Name: 이전 DNA의 정제없이 식물과 동물 샘플의 Genotyping (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 배우세요 정제 없이 식물과 동물 조직에서 직접 PCR을 수행하는 방법을. Arabidopsis와 오크 잎, 그리고 생쥐 귀 조직을 이용한 유전자형 분석 기술을 익혀 시간과 비용을 절감하세요.

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Arabidopsis 샘플 및 관련 PCR의 프리 머 위해 우리는 교수 Jaakko Kangasjärvi와 그의 그룹, 식물 스트레스 그룹 식물 생물학, Biosciences학과, 헬싱키 대학 감사드립니다. 기존의 방법의 실험은 부인의 Airi Lamminmäki에 의해 실시되었다. 유전자 변형 마우스 샘플은 박사 Jaana Vesterinen, 생물 의약 / 생화학 연구소, 헬싱키 대학에서 제공되었습니다. 해리스 유니 코어 및 해리스 절단 매트는 기타 모든 상표는 열 피셔 과학 주식회사와 그 자회사의 자산입니다 Shunderson 통신 주식회사의 등록 상표입니다.

1. 직접 프로토콜과 Arabidopsis 식물 개인의 Genotyping <ol><li> Arabidopsis 식물 잎에 직접 dCAPS의 genotyping 분석을 시작하려면 먼저 표 1에 설명되어있는 Phire 공장 직접 PCR 키트를 사용하여 20 또는 50 μl PCR 반응을 수립. </li><li> 다음, 해리스 유니 코어 및 해리스 절단 매트를 사용하여 Arabidopsis 식물 잎에서 0.50 mm 펀치를 잘라. 단단히 주먹 개최하는 것은 조직에 첨단을 눌러 앞뒤로 구멍을 뚫는를 회전 할 수 있습니다. </li><li> PCR 반응 혼합물에 펀치 디스크를 추출하는 플런저를 누르십시오. 샘플 PCR 솔루션으로 떨어지고 튜브 벽에 남아 있지 않은지 확인하십시오. </li><li> 2퍼센트 NaClO 솔루션에를 찍어하여 교차 오염을 방지하기 위해 각 샘플 사이의 구멍을 뚫는의 최첨단를 청소합니다. 플런저를 눌러 아래로 몇 번하고 깨끗한 종이 타월로 최첨단을 닦으십시오. 절단 매트도 있어야합니다샘플 사이에 헹구어. </li><li> 다음, 열 과학을 채용 Piko 자전거 타는 사람 및 열 과학 Piko PCR 플레이트는 표 2에 설명 된 자전거 조건을 사용하여 PCR 반응을 수행 할 24도 열. PCR 반응은 기존의 PCR 열 cyclers에서 수행 할 수 있습니다. </li><li> PCR 후, 식물 재료를 스핀 다운. 새로운 microcentrifuge 관에 표면에 뜨는 5 μl를 전송합니다. 물 4 μl 및 제한 효소, SSPI 1 μl를 추가합니다. 부드럽게 섞어서 튜브의 바닥에 내용을 수집하기 위해 간략하게 스핀 다운. 37 한 시간 동안 반응 혼합물을 품어 ° C. 20 분에 65 ° C에서 잠복기에 의해 제한 효소를 비활성화. </li><li> 식물 조직에서 직접 D​​NA를 증폭 할 때 PCR 제품은 제한 소화 효소를 방해 할 수 있습니다 식물과 PCR-파생 구성 요소가 포함되어 있습니다. 따라서 어느 희석 (예 : 1시 2분 또는 물에 1시 3분) 또는 t 전에 PCR 제품을 정화 할 필요가있을 수 있습니다그는 이러한 열 과학 GeneJET PCR 정화 키트로 적합한 상용 키트를 사용하여 예를 들어 다음 소화. </li><li> 제한 효소는 소화 후, 아가로 오스 젤에 대한 결과 조각을 분석 할 수 있습니다. 반응에 5 배를로드하는 버퍼의 2.5 μl를 추가하고 그 결과 혼합물의 10 μl와 아가로 오스 겔 전기 영동을 수행합니다. </li></ol> 2. 15 세의 오크에서 특정 DNA 조각을 증폭하는 것은 희석 프로토콜을 사용하여 잎 <ol><li> 시작하려면, 오크 잎의 2mm 펀치를 잘라. </li><li> Phire 공장 직접 PCR 키트와 함께 제공된 희석 버퍼 20 μl로 샘플을 놓습니다. 주먹의 첨단을 청소하고 이전처럼 매트를 절단. </li><li> 튜브 벽을 짧게 눌러 100 μl 피펫 팁과 잎 샘플을 크러시. 식물 재료에 따라 희석 프로토콜은 때때로 샘플을 분쇄하지 않고 더 나은 작동합니다. </li><li> t까지 microcentrifuge에 간단히 샘플을 스핀그는 반응 튜브의 하단에 있습니다. </li><li> 표면에 뜨는는 PCR에서 직접 사용할 수 있습니다, 또는 그것은 샘플 종류에 따라 멸균 물에 1시 10분 또는 1:100을 희석 할 수 있습니다. 20 μl PCR 반응을위한 템플릿으로 표면에 뜨는 또는 희석 1 μl에 0.5 μl를 사용합니다. 표 1에 설명 된대로 반응을 준비합니다. </li><li> 반응이 준비되면, 열 과학을 채용 Piko 자전거 타는 사람 및 열 과학 Piko PCR 플레이트는 표 2에 설명 된 자전거 조건을 사용하여 PCR 반응을 수행 할 24도 열. PCR 반응은 기존의 PCR 열 cyclers에서 수행 할 수 있습니다. </li><li> PCR 후, 반응에 5 배를로드하는 버퍼의 5 μl를 추가하고 결과 혼합물의 15 μl와 아가로 오스 겔 전기 영동을 수행합니다. </li></ol> 3. 희석 프로토콜을 사용하여 트렌스 제닉 마우스의 Genotyping <ol><li> m의 2mm 펀치를 삽입하여 형질 전환 생쥐에 희석 프로토콜을 시작Phire 동물 조직 직접 PCR 키트와 함께 제공된 DNARelease 첨가제의 0.5 μl를 포함하는 희석 버퍼 20 μl의 ouse 귀. </li><li> 98시 2 분 부화에 이어 2 분, ° C.에 대한 샘플을 상온를 품다 </li><li> 반응 튜브의 바닥에까지 microcentrifuge에 간단히 샘플을 봐. </li><li> 표 3에 설명 된대로 준비 20 μl PCR 반응을위한 템플릿으로 표면에 뜨는 1 μl를 사용하십시오. 바로 사용 할 수 없습니다 모든 표면에 뜨는는 새로운 튜브로 이동하고 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li><li> 다음, 열 과학 Piko 24도 열 자전거 타는 사람 및 열 과학 Piko PCR 플레이트는 표 4에 설명되어있는 자전거 조건을 사용하여 PCR 반응을 수행 할 수 사용합니다. 다시 PCR 반응은 기존의 PCR의 cyclers에서 수행 할 수 있습니다. </li><li> PCR 후, 반응에 5 배를로드하는 버퍼의 5 μl를 추가하고 아가로 오스 겔 전기 영동 w를 수행결과 혼합물의 i 번째 15 μl. </li></ol> 4. 대표 결과 dCAPS 기술에 대한 관심이 SNP 내에서 제한 사이트 중 도입하거나 대상 DNA에 하나 이상의 불일치와 PCR 프라이머를 사용하여 파괴된다. Arabidopsis 식물 개인의 Genotyping 직접 잎 주먹에서 dCAPS 기법으로 수행되었다. 증폭 제품은 소화 된 각 개인의 유전자형을 드러내는 결과 조각은 (그림 2) 겔 전기 영동에 의해 분석 하였다. 이 예에서 Arabidopsis 게놈에 대한 관심의 SNP 사이트 (G 또는 A allele)를 포함하는 160 BP PCR 제품은 Phire 공장 직접 PCR 키트와 함께 식물 잎 주먹에서 증폭되었다. 앞으로 입문서는 관심 SNP (A allele)하지만 포함 대상 DNA의 SSPI 별 제한 사이트를 제작, 3 &#39;끝 부분에 하나 불일치를 포함SNP (그림 2B)의 다른 allele 인치 희석 프로토콜은 페놀 화합물의 높은 농도로 인해 같은 참나무 잎으로 도전 식물 재료, 필​​요합니다. 희석 프로토콜을 사용하면 여기에 설명 chloroplastic DNA의 297 BP 조각은 3 단계 프로토콜을 사용하여 증폭되었다. 다른 dilutions와 오크 잎 표본은 긍정적이고 부정적인 컨트롤에 추가, 그림 3에 표시됩니다. Phire 동물 조직 직접 PCR 키트는 용 유전자 변형 마우스의 1500 BP 200 BP의 두 제대로 크기의 제품의 풍부한 생산량의 결과로 하나의 프라이머 세트는 대형의 차이에 두 조각 증폭에 사용 된 도전 프로토콜과 고용 된 야생 형 생쥐 (그림 4). heterozygote 마우스와 약자 상단 밴드 같은 프라이머 쌍 모두에 템플릿 (대립 유전자)의 경쟁 때문입니다하지만, genotypING 결과가 모호합니다. 희석 프로토콜을 사용하여 준비 샘플의 안정성도 테스트되었습니다. 결과는 희석 샘플은 최소한 1 년에 -20 ° C에서 저장 될 수 있습니다 보여줍니다. 또한, 반복 동결 / 해동주기는 크게 반응 (그림 5)에 영향을주지 않았다. 또한 Phire의 DNA 중합 효소와 따뜻한 시작 DNA 형성 촉매의 중합 효소 및 정화 DNA (그림 6)에 비해 직접 PCR 방법을 사용하여 마우스 귀 조직 샘플에서 강력한 증폭이되어 표시. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> 구성 요소들 </td><td fo:width=".75in"> 20 μl 반응 </td><td fo:width=".75in"> 50 μl 반응 </td><td fo:width=".75in"> 최종 Conc. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 20 μl에 추가 </td><td> 5 추가0 μl </td><td></td></tr><tr><td> 배 Phire 공장 PCR 버퍼 </td><td> 10 μl </td><td> 25 μl </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 프라이머 </td><td> X μl </td><td> X μl </td><td> 0.5 μM </td></tr><tr><td> 프라이머 B </td><td> X μl </td><td> X μl </td><td> 0.5 μM </td></tr><tr><td> Phire 핫 스타트 II의 DNA 중합 효소 </td><td> 0.4 μl </td><td> 1 μl </td><td></td></tr><tr><td> 샘플 / 직접 프로토콜 </td><td></td><td> 0.50 mm 펀치 </td><td></td></tr><tr><td> 샘플 / 희석 프로토콜 </td><td> 0.5-1 μl </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 1.<html> 공장 PCR을위한 반응 조건은이 프로토콜에 사용됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> 사이클 단계 </td><td fo:width=".5in"> 온도. </td><td fo:width=".5in"> 시간 </td><td fo:width=".4in"> 사이클 </td></tr><tr><td> 초기 변성 </td><td> 98 ° C </td><td> 5 분 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denaturing * 어닐링 확장 </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 초 5 초 20 초 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> 최종 확장 </td><td> 72 ° C 4 ° C </td><td> 1 분 보유 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> 표 2. 공장 PCR을위한 사이클링 조건이 프로토콜에 사용됩니다. 에 * TM 계산기oscientific.com / pcrwebtools &quot;대상 =&quot;Phire 온천 시작 II의 DNA 중합 효소와 함께 사용되는 프리 머에 대한 TM을 결정할 때 _blank는 &quot;&gt; www.thermoscientific.com / pcrwebtools을 권장합니다. 프리 머에 대한 권장 소둔 온도가 ≤ 20 NT와 동일합니다 WebTool을 제공 한 낮은 TM는. 프리 머&gt; 20 NT를 들어, 어닐링 온도 3을 사용 ° C WebTool을 제공 한 낮은 TM보다.주세요 <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> 구성 요소들 </td><td fo:width=".75in"> 20 μl 반응 </td><td fo:width=".75in"> 최종 Conc. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 20 μl에 추가 </td><td></td></tr><tr><td> 배 Phire 동물 조직 PCR 버퍼 </td><td> 10 μl </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 프라이머 </td><td> X μl </td><td> 0.5 μM </td></tr><tr><td> 프라이머 B </td><td> X μl </td><td> 0.5 μM </td></tr><tr><td> PH분노 핫 스타트 II의 DNA 중합 효소 </td><td> 0.4 μl </td><td></td></tr><tr><td> 샘플 / 희석 프로토콜 </td><td> 1 μl </td><td></td></tr></tbody></table> 표 3. 동물 조직 PCR을위한 반응 조건은이 프로토콜에 사용됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> 사이클 단계 </td><td fo:width=".5in"> 온도. </td><td fo:width=".5in"> 시간 </td><td fo:width=".4in"> 사이클 </td></tr><tr><td> 초기 변성 </td><td> 98 ° C </td><td> 5 분 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denaturing * 어닐링 확장 </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 초 5 초 20 초 ≤ 1킬로바이트 20 초 / 킬로바이트&gt; 1킬로바이트 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> 최종 확장 </td><td>72 ° C 4 ° C </td><td> 1 분 보유 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> 표 4.이 프로토콜에 사용되는 동물 조직 PCR을위한 사이클링 조건. *에서 TM 계산기 <a href="http://www.thermoscientific.com/pcrwebtools" target="_blank">www.thermoscientific.com / pcrwebtools는</a> Phire 온천 시작 II의 DNA 중합 효소와 함께 사용되는 프리 머에 대한 TM을 결정할 때 권장합니다. 프리 머 ≤ 20 NT 용 권장 어닐링 온도는 WebTool을 제공 한 낮은 TM 동일합니다. 프리 머&gt; 20 NT를 들어, 어닐링 온도 3을 사용 ° C WebTool을 제공 한 낮은 TM보다. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. 직접 PCR 워크 플로우. 직접 PCR은 두 다른 프로토콜을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 직접 프로토콜에서 샘플의 작은 금액은 PC에 직접 추가됩니다R 반응. 희석 프로토콜 샘플 자료에서 DNA를 출시 할 PCR 전에 간단한 사전 부화 단계를 고용합니다. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 잎 펀치에서 직접 dCAPS 기술과 Arabidopsis 식물 개인의 Genotyping. A) 그림 2A는 dCAPS 분석의 원칙이 수행 보여줍니다. 관심 SNP 내에서 제한 사이트 중 도입하거나 대상 DNA에 하나 이상의 불일치와 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제거됩니다. PCR 제품은 소화와 전기 영동하여 분석 할 때 발생하는 파편은 각 개인의 유전자형을 알 수있다. B) 식물의 잎에서 0.50 mm의 주먹 50 μl PCR 반응에 직접 배치 된 수 있습니다. SNP 사이트 (G 또는 A allele)를 포함 160 BP PCR 제품은 프리 머의 A-allele에 고유 한 SSPI 사이트를 소개로 증폭되었다. unpurified PCR 제품은 diges했다SSPI 제한 효소와 테드. 결과 조각은 3 % 아가로 오스 젤에 분석 하였다. 레인은 M은 크기 표시입니다, 레인은 A와 G 각 샘플의 SNP의 대립 유전자에 해당합니다. 얻은 결과는 PCR과 제한 소화 (데이터 미도시)에 의해 다음 DNA 추출의 통상적 인 분석을 통해 확인되었다. 템플릿 DNA가없는 대조군 반응이 설정 테스트에 포함되어 있으며 digestions을 (데이터가 게재되지 않음) 수행하기 전에 실제 PCR 반응과 병렬로 별도의 아가로 오스 젤에서 실행되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3.jpg" alt="그림 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3highres.jpg" /> 그림 3. 희석 프로토콜은 참나무 잎 샘플을 사용합니다. 희석 프로토콜 (1:100, 1시 10분, 1 다른 dilutions에 오크 잎 샘플 (3 단계 프로토콜, 62 ° C에서 어닐링)에서 chloroplastic DNA의 297 BP 조각을 증폭하는 데 사용 된 : 1 2:1)와 긍정적이고 부정적인 사기꾼trols [C + : C-: 아니요 템플릿 DNA와 대조군 정화 DNA (Arabidopsis)에서 긍정적 인 제어]. 샘플 명칭은 샘플 수집 사이트 (핀란드 마을)와 번호 샘플을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig4.jpg" alt="그림 4" /> 4 그림. 희석 프로토콜을 사용하여 하나 프라이머 쌍의 유전자 변형 생쥐의 Genotyping. 구 개별 마우스 (차선 1-9)의 귀 조직은 DNARelease 첨가제 등의 희석 버퍼 20 μl에 배치되었다. 상온에서 incubations 후 및 98 ° C, 표면에 뜨는 1 μl를 20 μl PCR 반응의 템플릿으로 사용되었다. 조각 크기 : 1,500 BP (유전자 변형) 200 BP (wildtype). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 샘플 장기 저장을 위해 안정적입니다. 마우스 귀 조직의 샘플은 주식회사 있었다 희석 프로토콜에 따라 준비<html> DNARelease 첨가제 등의 희석 버퍼 20 μl에 ubated 반복 냉동 / 해동 (레인 1) 대상이 1 년 (차선 2) -20 ° C에서 저장 또는 PCR (레인 3)에 즉시 사용됩니다. 증폭 조각 크기는 900 BP, 1500 BP와 3,200 BP했다. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig6.jpg" alt="그림 6" /> 6 그림. Phire 동물 조직 직접 PCR 키트는 뜨거운 시작 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소와 결합 된 상업 DNA 정화 시스템을 능가하는 성능을. 네 amplicons (0.5-1.5 킬로바이트)가 Phire 동물 조직 직접 PCR 키트의 희석 프로토콜을 사용하여 마우스 귀 조직에서 증폭되었다. 비교를 들어, DNA가 먼저 상용 DNA 추출 키트를 사용하고 같은 조각 제조업체의 권장 사항에 따라 뜨거운 시작 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소를 사용 증폭되었습니다 정화되었습니다. 만 Phire 동물 조직 직접 PCR 키트와 함께 성공적으로 증폭 네 가지 amplicons였다. t &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig7.jpg" alt="그림 7" /> 그림 7. 회 / 소비 시약.의 추정과 워크 플로우의 보편적 인 비교 열 과학 직접 PCR 접근 방식은 DNA 절연 방식, 추출 버퍼 접근 방법, 그리고 PCR 버퍼 방식과 비교됩니다. 전에 PCR 단계 각 접근 방식에 대한 추정 시간은 빨간색 텍스트로 표시됩니다. 열 과학 직접 PCR의 접근 방식은 PCR하기 전에 샘플 준비 만 0-4 분 정도 소요됩니다. 각 방법 아래 소비 시약가 나열됩니다. 열 과학 직접 PCR의 접근 방법은 다른 방법에 비해 시약의 최소 금액을 사용합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3844/3844fig7large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

<ol><li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).</li>
<li>Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+isolation+of+high+quality+genomic+DNA+from+fruit+trees+and+conifers+using+PVP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP.</a> Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).</li>
<li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dCAPS%2C+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms%3A+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).</li>
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여기를 입증 직접 PCR의 접근 방법은 시간이 필요한 줄이고 식물과 동물의 genotyping (그림 7)의 워크 플로우를 간소화 직접 unpurified 샘플 소량의 PCR 증폭 할 수 있습니다. 또한 여기에 증명하면 직접 PCR 방식 (그림 3)와 함께 희석 프로토콜의 사용이다. 희석 프로토콜은 어려운 샘플 (화합물을 방해 포함 된 예를 들면 노인 식물 잎, 식물 종) 또는 긴 (또는 GC 풍부한) amplicons으로 권장합니다. 반응의 최적화를 허용하는 직접 PCR 실험을 시작할 때이 프로토콜은 특히 유용합니다. 프로토콜은 조직 물질 및 / 또는 사용 프리 머의 차이로 인해 낮은 제품 수율로 가끔씩 문제를 해결하기위한 도구로 제공 할 수 있습니다. 희석 프로토콜은 전체 샘플은 하나에서 소비되지 않은 보장에 또한, 동일한 샘플에서 여러 반응을 실행할 때 사용반응. PCR을위한 식물에서 DNA를 정화하기 위해 대회는 잠재적으로 PCR 분석 8 영향을 줄 수 있습니다 다양한 구성 요소를 사용하여 DNA 절연 다음 세포 용해를 수행하는 것이 었습니다. 높은 페놀 콘텐츠, polyvinylpyrrolidone의 추가로, 특히 도전 식물 전통적으로 세포 용해 2,5에 따라 DNA에 바인딩 화합물을 제거하는 데 사용되었다. 분명 여기, 이러한 복잡하고, 시간이 많이 단계는 대상 DNA를 감지 할 수있는 Phire 공장 직접 PCR Kit의 사용을 통해 방지 할 수 있습니다. 세포 용해와 DNA의 분리 단계는 직접 Arabidopsis 식물 잎 (그림 2)에서 민감한 dCAPS 기술을 사용하여 생략 할 수 있습니다. 여기에 시연으로, 희석 프로토콜은 효율적으로 PCR (그림 3)를 방해 할 수 있습니다 문제가 구성 요소의 존재를 관리합니다. 전통적으로, 동물 genotyping에 대한 전제 조건은 isolati했습니다유기 용매 추출, 알코올 강수량, 그리고 원심 분리 단계 6,9,10 다음 피부와 결합 조직을 소화 할 수 proteinase K와 긴 부화 특징으로 독성, 시간이 소요되는 과정을 통해 동물의 조직에서 게놈 DNA의 있습니다. 여기를 시연,이 과정의 단순화는 유전자 변형 마우스는 이전에 DNA 정화 (그림 4)없이 genotyped 할 수 있도록, Phire 동물 조직 직접 PCR Kit의 ​​사용을 통해 달성된다. 이 문서에서 보여준 예는 특히 하나의 프라이머 세트는 대형의 차이에 두 조각 증폭에 사용 된로 도전하고 있습니다. 프로토콜의 본래 어려움에도 불구하고, 간단한 희석 프로토콜은 두 PCR 제품 (그림 4)의 높은 수율의 결과와 함께 직접 PCR 방식 중 하나를 사용하십시오. PCR 기반 대상 DNA 검출 식별 할 수 유전자형 분석 등의 연구에 많은 응용 프로그램이 있습니다개발, 생리학과 질병의 유전자의 역할. 전문의 DNA polymerases의 억제제 허용으로 인해, 프로토콜은 이전 DNA 정화없이 최소한의 시간에 완료 할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Phire 공장 직접 PCR 키트 </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> F-130 </td><td> 200 반응 (50 μl 각) </td></tr><tr><td> Phire 동물 조직 직접 PCR 키트 </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> F-140 </td><td> 200 reations (50 μl 각) </td></tr><tr><td> 해리스 유니 코어 0.35 mm (핑크) </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> F-180S / L </td><td> 수량 : 25분의 5 </td></tr><tr><td> 해리스 유니 코어 0.50 mm (파란색) </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> F-185S / L </td><td> 수량 : 25분의 5 </td></tr><tr><td> 해리스는 매트 6.4 × 7.6 cm를 절단 </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> F-190 </td><td> 수량 : 5 </td></tr><tr><td> SSPI </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> ER0771 </td><td> 100 μl (100 반응) </td></tr><tr><td> Piko 24 자 열 자전거 타는 사람 </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> 24 자 Piko PCR 플레이트 </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET PCR 정화 키트 </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> K0701 K0702 </td><td> 50 최상의 상태로 준비합니다 250 최상의 상태로 준비합니다 </td></tr></tbody></table>

이전 dna의 정제없이 식물과 동물 샘플의 genotyping

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

직접 PCR의 접근 방식은 직접 unpurified 샘플의 작은 양의 PCR 증폭을 용이하게하고, 여러 식물과 동물의 조직 (그림 1)은 여기를 증명하고 있습니다. 직접 PCR은 그들에게 이러한 억제제의 높은 내성 등의 고유 속성을 제공하는 이중 좌초 된 DNA 결합 도메인을 포함 특별히 설계 열 과학 Phusion 및 Phire의 DNA Polymerases에 따라 달라집니다. PCR 기반 대상 DNA 검출은 공장 유전자형 분석 및 transgenes의 인증 등의 식물 연구에 많은 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 식물 조직에서 PCR은 전통적으로 고가 또는 독성 시약을 필요로 할 수 있습니다 초기 DNA 절연 단계를 포함한다. 이 과정은 많은 시간이 소요됩니다 및 교차 오염 1, 2의 위험을 증가시킵니다. 반대로, 열 과학 Phire 공장 직접 PCR 키트를 사용하여 대상 DNA 쉽게 전에 DNA 추출없이 검색 할 수 있습니다. 모델에서 여기 시연파생 흘리고 증폭 다형성 서열 분석 (dCAPS) 3,4의 예제는 Arabidopsis 식물 잎에서 직접 수행됩니다. dCAPS genotyping의 assays는 SNP allele 특정 제한 endonuclease의 소화 3 단일 염기 polymorphisms (SNPs)를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 일부 식물 샘플은 이러한 페놀 화합물 등의 PCR 방해 요소를 포함로 직접 PCR 방법을 사용하는 경우 더 많은 도전이 될 경향이 있습니다. 이러한 경우에는 화합물을 제거 할 추가 단계는 전통적으로 2,5 필요합니다. 여기,이 문제는 직접 PCR 증폭 (그림 1) 다음 빠르고 쉽게 희석 프로토콜을 사용하여 극복 할 수 있습니다. 표본이 tannins 등의 페놀 화합물의 높은 양의가 포함되어 열 다섯 살 참나무 잎은 어려운 식물의 모델로 사용됩니다. 마우스에 유전자 송금이 크게 develo의 유전자의 역할을 연구하는 데 사용됩니다pment, 생리학 및 인간 질병. 이 동물의 사용은 일반적으로 PCR과 함께 transgene의 존재에 대한 검사가 필요합니다. 전통적으로,이 귀, 꼬리 나 발가락 조직 6,7에서 정화되어 PCR 분석을위한 DNA되는 동안 시간이 소요 DNA 절연 단계를 포함한다. 그러나, 열 과학 Phire 동물의 조직 직접 PCR 키트 유전자 변형 마우스로 전에 DNA 정화없이 genotyped 할 수 있습니다. 이 프로토콜 유전자 변형 마우스 genotyping에서와 같이 하나의 프라이머 세트의 크기는 크게 서로 다른 두 조각의 증폭에 사용되는 도전 예를 들어 여기 시연, 마우스 귀 조직에서 직접 이루어집니다.

여기에 제시된 직접 PCR의 접근 방식은 직접 unpurified 식물과 동물 조직의 작은 양의 PCR 증폭을 용이하게한다.

이전 DNA의 정제없이 식물과 동물 샘플의 Genotyping

Direct PCR 방식은 정제되지 않은 소량의 시료로부터 직접 PCR 증폭을 가능하게 하며, 본 영상에서는 여러 식물 및 ...를 대상으로 이를 시연합니다.

이 비디오의 전반적인 목표는 식물 및 동물 조직을 포함하여 정제되지 않은 소량의 시료로부터 직접 PCR 증폭을 수행하는 세 가지 사례를 시연하는 것입니다. 직접 PCR은 두 가지 대안적인 프로토콜을 사용하여 수행할 수 있습니다. 직접 프로토콜에서는 정제되지 않은 소량의 시료를 PCR 반응액에 직접 첨가하는 반면, 희석 프로토콜에서는 PCR 전 단계에서 시료 물질로부터 DNA를 방출시키기 위한 짧은 사전 배양 단계가 필요합니다.첫 번째 예시에서는 직접 프로토콜을 사용하여 애기장대의 유전자형 분석을 수행합니다. 타겟 DNA에 대립유전자 특이적 제한 효소 인식 부위를 도입한 후, 제한 효소 절단을 통해 대립유전자 특이적 단일 염기 다형성을 확인합니다. 이어서 희석 프로토콜을 적용하여 15년 된 참나무 잎에서 특정 DNA 단편을 먼저 증폭하고, 이후 생쥐의 귀 조직에서 형질전환 생쥐의 유전자형을 직접 분석합니다.세 가지 사례 모두에서, 다이렉트 PCR 방법을 통해 PCR 전의 샘플 정제 단계 없이 DNA 증폭을 달성하였습니다. 전통적인 방법과 비교했을 때 다이렉트 PCR의 주요 장점은 DNA 추출이나 정제 단계가 필요하지 않다는 것입니다. 이는 시간과 비용의 절감으로 이어집니다.서면 프로토콜에 기술된 대로 식물 직접 PCR 키트를 사용하여 20 또는 50 µL PCR 반응액을 조제함으로써 dCAPS(derived cleaved, amplified polymorphic sequence) 분석 또는 유전자형 분석 어세이를 시작합니다. 다음으로, Harris Uni unicorn 펀치와 커팅 매트를 사용하여 Arabidopsis 식물 잎에서 0.50 mm 펀치를 채취하며, 이때 펀처를 단단히 잡습니다. 절단부를 조직에 누른 후 펀처를 앞뒤로 회전시킵니다.플런저를 눌러 펀치 디스크를 PCR 반응 혼합물 속으로 배출합니다. 샘플이 두 벽면에 달라붙지 않고 PCR 용액 속으로 떨어지는지 확인하십시오. 직접 프로토콜에서 교차 오염을 방지하려면 샘플링 도구를 세척하는 정확한 방법을 사용하는 것이 매우 중요합니다.각 샘플 사이마다 펀처의 절단 부위를 2% sodium hypochlorite 용액에 담가 세척하십시오. 플런저를 몇 번 위아래로 누른 후 깨끗한 종이 타월로 절단 부위를 닦아내십시오. 커팅 매트 또한 샘플 사이에 헹궈주어야 합니다.다음으로, Pico 24-well thermal cycler와 PCR 플레이트를 사용하여 이 비디오에 수반되는 텍스트에 설명된 사이클링 조건으로 PCR 반응을 수행합니다. PCR 완료 후, 식물 시료를 원심 분리합니다. 상층액 5 µL를 새 마이크로 원심 분리 튜브로 옮긴 후 물 4 µL를 추가합니다. 제한 효소 SSP 1 1 µL를 첨가하고 가볍게 혼합한 다음, 튜브 바닥에 내용물이 모이도록 짧게 원심 분리합니다.반응 혼합물을 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그 다음 65 °C에서 20분 동안 배양하여 제한 효소를 불활성화합니다. 제한 효소 소화 후, 반응액에 5x loading buffer 2.5 µL를 첨가합니다.결과 혼합물 10 µL를 겔 웰에 로딩하여 아가로스 겔 전기영동을 수행하고 생성된 단편을 분석하십시오. 먼저, 오크 잎을 2mm 크기로 펀칭하여 절단합니다. 샘플을 Plant Direct PCR 키트에 제공된 희석 완충액 20 µL에 넣으십시오.이전과 동일하게 천공 및 절단 매트의 절단면을 세척하고, 100 µL 피펫 팁으로 잎 샘플을 튜브 벽면에 짧게 눌러 분쇄합니다. 반응물이 튜브 바닥에 모일 때까지 마이크로 원심분리기를 사용하여 샘플을 짧게 원심분리합니다. 상층액을 PCR에 직접 사용하거나 멸균수에 1:10 또는 1:100 비율로 희석하여 사용할 수 있습니다.시료 유형에 따라, 20 µL PCR 반응의 템플릿으로 상층액 또는 희석액 0.5 µL에서 1 µL를 사용하십시오. 서면 프로토콜에 설명된 대로 반응물을 준비하십시오. 반응 준비가 완료되면 PICO 24-well thermal cycler와 PCR 플레이트를 사용하여 본문에 기술된 사이클 조건으로 PCR 반응을 수행하십시오.PCR 완료 후, 반응액에 5x 로딩 버퍼 5 µL를 첨가하고, 결과 혼합액 15 µL를 사용하여 아가로스 겔 전기영동을 수행합니다. 형질전환 마우스의 유전자형 분석을 위한 희석 프로토콜을 시작하기 위해, 동물 조직과 함께 제공된 DNA 방출 첨가제 0.5 µL가 포함된 희석 버퍼 20 µL에 2 mm 펀치로 채취한 마우스 귀 조직을 넣습니다. Direct PCR 키트를 사용하여 시료를 상온에서 2분 동안 배양한 후, 98 °C에서 2분 동안 배양합니다.시료를 원심분리한 후, 상층액 1 µL를 20 µL PCR 반응의 템플릿으로 사용합니다. 즉시 사용하지 않는 상층액은 새 튜브로 옮겨 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. 마지막 단계로, 서면 절차에 기재된 사이클링 조건에 따라 24웰 열 순환기(thermal cycler)와 PCR 플레이트를 사용하여 PCR 반응을 수행합니다. PCR 완료 후, 반응물에 5x 로딩 버퍼 5 µL를 추가하고, 결과 혼합물 15 µL를 사용하여 D caps 기술로 아가로스 겔 전기영동을 수행합니다. 관심 있는 SNP 내의 제한 효소 인식 부위는 표적 DNA와 하나 이상의 미스매치(mismatch)가 있는 PCR 프라이머를 사용하여 도입하거나 제거합니다.본 예제에서는 Fire Plant Direct PCR 키트를 사용하여 Arabidopsis 게놈의 관심 SNP 부위인 g 또는 a 대립유전자를 포함하는 160 base pair의 PCR 산물을 식물 잎 펀치 시료로부터 증폭하였습니다. 정방향 프라이머의 3' 말단에 하나의 미스매치를 포함시켜 표적 DNA에 SspI 특이적 제한 효소 인식 부위를 생성하였으며, 이는 A 대립유전자에는 존재하지만 SNP의 다른 대립유전자에는 존재하지 않습니다. 정제되지 않은 PCR 산물을 SspI 제한 효소로 처리하여 소화시켰으며, 결과 파편들을 agarose 겔에서 분석하였습니다. 레인의 g와 a는 각 샘플의 SNP 대립유전자에 해당합니다.이 이미지에서 왼쪽은 온전한 PCR 산물이며, 오른쪽은 절단된 단편들입니다. 오크 잎과 같이 페놀 화합물의 농도가 높은 까다로운 식물 시료의 경우, 여기에 설명된 희석 프로토콜을 이용한 희석 과정이 필요합니다. 297 base pair의 엽록체 DNA 단편은 3단계 프로토콜을 통해 증폭되었습니다.양성 및 음성 대조군과 더불어 다양한 희석 배율의 떡갈나무 잎 시료가 표시되어 있습니다. 하나의 프라이머 세트만을 사용하여 크기 차이가 큰 두 개의 단편을 증폭하기 위해 fire animal tissue direct PCR 키트를 사용하였으며, 그 결과 형질전환 생쥐의 경우 1500 base pairs, 야생형 생쥐의 경우 200 base pairs의 정확한 크기를 가진 두 생성물 모두 풍부하게 얻었습니다. 이형접합체 생쥐에서 위쪽 밴드가 더 약하게 나타나는 것은 동일한 프라이머 결합을 위해 두 템플릿이 경쟁하기 때문입니다.하지만 유전자형 분석 결과는 명확합니다. 희석 프로토콜을 사용하여 준비한 시료의 안정성 또한 테스트하였습니다. 그 결과, 반복적인 동결-해동 사이클을 거친 희석 시료와 최소 1년 동안 -20°C에서 보관한 시료가 PCR에 즉시 사용한 시료와 유사한 결과를 보였습니다. 이 절차의 성능을 추가로 테스트하기 위해, fire animal tissue direct PCR kit의 희석 프로토콜을 사용하여 마우스 귀 조직에서 4개의 앰플리콘(Amplicons)을 증폭하였습니다.비교를 위해, 먼저 상용 DNA 추출 키트를 사용하여 DNA를 정제하고 제조사의 권장 사항에 따라 hot start tac DNA polymerase를 사용하여 동일한 단편들을 증폭시켰으나, fire animal tissue direct PCR kit를 사용했을 때에만 4개의 앰플리콘이 모두 성공적으로 증폭되었습니다. Direct PCR은 다수의 샘플 증폭이 필요한 유전자형 분석 연구에 특히 유용합니다. DNA 정제 단계를 생략함으로써 실험 수행에 필요한 시간을 상당히 단축할 수 있습니다. 또한 이 기술은 오염 위험을 줄이고 귀중한 샘플 재료를 절약함으로써 추가적인 이점을 제공합니다.

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배우세요 정제 없이 식물과 동물 조직에서 직접 PCR을 수행하는 방법을. Arabidopsis와 오크 잎, 그리고 생쥐 귀 조직을 이용한 유전자형 분석 기술을 익혀 시간과 비용을 절감하세요.

이전 DNA의 정제없이 식물과 동물 샘플의 Genotyping

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