YFP를 표현 잡습니다 마우스 뇌의 Multiphoton 현미경

전체 마우스 기관의 Multiphoton 현미경은 광학 이미징 전에 장기를 삭제하면 가능하지만, 모든 프로토콜은 형광 단백질의 형광 신호를 보존 할 수 있습니다. 에탄올 기반의 탈수 및 벤질 알코올 광학 개간 방법 사용 : 벤질 벤조산의 개간을, 우리는 전체 마우스 두뇌가 YFP을 표현의 고해상도 multiphoton 이미지를 보여줍니다.

고정 조직의 다광자 현미경 검사는 일반적으로 수백 미크론의 얕은 침투 깊이로 제한됩니다. 우리는 최근에 벤조 알코올과 벤조일 벤조에이트 용액을 사용한 광학 투명화를 사용하여 고정된 마우스 장기에 수 밀리미터 깊이의 다광자 현미경을 처음으로 사용하는 것을 시연했습니다. 우리의 초기 시연, 이 기술은 고유 조직 형광을 이미지화했습니다.

그러나 GFP와 같은 형광 단백질을 발현하는 조직에 광학 투명화 방법을 사용하는 것에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 여기에서는 허벅지에서 발현되는 노란색 형광 단백질의 형광을 보존하는 동일한 벤조 알코올 용액을 사용하여 투명화된 뇌 조직의 다광자 현미경 검사를 위한 프로토콜을 제시합니다. 쥐 뇌의 한 프로모터 다광자 현미경을 사용한 고해상도 전체 마우스 장기 이미징은 제거하지 않고 이미징하기 전에 장기를 광학적으로 투명화함으로써 가능합니다. 다광자.

뇌 이미징은 물과 뇌 조직을 구성하는 단백질의 굴절률 차이로 인해 생성되는 하이라이트 산란 효과로 인해 조직 표면 아래 300미크론으로 제한됩니다. 이 한계를 극복하기 위해 장기를 탈수시키고 물을 조직을 구성하는 단백질과 비슷한 굴절률을 가진 액체로 교체합니다. 이러한 광학적 투명화 과정은 광 산란을 크게 줄여 조직 표면 아래에서 더 나은 이미징을 제공하는 데 도움이 됩니다.

Batta 등의 이미지는 고유 형광 및 2차 고조파 생성을 사용하여 다양한 마우스 기관의 조직학을 보기 위해 이 기술을 적용하는 방법을 보여줍니다. 이 첫 번째 이미지는 조직 표면 아래 1.4mm에서 촬영한 쥐의 고환입니다. 다광자 현미경의 고해상도 특성으로 인해 정액 세뇨관에서 형성되는 개별 정자 세포를 확대하여 명확하게 볼 수 있습니다.

여기 맨 오른쪽에서 볼 수 있듯이 조직 표면 아래 1.4mm에서 촬영한 쥐의 폐 이미지를 보여줍니다. 이 이미지는 엘라스틴 성분이 빨간색으로 표시되고 콜라겐은 녹색으로 표시되는 2채널 다광자 이미징을 보여주며, 개별 oli를 확대하면 쉽게 구별할 수 있습니다. 마지막으로, 조직 표면 아래 850미크론을 차지하는 쥐 뇌 내부 영역의 고해상도 이미지를 보여줍니다.뇌의 신피질과 해마를 확대하면 개별 성상세포와 뉴런 세포체를 명확하게 볼 수 있습니다.

그러나 YFP와 같은 형광 단백질을 포함할 수 있는 장기를 광학적으로 투명화한 경우 badra의 광학 투명화 프로토콜은 이러한 형광 단백질의 형광 신호를 전혀 보존하지 않습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 YFP의 형광 신호와 에탄올 등급 시리즈를 사용하여 뇌를 탈수하는 뉴런의 형광 신호를 보존하면서 마우스 염좌의 전체 장기 광학 청소 및 이미징을 수행하는 새로운 방법이며, BAB라고도 알려진 벤조 알코올 벤조에이트의 1-2 용액으로 제거하면 형광 단백질의 손상을 줄이고 형광 신호를 보존하는 것으로 밝혀졌습니다. 다광자 이미징의 경우, YFP 마우스의 무게를 먼저 측정한 다음 케타민 자일라진의 복강 내 주사로 마취합니다.

수술을 진행하기 전에 수술용 마취판을 확인해야 합니다. 5분마다 동물을 점검하여 단단한 발가락이나 꼬리 꼬집에 반응하는지 확인해야 합니다. 동물이 반응하는 경우 케타민 자일라진의 S 보충 용량이 필요합니다.

일단 마취되면, 마우스는 실험실 테이프를 사용하여 각 팔다리를 수술 침대에 부착하여 마우스가 수술을 위해 가슴을 노출하는 누운 자세를 유지하도록 합니다.시작하기 위해, 절단이 이루어지는 동안 피부를 뒤로 당기기 위해 가위와 핀셋을 사용하여 흉곽 바닥을 따라 절단하기 위해 xiphoid 프로세스 아래를 절개합니다. 그런 다음 마우스 흉골의 양쪽에 두 개의 절단을 만들어 지혈을 사용하여 심장을 노출시킨 채로 흉강에서 멀리 떨어지게 하는 조직 플랩을 만듭니다. 그런 다음 23게이지 바늘을 심장의 좌심실에 삽입하고 우심방의 근육벽을 작게 절개하여 혈액이 빠져나갈 수 있도록 합니다. 우심방을 절단한 직후, 우심방에서 더 이상 혈액이 배출되지 않을 때까지 섭씨 4도의 인산염 완충 식염수로 관류를 시작합니다.

관류하는 동안 epistolic 펌프가 사용되며 바늘 끝에서 1.5-2인치 떨어진 곳에서 유체를 분출하는 펌핑 전력으로 설정됩니다. 모든 혈액이 배출되면 관류 매체는 마우스의 몸이 눈에 띄게 단단하고 뻣뻣해질 때까지 섭씨 4도에서 4% 파라폼 알데히드 용액으로 전환됩니다. 관류 후, 쥐를 수술 침대에서 꺼내고 참수를 하여 집게와 홍채 가위를 사용하여 뇌를 절제하기 시작합니다.

두개골은 두개골 뒤쪽에서 시작하여 앞으로 이동하는 작은 부분으로 제거됩니다. 가위로 두개골을 가로질러 2-4mm마다 작은 상처를 내고, 집게를 사용하여 뇌에서 뼈를 조심스럽게 잡아당겨 뇌의 윗면 전체가 드러날 때까지 이 작업을 수행합니다. 그런 다음 수술용 주걱을 사용하여 두개골에서 뇌를 절제하고 4% 파라폼 알데히드가 든 유리병을 6시간 동안 고정합니다.

이 시연을 위해 주로 YFP를 발현하는 쥐의 뇌 이미징에 중점을 두고 있지만, 이 절차의 제거 능력을 가장 잘 보여주기 위해 마우스, 뒷다리 및 소장 절편을 광학적으로 투명화할 것입니다. 고정 후 뇌와 기타 조직은 PBS에서 두 번 세척됩니다. 그런 다음 조직 샘플은 50%70%90% 및 100% 에탄올 농도의 일련의 에탄올 배양에 의해 실온에서 탈수됩니다.

각 배양은 2 시간 동안 지속되고 두 번째 배양은 지속됩니다.고정 된 조직에서 수분을 효율적으로 추출하기 위해 12 시간의 100 % 에탄올 배양이 수행됩니다. 탈수 후 마지막 100% 에탄올 용액을 붓고 조직 샘플을 100% BAB 투명화 용액에 담그기 전에 2시간 동안 BAB에 에탄올의 일대일 용액에 담급니다.

일단 bab에 들어가면 뇌 및 기타 조직 샘플이 4-5시간 이내에 눈에 띄게 투명해집니다. 여기에서는 광학 제거 프로세스의 처음 6시간에 대한 타임랩스 비디오를 보여줍니다. 스킵은 에탄올과 BAB의 일대일 용액이 100% BAB 용액으로 대체된 시점을 표시합니다.

6시간이 지나면 모든 장기가 투명해지는 징후를 보이는데, 예를 들어 마우스의 뒷다리에 있는 뼈가 이제 명확하게 표시되어 최상의 세척 결과를 얻을 수 있습니다. 뇌는 밝은 빛으로부터 보호된 상태에서 실온에서 6일 동안 맑게 두어야 합니다. 뇌가 깨끗해지고 이미징 준비가 되면 Sano 아크릴 또는 슈퍼 접착제를 사용하여 페트리 접시 바닥에 부착됩니다.

접착제가 마르면 뇌가 BAB에서 나오고 페트리 접시를 이미징 목표 아래에 놓습니다. 이미징을 위해 710에서 990 나노미터 여기 파장 사이에서 조정 가능한 MI 타이 티타늄 사파이어 레이저를 통합한 다광자 현미경을 사용합니다. YFP 신호를 생성하는 데 사용하는 여기 파장은 886나노미터입니다.

그런 다음 반사형 형광 신호는 넓은 시야 이미징을 허용하는 NIK icon five x objective를 사용하여 캡처됩니다. 반사형 형광 신호는 5 35 50 대역 통과 필터를 사용하여 필터링되고 높은 양자 효율 폴더를 사용하여 수집됩니다. OMA Matsu 이미지의 승수 2는 2048 x 2048 픽셀 해상도의 스캔 이미지 소프트웨어를 사용하여 라인당 2밀리초의 스캔 속도를 사용하여 고해상도 YFP 이미지를 생성합니다.

이미징이 완료되면 뇌는 P two 접시에서 제거되어 BAB에 보관되고 향후 이미징을 위해 빛으로부터 보호됩니다. 여기에 표시된 대표적인 이미지와 비디오는 광학 투명화로 가능해진 고해상도 다중 광자 이미징 기능을 보여줍니다. 전체 뇌 이미징을 통해 해마와 신피질의 여러 층에 있는 YFP 라벨 뉴런을 조직 표면 아래 2mm 깊이까지 명확하게 볼 수 있습니다.

여기에서 우리는 해마의 다양한 해부학적 층을 드러내기 위해 뇌에 0.8-2mm 떨어진 곳에서 1.2mm 길이의 구강 염좌 이미지 스택을 보여주는 비디오를 보여줍니다. 다음은 버그만에게 알려진 1.94mm의 코로나 단면도의 대표적인 이미지로, 해마의 서로 다른 층이 표시되어 있는 2mm 깊이의 이미지에서 가져온 것입니다. 신피질을 확대하면 신피질의 5층 과뉴런의 개별 축삭돌기와 뉴런 세포체를 조직 표면 아래 1.02mm까지 명확하게 구별할 수 있습니다.

여기에서 우리는 조직 표면 아래 700에서 1020 미크론 사이의 5 층 뉴런이 붙어있는 이미지를 보여줍니다. 다음은 774미크론을 뇌에 주입한 스택의 대표적인 이미지입니다. 이와 동일한 이미지 스택을 사용하여 Image J 소프트웨어를 사용하여 뉴런 영역의 3D 재구성이 이루어졌습니다.

multi bot microscopy의 고해상도 기능을 통해 전체 개별 뉴런의 이미지를 표시할 수도 있습니다. 여기서 우리는 D 유전 과정이 명확하게 보이는 신피질의 5층 뉴런의 재구성을 보여줍니다. 이것으로 YFP를 발현하는 광학 투명화, 전체 마우스 염좌에 대한 발표를 마칩니다.

이 기술을 수행하는 것은 비교적 간단하며 앞에서 보여준 것처럼 마우스 염좌의 다양한 영역과 구조를 보고 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사드리며 행운을 빕니다.