YFP를 표현 잡습니다 마우스 뇌의 Multiphoton 현미경

고정된 조직의 다광자 현미경 관찰은 보통 수백 마이크론 정도의 얕은 침투 깊이로 제한됩니다. 당사는 최근 벤조 알코올과 벤조일 벤조에이트 용액을 이용한 광학 투명화 기술을 통해 고정된 마우스 장기 내부로 수 밀리미터 깊이까지 다광자 현미경 관찰이 가능하다는 것을 최초로 입증하였습니다. 초기 시연에서 이 기술은 조직 고유의 형광을 이미징하였습니다.

하지만 GFP와 같은 형광 단백질을 발현하는 조직에 광학 투명화 방법을 적용하는 것에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 본 프로토콜에서는 마우스 뇌의 하나의 프로모터에서 발현되는 yellow fluorescent protein의 형광을 보존하는 benzo alcohol 용액을 사용하여, 투명화된 뇌 조직의 다광자 현미경 관찰 방법을 제시합니다. 장기를 이미지화하기 전에 광학적으로 투명화함으로써 다광자 현미경을 이용한 고해상도 마우스 전 장기 이미징이 가능해집니다. 다광자.

뇌 조직을 구성하는 단백질과 물의 굴절률 차이로 인해 발생하는 강한 산란 효과로 인해, 뇌 영상 촬영은 조직 표면 아래 300 microns depth로 제한됩니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 장기를 탈수시키고, 물을 조직 구성 단백질과 유사한 굴절률을 가진 액체로 대체합니다. 이러한 광학 투명화(optical clearing) 과정은 빛의 산란을 크게 줄여 조직 표면 더 깊은 곳까지 더 나은 영상 촬영이 가능하도록 돕습니다.

Batta 등의 이미지는 고유 형광 및 제2고조파 발생을 이용하여 서로 다른 마우스 장기의 조직학적 구조를 관찰하는 데 이 기술을 어떻게 적용할 수 있는지 보여줍니다. 첫 번째 이미지는 마우스 고환의 영상으로, 조직 표면에서 1.4 millimeters 아래에서 촬영되었습니다. 다광자 현미경의 고해상도 특성 덕분에 확대하여 정세관에서 형성되는 개별 정자 세포를 명확하게 관찰할 수 있습니다.

여기 오른쪽 끝에서 볼 수 있듯이, 조직 표면으로부터 1.4 millimeters 아래에서 촬영한 마우스 폐 이미지를 보여줍니다. 이 이미지는 두 채널 다광자 이미징의 시연으로, 엘라스틴 성분은 적색으로, 콜라겐은 녹색으로 라벨링되었으며, 확대 시 개별 섬유를 쉽게 구별할 수 있습니다. 마지막으로, 조직 표면으로부터 850 microns 아래에서 촬영한 마우스 뇌 내부 영역의 고해상도 이미지를 보여줍니다. 뇌의 신피질과 해마 영역을 확대하면 개별 성상교세포와 신경세포체가 명확하게 관찰됩니다.

하지만 YFP와 같은 형광 단백질을 포함할 수 있는 장기를 광학 투명화할 때, 기존의 badra 광학 투명화 프로토콜은 이러한 형광 단백질의 형광 신호를 보존하지 못합니다. 본 연구에서 제시하는 프로토콜은 YFP 및 뉴런의 형광 신호를 보존하면서 마우스 뇌의 전장기 광학 투명화 및 이미징을 수행하는 새로운 방법입니다. 에탄올 단계별 희석 시리즈를 사용하여 뇌를 탈수시키고, BAB로 알려진 benzyl alcohol benzoate 1:2 용액으로 투명화하는 방식이 형광 단백질의 손상을 줄이고 형광 신호를 보존하는 것으로 밝혀졌습니다. 다광자 이미징을 위해, 먼저 YFP 마우스의 체중을 측정한 후 케타민-자일라진을 복강 내 주사하여 마취시킵니다.

수술을 진행하기 전 마취 평면(surgical plane of anesthesia)을 반드시 확인해야 합니다. 5분마다 동물의 발가락이나 꼬리를 강하게 집어 반응 여부를 확인하십시오. 만약 동물이 반응한다면 케타민-자일라진(ketamine xylazine) 추가 투여가 필요합니다.

마취가 완료되면, 실험용 테이프를 사용하여 각 사지를 수술대와 부착함으로써 생쥐가 흉부를 노출시킨 채 등으로 누운 자세(supine position)를 유지하게 합니다. 먼저, 검상돌기 아래에 절개를 가한 뒤, 가위와 핀셋으로 피부를 젖히며 늑골 하단을 따라 절개합니다. 이어서 생쥐 흉골 양측을 따라 두 번의 절개를 가해 조직 플랩을 만들고, 지혈집게(hemostat)를 사용하여 이를 흉강에서 멀리 고정함으로써 심장을 노출시킵니다. 다음으로, 23 gauge 바늘을 심장의 좌심실에 삽입하고, 혈액이 빠져나갈 수 있도록 우심방의 근육벽에 작은 절개를 가합니다. 우심방을 절개한 직후, 우심방에서 더 이상 혈액이 배출되지 않을 때까지 4 °C의 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline)로 관류를 시작합니다.

관류 시, 수축기 펌프를 사용하며 액체가 바늘 끝에서 1.5~2인치 정도 밖으로 분출되도록 펌핑 강도를 설정합니다. 모든 혈액이 배출되면, 생쥐의 몸이 눈에 띄게 딱딱해지고 굳어질 때까지 관류액을 4°C의 4% 파라포름알데히드 용액으로 교체합니다. 관류 후, 생쥐를 수술대에서 옮겨 머리를 분리한 다음 핀셋과 홍채 가위를 사용하여 뇌 적출을 시작합니다.

두개골 뒷부분부터 앞부분을 향해 작은 구획으로 나누어 제거합니다. 가위로 두개골 전체에 걸쳐 2~4 mm 간격으로 작게 절개하는 동안, 포셉을 사용하여 뼈를 뇌 조직으로부터 조심스럽게 조금씩 떼어내어 뇌의 상단 표면 전체가 노출될 때까지 이 과정을 반복합니다. 그런 다음 외과용 스패튤라를 사용하여 뇌를 두개골에서 적출하고, 6시간 동안 고정하기 위해 4% paraform aldehyde가 담긴 유리 바이알에 넣습니다.

본 시연에서는 주로 YFP를 발현하는 마우스 뇌의 이미징에 집중하지만, 이 절차의 투명화 능력을 최적으로 보여주기 위해 마우스의 뒷다리와 소장 절편 또한 광학적으로 투명화할 것입니다. 사후 고정 후, 뇌 및 기타 조직을 PBS로 2회 세척합니다. 그다음 조직 샘플을 50%, 70%, 90% 및 100% 농도의 에탄올 시리즈에 순차적으로 배양하여 상온에서 탈수시킵니다.

각 배양 단계는 2시간 동안 진행되며, 이어서 100% ethanol 배양을 12시간 동안 수행하여 고정된 조직에서 수분을 효율적으로 제거합니다. 탈수 후, 마지막 100% ethanol 용액을 따라 버리고 조직 샘플을 ethanol과 BAB의 1:1 혼합 용액에 2시간 동안 담가둔 후, 100% BAB 투명화 용액에 침지시킵니다.

bab 용액에 넣으면, 뇌와 기타 조직 샘플은 4~5시간 이내에 눈에 띄게 투명해집니다. 여기서는 광학 투명화 과정의 처음 6시간 동안의 타임랩스 영상을 보여줍니다. 영상의 끊긴 부분은 에탄올과 BAB의 1:1 혼합 용액을 100% BAB 용액으로 교체한 시점을 나타냅니다.

6시간이 지나면 모든 장기가 투명해지는 징후를 보이며, 예를 들어 최적의 투명화 결과가 나타나면 생쥐 뒷다리의 뼈가 이제 명확하게 보입니다. 뇌는 강한 빛을 차단한 상태에서 실온에 6일 동안 두어 투명화시켜야 합니다. 뇌가 투명해져 이미징 준비가 되면, Sano 아크릴 접착제나 순간접착제를 사용하여 페트리 접시 바닥에 고정합니다.

접착제가 마른 후, 뇌를 BAB에 담그고 이미지 촬영을 위해 페트리 접시를 대물렌즈 아래에 배치합니다. 이미지 촬영에는 710에서 990 nanometer 사이의 여기 파장으로 조절 가능한 MI tie 티타늄 사파이어 레이저가 통합된 다광자 현미경을 사용합니다. YFP 신호를 생성하기 위해 사용하는 여기 파장은 886 nanometers입니다.

그 다음, 넓은 시야의 이미징이 가능한 NIK icon 5x 대물렌즈를 사용하여 반사 형광 신호를 캡처합니다. 반사 형광 신호는 5 35 50 밴드패스 필터로 필터링되며, 고양자 효율의 multiplier two OMA Matsu를 사용하여 수집됩니다. 이미지는 scan image 소프트웨어를 사용하여 2048 x 2048 픽셀의 해상도로 처리되며, 라인당 2ms의 스캔 속도를 적용하여 고해상도 YFP 이미지를 생성합니다.

이미징이 완료되면, 뇌를 P two dish에서 꺼내 BAB에 담아 빛이 차단된 상태로 보관하여 향후 이미징에 사용합니다. 여기에 제시된 대표 이미지와 영상은 광학 투명화(optical clearing)를 통해 구현된 고해상도 다광자 이미징 능력을 보여줍니다. 전체 뇌 이미징을 통해 해마와 신피질의 서로 다른 층에 있는 YFP 표지 뉴런들을 조직 표면으로부터 최대 2 mm 깊이까지 명확하게 관찰할 수 있습니다.

여기에서는 해마의 서로 다른 해부학적 층을 드러내기 위해 뇌 내부 0.8에서 2mm 깊이까지 촬영한 1.2mm 두께의 전체 입 구강 스프레인(whole mouth sprain) 이미지 스택 영상을 보여줍니다. 다음은 2mm 깊이의 이미지 스택에서 추출한 Bergman으로부터 1.94mm 떨어진 관상면 절단의 대표 이미지이며, 여기에는 해마의 서로 다른 층들이 표시되어 있습니다. 신피질을 확대해 보면, 조직 표면 아래 1.02mm 지점까지 신피질 5층 피라미드 뉴런의 개별 축삭과 뉴런 세포체를 명확하게 구분할 수 있습니다.

여기 조직 표면에서 700~1020 µm 깊이에서 촬영한 5층 뉴런의 이미지 스택을 보여줍니다. 다음은 해당 스택 중에서 뇌 내부 774 µm 지점에서 촬영한 대표 이미지입니다. 동일한 이미지 스택을 사용하여 Image J 소프트웨어로 뉴런 영역의 3D 재구성을 수행하였습니다.

멀티봇 현미경의 고해상도 기능은 개별 뉴런 전체의 이미지 또한 제시할 수 있게 해줍니다. 여기에서는 D 유전적 과정이 명확하게 보이는 신피질 5층 뉴런의 재구성 영상을 보여드립니다. 이것으로 YFP를 발현하는 생쥐 뇌 전체의 광학 투명화에 대한 발표를 마치겠습니다.

이 기법의 수행 방법은 비교적 간단하며, 앞서 보여드린 바와 같이 마우스 뇌의 다양한 영역과 구조를 관찰하고 이미징하는 데 활용될 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 행운을 빕니다.