3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

이 절차의 전반적인 목표는 3차원 환경에서 배양된 인간 신경 전구 세포의 신경 분화 분석 속도를 높이는 것입니다. 이는 먼저 자체 조립 펩타이드 기반의 하이드로젤 퓨어 매트릭스에서 세포를 배양함으로써 달성됩니다. 다음으로, 3차원 스캐폴드로부터 세포를 분리합니다.

세 번째 단계에서는 마지막 과정으로 세포의 면역 식물화학 염색을 수행합니다. 세포 수는 유세포 분석법을 통해 측정합니다. 최종적으로, 신경세포 또는 세포 사멸 마커에 대한 유세포 분석을 통해 각각 신경 분화율 또는 세포 사멸률을 결정할 수 있습니다.

이 기술을 이용하면 신경 분화의 정량화 속도가 훨씬 빨라지며, Optane 데이터는 더 넓은 기반의 마이크로 사진 기술로 구축됩니다. 순수 매트릭스 내에 세포를 임베딩하려면, 먼저 4-웰 세포 배양 플레이트의 두 웰 각각에 멸균된 13 millimeter 직경의 유리 커버슬립을 넣습니다. 그다음, 나중에 사용할 수 있도록 플레이트를 클린 벤치에 보관하십시오. 다음으로, 신선하게 준비한 trypsin 2.5 milliliters를 첨가하여 인간 신경 전구세포(H NPCs)를 분리합니다.

배양 접시에 Benzon a 용액을 첨가하고 세포 현탁액을 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 5분 후, trypsin 억제제인 Benzon a 용액으로 반응을 중단시킵니다. 그런 다음 분리된 세포를 실온에서 3000 ×g로 5분간 원심 분리하여 가라앉힌 후, 생성된 펠렛을 10% sucrose 용액 5 mL로 재현탁하고, 동일한 원심 분리 조건에서 세포 현탁액을 세척합니다.

snat Resus를 제거한 후, 펠렛을 sucrose 용액에 부유시켜 최종 세포 농도가 1×10⁶ cells/mL가 되도록 합니다. 이제 가능한 한 신속하게, 세포 부유액 60 µL를 용액 1과 혼합합니다. 이 부유액 120 µL를 용액 2가 들어 있는 원추형 튜브로 옮겨 조심스럽게 혼합한 후, 즉시 이 혼합액 100 µL를 4-웰 플레이트의 각 커버슬립 위에 층을 이루도록 분주합니다. 마지막으로 각 웰에 세포 배양 배지 200 µL를 천천히 첨가합니다.

2~3분 후, 웰에 세포 배양 배지 200 µL를 추가하여 매트릭스의 자가 조립을 유도합니다. 클린 벤치의 가열 구역에서 세포를 37 °C로 1시간 동안 배양합니다. 매트릭스가 조립된 후에는 세포 배양 플레이트를 가능한 한 움직이지 않도록 주의하며, 1000 µL 피펫을 사용하여 매트릭스가 건조되는 것을 방지하기 위해 배지의 대부분을 제거하되 일부는 남겨둡니다.

그 다음, 500 µL의 신선한 배지로 매트릭스를 10분 동안 세척합니다. 마지막으로 세척액을 제거합니다. 배지 500 µL를 추가로 넣고 배양 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다.

가능하다면, 염색 실험 첫날 구조물이 실수로 흔들리는 것을 방지하기 위해 매트릭스를 별도의 인큐베이터에 보관하십시오. 1000 µL 피펫을 사용하여 매트릭스에서 배지를 제거한 다음, 스캐폴드를 PBS로 5분 동안 한 번 세척합니다.

그런 다음 PBS를 제거하고 각 웰에 400 µL의 paraldehyde를 첨가하여 매트릭스를 고정시킨 후, 상온에서 30분 동안 배양합니다. 스캐폴드가 고정되면 500 µL의 PBS로 5분 동안 세척합니다. 이어서 구조물을 blocking buffer와 함께 6~9시간 동안 배양하며, 2~3시간마다 한 번씩 버퍼를 교체해 줍니다. 마지막으로 4 °C에서 신선한 blocking buffer로 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 blocking buffer를 제거합니다.

항체 용액을 웰에 넣고 매트릭스를 다시 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이제 1차 항체 용액을 제거하고 500 µL의 PBS로 스캐폴드를 8시간 동안 세척하며, 이때 PBS는 2시간마다 교체하고, 이후 4 °C에서 신선한 PBS로 하룻밤 동안 추가 세척합니다. 하룻밤 세척 후, PBS를 제거하고 2차 항체 용액과 함께 상온의 암실에서 4시간 동안 스캐폴드를 배양합니다.

그런 다음 샘플을 PBS로 1시간씩 4~6회 세척하고, 구조물을 신선한 PBS와 함께 4°C 암소에서 밤새 배양합니다. 이제 매트릭스 마운팅 준비를 위해 현미경 슬라이드에 MOE all dab co 50 µL를 첨가합니다. 그런 다음 각 슬라이드 위에 커버슬립을 조심스럽게 덮습니다.

마지막으로, 형광 현미경을 사용하여 뉴런 마커인 beta three tubulin의 발현으로 인해 녹색으로 염색된 NPCs와 유사한 단일 마이크로그래프를 얻습니다. HBSS 500 µL로 스캐폴드를 1분 동안 세척한 후, 1000 µL 피펫을 사용하여 스캐폴드를 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 1000 µL 피펫으로 세포 용액을 여러 번 재부유시켜 매트릭스를 기계적으로 분해하고, 이후 스캐폴드 용액을 상온에서 3000 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다. 피펫으로 상층액을 제거한 다음, 피펫팅을 여러 번 반복하여 펠렛을 trypsin benzine 용액 500 µL에 재부유시킵니다.

그 다음 세포를 37 °C에서 배양합니다. 5분 후 1 mL의 trypsin 억제제 Benzonase 용액을 가하여 반응을 중단시키고, 이전과 동일한 원심분리 조건으로 세포 현탁액을 침전시킨 후 피펫팅하여 여러 번 섞어줍니다.

HBSS 버퍼 2 mL로 세포를 2회 세척하여 매트릭스 잔해물을 제거합니다. 마지막으로, 동일한 조건에서 세포 현탁액을 70 micron 세포 스트레이너 원심분리기에 통과시켜 응집물을 제거하고, 세포 배양 배지에 세포를 수집합니다. 분리된 세포를 1% paraformaldehyde에 넣고 쉐이커 위에서 상온으로 15분 동안 고정하는 것으로 시작합니다.

그런 다음 세포를 다시 원심 분리한 후, 펠렛을 세척 버퍼에 현탁합니다. 이제 4°C에서 350 ×g로 10분 동안 세포를 원심 분리한 후, 생성된 펠렛을 25 µL의 항체 용액에 다시 현탁합니다. 세포 현탁액을 진탕기 위에서 실온으로 2시간 동안 배양합니다.

그런 다음 샘플에 pon 버퍼 300 µL를 직접 첨가하고, 동일한 원심분리 조건에서 세포 현탁액을 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 2차 항체 25 µL를 첨가하고 실온의 암소에서 세포를 1시간 동안 배양합니다. 이어서 사포닌 버퍼로 세포를 두 번 더 세척한 후, 펠렛을 세척 버퍼 500 µL로 재현탁하여 유세포 분석을 진행합니다.

이 그림의 H에서는 캡슐화된 NPC와 순수 매트릭스가 나타나 있습니다. 세포들은 구체 형태로 성장하며, 구체의 직경이 수백 µm에 달하는 조밀하게 팩킹된 구조를 형성하고 구체들 사이에 위치합니다. 흰색 화살표로 표시된 것처럼, 세포들에 의해 형성된 돌기 다발을 관찰할 수 있습니다. 개별 세포를 거의 인식하기 어려운 반면, laminin이 첨가된 순수 매트릭스에 캡슐화된 세포들은 이 그림에서 보는 바와 같이 덜 조밀한 구조로 성장하며 더 균일하게 분포되어 있습니다. 검은색 화살표로 표시된 것처럼, 덜 조밀한 영역에서는 개별 세포까지 인식할 수 있습니다. 여기서 H NPC는 laminin이 첨가된 순수 매트릭스에서 4일 동안 분화되었으며, 뉴런 마커의 발현을 나타내기 위해 녹색으로 염색되었습니다.

양성 세포의 백분율을 평가하기 위해 Beta three tubulin을 나타냈습니다. 전체 세포 수는 여기에서 DAPI로 청색 염색된 세포 핵을 계수하여 결정할 수 있습니다. 이 현미경 사진은 형광 현미경으로 촬영한 Z-stack 사진들의 전체 투영 영상입니다.

매트릭스에서 방출된 세포는 추가적인 기능 연구를 위해 이 그림에서 보여주는 것과 같이 커버슬립 위에 다시 안착시킬 수 있습니다. 이 현미경 사진은 앞서 언급한 방출 절차를 거친 후 3일 동안 배양한 3D 배양 세포를 보여줍니다. 빨간색으로 염색된 beta three tubulin 염색 결과는 염색하지 않은 세포를 음성 대조군으로 사용했을 때, 3D 스캐폴드 내에 수용된 세포와 유사한 형태임을 나타냅니다.

검은색 프레임으로 표시된 GA는 이후 beta three tubulin 양성 세포 분석을 위해 설정되었습니다. 이 도트 플롯에서 양성 세포는 x축의 오른쪽 검은색 프레임 내에 나타나며, 점선 프레임의 중간 집단은 세포 잔해(cell debris)일 가능성이 높으며 함께 관찰될 수 있습니다. 마지막 그림에서는 수동 세포 계수와 유세포 분석을 통한 수치화 결과를 비교하여 보여줍니다. 빈 검은색 사각형으로 표시된 유세포 분석법으로 검출된 양성 세포의 비율이 채워진 검은색 삼각형으로 표시된 일반적인 수동 계수 결과보다 훨씬 더 높게 나타납니다.

이 영상을 시청한 후, 귀하는 3D 스캐폴드 내 edge MPC 배양을 위해 poor metrics를 사용하는 방법과 유세포 분석기(flow cyto metric analyzers) 측정을 위해 스캐폴드에서 세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.