Name: 신생아 쥐 뇌 조직의 혼합 Glial 세포 배양의 기본 Microglia 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 배우세요 신생아 쥐 뇌에서 기본 미세아교세포를 분리하는 방법을 혼합 신경교 세포 배양을 통해. 이 기술은 높은 순도와 생존율의 세포를 제공하여 신경과학 연구에 활용됩니다.

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1. 신생아 쥐 뇌 조직의 해부 <ol><li> 칠이 Leibovitz의 L-15 에어컨 미디어 (레이 보위 츠 L-15 + 0.1 % BSA + 1 %의 펜 / Strep) ~ 4 ° C. 따뜻한 문화 미디어 (DMEM + 10% FBS + 1% 페니실린 / 스트렙토 마이신) 37 가기 ° C. 얼음 냉방 L-15 미디어의 4-5 ML 4 개의 60x15 mm 배양 접시를 준비합니다. 100 % 에탄올 모든 수술 도구를 소독. </li><li> 70 % 에탄올과 P2 신생아 랩 새끼를 씻어. (P1-P5 사이에 세 신생아 쥐 새끼는이 프로토콜에서 사용할 수 있습니다.) </li><li> 신속 멸균 날카로운 가위로 강아지 쥐의 목을 벨 및 70 % 에탄올로 바로 머리를 놓습니다. 5 쥐 새끼의 총 반복 후 생리 식염수로 머리를 전송합니다. </li><li> 얼음 5 ML L-15 용액 (레이 보위 츠 L-15 + 0.1 % BSA + 1퍼센트 펜 / Strep) - 4 페트리 접시에 머리와 장소에서 전체 두뇌를 제거합니다. </li><li> 1.4 쓰레기의 나머지 새끼 용 - 절차 1.2 반복합니다. </li><li> 두뇌에서 meninges를 제​​거하고 DES를 전송L-15 솔루션의 4-5의 ML과 새로운 배양 접시에 ired 뇌 조직 (즉, 피질, 소뇌, 전체 뇌 등) (레이 보위 츠 L-15 + 0.1 % BSA + 1 %의 펜 / Strep) 얼음. </li></ol> 2. 혼합 Glial 세포 인구의 작성 <ol><li> 가위 혹은 칼날로 손상 뇌 세포없이는 무균 50 ML 원뿔 튜브에 10 ML의 피펫과 조직을 전송합니다. </li><li> 4 ° C.에서 5 분 2,500 RCF에 원뿔 원심 분리기 </li><li> 뜨는을 기음. 신선한 L-15 미디어의 4-5 ML 추가하십시오 (레이 보위 츠 L-15 + 0.1 % BSA + 1 %의 펜 / Strep). </li><li> 멸균 10 ML의 피펫과 피펫은 조직을 위아래로 10 회. </li><li> 신선한 50 ML 원뿔 튜브에 세포 스트레이너 (100 μm의 제품 모공)를 놓습니다. 멸균 5 ML 피펫으로하고 셀 스트레이너에 빠질때 피펫과 피펫 한 조직 위아래은 원뿔 튜브에 세포 스트레이너를 통해 자료를 분배. </li><li> 신선한 L-15 미디어의 4-5 ML (와 세포 스트레이너를 씻어 레이 보위 츠 L-15 + 0.1 % 학사+ 1 %의 펜 / Strep). </li><li> 4에서 5 분 동안 2,500 RCF에서 무한 세포와​​ 원뿔 원심 ° C. </li></ol> 3. 혼합 Glial 세포 문화 도금 및 유지 관리 <ol><li> 각 쥐​​ 새끼 머리가 처리된 경우, 문화, 미디어의 12 ML 추가하여 한 멸균 T-75 플라스크를 준비 (를 DMEM + 10% FBS + 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신) 각 플라스크에.에게 </li><li> pelleted 세포에서 뜨는을 기음과 세포 펠렛으로 문화 미디어의 5-6 ML을 추가합니다. 10 ML의 피펫으로 10 배 아래로 피펫합니다. </li><li> 각 T-75 플라스크에 세포 현탁액의 동등한 볼륨을 전송합니다. </li><li> 1~3주 총 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 flasks을 품어. </li><li> Flasks는 처음 5 일 동안 incubated, 그리고 다섯 번째 날에, 신선한 매체의 12 ML 각 플라스크에 문화 미디어를 교체하고 인큐베이터로 돌아가려한다. 그런 다음, 매 3 일 합류를 달성하기위한 새로운 매체의 12 ML 각 플라스크에 갖추어진 미디어를 대체합니다. 이것은 어떻게해야NE는 매우 신중하게 세포 부착 flasks의 바닥에 닿지 않고. </li></ol> 4. 차 Microglia의 분리 및 도금 <ol><li> 혼합 glial 문화가 완전히 합류 후에는 인큐베이터에서 flasks를 제거하고 환경 공기 가스 교환을 방지하기 parafilm있는 술병 뚜껑을 포괄합니다. </li><li> 37에서 1 시간 동안 100 rps (랩 동반자 SI-600, Jeio 테크)에서 flasks 흔들어 ° C. </li><li> 플라스크 표면에 astrocyte 레이어를 중단하지 않고 10 ML의 피펫을 가진 모든 flasks에서 미디어를 수집합니다. 50 ML 원뿔 튜브에 미디어를 넣습니다. 인큐베이터에 flasks 및 반품 flasks에 신선한 미디어를 추가합니다. </li><li> 4에서 5 분 동안 2,500 RCF에서 원뿔 튜브를 원심 ° C. </li><li> 모든 원뿔 튜브의 표면에 뜨는을 기음. 세포 펠렛은 고순도 microglia 세포입니다. microglia 도금 미디어 (DMEM + 10 % FES + 1% 페니실린 / 스트렙토 마이신) 1 ML에 Resuspend 쥐똥. </li><li> 사용 resuspended 매체 셀 밀도를 세어hemocytometer. </li><li> ML 밀도 당 2 X 10e5 세포를 달성하기 위해 microglia 도금 매체의 적절한 볼륨을 추가합니다. 실험 분석을 위해 적절한 플레이트. </li><li> microglia는 하룻밤 사이에 부착하도록 허용합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 프로토콜은 고순도 기본 microglia 문화에 결과를 위에서 설명한. 로 대식 세포 / 세포 microglia 특정 마커 (Iba1)에 immunohistochemistry에 의해 결정, 도금 microglia 문화 정보&gt; 90% 순수 (그림 2)입니다. 또한 astrocyte, oligodendrocyte 및 신경 세포 세포 특정 마커에 대해 더럽히는 것은 최소한의 오염 (그림 2)를 보여줍니다. 혼합 glial 세포 문화를 맺은 후, microglia은 4 연속 시간까지 흔들어에 의해 격리 수 있습니다. 초기 microglia 절연은 약 2.2 X 106 세포 / ML 또는 10 flasks 및 예상 수확량 약 9,000,000 세포가 각각의 연속된 SHA와 감소를 얻을 것입니다KE. 이 방법에 의해 격리 Microglia는 phagocytosis 능력과 같은 질소 산화물 생산과 같은 기능과 독성의 연결 (그림 3) 13-14를 조사하기 위해 성공적으로 사용되었습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig1.jpg" /> 그림 1. 혼합 glial 세포 배양 및 기본 microglia의 절연을 준비하기위한 프로토콜의 개요. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig2.jpg" /> 그림 2. 같은 astrocyte microglia (Iba-1, 빨강), (GFAP, 녹색), 신경 세포 (NeuN, 빨강)와 oligodendrocyte를 사용 immunohistochemical 분석에 의해 검증 고순도 microglia의 절연 (CC1, 빨강) 특정 마커. DAPI (파란색)에 의해 문화에 세포의 DNA를 염색법도 표시됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig3.jpg" /> 그림 3. Microglia는 방법 descri에 고립침대를 포함한 assays의 숫자에 사용하지만, phagocytosis의 assays, 함수 assays와 neurotoxicity 연구에 국한되지되었습니다. 이러한 연구에서 우리는 () 또는 LPS (B) 처리 미디어, 계량하실 수 있습니다 fluorescently 레이블 라텍스 구슬 (빨간색), (그들의 phagocytosis를 증가 microglia (Iba-1 양성, 녹색)를 통제할 수 있도록 노출된 경우 것으로 나타났습니다 C). 또한, LPS (1ng/ml) 치료는 microglia (D)에서 질소 산화물의 생산을 늘릴 수 있습니다. 마지막으로, transwell 삽입 구분 또는 직접 microglia - 신경 세포 배양 모두를 통해, 우리는 락트 산 탈수소 효소 (LDH) 릴리스 (E, F)에 의해 측정으로 LPS와 incubated microglia가의 연결을 세포 죽음을 유도 것으로 나타났습니다.

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이 프로토콜은 정기적으로 연구 실험을위한 순수하고 건강한 microglia를 생성하기 위해 이용되는 동안 절차의 중요한 부분 중에 기술적인 관점의 신중한 검토가 고립된 microglia의 변화를 최소화합니다. 첫째, 제시간에 작업 신생아 쥐 새끼의 뇌 조직의 해부 동안 조직에 hypoxic 및 허혈성 손상을 최소화해야합니다. 그러나 meninges의 존재는 이러한 문화 조건 하에서 그들의 빠른 확산 속도로 인해 상당한 fibroblast 오염에 기여하는 것이기 때문에 완전히 절개하는 동안 두뇌에서 meningeal 덮개를 제거하는 것도 중요합니다. 혼합 glial 세포 배양의 준비 기간 동안 조직 물질 둘째, 부드러운 핸들링은 세포 손상, 사망, 또는 과도한 microglial 활성화를 제한하는 것도 중요하다. 문화 미디어를 추가할 때주의가 astrocyte 월을 손상하지 않도록 복용해야olayer. 또한, microglia 분리에 대한 flasks 흔들어 흔들어의 빈도를 조...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 60mm X 15mm 배양 접시 </td><td> 피셔 브랜드 </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 샤프 해부 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 14094-11 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 # 곡선 7B 포셉 표준 팁, 11cm </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11270-20 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 # 5 포셉 표준 팁, 스트레이트, 11cm </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ML 원추형 원심 분리기 튜브 </td><td> VWR </td><td> 89039-656 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ML serological pipettes </td><td> Grenier 바이오 하나 </td><td> 606,180 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ML serological pipettes </td><td> Grenier 바이오 하나 </td><td> 607,180 </td><td></td></tr><tr><td> 100 μm의 멸균 나일론 셀 스트레이너 </td><td> 매 </td><td> 35-2360 </td><td></td></tr><tr><td> 75cm 두 조직 문화 flasks </td><td> 코닝 </td><td> 430,641 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 최소한의 필수적인 매체 (DMEM) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 31053-028 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz의 L-15 배지 </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11415064 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 16000-036 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 말 혈청 </td><td> 어부 </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 15140163 </td><td></td></tr><tr><td> 100 % 에탄올 </td><td> 워너 그레이엄 회사 </td><td> 64-17-5 </td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 10X 생리 식염수, 산도 7.4 버퍼 </td><td> 품질 생물학, INC. </td><td> 119-069-131 </td><td> 멸균, 증류수에 1X </td></tr><tr><td> 바이오 해저드 가방 </td><td> VWR </td><td> 14220-028 </td><td></td></tr><tr><td> 혈구계 </td><td> Hausser 과학 </td><td> 1492 </td><td></td></tr><tr><td> cellBIND 표면과 6도 세포 배양 접시 </td><td> 코닝 </td><td> 3335 </td><td></td></tr></tbody></table>

신생아 쥐 뇌 조직의 혼합 glial 세포 배양의 기본 microglia 격리

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

포유류의 두뇌에서 전체 세포 인구의 약 12​​ %를 Microglia 계정. 뉴런과 astrocytes는 신경 계통의 주요 세포 유형을 고려하는 동안 microglia는 파편과 병원균을 위해 조직을 모니터링하고 phagocytic 활동 1,2를 통해 실질 조직의 항상성을 유지하여 정상적인 뇌 생리에 중요한 역할을한다. Microglia는 neurodegenerative 질병, 외상성 뇌 손상, 그리고 신경계 감염 3를 포함해 부상과 질병 조건의 수를 동안 활성화됩니다. 이러한 작동 조건에서 microglia은 그들의 phagocytic 활동을 증가 morpohological과 proliferative 변화를 받아야하고, 적극적으로 반응 산소와 질소 종, 프로 - 염증 chemokines 및 크린 시토킨을 분비, 종종 paracrine 또는 autocrine 루프 4-6를 가동합니다. 이 microglial 답변 신경학 조건 질병 pathogenesis에 기여으로 연구 m에 초점을icroglia이 보증됩니다. 두뇌의 세포 이질 때문에, 그것은 생체내 실험의 도중에 고순도로 충분한 microglial 샘플 자료를 얻기 위해 기술적으로 어렵습니다. microglia의 neuroprotective과 neurotoxic 기능에 관한 현재의 연구는 지속적으로 연구를위한 충분한 수율와 순수하고 건강한 microglia를 생성하는 루틴 기술적 방법을 필요로합니다. 우리는, 텍스트 및 비디오에 다운 스트림 애플 리케이션의 다양한 혼합 glia 문화에서 순수 일차 microglia를 분리하기위한 프로토콜을 제시한다. 간단히,이 기술은 혼합 glial 세포 문화를 만들어 신생아 쥐 새끼에서 dissociated 뇌 조직을 활용합니다. 혼합 glial 문화 confluency 도달 후, 일차 microglia는 기계 흔들림의 짧은 기간으로 문화에서 고립된다. microglia 그러면 실험적인 연구를위한 고순도로 도금된다. 이 방법론의 원리와 프로토콜되었습니다문헌 7,8에 설명되어. 또한, 기본 microglia를 분리하기 위해 대체 방법을 잘 9-12 설명되어 있습니다. 균질 뇌 조직은 기본 microglia 12 양보하는 밀도 기울기 원심 분리로 구분됩니다. 그러나, 원심 분리는 적당한 길이 (45 분)입니다 그리고 세포 손상 및 활성화뿐만 아니라, 풍부한 microglia 및 기타 세포 인구를 일으킬 원인이 될 수 있습니다. 다른 프로토콜은 문화 9-11에있는 동안 흔들림 (16 시간) 장기간에 의해 생물의 다양한 기본 microglia를 분리하기 위해 활용되었습니다. 떨고 후 미디어 뜨는는 microglia를 분리 centrifuged있다. 이것은 더 이상 두 단계의 격리 방법도 microglial 기능과 활성화를 교란시키다 있습니다. 우리는 주로 여러 가지 이유로 저희 연구실에서 다음과 microglia 격리 프로토콜을 활용 (1) 기본 microglia (2 더 충실 불후의 쥐 microglia 세포 라인보다 생체내 생물학에서 시뮬레이션) 공칭 기계적 장애는 잠재적인 세포 기능 장애 또는 활성화를 최소화하고, (3) 충분한 수율은 혼합 glial 세포 문화가 통과하지 않고도 얻을 수있다. 그것은이 프로토콜이 microglia를 분리하기 위해 신생아의 쥐 새끼의 뇌 조직을 사용하고 microglia 상당히 고립된 microglia의 이윤율, 정품 인증 상태와 기능적 특성에 영향을 미칠 수있는 분리 이전 쥐를 사용한다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 노화가 microglia 부전, 증가 neuroinflammation 및 neurodegenerative pathologies와 연결되어있다는 증거가있다, 그래서 이전의 연구는 노화가 중요한 매개 변수는 어디에 좋은 neurodegenerative 질병에서 microglia의 역할을 이해하기 위해 전직 생체내 성인 microglia를 사용했습니다. 그러나 전직 생체내 microglia는 시간의 장시간 기간 동안 문화에 보관하실 수 없습니다. 이 프로토콜은 문화의 기본 microglia의 수명을 연장하면서 따라서, 그것은 microglia가 D를 행동 것을인지해야생체내 설정에서로 번역하면 ifferently 성인 microglia에서와 체외 연구에서 신중하게 고려되어야합니다.

두뇌의 세포 이질에서 기본 microglia를 분리하는 것은 생리적 및 병리 학적 조건에 모두 자신의 역할을 조사하는 것이 필수적이다. 이 프로토콜은 기계적인 고립과 높은 수율과 높은 순도를 제공 혼합 세포 배양 기술에 대한 실용적 기본 microglial 세포에 대해 설명<em&gt; 체외에서</em&gt; 학업 및 다운 스트림 응용 프로그램입니다.

신생아 쥐 뇌 조직의 혼합 Glial 세포 배양의 기본 Microglia 격리

미세아교세포는 포유류 뇌의 전체 세포 집단의 약 12%를 차지한다. 뉴런과 성상교세포가 주요한...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 신생 쥐의 뇌로부터 일차 미세아교세포 배양물을 준비하는 것입니다. 이는 우선 뇌를 분리하고 뇌막을 제거함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 뇌 조직을 균질화하고 혼합 글리아 배양물을 T 75 플라스크에 분주하는 것입니다.다음으로, 성상교세포 단층이 합류(confluence) 상태에 도달할 때까지 플라스크를 10~14일 동안 배양합니다. 마지막 단계로 플라스크를 흔들어 성상교세포 단층 위에서 성장하고 있는 미세아교세포를 분리하면, 정제된 미세아교세포 배양물을 얻을 수 있습니다. 최종적으로 이렇게 얻은 고순도의 일차 미세아교세포는 후속 in vitro 단일 세포 배양 및 공동 배양 분석에 사용할 수 있습니다.Perico 구배법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 기계적 파쇄를 최소화하여 미세아교세포의 기능 장애나 활성화를 줄일 수 있으며, 초기 준비 후 수 주 동안 실험용 미세아교세포를 생성할 수 있다는 점입니다. 저는 Clifton Dau guard 박사님 연구실의 대학원생인 Tammy Tero와 함께 이 절차를 시연하겠습니다. 이 프로토콜을 통해 얻은 고순도의 미세아교세포 배양물은 정상적인 생리적 조건뿐만 아니라 병리적 질환 상태에서의 미세아교세포 기능을 연구하기 위한 in vitro 실험에 사용될 수 있습니다.조직 손상 및 염증성 자극에 대한 미세아교세포(Microglia)의 반응성은 신경 손상 및 신경퇴행성 질환 상태와 직접적인 관련이 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 일차 미세아교세포 배양 시 섬유아세포 오염을 줄이기 위해 뇌 조직에서 뇌수막을 신속하게 제거하는 방법에 서툴러 어려움을 겪을 수 있습니다. 또한, 플라스크를 흔들거나 미세아교세포 배양물을 다룰 때 성상교세포 단일층(astrocyte monolayer)이 손상되지 않도록 주의해야 합니다.절차를 준비하기 위해, L 15 배지를 4°C로 냉각하여 L 15 배지가 담긴 60 x 15 mm 페트리 접시를 준비하고 얼음에 놓습니다. 배양 배지를 37°C로 가온하고 모든 수술 도구가 멸균되었는지 확인합니다. 날카로운 가위로 P1~P5 단계의 쥐 새끼의 머리를 절단한 후, 머리를 70% 에탄올에 넣습니다.새끼 쥐 5마리의 머리를 수집한 후, 이를 생리식염수로 옮깁니다. 양쪽 귀 윗부분의 두개골 양측을 조심스럽게 절개하여 각 머리에서 전뇌를 분리한 다음, 얼음 위에 놓인 L 15 배지가 들어 있는 Petri 접시 중 하나로 뇌를 꺼내 옮깁니다. 처음 5개의 뇌를 얼음 위 L 15 배지로 옮기고 나면, 모든 뇌가 수집될 때까지 다음 5마리의 새끼 쥐도 동일한 방식으로 처리할 수 있습니다.포셉으로 뇌수막 시트의 가장자리를 살며시 잡고 하부 피질에서 조심스럽게 벗겨내어 뇌수막을 제거합니다. 뇌수막을 철저하게, 그리고 가능한 한 빠르게 제거하는 것이 중요합니다. 뇌수막을 제거한 후, 각 뇌를 얼음 위에 놓인 L 15 배지가 담긴 새 페트리 접시에 옮깁니다.10 mL 피펫을 사용하여 플레이트에서 뇌 조직과 배지를 흡입하여 멸균된 50 mL 원심분리관(conical tube)으로 옮깁니다. 그다지 4°C에서 2,500 RCF로 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 흡입하여 제거합니다.그 다음 멸균된 10 milliliter 피펫을 사용하여 펠렛을 회수합니다. 4~5 milliliters의 신선한 L 15 배지에 펠렛을 현탁하고, 배지와 조직을 10회 정도 피펫팅하여 섞어줍니다. 다음으로 신선한 50 milliliter 원추형 튜브 위에 100 micron 공극의 셀 스트레이너를 배치합니다.멸균된 5 mL 피펫을 사용하여 조직 현탁액을 위아래로 피펫팅한 다음, 피펫을 세포 스트레이너에 밀착시켜 재료를 세포 스트레이너를 통해 원추형 튜브로 분주합니다. 스트레이너를 4~5 mL의 신선하고 차가운 L 15 배지로 헹굽니다. 그런 다음 4 °C에서 5분 동안 2,500 RCF로 원심분리합니다.처리된 각 쥐 새끼 뇌당, T 75 플라스크에 12 milliliters의 사전 가온 배양액을 넣어 멸균 플라스크를 준비합니다. 다음으로, 펠릿화된 세포에서 상층액을 흡입하여 제거한 후, 세포 펠릿에 5~6 milliliters의 배양액을 첨가하고 10 milliliter 피펫을 사용하여 10회 반복적으로 피펫팅합니다. 그 후, 동일한 부피의 세포 현탁액을 각 T 75 플라스크로 옮깁니다.플라스크를 5% carbon dioxide 배양기에서 37 °C로 1~3주 동안 배양하며, 초기 플레이팅 후 처음 5일 동안은 세포가 방해받지 않고 유지되도록 합니다. 5일 후, 각 플라스크의 조건화 배지를 12 mL의 신선한 배지로 교체하여 세포가 합류(confluence) 상태에 도달하게 합니다. 이때 세포가 부착되어 있는 플라스크 바닥에 닿지 않도록 매우 주의해서 수행해야 합니다.혼합 글리아 배양 세포가 완전히 합류(confluence)되면, 플라스크를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 외부 공기와의 가스 교환을 방지하기 위해 플라스크 캡을 파라필름으로 덮고, 100 RPS 및 37 °C로 설정된 진탕 인큐베이터에 플라스크를 1시간 동안 둡니다. 1시간이 경과한 후, 10 mL 피펫을 사용하여 성상교세포 층을 손상시키지 않고 플라스크에서 배지를 수집하여 50 mL 원추형 튜브에 분주합니다. 플라스크에 신선한 배지를 추가하고 인큐베이터로 다시 넣습니다.튜브를 4 °C에서 2,500 RCF로 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 1 mL의 microglia plating medium에 세포를 재현탁합니다. 그 다음, 혈구계수기(hemocytometer)와 표준 절차를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 세포 수가 결정되면, 적절한 농도의 세포 수를 맞추기 위해 적절한 부피의 microglial plating media를 추가합니다.1mL당 2×10⁵ cells 농도로 플레이트에 분주하는 것이 실험에 적절하며, 이를 인큐베이터로 옮깁니다. 미세아교세포(microglia)가 밤새 부착되도록 합니다. 세포들은 미세아교세포 마커인 IBA1에 특이적인 항체로 면역 염색되었으며, 이는 붉은색으로 나타납니다.빨간색으로 나타나는 새로운 NA 신경 세포 마커 항체를 이용한 면역 염색 현미경 이미지에서 알 수 있듯이, 배양물 내 신경 세포의 오염은 최소 수준입니다. 슬라이드는 모든 세포핵을 파란색으로 염색하기 위해 DPI로 대조 염색되었습니다. 이 이미지는 GFAP와 성상교세포 마커를 이용한 면역 염색 결과를 보여줍니다.별아교세포는 녹색으로 나타납니다. 여기서는 희소돌기아교세포 마커인 CC1 특이적 항체로 면역 염색한 미세아교세포 배양 이미지입니다. 희소돌기아교세포는 적색으로 나타납니다.이 히스토그램은 각 세포 유형의 정량 분석 결과를 보여줍니다. 플레이팅된 미세아교세포 배양물의 순도가 90% 이상임을 확인할 수 있습니다. 이 형광 현미경 이미지는 IBA1으로 면역 염색된 미세아교세포 배양물을 보여줍니다.붉은색 영역은 형광 표지된 라텍스 비드입니다. 여기에 제시된 미세아교세포 배양물은 1 ng/mL의 lipopolysaccharide로 처리되었으며, 미세아교세포가 형광 표지된 라텍스 비드를 식세포 작용으로 섭취했음을 확인할 수 있습니다. 여기서 식세포 작용 분석 결과가 히스토그램으로 표시되어 있습니다.LPS 처리 후 식세포 작용이 증가하는 것이 관찰됩니다. 이 그림은 LPS 첨가 후 미세아교세포 배양물에서 일산화질소 생성 또한 증가함을 보여줍니다. 마지막으로, 직접 배양 또는 transwell insert로 분리된 미세아교세포-신경세포 공동 배양물 모두 LPS 배양 후 젖산 탈수소효소 방출로 측정했을 때 세포 사멸이 증가하는 것에 취약합니다. 이 기술의 첫 번째 단계인 T 75 플라스크 도말까지의 과정에 숙달되면 1.5시간 이내에 완료할 수 있으며, 전체 과정은 2주 이내에 완료할 수 있습니다.본 프로토콜을 최적화할 때 고려해야 할 또 다른 사항은 소요 시간을 결정하는 것입니다. 고순도 배양을 확립한 후, 일차 미세아교세포를 분리하여 플레이팅하기 전에 혼합 글리아 배양을 유지해야 합니다. 이 절차를 통해, 일산화질소 생성, 사이토카인 및 케모카인 방출의 in vitro 측정과 위상 활동(phasic activity) 등 미세아교세포의 기능을 일반적인 실험실 분석법을 사용하여 모두 결정하고 측정할 수 있습니다.따라서 이 절차의 개발을 통해 신경과학 분야의 연구자들은 균질한 세포 환경에서 미세아교세포의 활성을 탐구하고 다양한 신경학적 조건에서의 역할을 조사할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 신생 랫 뇌에서 일차 미세아교세포 배양물을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 먼저 뇌를 분리하고 뇌막을 제거한 다음, 뇌를 균질화하여 플라스크에 분주하고, 성상교세포 단일층이 합류 상태(confluence)에 도달할 때까지 10~14일 동안 플라스크를 배양합니다.마지막 단계는 플라스크를 흔들어 astrocyte 단층 위에 성장하고 있는 microglia를 분리하는 것이며, 이를 통해 정제된 microglia 배양물을 얻을 수 있습니다.

primary-microglia-isolation-from-mixed-glial-cell-cultures-neonatal

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 쥐의 뇌에서 미세아교세포를 분리하고 배양하는 방법을 보여줍니다. 그것은 미세아교세포에 특이적인 단클론 항체로 코팅된 플레이트를 사용하여 다른 신경 세포와 비신경 세포에서 미세아교세포를 분리하는 것을 수반합니다.

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free 배지를 이용한 쥐 뇌로부터의 미세아교세포(Microglia)

이 비디오는 신생아 쥐의 뇌에서 세포를 분리하고 배양하는 방법을 보여주었습니다. 그것은 뇌의 효소적, 기계적 해리를 포함했으며, 그 다음에는 혼합 신경교세포 집단을 얻기 위해 신경 세포 성장 인자가 결핍된 성장 매체에서 배양하는 것이 포함되었습니다.

Obtaining a Mixed Glial Cell Culture from a Neonatal Mouse Brain(신생아 마우스 뇌에서 혼합 신경교세포 배양 얻기)

우리는 신생아 대뇌 피질 성인 척수 가능한 미세 아교 세포의 효율적이고 신속한 분리 / 문화 방법을 설명합니다. 대뇌 피질의 미세 아교 세포의 해부 및 도금은 초기 박리 다음 장소 ~ 10 일을 복용 이후 미세 아교 수확으로 90 분 이내에 수행 할 수 있습니다.

신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

미세 아교 세포 생물학의 성공적인 조사에 하나의 키는 CNS의 조직으로부터 분리하는 동안 생체 미세 아교 immunofunction의 보존이다. 형광 이미징, 면역 세포 화학, 및 염증성 자극 지질 다당류 (LPS)와 팸 3 CSK 4 (팸)와 ELISA 다음 미세 아교 세포의 활성에 의해 평가 매우 순수하고 immunofunctional 세포 배양에 회전 흔들림 결과를 통해 미세 아교 세포를 분리.

쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리

여기, 우리는 시험 관내 실험에 대한 출생 마우스 새끼에서 미세 아교 세포를 분리하는 프로토콜 (1 일)을 제시한다. 단리 방법이 즉석에서 모두 높은 수율 및 순도, 소교 생물학의 해명을 목적으로 다양한 실험을 허용 다른 방법에 비해 상당한 이점을 생성한다.

향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연

세부 사항에 microglial 함수를 이해 하는 노력 microglia 성숙한 vivo에서 속성 정리 microglial 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 이 프로토콜 정의 매체 조건 하에서 높은 없는 성숙한 쥐 microglia의 강력한 생존을 유지 하기 위해 설계 된 절연과 문화 접근을 설명 합니다.

절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

여기에서는 마우스 CNS로부터 다중 신경교 세포 집단의 시험관 내 분리를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 국소 미세아교세포, 희소돌기아교세포 전구체 세포 및 성상세포를 분리하여 다양한 배양 시스템에서 각각의 표현형을 연구할 수 있습니다.

여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

이 프로토콜은 살아있는, 성인, 인간의 뇌 조직에서 기본 microglia를 격리하는 효율적이고 비용 효율적이며 강력한 방법입니다. 고립 된 1 차적인 인간 microglia는 항상성 및 질병에 있는 세포 프로세스를 공부하기 위한 공구역할을 할 수 있습니다.

성인 인간 뇌 조직에서 인간 마이크로글리아 획득

1차 미세아교세포 배양은 일반적으로 새로운 항염증 분자를 평가하는 데 사용됩니다. 본 프로토콜은 신생아 새끼로부터 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 설명합니다.

일차 세포 배양을 위한 Neonate 마우스의 미세아교세포의 자기 분리

이 프로토콜은 배아 15-16일에 마우스 배아에서 분리한 일차 신경 세포와 출생 후 1-2일에 신생아 마우스의 뇌에서 생성된 일차 미세아교세포에서 확립된 미세아교세포-뉴런 공동 배양을 설명합니다.

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

배우세요 신생아 쥐 뇌에서 기본 미세아교세포를 분리하는 방법을 혼합 신경교 세포 배양을 통해. 이 기술은 높은 순도와 생존율의 세포를 제공하여 신경과학 연구에 활용됩니다.

신생아 쥐 뇌 조직의 혼합 Glial 세포 배양의 기본 Microglia 격리

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