정량 실시간 PCR (qPCR)에 의한 전립선 종양에 MicroRNA 감지

다음 실험의 전반적인 목표는 정량적 실시간 PCR을 사용하여 전립선암 및 정상 전립선 조직 내 마이크로 RNA 분자의 발현 수준을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 전립선 조직에서 mRNA, 마이크로 RNA 및 기타 소형 RNA를 포함하는 총 RNA를 추출함으로써 달성됩니다.

다음으로, RNA를 역전사하여 cDNA를 생성합니다. 그런 다음, cDNA를 템플릿으로 사용하여 SYBR Green 기반의 실시간 PCR을 수행함으로써 microRNA 발현을 실시간으로 증폭하고 정량화합니다. 이를 통해 정량적 실시간 PCR을 기반으로 다양한 전립선 샘플 내 microRNA의 상대적 발현량을 나타내는 결과를 얻습니다.

다른 방법들과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 민감도, 정확성, 재현성이 뛰어나며 신속하고 비용 효율적이라는 점입니다. microRNA 발현은 암 과정에 깊이 관여하는 유전자들과 상관관계가 있는 경우가 많으므로, 이 방법은 암 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 사용될 수 있습니다. 따라서 QPCR을 사용하여 microRNA의 발현을 평가하고, 이것이 임상 변수들과 어떻게 상관관계를 갖는지 확인할 수 있습니다.

이러한 바이오마커는 진단 및 예후 도구로 모두 활용될 가능성이 있습니다. 이는 전립선암을 진단하는 것뿐만 아니라, 어떤 전립선암이 공격적인지 판단하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 또한, 이 바이오마커들이 치료제로 사용될 가능성도 있습니다.

이 방법은 전립선 종양 발생에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 다른 암 및 질환에도 적용될 수 있습니다. 적출술 시 전립선 샘플을 수집하고 해부학적 지표를 사용하여 검체를 정위합니다. 전립선과 정낭을 다음과 같이 표시합니다: 우측은 녹색, 좌측은 청색으로 칠합니다.

직장 표면에 수직이 되도록 조직의 가로 중간 단면을 무작위로 채취하여, 샘플을 급속 냉동한 후 -80 °C에서 보관하십시오. 표본 절편의 사진을 촬영하여 방향을 잡고 이를 4등분으로 나눕니다. 병리학자와 상의하여 해당 이미지에서 종양 부위와 정상 부위를 구분하십시오.

RNA를 분리하기 위해, 표시된 영역을 가이드로 삼아 RNA 추출용 종양 조직을 식별하십시오. 먼저 냉동된 전립선 샘플을 드라이아이스 위에 놓고 표시된 복사본을 참조하십시오. 전립선 종양의 일부분을 작게 절제하십시오.

전립선 종양 조직을 1 mL의 triol 시약에서 균질화합니다. 균질화된 샘플을 5분 동안 배양합니다. 실온에서 샘플에 0.2 mL의 클로로포름을 첨가하고 15초 동안 격렬하게 흔들어 섞습니다.

샘플을 상온에서 3분 동안 배양한 후, 4°C에서 12,000 ×g로 15분 동안 원심 분리합니다. 무색의 상층 수용액 층을 새 튜브로 옮기고 isopropyl alcohol 0.5 mL를 첨가합니다. 샘플을 상온에서 10분 동안 배양한 후, 4°C에서 12,000 ×g로 10분 동안 원심 분리합니다.

RNA가 포함된 펠릿이 손상되지 않도록 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. RNA 펠릿에 75% ethanol 1 mL를 추가하고, 4 °C에서 7,500 ×g로 5분 동안 원심분리하여 샘플을 침전시킵니다. 다시 상층액을 흡입하여 제거하고 RNA 펠릿을 5~10분 동안 건조시키되, 완전히 마르지 않도록 주의합니다.

펠릿을 nuclease free water에 녹인 후, 분광광도계를 사용하여 RNA의 농도를 측정하십시오. Bioanalyzer를 사용하여 RNA 샘플의 품질과 무결성을 확인하십시오. 제조사의 지침에 따라 역전사 키트를 사용하여 RNA를 cDNA로 역전사하십시오.

표준 곡선을 생성하려면, 관심 유전자가 상당히 발현된 것으로 알려진 샘플로부터 원래의 CD NA를 일련의 희석 농도로 준비합니다. 2 x quant. Detect cyber green PCR master mix, 10 x microscript universal primer, 10 x microscript primer assay 및 RN a's free water를 사용하여 20 µL의 반응 부피를 기준으로 마스터 믹스를 준비하여 실시간 PCR을 수행합니다.

표적 유전자용 프라이머 세트 하나와 대조 유전자(이 경우 RNU six B)용 프라이머 세트 하나, 이렇게 두 세트의 프라이머를 준비합니다. 각 cDNA 희석액 2 µL를 개별 라이트 사이클러(light cycler) 모세관 튜브에 피펫으로 분주하고, 마스터 믹스 18 µL를 추가합니다. 모세관 어댑터를 사용하여 원심 분리합니다. 모세관들을 모세관 기반 실시간 사이클러(realtime cycler)에 넣고, 95 °C에서 15분간 처리한 후 94 °C에서 15초간 처리하는 과정을 50회 반복하는 PCR 프로그램을 실행합니다.

55 °C에서 30초, 70 °C에서 30초 동안 반응시킵니다. 보정자로 사용할 샘플을 선택하고 해당 샘플의 정규화된 목표 양을 1로 설정합니다. 나머지 모든 샘플의 micro RNA 상대적 발현량을 보정자와 비교하여 증폭 곡선을 생성합니다.

PCR 반응의 경우, molecular biochemicals light cycler 소프트웨어 버전 3.5의 quantification 탭을 사용하십시오. 반응을 정량화하고 데이터를 텍스트 파일로 내보내십시오. 해당 데이터를 REL quant 분석 소프트웨어로 가져와 정량 분석 결과를 생성하십시오.

표적 유전자, 참조 유전자 및 표준 곡선 데이터에 대한 별도의 파일을 가져옵니다. 표적 및 참조 유전자 모두에 대해 보정자(calibrator)의 위치와 샘플의 위치를 지정합니다. 데이터는 서로 다른 샘플의 표적 대 참조 비율을 보정자의 표적 대 참조 비율로 나눈 값으로 표시됩니다.

특정 micro RNA 및 하우스키핑 유전자에 대해 앞서 작성한 표준 곡선을 참조 표준으로 사용하여, 농도를 모르는 micro RNA 표적의 정량 데이터를 추정하십시오. 세 개의 샘플을 하나의 그룹으로 분석하고, 3반복 측정값의 평균 농도와 표준 편차를 계산하십시오.

세 번의 반복 측정치 중 하나가 나머지 세트와 일치하지 않는 경우, 프로그램이 이를 제외합니다. 여기 전립선 샘플의 A-Q-P-C-R 분석 예시가 나와 있습니다. 기준 유전자인 U six의 발현 수준을 나타내는 그래프는 약 20 사이클에서 지수 증폭이 시작되는 반면, 표적 유전자인 MIR 98의 발현은 25 사이클 부근에서 지연된 증폭을 보였습니다.

본 실험의 데이터는 텍스트 파일로 내보내어 분석 소프트웨어를 통해 분석되었으며, 교정물질과 시료가 포함된 모세관의 위치가 지정되었습니다. 숙달되면, 적절하게 수행했을 때 이 기술은 하루 만에 완료할 수 있습니다. 이 기술의 신뢰성은 RNA의 품질에 따라 달라집니다.

따라서 RNA는 매우 쉽게 분해될 수 있으므로 취급 시 각별한 주의를 기울이는 것이 중요합니다.