스크에 12 milliliters의 사전 가온 배양액을 넣어 멸균 플라스크를 준비합니다. 다음으로, 펠릿화된 세포에서 상층액을 흡입하여 제거한 후, 세포 펠릿에 5~6 milliliters의 배양액을 첨가하고 10 milliliter 피펫을 사용하여 10회 반복적으로 피펫팅합니다. 그 후, 동일한 부피의 세포 현탁액을 각 T 75 플라스크로 옮깁니다.

플라스크를 5% carbon dioxide 배양기에서 37 °C로 1~3주 동안 배양하며, 초기 플레이팅 후 처음 5일 동안은 세포가 방해받지 않고 유지되도록 합니다. 5일 후, 각 플라스크의 조건화 배지를 12 mL의 신선한 배지로 교체하여 세포가 합류(confluence) 상태에 도달하게 합니다. 이때 세포가 부착되어 있는 플라스크 바닥에 닿지 않도록 매우 주의해서 수행해야 합니다.

혼합 글리아 배양 세포가 완전히 합류(confluence)되면, 플라스크를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 외부 공기와의 가스 교환을 방지하기 위해 플라스크 캡을 파라필름으로 덮고, 100 RPS 및 37 °C로 설정된 진탕 인큐베이터에 플라스크를 1시간 동안 둡니다. 1시간이 경과한 후, 10 mL 피펫을 사용하여 성상교세포 층을 손상시키지 않고 플라스크에서 배지를 수집하여 50 mL 원추형 튜브에 분주합니다. 플라스크에 신선한 배지를 추가하고 인큐베이터로 다시 넣습니다.

튜브를 4 °C에서 2,500 RCF로 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 1 mL의 microglia plating medium에 세포를 재현탁합니다. 그 다음, 혈구계수기(hemocytometer)와 표준 절차를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 세포 수가 결정되면, 적절한 농도의 세포 수를 맞추기 위해 적절한 부피의 microglial plating media를 추가합니다.

1mL당 2×10⁵ cells 농도로 플레이트에 분주하는 것이 실험에 적절하며, 이를 인큐베이터로 옮깁니다. 미세아교세포(microglia)가 밤새 부착되도록 합니다. 세포들은 미세아교세포 마커인 IBA1에 특이적인 항체로 면역 염색되었으며, 이는 붉은색으로 나타납니다.

빨간색으로 나타나는 새로운 NA 신경 세포 마커 항체를 이용한 면역 염색 현미경 이미지에서 알 수 있듯이, 배양물 내 신경 세포의 오염은 최소 수준입니다. 슬라이드는 모든 세포핵을 파란색으로 염색하기 위해 DPI로 대조 염색되었습니다. 이 이미지는 GFAP와 성상교세포 마커를 이용한 면역 염색 결과를 보여줍니다.

별아교세포는 녹색으로 나타납니다. 여기서는 희소돌기아교세포 마커인 CC1 특이적 항체로 면역 염색한 미세아교세포 배양 이미지입니다. 희소돌기아교세포는 적색으로 나타납니다.

이 히스토그램은 각 세포 유형의 정량 분석 결과를 보여줍니다. 플레이팅된 미세아교세포 배양물의 순도가 90% 이상임을 확인할 수 있습니다. 이 형광 현미경 이미지는 IBA1으로 면역 염색된 미세아교세포 배양물을 보여줍니다.

붉은색 영역은 형광 표지된 라텍스 비드입니다. 여기에 제시된 미세아교세포 배양물은 1 ng/mL의 lipopolysaccharide로 처리되었으며, 미세아교세포가 형광 표지된 라텍스 비드를 식세포 작용으로 섭취했음을 확인할 수 있습니다. 여기서 식세포 작용 분석 결과가 히스토그램으로 표시되어 있습니다.

LPS 처리 후 식세포 작용이 증가하는 것이 관찰됩니다. 이 그림은 LPS 첨가 후 미세아교세포 배양물에서 일산화질소 생성 또한 증가함을 보여줍니다. 마지막으로, 직접 배양 또는 transwell insert로 분리된 미세아교세포-신경세포 공동 배양물 모두 LPS 배양 후 젖산 탈수소효소 방출로 측정했을 때 세포 사멸이 증가하는 것에 취약합니다. 이 기술의 첫 번째 단계인 T 75 플라스크 도말까지의 과정에 숙달되면 1.5시간 이내에 완료할 수 있으며, 전체 과정은 2주 이내에 완료할 수 있습니다.

본 프로토콜을 최적화할 때 고려해야 할 또 다른 사항은 소요 시간을 결정하는 것입니다. 고순도 배양을 확립한 후, 일차 미세아교세포를 분리하여 플레이팅하기 전에 혼합 글리아 배양을 유지해야 합니다. 이 절차를 통해, 일산화질소 생성, 사이토카인 및 케모카인 방출의 in vitro 측정과 위상 활동(phasic activity) 등 미세아교세포의 기능을 일반적인 실험실 분석법을 사용하여 모두 결정하고 측정할 수 있습니다.

따라서 이 절차의 개발을 통해 신경과학 분야의 연구자들은 균질한 세포 환경에서 미세아교세포의 활성을 탐구하고 다양한 신경학적 조건에서의 역할을 조사할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 신생 랫 뇌에서 일차 미세아교세포 배양물을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 먼저 뇌를 분리하고 뇌막을 제거한 다음, 뇌를 균질화하여 플라스크에 분주하고, 성상교세포 단일층이 합류 상태(confluence)에 도달할 때까지 10~14일 동안 플라스크를 배양합니다.

마지막 단계는 플라스크를 흔들어 astrocyte 단층 위에 성장하고 있는 microglia를 분리하는 것이며, 이를 통해 정제된 microglia 배양물을 얻을 수 있습니다.