Name: YFP를 표현 잡습니다 마우스 뇌의 Multiphoton 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 학습하세요 광학 투명화와 다광자 현미경을 이용한 YFP 발현 마우스 뇌 고해상도 이미징 방법입니다. 에탄온 탈수와 벤질알코올:벤질벤조에이트 용액으로 형광 신호를 보존하며 수 밀리미터 깊이까지 촬영 가능합니다.

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우리는 비디오 편집에서 자신의 도움을 야곱이 솔리스 감사드립니다. 이 작품은 MJ Levene에 NSF 경력 수상 DBI-0953902이 부분에 자금을 지원했다.

1. 동물 재관류 5 전체 마우스 뇌 정산 <ol><li> 프로 시저의 전체 길이는 탈수 단계 당 사용 시간의 길이에 따라 달라질 수 있지만, 총 전체 과정은 두 개의 일 실시 할 수 있습니다. </li><li> YFP 마우스 무게 그리고 깊이 케타민 / xylazine (100 밀리그램 / kg : 10 밀리그램 / kg)의 intraperitoneal 주사로 마취. </li><li> 수술하기 전에 깊은 마취의 수술 비행기를 확인합니다. 동물에게이 회사의 발가락이나 꼬리 핀치에 반응하는지 확인하기 위해 매 5 분을 확인합니다. 동물이 반응하면 케타민 / xylazine의 보충 복용 (원본 용량의 1 / 3)가 필요합니다. </li><li> 일단 깊이 anesthetized, 마우스가 수술의 가슴 노출, 위로 향한 위치 (등쪽 recumbancy)에 있도록 실험실 테이프를 사용하여 수술 침대에 각 다리를 준수하여 마우스를 억제. 수술 침대는 보통 금속이나 플라스틱 메쉬 만든 및 세면대로 또는 입술 - 팬의 상단에 배치됩니다 있도록 혈액 및 정착액폐기물은 쉽게 수집 할 수 있습니다. </li><li> 시작하려면 xyphoid 과정 아래 절개를합니다. 가위와 핀셋을 사용하여 갈비의 기본을 따라 잘라 컷이 완료로 피부를 뒤로 빼는거야. 마우스 가슴의 양쪽 두명 인하 (갈비까지) 심장이 노출 떠날 hemostat를 사용하여 흉강에서 떨어져 개최되는 조직의 플랩을 만들 할 수 있습니다. </li><li> 심장의 왼쪽 심실에 23g 바늘을 삽입하고 혈액이 탈출 할 수 있도록 오른쪽 심방의 근육 벽의 작은 절개를합니다. 이 절차의 동영상 기사 2497을 주피터를 참조하십시오 5. </li><li> 오른쪽 심방이 절단 후 즉시, 4 재관류를 시작 ° C 피가 더 이상 심장의 우심방 (30에서 에너지가 관찰되지 때까지 인산염은 PBS (산도 7.2) 생리 버퍼 - 약 5의 비율로 40 ML ML / 분). </li><li> 일단 모든 혈액 (오른쪽 아트리움을 종료 유체가 분명하다) 배수되었습니다 차가운 4 % 재관류 매체를 전환PFA 솔루션입니다. 마우스의 몸 터치 (- 5 ML / 분의 속도로 40 ML 약 30)에 띄게 강성과 차가운 될 때까지 Perfuse. (농축 16% PFA 솔루션은 제조업체의 지침 및 산도 7.2에 도달 할 때까지 NaOH를 추가에 따라 희석된다. 장갑과 실험실 코트를 입고 연기 후드 내부의 화학 물질을 처리하고 섞는다.) </li><li> 재관류 후 수술 침대에서 마우스를 제거하고 뇌의 절단을 시작하는 목을 베다. </li><li> 포셉 및 홍채 가위 사용하여 두개골의 뒷면에서 시작하여 앞으로 이동 작은 섹션에 두개골을 제거합니다. 조심스럽게 작은 부분에 뇌에서 떨어져 뼈를 뽑아 포셉를 사용하는 동안 머리에서 가위로 4mm - 작은 상처 매 2을 만듭니다. 뇌의 전체 상단 표면이 노출 될 때까지이 작업을 수행합니다. </li><li> 소비세 유리관에 5 폭 mm, 평면 주걱과 장소를 사용하여 두개골에서 뇌. 포스트 고정 4 6 시간에 4% PFA ° C에서 잠수. </li><li> 게시 한 후고정, 유리 약병의 PFA를 주입하고 PBS로 교체하여 방 온도 PBS에 두 번 뇌를 씻어. 쏟아 및 제 세척을 위해 PBS로 교체하기 전에 PBS 솔루션의 소용돌이 뇌합니다. </li><li> 등급 부화 당 2 시간의 에탄올 incubations의 시리즈 (한 번에 50 %, 70 %, 95 %, 그리고 두 번이나 100 %), 후 두 번째 100 % 에탄올 보육 12 시간으로 실온에서 뇌를 탈수,에 고정 조직에서 물을 압축을 풉니 다. 각 부화를 들어, 유리관에서 이전 에탄올 솔루션을 쏟아과 뇌가 완전히 침수 될 때까지 이후의 솔루션으로 대체. </li><li> 100 % 에탄올에서 두 번째로 부화 후 솔루션을 쏟아과 같은 부품 에탄올과 벤질 알코올 및 벤질 벤조산을 (1시 2분 권 : 권 비율)이 포함 된 개간 솔루션으로 교체하십시오. 부화, 가만히 따르다이 솔루션의 2 시간 후와 벤질 알코올 및 벤질 벤조산 (1시 2분 권 : 권 비율)의 100 % 솔루션으로 교체하십시오. refra개간 솔루션의 ctive 인덱스는 N = 1.54입니다. </li><li> 일단 BABB에, 뇌는 4 안에 현저하게 투명한 될 것입니다 - 5 시간. 가장 소요되는 결과를 얻으려면 밝은 빛으로부터 차폐하는 동안 뇌는 실온에서 6 일간을 취소 둡니다. </li></ol> 2. 현미경 설정 <ol><li> 뇌 이미징을 허가 준비되면, 페트리 접시의 바닥에 부착은 시아 노 아세틸렌 사용합니다. 접착제 계속하기 전에 건조하도록 허용합니다. </li><li> 건조 후, 잠수함 BABB의 뇌를 및 이미징을위한 현미경 대물 아래의 페트리 접시를 놓습니다. </li><li> 우리는 990 나노 미터 여기 파장에 대한 710 nm의 사이에 조절 마이 타이 티타늄 사파이어 레이저를 통합 multiphoton 현미경을 사용합니다. 우리가 YFP 신호를 생성 할 때 사용하는 여기 파장은 886 nm의 것입니다. 레이저 전력은 30 일부터 다릅니다 - 100 MW는 영상의 깊이에 따라 다릅니다. </li><li> 대형을 허용 니콘 5 배 목표 (NA, 0.5)를 사용하여 반사 형광 신호를 캡처뷰 필드 영상 (2 X 2mm). </li><li> 50분의 535 대역 통과 필터를 사용하여 반사 형광 신호를 필터링하고 GaAsP PMT (H7422PA-40, 하마 마츠, 브리지 워터, 뉴저지)를 사용하여 수집합니다. </li><li> 높은 해상도, YFP 이미지를 생성하는 2 밀리 초 당 라인의 스캔 속도를 사용하여 2048 X 2048 픽셀의 해상도로 ScanImage 소프트웨어 6을 사용하여 프로세스 이미지를 표시합니다. </li><li> 일단 이미지가 완료되면 미래의 이미징을위한 빛으로부터 차폐 포셉 및 BABB에 저장을 사용하여 페트리 접시에서 뇌를 제거합니다. 접착 샘플의 경우, 30도보다 더 큰 각도로 접착제와 페트리 접시 사이에 면도날을 실행하여 조직을 제거합니다. 우리는 눈에 띄는 저하와 함께 1 년에 BABB에서 샘플을 저장합니다. </li></ol> 3. 대표 결과 여기에 표시 대표 이미지 및 동영상은 광학 삭제하여 가능하게 고해상도 multiphoton 이미징 기능을 보여줍니다. 전체 뇌 영상이 있습니다YFP - 표시 해마와 피질의 다른 레이어의 뉴런이 조직 표면 아래 2mm로 깊이로 명확하게 볼 수 있습니다. 그림 1의 해마의 해부학 적 기능에 해당하는 코로나보기의 대표 이미지 꼬리 2.92 mm에서 보여줍니다 bregma 7. 예제에서 이미지의 깊이가 1.94 mm이었다. 이 차이의 일부는 뇌의 꼬리 끝에있는 소뇌의 제거로 인해이고 잔액은 탈수 과정에서 수축으로 인해했다. 스택에서 다른 이미지는 조직 표면 (그림 2) 아래에 YFP 2mm을 표현 네크로의 레이어 V / VI 피라미드 뉴런을 보여줍니다. 모든 이미지는 니콘 5 배 객관적이고 배율이 ScanImage 소프트웨어에서 이미지 수집을 위해 디지털 줌 기능을 사용하여 이루어졌다 이용하여 획득 하였다. 네크로의 확대함으로써, 네크로의 레이어 V의 피라미드 뉴런의 개별 axons과 신경 세포 기관은 명확하다지적인 조직의 표면 아래에 1.02 mm (그림 3)까지 구별. 그림 3에서 이미지 스택을 사용하여 뉴런 지역의 3D 복원이 ImageJ 소프트웨어 8 (그림 4)를 사용하여 만들어졌습니다. MPM의 고해상도 기능은 우리 전체, 개별 뉴런의 이미지를 제공 할 수 있습니다. 여기 개별 수지상 프로세스가 명확하게 볼 수 있습니다하는 네크로 (그림 5)의 레이어 V 피라미드의 신경 세포의 재건을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig1.jpg" /> 그림 1 1.2 mm 이미지 스택에서 대표 이미지 (0.8 - 조직의 표면 아래 2mm). 네크로와 해마의 다른 층을 보여주는 전체 마우스 뇌의. 해마의 특징은 조직의 표면 아래에 1.1 mm 볼 수 있으며 후속를 사용하여 라벨이되었습니다ING 번호 :. DG = 이가있는 이랑, DG의 = 세분화 된 계층을 GrDG, Lmol = lacunosum moleculare 층, 몰 = 분자 층 DG, 또는 = oriens 층, PoDG = polymorph 층 DG, 평 = 피라미드 세포 층, RAD = 지층 radiatum 7 이미지가 1.8 X 1.8 mm의 크기, 규모 바 = 200 μm이다. 뇌의 뱃 부리 장식이있는 끝은 목표를 향해까지 직면하고있는 꼬리 끝 페트리 접시에 부착되었다. 이 코로나 비행기에 이미지를 촉진. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig2.jpg" /> 그림 2 1.2 mm 이미지 스택에서 대표 프레임 (0.8 - 조직의 표면 아래 2mm). 네크로을 강조 전체 마우스 뇌의. 피질의 레이어 V / VI에 YFP을 표현 피라미드 세포와 프로세스는 조직의 표면 아래에 보이는 2mm 있습니다. 라벨의 정도는 네크로의 희박한 라벨의 이전 보고서와 일치한다. 삽입 9 (오른쪽) B에서 확대됩니다<html> 왼쪽에 oxed 공간이 마련되어 있습니다. 이미지 크기가 1.8 X 1.8 mm이며, 규모의 바 = 200 μm (50 μm 삽입). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig3.jpg" /> 그림 3. 대표 프레임 뇌의 네크로의 레이어 V 피라미드 뉴런의 이미지 스택에서 조직의 표면 아래에 774 μm를 취. 스택 700 μm에서 조직의 표면 아래 1,020 μm로 이동합니다. 8X 디지털 줌은 이러한 고급 프로세스와 같은 세부 정보를 캡처하는 데 사용되었다. 이미지의 크기는 225 x 225 크기 μm, 스케일 바 = 20 μm이다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig4.jpg" /> 그림 4. 그림 3에서 이미지 스택의 3D 재건의 대표 이미지 (225 x 225 크기 X 320 μm). 이미지의 크기는 225 x 225 크기 μm, 스케일 바 = 28 μm이다. S &quot;&gt; <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig5.jpg" /> 그림 5. 10X 디지털 줌을 사용하여 네크로의 레이어 V 피라미드의 신경 세포의 고해상도 복원 이미지입니다. 뉴런의 길이, 스케일 바 = 25 μm에서 485 μm를 측정합니다. 각 이미지 타일에 대한 시야는 180 μm X 180 μm이다. 각 타일은 서로 다른 깊이 (Z-레벨)에 있습니다. 대뇌 피질의 꼭대기 수석이 일반적으로 명시 적 YFP뿐만 아니라 소마에서하지 않습니다. 여기에 도시 된 바와 같이, 전원이 소마의 채도를 최소화하기 위해었다,보기 같은 분야에서 모두가한다이 미세 공정 모양의 주차를합니다. 여기에 우리의 강조보다는 세부 사항보다 뷰 필드를 시연 있었다. 미세한 세부 정보를 공개하려면, 소마없이 지역에 초점을, 디지털 줌을 사용하고, 레이저 파워를 향상시킬 수 있습니다.

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</ol>

동물 실험은 예일 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

표준 유기 염료는 유기 용제의 범위와 호환되는, 따라서 프로토콜을 삭제하기위한 특정 과제를 포즈를하지 않는 반면, 형광 단백질은 용매에 자주 변화를 덜 관대합니다. 현재 작업의 4 목표는의 심각한 한계를 극복하는 것이 었습니다 XFPs의 형광이 분실 또는 심각하게 저하 된 이전 광학 소요되는 프로토콜. 여기에 표시되는 이미지가 YFP의 형광을 보존되었다고 보여줍니다. 여기에 설명 된 광학 소요되는 기술은 조직의 표면 아래 2mm로 전체 마우스 뇌 YFP - 분류 뉴런까지의 고해상도 이미징 할 수 있습니다. 이전에 보여준 것처럼, 에탄올 탈수를 사용하여도 녹색과 빨간색 형광 단백질 신호를 유지합니다. 여기에 광학 소요되는 기술은 이러한 해마 나 네크로 그 표현 형광 단백질로 전체 기관이 지역을 공부하고 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다를 보여 4 이미지. 고multiphoton 현미경의 해상도 기능도 장기 지역 내 관심의 특정 셀 또는 지역의 맑은 확대 할 수 있습니다. 단백질 형광을 유지...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 인산염은 식염 버퍼 </td><td> 시그마 - 알드리치 주식회사 </td><td> D8537 </td><td> 500 ML, pH를 7.2 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 15,710 </td><td> 10 × 10 ML, 16 %의 paraformaldehyde </td></tr><tr><td> 에틸 알코올 </td><td> Bioanalytical 미국 </td><td> AB00515-00500 </td><td> 500 ML, 200 증명 </td></tr><tr><td> 에틸 알코올 </td><td> Pharmco 제품, 주식회사 </td><td> 111000190 </td><td> 한 여자., 190 증명 </td></tr><tr><td> 벤질 알코올 </td><td> 시그마 - 알드리치 주식회사 </td><td> 402834 </td><td> 500 ML 99 + % </td></tr><tr><td> 벤질 벤조산 </td><td> 시그마 - 알드리치 주식회사 </td><td> B6630-IL </td><td> 500 ML, ≥ 99% </td></tr><tr><td> 5X/0.5 NA 목표 </td><td> 니콘 </td><td> 5 배 AZ 계획 밀가루 </td><td> 15 WD </td></tr></tbody></table>

yfp를 표현 잡습니다 마우스 뇌의 multiphoton 현미경

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

전체 마우스 기관의 고유 형광와 두 번째 고조파 세대 (SHG)의 Multiphoton 현미경은 광학 이미징 전에 장기를 삭제하여 가능하게됩니다. 1,2 그러나, GFP 및 YFP 등의 형광 단백질을 포함 기관, 메탄올을 사용하는 광학 소요되는 프로토콜 벤질 알코올 사용 탈수와 투명 : 빛 3에서 보호하면서 벤질 벤조산 (BABB)는 형광 신호를 보존하지 않습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 뉴런으로 표현 YFP의 형광 신호를 유지하면서 마우스 뇌에 전체 기관이 광학 개간을 수행 할 수있는 새로운 방법입니다. 기관은 형광 단백질에 손상을 줄이고 multiphoton 이미징 대한 형광 신호를 보존하는 것으로 확인되었습니다 에탄올 등급 시리즈를 사용하여 건조하다고 등의 광학 소요되는 프로토콜을 변경. 4 에탄올 기반의 탈수와 광학 소요의 최적화 방법을 사용하고 BABB에 의해 삭제빛으로부터 차폐하는 동안, 우리는 조직의 표면 아래 2mm 이상 마우스 뇌의 뉴런에 노란색 형광 단백질 (YFP) 표현의 고해상도 multiphoton 이미지를 보여줍니다.

전체 마우스 기관의 Multiphoton 현미경은 광학 이미징 전에 장기를 삭제하면 가능하지만, 모든 프로토콜은 형광 단백질의 형광 신호를 보존 할 수 있습니다. 에탄올 기반의 탈수 및 벤질 알코올 광학 개간 방법 사용 : 벤질 벤조산의 개간을, 우리는 전체 마우스 두뇌가 YFP을 표현의 고해상도 multiphoton 이미지를 보여줍니다.

YFP를 표현 잡습니다 마우스 뇌의 Multiphoton 현미경

마우스 전체 장기의 내인성 형광 및 제2 고조파 생성(SHG)에 대한 다광자 현미경 관찰은 ...의 광학적 투명화를 통해 가능해집니다.

고정된 조직의 다광자 현미경 관찰은 보통 수백 마이크론 정도의 얕은 침투 깊이로 제한됩니다. 당사는 최근 벤조 알코올과 벤조일 벤조에이트 용액을 이용한 광학 투명화 기술을 통해 고정된 마우스 장기 내부로 수 밀리미터 깊이까지 다광자 현미경 관찰이 가능하다는 것을 최초로 입증하였습니다. 초기 시연에서 이 기술은 조직 고유의 형광을 이미징하였습니다.하지만 GFP와 같은 형광 단백질을 발현하는 조직에 광학 투명화 방법을 적용하는 것에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 본 프로토콜에서는 마우스 뇌의 하나의 프로모터에서 발현되는 yellow fluorescent protein의 형광을 보존하는 benzo alcohol 용액을 사용하여, 투명화된 뇌 조직의 다광자 현미경 관찰 방법을 제시합니다. 장기를 이미지화하기 전에 광학적으로 투명화함으로써 다광자 현미경을 이용한 고해상도 마우스 전 장기 이미징이 가능해집니다. 다광자.뇌 조직을 구성하는 단백질과 물의 굴절률 차이로 인해 발생하는 강한 산란 효과로 인해, 뇌 영상 촬영은 조직 표면 아래 300 microns depth로 제한됩니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 장기를 탈수시키고, 물을 조직 구성 단백질과 유사한 굴절률을 가진 액체로 대체합니다. 이러한 광학 투명화(optical clearing) 과정은 빛의 산란을 크게 줄여 조직 표면 더 깊은 곳까지 더 나은 영상 촬영이 가능하도록 돕습니다.Batta 등의 이미지는 고유 형광 및 제2고조파 발생을 이용하여 서로 다른 마우스 장기의 조직학적 구조를 관찰하는 데 이 기술을 어떻게 적용할 수 있는지 보여줍니다. 첫 번째 이미지는 마우스 고환의 영상으로, 조직 표면에서 1.4 millimeters 아래에서 촬영되었습니다. 다광자 현미경의 고해상도 특성 덕분에 확대하여 정세관에서 형성되는 개별 정자 세포를 명확하게 관찰할 수 있습니다.여기 오른쪽 끝에서 볼 수 있듯이, 조직 표면으로부터 1.4 millimeters 아래에서 촬영한 마우스 폐 이미지를 보여줍니다. 이 이미지는 두 채널 다광자 이미징의 시연으로, 엘라스틴 성분은 적색으로, 콜라겐은 녹색으로 라벨링되었으며, 확대 시 개별 섬유를 쉽게 구별할 수 있습니다. 마지막으로, 조직 표면으로부터 850 microns 아래에서 촬영한 마우스 뇌 내부 영역의 고해상도 이미지를 보여줍니다. 뇌의 신피질과 해마 영역을 확대하면 개별 성상교세포와 신경세포체가 명확하게 관찰됩니다.하지만 YFP와 같은 형광 단백질을 포함할 수 있는 장기를 광학 투명화할 때, 기존의 badra 광학 투명화 프로토콜은 이러한 형광 단백질의 형광 신호를 보존하지 못합니다. 본 연구에서 제시하는 프로토콜은 YFP 및 뉴런의 형광 신호를 보존하면서 마우스 뇌의 전장기 광학 투명화 및 이미징을 수행하는 새로운 방법입니다. 에탄올 단계별 희석 시리즈를 사용하여 뇌를 탈수시키고, BAB로 알려진 benzyl alcohol benzoate 1:2 용액으로 투명화하는 방식이 형광 단백질의 손상을 줄이고 형광 신호를 보존하는 것으로 밝혀졌습니다. 다광자 이미징을 위해, 먼저 YFP 마우스의 체중을 측정한 후 케타민-자일라진을 복강 내 주사하여 마취시킵니다.수술을 진행하기 전 마취 평면(surgical plane of anesthesia)을 반드시 확인해야 합니다. 5분마다 동물의 발가락이나 꼬리를 강하게 집어 반응 여부를 확인하십시오. 만약 동물이 반응한다면 케타민-자일라진(ketamine xylazine) 추가 투여가 필요합니다.마취가 완료되면, 실험용 테이프를 사용하여 각 사지를 수술대와 부착함으로써 생쥐가 흉부를 노출시킨 채 등으로 누운 자세(supine position)를 유지하게 합니다. 먼저, 검상돌기 아래에 절개를 가한 뒤, 가위와 핀셋으로 피부를 젖히며 늑골 하단을 따라 절개합니다. 이어서 생쥐 흉골 양측을 따라 두 번의 절개를 가해 조직 플랩을 만들고, 지혈집게(hemostat)를 사용하여 이를 흉강에서 멀리 고정함으로써 심장을 노출시킵니다. 다음으로, 23 gauge 바늘을 심장의 좌심실에 삽입하고, 혈액이 빠져나갈 수 있도록 우심방의 근육벽에 작은 절개를 가합니다. 우심방을 절개한 직후, 우심방에서 더 이상 혈액이 배출되지 않을 때까지 4 °C의 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline)로 관류를 시작합니다.관류 시, 수축기 펌프를 사용하며 액체가 바늘 끝에서 1.5~2인치 정도 밖으로 분출되도록 펌핑 강도를 설정합니다. 모든 혈액이 배출되면, 생쥐의 몸이 눈에 띄게 딱딱해지고 굳어질 때까지 관류액을 4°C의 4% 파라포름알데히드 용액으로 교체합니다. 관류 후, 생쥐를 수술대에서 옮겨 머리를 분리한 다음 핀셋과 홍채 가위를 사용하여 뇌 적출을 시작합니다.두개골 뒷부분부터 앞부분을 향해 작은 구획으로 나누어 제거합니다. 가위로 두개골 전체에 걸쳐 2~4 mm 간격으로 작게 절개하는 동안, 포셉을 사용하여 뼈를 뇌 조직으로부터 조심스럽게 조금씩 떼어내어 뇌의 상단 표면 전체가 노출될 때까지 이 과정을 반복합니다. 그런 다음 외과용 스패튤라를 사용하여 뇌를 두개골에서 적출하고, 6시간 동안 고정하기 위해 4% paraform aldehyde가 담긴 유리 바이알에 넣습니다.본 시연에서는 주로 YFP를 발현하는 마우스 뇌의 이미징에 집중하지만, 이 절차의 투명화 능력을 최적으로 보여주기 위해 마우스의 뒷다리와 소장 절편 또한 광학적으로 투명화할 것입니다. 사후 고정 후, 뇌 및 기타 조직을 PBS로 2회 세척합니다. 그다음 조직 샘플을 50%, 70%, 90% 및 100% 농도의 에탄올 시리즈에 순차적으로 배양하여 상온에서 탈수시킵니다.각 배양 단계는 2시간 동안 진행되며, 이어서 100% ethanol 배양을 12시간 동안 수행하여 고정된 조직에서 수분을 효율적으로 제거합니다. 탈수 후, 마지막 100% ethanol 용액을 따라 버리고 조직 샘플을 ethanol과 BAB의 1:1 혼합 용액에 2시간 동안 담가둔 후, 100% BAB 투명화 용액에 침지시킵니다.bab 용액에 넣으면, 뇌와 기타 조직 샘플은 4~5시간 이내에 눈에 띄게 투명해집니다. 여기서는 광학 투명화 과정의 처음 6시간 동안의 타임랩스 영상을 보여줍니다. 영상의 끊긴 부분은 에탄올과 BAB의 1:1 혼합 용액을 100% BAB 용액으로 교체한 시점을 나타냅니다.6시간이 지나면 모든 장기가 투명해지는 징후를 보이며, 예를 들어 최적의 투명화 결과가 나타나면 생쥐 뒷다리의 뼈가 이제 명확하게 보입니다. 뇌는 강한 빛을 차단한 상태에서 실온에 6일 동안 두어 투명화시켜야 합니다. 뇌가 투명해져 이미징 준비가 되면, Sano 아크릴 접착제나 순간접착제를 사용하여 페트리 접시 바닥에 고정합니다.접착제가 마른 후, 뇌를 BAB에 담그고 이미지 촬영을 위해 페트리 접시를 대물렌즈 아래에 배치합니다. 이미지 촬영에는 710에서 990 nanometer 사이의 여기 파장으로 조절 가능한 MI tie 티타늄 사파이어 레이저가 통합된 다광자 현미경을 사용합니다. YFP 신호를 생성하기 위해 사용하는 여기 파장은 886 nanometers입니다.그 다음, 넓은 시야의 이미징이 가능한 NIK icon 5x 대물렌즈를 사용하여 반사 형광 신호를 캡처합니다. 반사 형광 신호는 5 35 50 밴드패스 필터로 필터링되며, 고양자 효율의 multiplier two OMA Matsu를 사용하여 수집됩니다. 이미지는 scan image 소프트웨어를 사용하여 2048 x 2048 픽셀의 해상도로 처리되며, 라인당 2ms의 스캔 속도를 적용하여 고해상도 YFP 이미지를 생성합니다.이미징이 완료되면, 뇌를 P two dish에서 꺼내 BAB에 담아 빛이 차단된 상태로 보관하여 향후 이미징에 사용합니다. 여기에 제시된 대표 이미지와 영상은 광학 투명화(optical clearing)를 통해 구현된 고해상도 다광자 이미징 능력을 보여줍니다. 전체 뇌 이미징을 통해 해마와 신피질의 서로 다른 층에 있는 YFP 표지 뉴런들을 조직 표면으로부터 최대 2 mm 깊이까지 명확하게 관찰할 수 있습니다.여기에서는 해마의 서로 다른 해부학적 층을 드러내기 위해 뇌 내부 0.8에서 2mm 깊이까지 촬영한 1.2mm 두께의 전체 입 구강 스프레인(whole mouth sprain) 이미지 스택 영상을 보여줍니다. 다음은 2mm 깊이의 이미지 스택에서 추출한 Bergman으로부터 1.94mm 떨어진 관상면 절단의 대표 이미지이며, 여기에는 해마의 서로 다른 층들이 표시되어 있습니다. 신피질을 확대해 보면, 조직 표면 아래 1.02mm 지점까지 신피질 5층 피라미드 뉴런의 개별 축삭과 뉴런 세포체를 명확하게 구분할 수 있습니다.여기 조직 표면에서 700~1020 µm 깊이에서 촬영한 5층 뉴런의 이미지 스택을 보여줍니다. 다음은 해당 스택 중에서 뇌 내부 774 µm 지점에서 촬영한 대표 이미지입니다. 동일한 이미지 스택을 사용하여 Image J 소프트웨어로 뉴런 영역의 3D 재구성을 수행하였습니다.멀티봇 현미경의 고해상도 기능은 개별 뉴런 전체의 이미지 또한 제시할 수 있게 해줍니다. 여기에서는 D 유전적 과정이 명확하게 보이는 신피질 5층 뉴런의 재구성 영상을 보여드립니다. 이것으로 YFP를 발현하는 생쥐 뇌 전체의 광학 투명화에 대한 발표를 마치겠습니다.이 기법의 수행 방법은 비교적 간단하며, 앞서 보여드린 바와 같이 마우스 뇌의 다양한 영역과 구조를 관찰하고 이미징하는 데 활용될 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 행운을 빕니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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