위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용

본 실험의 목적은 정의된 인공 가래 배지를 사용하여 낭성 섬유증 폐의 만성 감염을 대표하는 조건 하에서 pseudomonas Aerogen 바이오필름에 대한 항생제의 효능을 평가하는 것입니다. 세균 바이오필름은 24웰 마이크로타이터 플레이트에서 배양됩니다.

그다음 바이오필름을 항생제에 노출시킵니다. 이어서 항생제 처리된 배양물을 셀룰라아제(cellulase)를 사용하여 분해하고, 생존 세포에 의해 청색에서 분홍색으로 환원되는 대사 염료인 srin과 함께 배양합니다. 웰의 흡광도를 측정함으로써, 생리적 조건과 유사한 환경에서의 항생제 감수성을 정량화하기 위한 바이오필름 세균 최소 억제 농도(B-S-M-I-C)를 결정할 수 있습니다.

부유 배양 기반의 최소 억제 농도 결정과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 가래의 모든 성분이 포함된 특수 배지에서 박테리아를 배양하여 바이오필름 형성을 촉진한다는 점입니다. 이러한 바이오필름은 항생제에 훨씬 더 높은 내성을 보입니다. 배지를 만들기 위해, 먼저 첫 번째 병에 250 milliliters의 멸균수를 담은 병 두 개를 준비하십시오.

교반하며 서서히 4g의 어류 정자 DNA를 250mL의 멸균수에 첨가합니다. 실온에서 용액을 교반하여 DNA를 완전히 용해시킨 후 두 번째 병에 옮깁니다. 5g의 돼지 위 유래 2형 뮤신을 서서히 첨가하며 교반합니다.

DNA와 뮤신 용액이 준비되면, L-tyrosine과 L-cysteine을 제외한 아미노산들을 100 mL의 멸균수에 녹입니다. L-tyrosine과 L-cysteine은 각각 25 mL의 물 또는 25 mL의 0.5 M potassium hydroxide에 녹여야 합니다. 다음으로, 5.9 mg의 DTPA, 5 g의 sodium chloride, 2.2 g의 potassium chloride를 100 mL의 물에 녹입니다. 이 모든 용액들을 1 L 병에 합친 후, 5 mL의 난황 에멀젼을 추가하고 물을 부어 혼합물의 최종 부피를 850 mL로 맞춥니다.

1 M Tris를 사용하여 pH를 6.9로 조정한 후, 멸균을 위해 증류수를 더해 최종 부피를 1 L로 맞춥니다. Vacuum brand ME 2 다이아프램 진공 펌프와 45 mm 넥 및 0.2 µm 공극 크기의 Millipore Stericup 필터 유닛을 사용하여 배지를 여과합니다. 여과 과정은 이틀에 걸쳐 진행할 수 있습니다. A SM 배지는 4 °C에서 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다.

먼저 밤새 배양한 *Pseudomonas aeruginosa* 배양액을 LB 배지로 희석하여 OD 0.05로 맞춥니다. 그다음, 희석된 박테리아를 SM 배지 플레이트에 1:100 비율로 추가 희석합니다. 24웰 조직 배양 플레이트의 21개 웰에 희석된 박테리아 배양액을 웰당 1.8 milliliters씩 분주하고, 나머지 3개 웰에는 공백 음성 대조군으로 사용할 동일한 부피의 SM 배지를 분주합니다. 24웰 플레이트를 밀봉하고, 바이오필름이 형성될 수 있도록 미호기성 조건 하에 둡니다. 이러한 조건은 대형 혐기성 자(jar) 내에 Campden 가스 발생 팩을 사용하여 조성할 수 있습니다.

배양액을 37 °C에서 75 RPM으로 설정된 쉐이커에서 3일 동안 배양합니다. 3일 후면 박테리아 세포를 포함하는 젤라틴성 덩어리 형태의 바이오필름이 형성되며, 이는 피펫팅으로 분해되지 않습니다. 바이오필름이 형성되면 각 웰에 단계적으로 희석된 농도의 항생제를 200 µL씩 첨가합니다. 테스트할 각 약물 농도당 최소 4개의 반복구를 설정하고, 음성 대조군으로 사용할 바이오필름 포함 웰 4개는 처리하지 않은 상태로 둡니다.

그 다음, 항생제 배양 후 플레이트를 24시간 동안 추가로 배양합니다. 바이오필름을 분해하기 위해 시트르산 완충액(citrate buffer)으로 100 mg/mL로 희석한 셀룰라아제(cellulase)를 웰당 100 µL씩 사용하며, 플레이트를 37 °C의 호기성 조건에서 150 RPM으로 설정된 쉐이커에서 1시간 동안 배양합니다. 이 배양 단계 이후, 배지에 세포 덩어리가 보일 경우 피펫팅을 통해 바이오필름을 추가로 분산시킬 수 있습니다.

다음으로, 바이오필름에서 방출된 세포의 생존력을 정량화하기 위해 웰당 100 µL의 rezin을 첨가하고 세포를 1~2시간 동안 배양합니다. 37 °C에서 생존 가능한 세포만이 청색 zarin 염료를 분홍색 형광 형태로 대사할 수 있습니다. 배양 후, 샘플을 96 웰 플레이트로 옮기고 540 nm의 들뜸 파장과 590 nm의 방출 파장을 사용하여 웰의 형광을 측정합니다.

박테리아의 생존력과 약물 감수성을 정량화하려면, 먼저 공백 대조군의 배경 형광 값을 다른 웰의 값에서 뺍니다. 그다음, 각 농도의 평균 형광 값을 처리하지 않은 대조군의 평균 형광 값으로 나누고 100을 곱하여 억제 백분율을 계산합니다. B-S-M-Y-C는 대사 활성을 90% 억제하는 항생제 농도로 정의되며, 이 전자현미경 사진에서 볼 수 있듯이 바이오필름 내에서 성장한 세포는 플랑크톤 배양으로 성장한 박테리아와 상당히 다릅니다.

특히, 노란색으로 표시된 다량의 세포외 기질이 녹색의 바이오필름 내 세포들을 둘러싸고 있는 반면, 부유성 콜로니에서는 나타나지 않습니다. 또한, 본 실험에서 바이오필름 내의 박테리아는 일반적으로 항생제에 대해 더 높은 내성을 보입니다. 파란색으로 표시된 Pseudomonas aerogen 부유 배양액에 대한 tobramycin의 최소 억제 농도는 약 4 µg/mL로 측정되었습니다.

이와 대조적으로, 빨간색으로 표시된 바와 같이 바이오필름 내 박테리아의 100%가 512 micrograms per milliliter의 항생제 농도에서도 생존했습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 정의된 인공 객담 배지에서 박테리아를 배양하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한, 낭성 섬유증 폐와 더 유사한 환경에서 박테리아 성장을 억제하는 데 필요한 최소 억제 농도를 결정하기 위한 항생제 감수성 테스트를 수행할 수 있어야 합니다.