Name: 흡입 피펫 기법을 사용하여 강한 수용체 뉴런에서 기록 Odorant 유발 응답 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 학습하세요 흡입 피펫 기법을 사용하여 생쥐 후각 수용체 뉴런에서 냄새 물질 유발 반응을 기록하는 방법을. 이 기술은 수용체 전류와 활동 전위를 동시에 측정하여 후각 신호 전달 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 NIH DC009613, 인간 프론티어 과학 프로그램과 몰리 케어 휄로 십 (JR까지)에 의해 지원되었다.

1. 녹음 설정 녹음 챔버는 공기 테이블에 장착되어 전기적으로 패러데이 케이지를 사용하여 차폐되어 위상 대비 광학있는 니콘 TE2000U 이클립스 (Eclipse) 역 현미경에 장착되어 있습니다. 플렉시 글라스 기록 챔버는 두 부분 부분적으로 장벽에 의해 분리되어 silanized 유리 슬라이드에 접착으로 구성되어 있습니다. 챔버의 한 부분이 다른이 odorant에 조기 정착의 노출하지만, 아직 사용하지 않은 셀을 최소화하기 위해 녹화 중에 자극 - 노출에 사용되는 동안 세포를 해결하는 데 사용됩니다. 녹음 설정은 pelleted 피펫 홀더 및 접지 전극에 장착 흡입 피펫 (아래 참조)으로 구성되어 있습니다. 흡입 피펫은 micromanipulator를 사용하여 위치하고 있습니다. 자극 솔루션은 각각의 사각형 튜브가 0.7 mm X 0.7 mm거든요, 트리플 통 유리 사각형 튜브를 사용하여 적용됩니다. 트리플 배럴 유리는 머니퓰레이터에 장착 동력 빠른 단계 재관류 시스템 (Sut에 연결되었습니다적이 SF-77B, 워너 계측기)과 ~ 45 °의 각도로 녹화 챔버를 입력했습니다. 트리플 통 유리의 끝은 트리플 통 유리의 마지막 얼굴 (개방)은 피펫의 가까이에 위치하도록 허용하고, 수직이라고 같은 다시 45 °의 각도로 beveled되었습니다. 표준 포유류의 벨소리 솔루션과 접지 전극으로 가득 흡입 피펫 전극은 전압 클램프 모드에서 패치 클램프 증폭기의 1 GΩ의 headstage (PC-501A, 워너 악기)에 연결되어 있습니다. 앰프 (낮은 패스 5 kHz에서에서 필터링)에서 아날로그 신호는 실시간으로 신호를 모니터링하기 위해 디지털 오실로스코프에 표시되며 신호가 통과 필터링 낮은 8 극 베셀 필터 (Krohn-Hite)에 연결되어 50 Hz에서. 두 신호 (5 kHz에서 50 Hz에서 필터링 저역 통과) 데이터 수집을 위해 PC에 연결되어 A / D 컨버터 (캠브리지 전자 디자인 마이크로 1401의 mkII)에 공급하고 있습니다. 데이터 신호 3 acq를 사용하여 기록됩니다10 kHz에서의 샘플링 주파수에서 uisition 소프트웨어 (캠브리지 전자 디자인). 신호는 먼저 겹쳐 작업 가능성과 함께 현재의 수용체 후 혼자 전류 수용체를 (그림을 참조하십시오. 2) 기록하는 두 개의 서로 다른 대역폭에 기록됩니다. 재관류 시스템은 신호음 (제어) 솔루션과 odorant 자극 또는 원하는 구성의 솔루션을 사이에 빠르게 전환하는 데 사용되며 PC 및 신호 3 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 솔루션은 60 ML의 주사기에 포함되어 있으며 유량은 의료 수준의 정맥 흐름 규제에 의해 제어됩니다. 일반적으로 유량은 1 ML / 분으로 설정되어 있습니다. 녹음 피펫의 흡입은 다음과 같은 방법으로 제어됩니다 : 피펫 홀더의 측면 포트가 차례로 높이 조절 오일 저장조에 연결되어 오일 라인에 연결되어 있습니다. 높이거나 저수지를 낮추면 보장 그 P의 끝을 통해 피펫 압력, 따라서 벨소리 흐름ipette을 최소화하고 약간 긍정적이다. 추가 흡입 또는 압력은 녹음 피펫의 끝으로 격리 ORN의 전지 본체를 빨아 다른 끝에서 마우스 피스와 저수지의 영공에 연결된 튜브를 통하여 적용 할 수 있습니다. 실험 ° C 밀접하게 세포의 기본 생리 조건을 시뮬레이션하기 위해 37 수행됩니다. 온도는 솔루션을 포함하는 스테인리스 스틸 튜브는 10을 통과하는 통과 세라믹 저항기로 구성되어 주문 제작 난방 장치를 통해 솔루션을 전달하여 제어됩니다. 온도는 열전대 온도계 (우연)를 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. 2. 솔루션 포유류의 벨소리의 솔루션 (MM) : 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 2 CaCl 2, 0.01 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 HEPES, 10 포도당. 산도는 NaOH와 7.5로 조정되었습니다. 10 % 희석 벨소리의 솔루션은 접합 전류를 측정하기 위해 사용되었다. OdoraNT 솔루션 : 아세토 페논 및 유제 놀은 20 MM DMSO 주식에서 벨소리의 솔루션에서 매일 준비했다. 3. 전극을 만들기 <ol><li> 셔터 P-97 micropipette의 풀러의 모세관 unfilamented 붕규산 유리를 놓고 긴 테이퍼와 micropipette를 당겨. </li><li> 접안 렌즈와 무대에 탑재 된 이동식 다이아몬드 나이프의 십자선이 마련되어 차례에 니콘 E200 이클립스 현미경에 장착 주문 제작 micropipette 홀더에 피펫을 전송합니다. </li><li> 20x 목적 아래 피펫의 팁을 관찰하고 reticle을 가이드로 사용하여, 부드럽게 서기 피펫은 10 μm 폭 (외경)입니다 맞춤 제작 다이아몬드 칼을 사용하여 90 ° 각도로 피펫. </li><li> 끝으로 더 다이아몬드 칼을 이동하고 점차 다이아몬드 칼 끝에 압력을 적용 할 수 있습니다. 피펫 팁은이 scribed 된 시점에서 완전히 깨해야합니다. </li></ol> 또는 3.1로 단계를3.4이 결합 될 수 있으며 이러한 큰 팁 직경 깔끔하게 잘라 가장자리를 안정적으로 피펫을 끌어 어려워 증명할 수 있지만 피펫은 직접 피펫 팁을 잘라 할 필요없이 원하는 크기로 끌어 할 수 있습니다. <ol start="5"><li> 40x 목적에서 전기 온수 필라멘트를 사용하여 5 μm의 내부 직경 피펫의 끝을 연마 발사. 일단 완료, micropipette 마우스 ORNs에서 녹화 전류에 사용 할 준비가되어 있습니다. 벨소리로 가득 할 때 열려있는 피펫 저항은 MΩ 한 주변해야합니다. </li></ol> 4. 강한 수용체 뉴런의 절연 <ol><li> 기관 지침 및 규정에 따라 마우스를 희생. , 머리를 제거 벗겨 버릴 피부는 두개골을 놓인하고 medially 중간 선을 따라 머리를 두 갈래로 갈라지다. </li><li> 해부 stereomicroscope 아래 두 반의 뜻 헤드를 배치, 코 중격을 뽑아 후각 turbinates를 제​​거합니다. 포도당 (C)와 배양 접시에있는 모든 조직을 놓으십시오포유류의 벨소리 솔루션을 ontaining. </li><li> 이 turbinates에서 기본 연골에서 후각 상피 껍질을 250 μl 벨소리를 포함하는 Eppendorf 튜브에 조직을 전송합니다. 우리는 우리의 기록 챔버의 크기에 셀의 오른쪽 밀도를 얻을이 turbinates에서 조직을 사용합니다. ° C 나중에 사용하기 위해 4에 남아있는 조직을 저장합니다. </li><li> 중간 속도로 1 초에 두 번 짧게 후각 상피를 포함하는 소용돌이 Eppendorf 튜브. 이 단계는 상피에서 ORNs의 기계 분해로 연결됩니다. </li><li> 녹화 실에서 dissociated ORNs를 포함하는 벨소리 솔루션을 놓으십시오. 고급 집게를 사용하여 정지도 현재 조직의 큰 조각을 제거합니다. </li><li> ORNs은 벨소리와 함께 지속적으로 superfusion를 시작하기 전에 20 분에 정착하고 녹음을 계속하자. </li></ol> 5. 녹음 <ol><li> 녹음 챔버와 regul에 오일 라인에 연결된 흡입 전극을 낮 춥니 다피펫 팁에 약간의 긍정적 인 압력을 수립 할 수있는 오일 탱크의 높이를 먹었다. 이것은 피펫에서 (긍정적 인 압력) 또는 (부정적인 압력)에 대한 멀어 예를 들어 세포 파편을 관찰하여 수행 할 수 있습니다. 셀 쓰레기와 피펫의 팁을 오염하지보십시오. </li><li> 20 40x의 배율을 사용하여 전형적인 바이폴라 형태에 의해 인식 될 수있는 절연 ORN에 대한 기록 챔버를 검사합니다. ORN 전지 본체의 근접에 기록 전극을 이동합니다. 부드럽게 전지 본체는 피펫의 팁을 체결 있도록 빠는 시작합니다. 조심스럽게 천천히 전체 전지 본체는 목욕 솔루션에 노출 dendrite과 섬모가 부족해 남겨두고 흡입 피펫의 끝으로 그려 될 때까지 흡입을 적용하고 있습니다. 형편 ORNs 및 피펫 모양의 이미지 7,11를 참조하십시오. 더 흡입이 적용되지 않습니다되면, ORN은 피펫의에서 이동하거나하지 않습니다 있는지 확인하십시오. 그렇다면, 그에 따라 석유 저수지의 높이를 조정합니다. </li><li> 를 사용하여마이크로은 챔버의 기록 섹션에 정착 ORNs를 포함하는 섹션에서 흡입 피펫 이동합니다. 솔루션 교환을위한 3 질주 관 앞의 흡입 피펫을 조심스럽게 넣습니다. ORN은 따라서 혼합 난류를 피 층류에 노출되어 있으며 빠른 솔루션 교환을 달성하기 위해되도록 흡입 피펫은 충분히 3 질주 튜브의 개통에 배치해야합니다. 솔루션 교환은 흡입 피펫의 끝에서 흐르는 솔루션의 병렬 스트림 사이의 인터페이스를 스테핑에 의해 달성된다. 솔루션 교환의 시간 코스는 일반적으로 서로 다른 이온 성분의 솔루션 사이의 셀을 (그림을 참조하십시오. 2) 스테핑에 의해 evoked 접합 전류에서 측정 약 20 밀리 초입니다. 솔루션은 중력에 의해 전달됩니다. </li></ol> &lt;스팬 클래스 = "pdflinebreak"&gt; 6. 대표 결과 <img alt="1 그림." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig1.jpg"> 그림 1. 후각 망울에서 A) 바이폴라 수용체 뉴런. B) 속눈썹의 신호 전달 기계는 궁극적으로 현재의 유입을 흥분성의로 연결됩니다. 다음의 탈분극은 전지 본체의 행동 가능성 생성을 트리거합니다. <img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig2.jpg"> 그림 2는 솔루션 교류의 속도와 안정성을 보여줍니다. 피펫는 100 밀리와 비슷 이온 농도에 의한 접합 전류가 기록 된 10 % 희석 벨소리로 정상에서 내려올되었습니다. 블랙 추적 번가입니다5 시험의 분노를, 빨강은 SD를 추적. 솔루션 교환시 SD에서 약간의 변화는 시험에서 시험 및 솔루션 스트림 하나를 초과하는 소음의 부족으로 솔루션 교류의 신뢰성을 보여줍니다. <img alt="그림 3." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig3.jpg"> 그림 3은 흡입 피펫 기술을 사용하여 ORN에서 유제 놀 유발 응답을 보여줍니다. 녹화 위의 막대로 표시로 ORN은 1 초 동안 100 μM의 유제 놀에 노출되었다. 그림합니다. 만 현재 수용체를 표시하려면 50 Hz에서 그림은 - 3A는 (검은 색 추적) 수용체 전류는 대역폭이 0에서 필터링되었습니다.. 5000 Hz에서 (빨간색 추적)도 작업 잠재력을 (화살표로 표시 APS) 표시 - 3B 지금은 0의 폭 넓은 대역폭에서 필터링 같은 기록을 보여줍니다. 삽입은 응답의 발병에 더 명확하게 APS를 시각적으로 확장 timescale에서 동일한 추적을 보여줍니다. <img alt="4 그림." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig4.jpg" files> 유제 놀 - 응답 ORN의 그림 4. 선량 반응 가족 (A). 유제 놀은 0.3 μM에서 100 μM에 이르기까지 다양한 농도에서 사용 된, 자극 기간은 1 초이고 흔적은 0에서 필터링 - 50 Hz에서. odorant 농도의 진보적 인 증가는 odorant 노출이 종료 된 후에는 더 많은 느리게 종료 크고 빠른 응답을 낳았다. ORNs는 중간 odorant 농도 (그림 4B)에서 긴 stimulations 동안 왕복 응답 패턴을 표시 할 수 있습니다. 다음은 acetephenone (3 μM) 응답 ORN은 8 초 동안 자극했다. 자극의 발병에 신속하고 과도 피크 응답 후 작은, 반복 응답의 일련의 관찰됩니다. 50 Hz에서 - 녹화 대역폭은 0이었다.

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</ol>

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<p class="jove_content"&gt; 흡입 피펫 기술은 동시에 ORN에서 냄새 유발 느린 수용체 전류와 빠른 biphasic 작업 잠재력을 기록하는 데 사용됩니다 electrophysiological 방법입니다. 세포의 플라즈마 막이 위반되지 않기 때문에,이 방법은 odorant 응답은 세포 내 요소의 세포질 이온 농도 또는 희석의 변화로 인해 변경되지 않도록 보장 방해받지 세포 환경을 남긴다. 셀은 긴 기간 (마우스 개구리 1 H에서 최대 4 H)에에서 기록 할 수 있습니다. 전지 본체는 기록 피펫 내부이기 때문에이 기술의 또 다른 장점은 자극이 ORN의 꼭대기 부분에만 전달되어,이 즉, 속눈썹 및 수지상 손잡이 (같은 경우가<em&gt; 생체 내</em&gt;) 따라서 전체 셀이 노출 된 경우 발생할 수있는 비 특정 효과를 제거. 셀이 비교적 잘 피펫, 높은 솔루션 유량의 끝에서 안정적으로 앉아에 의해 보호되며, 따라서 빠른 솔루션 변경 달성 될 수 있으므로 또한, 고 유량 쉽게 실의 손실이 발생할 수있는 긴밀한-인감 기록 구성에 비해 . 세포 액세스 권...

<table border="1"><tbody><tr><td> 물질의 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 / 모델 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 에어 테이블 </td><td> 장비 </td><td> 뉴 포트 (Newport) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 에어 펌프 </td><td> 장비 </td><td> 뉴 포트 (Newport) </td><td> ACGP </td><td></td></tr><tr><td> 피펫 풀러 </td><td> 장비 </td><td> 셔터 </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> 붕규산 유리 </td><td> 장비 </td><td> WPI </td><td> 1B150-4 </td><td></td></tr><tr><td> 니콘 이클립스 역 현미경 </td><td> 장비 </td><td> 니콘 </td><td> TE2000U </td><td> HG 램프, GFP 필터 및 목표 20X 및 최소 5 배를 갖춘 </td></tr><tr><td> 앰프 PC-501A </td><td> 장비 </td><td> 워너 </td><td> 64-0008 </td><td> Headstage 1 GΩ </td></tr><tr><td> 다이아몬드 나이프 </td><td> 장비 </td><td> 맞춤 양복 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 디지타이저 Mikro1401 A / D </td><td> 장비 </td><td> 캠브리지 전자 디자인 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 필터 유닛 3382 </td><td> 장비 </td><td> Krohn Hite 법인 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 신호 </td><td> 소프트웨어 </td><td> 캠브리지 전자 디자인 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 자세 / AgCl 펠릿 성형 </td><td> 장비 </td><td> WPI </td><td> 64-1297 </td><td></td></tr><tr><td> 피펫 홀더 </td><td> 장비 </td><td> 워너 </td><td> 64-0997 </td><td> 맞춤에 맞게 수정 headstage </td></tr><tr><td> 녹음 챔버 </td><td> 장비 </td><td> 맞춤 양복 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator MP85-1028 </td><td> 장비 </td><td> 셔터 악기 </td><td> Micromanipulator MP85-1028 </td> &lt;TD&gt; </td></tr><tr><td> 미네랄 오일 </td><td> 용액 </td><td> 시그마 </td><td> 330779-1L </td><td></td></tr><tr><td> 오실로스코프 TDS 1001 </td><td> 장비 </td><td> 텍트로닉스 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 세 질주 평방 유​​리관 </td><td> 장비 </td><td> 워너 </td><td> 64-0119 </td><td> 5cm 길이 0.6 mm의 ID, </td></tr><tr><td> 판막 </td><td> 장비 </td><td> 리 회사 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Valvelink 8.2 </td><td> 장비 </td><td> 과학 자동화 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SF-77B 재관류 빠른 단계 </td><td> 장비 </td><td> 워너 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

흡입 피펫 기법을 사용하여 강한 수용체 뉴런에서 기록 odorant 유발 응답

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

동물은 비강에있는 chemosensory 시스템을 통해 주위의 향기가있는 환경을 드셔보세요. Chemosensory 신호는 식품 선택, 육식 동물, conspecific 및 동료 인식과 다른 사회적 관련 신호로 복잡한 동작에 영향을 미칩니다. 후각 수용체 뉴런은 (ORNs) 후각 상피에 포함 된 비강의 등 부분에 위치하고 있습니다. 이러한 양극성 뉴런은 (그림을 참조하십시오. 1, 원래 일반 생리학의 저널에 출판 Reisert &amp; 조 1) 후각 망울에 축삭을 보내 후각을 커버 점액에있는 솜털의 방출에서 상피 국경에 하나의 dendrite를 확장 상피. 채널 (그림 1) - 속눈썹은 궁극적으로 ciliary 전달 채널, 순환 염기 - 게이트 (CNG) 채널 및 칼슘 2 + - 활성화의 망할 CIA를 통해 현재의 유입을 흥분성의로 연결 신호 전달 기기가 포함되어 있습니다. 다음의 depolarization는 전지 본체 2-4에서 행동 가능성 생성을 트리거합니다. 이 비디오에서 우리는 ORNs에서 odorant 유발 반응을 기록 할 수있는 &#39;흡입 피펫 기술 &quot;의 사용을 설명합니다. 이 방법은 원래로드 photoreceptors 5에서 기록하기 위해 개발되었으며,이 방법의 변형은 마우스 콘 photoreceptors 6 일부터 기록하도록 수정 jove.com에서 찾을 수 있습니다. 흡입 피펫 기술은 나중에도 ORNs 7,8에서 기록하도록 구성되었습니다. 간단히, 후각 상피 및 세포 분리의 분리에 따라, ORN의 전체 전지 본체는 기록 피펫의 끝으로 빨려 있습니다. dendrite과 속눈썹은 목욕 솔루션에 노출 예를 들어 odorant 또는 약리 차단 응용 프로그램을 활성화하는 솔루션 변경에 따라서 액세스 할 수 남아 있습니다. 이 구성에서, 세포 내 환경에 더 접근 얻은 없습니다 (NO 전체 셀 전압 클램프)와 세포 내 전압이 다를 무료로 남아있다. 이 모든속눈썹과 전지 본체 9 발사 빠른 작업 잠재력에 유래 속도가 느린 수용체 전류의 동시 녹음을 ows. 이 두 신호 사이의 속도론의 차이는 그들에게 서로 다른 필터 설정을 사용하여 분리 할 수​​ 있습니다. 이 기술은 모든 야생 유형 또는 녹아웃 마우스에서 사용할 수 있습니다 또는도 ORNs의 특정 하위 집합에 라벨을 GFP를 표현 ORNs에서 선택적으로 기록하기 위해, 예를 들어 주어진 odorant 수용체 또는 이온 채널을 표현.

후각 수용체 뉴런 (ORNs)는 수용체에 첫 소절에 후각 망울에서 두 번째 주문 뉴런에 전달 아르 액션 잠재력을 실행하는 현재의 냄새 신호를 변환합니다. 여기 동시에 odorant 유발 수용체 마우스 ORNs의 현재와 실천 가능성을 기록 할 수있는 흡입 피펫 기술을 설명합니다.

흡입 피펫 기법을 사용하여 강한 수용체 뉴런에서 기록 Odorant 유발 응답

동물은 비강에 위치한 화학감각 시스템을 통해 주변의 후각 환경을 샘플링합니다. 화학감각 신호는 복잡한 ...

이 절차의 전체적인 목적은 생쥐 후각 수용체 뉴런에서 후각 물질에 의해 유도된 반응을 기록하는 것입니다. 이를 위해 먼저 후각 상피를 절제하여 생쥐 후각 수용체 뉴런을 분리합니다. 두 번째 단계는 분리된 후각 수용체 뉴런을 도립 현미경에 장착된 기록 챔버에 배치하는 것입니다.마이크로 매니퓰레이터가 기록 전극과 용액 교환기를 고정합니다. 다음으로, 식별된 후각 수용체 뉴런을 흡입 피펫 전극의 팁 안으로 흡입합니다. 마지막 단계는 세포가 흡입된 피펫을 용액 교환기 앞에 배치하여 뉴런을 취기 물질에 노출시키는 것입니다.궁극적으로, 흡입 피펫 기록법은 후각 수용체 뉴런의 기능을 조사하는 데 사용됩니다. 전세포 전압 고정법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 빠르고 정밀한 용액 교체를 통해 장시간 기록이 가능하다는 점입니다. 기록 피펫의 모양이 중요하고 소켓 세포를 피펫 팁에 안정적으로 배치하는 법을 익히기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.마이크로 피펫 풀러를 사용하여 긴 테이퍼(taper) 형태로 UNFI 라미네이트 붕규산 유리 모세관을 당겨 마이크로 피펫을 제작함으로써 이 절차를 시작합니다. 그런 다음, 제작된 피펫을 정립 현미경에 장착된 맞춤형 마이크로 피펫 홀더로 옮깁니다. 현미경의 접안렌즈에는 레티클(reticle)이 있으며, 스테이지에는 이동 가능한 다이아몬드 칼이 장착되어 있습니다.다음으로, 20 x 대물렌즈 하에서 피펫의 끝부분을 관찰하십시오. 레드렛(redle)을 가이드로 사용합니다. 피펫 외경 10 micrometers 지점에서 맞춤 제작된 다이아몬드 나이프를 사용하여 피펫을 90도 각도로 조심스럽게 긋습니다.다이아몬드 칼을 팁 쪽으로 더 이동시킵니다. 그 위에 서서히 압력을 가합니다. 피펫 팁은 흠집을 낸 지점에서 깨끗하게 부러져야 합니다.그런 다음 40 x 대물렌즈 하에서 전기 가열 필라멘트를 사용하여 피펫 팁의 내경이 5 µm가 되도록 파이어 폴리싱(fire polish)합니다. 작업이 완료되면, 마우스 olfaction receptor neurons(orns)로부터 전류를 기록하는 데 사용할 마이크로 피펫이 준비됩니다. 다음 단계에서는 마우스를 희생시켜 머리를 적출합니다.그다음 두개골 위의 피부를 벗겨내고, 머리를 정중선을 따라 이등분합니다. 이어서 두 개의 머리 반구를 해부용 실체현미경으로 옮깁니다. 비중격을 제거하고 비갑개를 제거합니다.조직을 포도당이 포함된 포유류 링거액이 담긴 페트리 접시에 놓습니다. 그 후, 두 개의 비갑개에서 하부 연골로부터 후각 상피를 벗겨냅니다. 해당 조직을 250 µL의 링거액이 들어 있는 에펜도르프 튜브로 옮깁니다.그 후 남은 조직은 나중에 사용하기 위해 4 °C에서 보관하십시오. 후각 상피가 들어 있는 EOR 튜브를 중간 속도에서 1초씩 두 번 짧게 보텍싱합니다. 이 단계는 상피로부터 NS의 기계적 해리를 유도합니다.다음으로 해리된 ORN이 포함된 링거 용액을 현미경에 장착된 기록 챔버에 넣고, 미세 핀셋을 사용하여 현탁액 내의 큰 조직 조각들을 제거합니다. 링거 용액으로 연속 관류를 시작하고 본 절차의 기록 단계로 진행하기 전, ORN이 가라앉도록 20분 동안 둡니다. 피펫을 링거 용액으로 채웁니다. 피펫을 피펫 홀더에 끼우고 홀더를 패치 클램프 증폭기 헤드 스테이지에 연결합니다.다음으로, 오일 라인을 피펫 홀더의 측면 포트에 연결합니다. 그런 다음 피펫을 기록 챔버 내부로 내립니다. 오일 저장조의 높이를 조절하여 피펫 팁에 약간의 양압이 형성되도록 합니다.이는 세포 파편이 피펫에서 멀어지거나 피펫 쪽으로 이동하는 것을 관찰함으로써 수행할 수 있습니다. 피펫 팁이 세포 파편으로 오염되지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 20~40배 배율을 사용하여 전형적인 양극성 형태(bipolar morphology)로 식별 가능한 단일 ORN을 찾기 위해 기록 챔버를 스캔합니다.그런 다음 기록 전극을 ORN 세포체 근처로 이동시킵니다. 오일 저장조에 연결된 에어라인을 부드럽게 흡입하여 세포체가 피펫 팁 안으로 들어가게 합니다. 세포체 전체가 흡입 피펫 팁 내부로 완전히 빨려 들어갈 때까지 조심스럽고 천천히 흡입을 계속하며, 이때 수상돌기와 섬모는 배양액에 노출된 상태로 둡니다.침전된 ORN이 포함된 구역에서 챔버의 기록 구역으로 흡입 피펫을 이동합니다. 용액 교환을 위해 흡입 피펫을 3구 튜브 앞에 조심스럽게 배치합니다. ORN이 층류에 노출되어 혼합 난류를 피할 수 있도록, 흡입 피펫을 3구 튜브의 입구에 충분히 가깝게 배치해야 합니다. 용액 교환을 수행하려면, 용액 교환기의 3구 튜브에서 흐르는 평행 용액 스트림 사이의 경계를 흡입 피펫의 팁을 가로질러 이동시켜 용액 교환의 품질과 신뢰성을 모니터링합니다.서로 다른 이온 조성의 용액 사이로 세포를 이동시킬 때 유발되는 접합 전류를 측정할 수 있습니다. 용액 교환의 시간 경과는 일반적으로 약 20 milliseconds입니다. 후각 수용체 뉴런을 후각 물질 용액으로 단계적으로 이동시키면, 여기서 후각 물질에 의해 유발된 반응을 이끌어낼 수 있습니다.기록 상단의 막대로 표시된 바와 같이, ORN을 100 µM eugenol에 1초 동안 노출시켰습니다. 상단 패널에서는 수용체 전류만을 보여주기 위해 수용체 전류를 0~50 Hz의 대역폭으로 필터링하였습니다. 하단 패널에서는 활동 전위까지 함께 보여주기 위해 동일한 기록을 0~5,000 Hz의 넓은 대역폭으로 필터링하여 나타내었습니다. 여기 eugenol에 반응하는 ORN의 용량 반응 곡선이 있습니다. Eugenol은 0.3 µM에서 100 µM 범위의 농도로 사용되었습니다.자극 지속 시간은 1초였으며, 트레이스는 0에서 50 hertz 범위에서 필터링되었습니다. 후각 물질 농도가 점진적으로 증가함에 따라 더 크고 빠르게 상승하는 반응이 나타났으며, 반응의 종료 또한 더 느리게 진행되었습니다. 후각 물질 노출이 종료되면, 중간 농도의 후각 물질을 이용한 장기 자극 동안 ORNS는 진동하는 반응 패턴을 보일 수 있습니다.본 실험에서는 아세토페논(acetophenone)에 반응하는 ORN을 8초 동안 자극하였으며, 자극 시작 시점에 빠르고 일시적인 피크 반응이 나타났습니다. 이 절차를 수행하는 동안 일련의 더 작은 반복 반응들이 관찰됩니다. 후각 수용체 뉴런을 조심스럽게 다루고 충분한 인내심을 갖는 것이 중요합니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

electroolfactogram (EOG) 녹음은 후각 상피의 수준에서 후각 기능을 평가의 유익 - 실시 - 쉽고 안정적​​인 방법입니다. 이 프로토콜은 녹음 설정, 마우스 조직 준비, 데이터 수집, 그리고 기본적인 데이터 분석을 설명합니다.

에어 - 상 Electroolfactogram 기록을 사용하여 마우스 강한 감각 뉴런의 분석 응답

이 비디오는 천공 패치 클램프 기술을 사용하여 마우스의 후각 감각 뉴런(OSN)을 전기생리학적으로 기록하는 방법을 보여줍니다. 형광단이 부착된 냄새 수용체를 가진 OSN을 포함하는 후각 상피는 마우스에서 분리되어 기록 챔버에 고정됩니다. 기록 피펫은 OSN의 수지상 손잡이에 고정되고 피펫 내의 니스타틴은 멤브레인에 구멍을 뚫어 세포와 전기적 연결을 형성합니다. 마지막으로, 다른 피펫을 사용하여 냄새 자극제를 전달하고 패치된 세포의 전기 생리학적 활성을 기록합니다.

생쥐의 후각 감각 뉴런에 대한 천공된 패치 클램프 기록

프로토콜 비디오는 마우스의 vomeronasal organ(VNO)의 감각 뉴런에서 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프를 설정하는 방법을 설명합니다. 형광 표지된 감각 뉴런이 있는 코로나 VNO 슬라이스가 기록 설정에 배치됩니다. 표지된 뉴런은 화학적 자극에 대한 반응으로 전기생리학적 기록을 위해 전체 세포 구성의 기록 피펫으로 패치됩니다.

Vomeronasal Sensory Neuron의 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프 구축

이 비디오에서는 전기생리학 연구를 위해 살아있는 초파리 파리가 튜브에 장착되어 있습니다. 전극은 파리의 후각 수용체 뉴런과 함께 페로몬에 대한 특정 뉴런 반응을 기록하기 위해 감각의 기저부에 위치합니다.

휘발성 냄새 물질에 대한 반응으로 Drosophila Sensilla의 전기 생리학적 기록

우리는 invertebrate 후각 경로의 처음 세 단계에서 냄새 evoked 응답을 특징하는 세포 다중 단위 기록 기술의 변화를 보여줍니다. 이 기술은 쉽게뿐만 아니라 다른 신경 시스템에서 앙상블 활동을 검토하도록 구성 할 수 있습니다.

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (<em&gt; Schistocerca 아메리카나</em&gt;) 강한 회로

후각 감각 뉴런의 생리학적 특성을 분석하는 것은 여전히 기술적 한계에 직면해 있습니다. 여기에서 우리는 유전자 표적 마우스의 후각 상피의 온전한 준비에서 천공된 패치 클램프를 통해 기록합니다. 이 기술을 사용하면 정의된 후각 수용체를 발현하는 뉴런의 특정 리간드에 대한 멤브레인 특성과 반응을 특성화할 수 있습니다.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

빈대는 더듬이 후각 감각에 있는 후각 수용체 뉴런에 의존하여 환경의 기호화학 물질을 감지합니다. 단일 센실럼 기록을 활용하여 기호화학 물질에 대한 빈대 반응을 평가하고 관련된 코딩 프로세스를 탐구하는 방법을 보여줍니다.

Semiochemicals에 침대 버그의 후각 신경 세포 응답을 감지하기 위해 단일 ​​Sensillum 기록을 사용하여

Odorant 수용 체의 기능을 특성화 deorphanization 과정에서 필수적인 부분을 제공 합니다. 우리 캠프 분석 결과 사용 하 여 실시간으로에서 odorant 수용 체의 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다.

라이브 셀 측정의 Odorant 수용 체 활성화를 사용 하 여 분석 결과 실시간 캠프

이 프로토콜의 전반적인 목표는 장쇄 사상 페로몬에 반응하는 Drosophila 후각 수용체 뉴런으로부터 단일 감각 기록을위한 낮은 휘발성의 냄새 물질을 제시하는 방법을 입증하는 것입니다.

에서 전기 생리 학적 기록<em&gt; Drosophila</em&gt; 낮은 휘발성의 냄새에 반응하는 Trichoid Sensilla

순수, odorant 수용 체 odorant 분자 수증기 단계에서 흡입에 의해 활성화 됩니다. 그러나, 대부분의 생체 외에서 시스템 활용 액체 단계 odorant 자극. 여기, 선물이 odorant 자극 기상에 따라 odorant 수용 체 활성화의 실시간 생체 외에서 모니터링 수 방법.

실시간 체 외 Odorant 수용 체 활성화는 Odorant 수증기 단계에서의 모니터링

후각 신경에서 세포 외 다단위 기록은 해양 물고기의 후각 감도를 평가하기위한 민감하고 견고하며 재현 가능한 방법입니다. 그것은 기본 감각 입력을 기록하고 외부 염도의 독립적이다.

텔레오스트의 후각 신경에서 세포 외 다중 단위 기록

학습하세요 흡입 피펫 기법을 사용하여 생쥐 후각 수용체 뉴런에서 냄새 물질 유발 반응을 기록하는 방법을. 이 기술은 수용체 전류와 활동 전위를 동시에 측정하여 후각 신호 전달 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

흡입 피펫 기법을 사용하여 강한 수용체 뉴런에서 기록 Odorant 유발 응답

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