Name: 유동세포계측법 및 자동화된 마그네틱 활성화 셀 정렬 (AutoMACS)를 사용 나이브 및 췌장 종양 베어링 마우스에서 골수양 파생 억제 세포 (MDSC)의 작성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: 배우세요 유동세포계측법과 AutoMACS를 활용하여 마우스 비장에서 골수양 파생 억제 세포(MDSC)를 분리하고 Gr-1 양성 백혈구를 농축하는 방법을. 이 기술은 면역학 및 종양 연구에 활용됩니다.

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우리는 USF의 유동세포계측법 핵심 시설을 인정합니다. 우리는 자원을 공유 닥터 드니즈 쿠퍼 감사드립니다. 우리는 또한 설정이 비디오의 촬영에 그들의 도움 마야 코헨, 로라 비롯와 다이애나 Latour 감사드립니다. NN은 박사 원정대 HRD # 0,929,435에 NSF FG-LSAMP 브리지에 의해 지원. 이 작품은 TG에게 수여 미국 암 학회 기관 연구 그랜트 # 93-032-13/Moffitt 암 센터에 의해 재정 지원되었다.

이전 시작하기 전 다음과 같은 솔루션을 준비할 : 3퍼센트 염색법 미디어 (SM) : 1X 인산 버퍼 염분의 -3 % 태아 소 혈청 (FBS) (PBS) 맥에서 버퍼 (MB) : - 1XPBS에서 소 혈청 (BSA)에서 0.5 % 알부민 1. 마우스에서 수확 Spleens <ol><li> (; TB 종양 베어링) Subcutaneously 1.5 X Panc02 10 5 murine 세포를 100 μl 1X PBS에서 정지로 연령 C57BL 6-8 주 / 6 마우스 (할란)을 주입. 컨트롤 마우스는 (순진) 100 μl 1XPBS를 받게됩니다. </li><li> 약 사주 포스트 분사, 이산화탄소 질식사로 쥐를 안락사시켜야. </li><li> 집게와 가위를 사용 무딘 절개로 생쥐에서 수확 spleens 그런 다음 균형을 사용해 무게. 별도의 장소 spleens는 1 X PBS를 포함하는 50 ML 원뿔 튜브를 분류. </li></ol> 2. 단일 셀 Suspensio 생성Spleens에서 Leukocytes의 N 모든 절차는 생물 안전 후드와 얼음에 보관 세포와 항체 하에서 무균 환경에서 수행되어야합니다. <ol><li> 하단쪽으로 컵의 개통으로 메쉬 스크린을 삽입하여 세포 분리 체를 조립. 그런 다음 홈 붙이 측면과 함께 스레드 영역으로 유지 링을 삽입하기 때문에 장소에서 화면을 잡고 유지 링을 강화하기 위해 고리 키를 사용합니다. 10 ML 1 X PBS가 들어있는 배양 접시에있는 조립 체를 놓습니다. </li><li> 풀 spleens 및 사용 유리 유봉은 세포 분열 체의 메쉬 스크린 반대하고 페트리 접시에 spleens를 갈아서합니다. 생쥐의 각 치료 그룹에 대해 반복합니다. </li><li> 70 μm의 셀 스트레이너와 5 ML serological 피펫을 사용하여 50 ML 원뿔 튜브로 필터 세포 현탁액. 5 분 동안 12,000 RPM (250-300 XG)에서 원심 분리기. </li><li> 비장 당 5 ML 1 X RBC의 용해 버퍼에 뜨는 및 resuspend 펠릿 제거. Pipet 위아래로 풍성히. 5 분 동안 상온에서 품어. 1 X PBS의 20 ML을 추가하여 반응을 중지합니다. Pipet 위아래로 풍성히. 5 분 동안 12,000 RPM (250-300 XG)에서 원심 분리기. </li><li> 20 ML 멸균 1 X PBS에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 제거합니다. Pipet 위아래로 풍성히. </li><li> 50 μl가 5x10 5-1x10 6 전지 (- 2x10 7 셀 / ML 1x10 7 세포 / ml) 쇼핑하는 것과 같습니다 있도록 trypan 파랑, 3 % SM에서 원하는 농도에서 hemacytometer과 resuspend를 사용하여 세포를 세어보세요. </li></ol> 3. 유동세포계측법를 사용 MDSC의 세포 - 표면 염색법 / Immunophenotyping <ol><li> (; 맥-1-FITC, GR-1-APC 및 DAPI 얼룩 없음, NS) 제어 및 보정 컨트롤에 대한 실험 시료와 단일 얼룩을위한 96 - 웰 V 바닥 플레이트의 우물을 레이블. </li><li> 96도 V-맨 아래 판에서 / 잘 각각의 우물에 splenocytes 50 μl에 상응 5x10 5-1x10 6 셀을 추가합니다. 원심 분리기5 분 용 12,000 RPM (250-300 XG)에서 판. </li><li> 얼음 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 3 % SM에서 희석 마우스 BD FC 블럭 (쥐 안티 마우스 CD16/32 단클론 항체)의 &quot;마스터 믹스&quot;(MM)를 준비합니다. 출발점으로서, 당 음 50 μl의 최종 볼륨의 3 % SM 1 μg FC 블록을 사용합니다. </li><li> 조심스럽게 세포 펠렛의 중단없이 폐기물 컨테이너 또는 싱크대에 다시 걸쳐 빠르게 반전 판으로 96도 V-맨 아래 접시의 각 우물에서 뜨는을 제거합니다. </li><li> 와동, 짧게 5 초 동안 FC 블록 MM을 원심 분리기와 96도 V-맨 아래 판의 모든 산탄 50 μl를 추가합니다. 부드럽게 자신의 우물에 샘플을두고, 아래로 pipetting 및하여 잘 섞는다. 얼음 어둠 속에서 15 분 동안 접시를 품어. 5 분 동안 12,000 RPM (250-300 XG)에서 접시를 원심 분리기. </li><li> 샘플 FC 블록으로 품어 동안 얼음 1.5ml microcentrifuge 튜브의 3 % SM에서 희석 fluorochrome-복합 항체의 &quot;마스터 믹스&quot;(MM)를 준비합니다. 항체가 titrated해야절차를 더럽히는 것을위한 최적의 dilutions를 확인하십시오. 출발점으로서, 이런 샘플 당 50 μl의 최종 볼륨의 3 % SM에서 1시 25분 맥-1-FITC의 희석 및 GR-1-APC의 1시 20분 희석을 결합. </li><li> 이전에 설명한대로 조심스럽게 96도 V-하단에 각 우물에서 뜨는 제거합니다. </li><li> 와동은 짧게 5 초 동안 형광등-복합 염색법의 항체의 MM을 원심 분리기 및 제어 및 실험 쥐똥 50 μl를 추가합니다. 부드럽게 최대 pipetting 및 아래쪽으로 잘 섞는다. 단일 얼룩 보상 내용 잘 당 50 μl의 최종 볼륨의 3 % SM에서 맥-1-FITC의 1시 25분 희석, GR-1-APC 75 NG / DAPI의 ML의 1시 20분 희석을 추가 각각 웰스 있습니다. (얼룩 없음) 잘 흠없는 50 μl 3 % SM을 추가합니다. 잘 섞어서 얼음에 어두운 30 분 96도 V-맨 아래 판에서 세포를 품어. </li><li> 라벨 FACS 튜브는 (5 ML, 12mm X 75mm의 폴리스티렌 원형 바닥 튜브) 96 - 웰 V-하단 플레이트의 각도에 대응합니다. 각 FACS 200 μl 3 % SM 추가튜브. </li><li> 5 분 동안 12,000 RPM (250-300 XG)에서 접시를 원심 분리기와 supernatants를 제거합니다. 각 펠렛 100 μl 3 % SM을 추가하여 알약을 씻어 부드럽게 최대 pipetting 및 아래쪽으로 잘 섞는다. 5 분 동안 12,000 RPM (250-300 XG)에서 접시를 원심 분리기. 한 번 더 씻어 단계를 반복합니다. </li><li> 이전에 설명한대로 조심스럽게 96도 V-하단에 각 우물에서 뜨는 제거합니다. 100 μl 3 % SM에서 각각의 펠렛을 Resuspend 잘 섞는다. </li><li> 그들의 각각 분류 FACS 관으로 96도 V-맨 아래 접시의 각 우물에서 100 μl resuspended 펠렛을 전송합니다. </li><li> cytometry 분석을 섞여 이전하기 위해, 75 NG / ML DAPI 제어 및 실험 샘플 및 DAPI 단일 얼룩 보상 컨트롤을 추가합니다. </li><li> MDSC 비율의 흐름 cytometric 데이터 수집을 수행합니다. 부정적인 (아무 얼룩 제어)와 하나의 긍정적인 컨트롤을 사용하여 보정을 수행합니다. 있도록 로그 스케일에서 앞으로 (FSC) 대 측면 산란 (SSC)를 표시하는 도트 음모를 설정의 백혈구 인구관심을 확인할 수 있습니다. 파편과 낮은 순방향 및 사이드 흩어있는 대단히 짧은 시간을 제외한 모든 leukocytes에 큰 성문을 그립니다. 이 부모 게이트에서 DAPI-(라이브) 세포에 SSC 대 DAPI와 게이트를 표시 새로 도트 음모를 만듭니다. 이 새로 문이 인구를 선택하고 더블 긍정 맥-1 대 GR-1과 게이트를 표시하는 도트 줄거리 만듭니다 (맥-1 + GR-1 +) MDSC. </li></ol> 4. GR-1 + Leukocytes의 자성 농축 <ol><li> 5 분 용 12,000 RPM (250-300 XG)에서 적절하게 라벨이 FACS 튜브 및 원심 분리기로 나누어지는 1x10 7 남아있는 흠없는 leukocytes. </li><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 GR-1-PE 항체의 MM을 준비합니다. 최대 10 7 세포에 대한 내용은 샘플 당 50 μl 메가바이트에 GR-1-PE 항체의 1시 10분 희석을 사용합니다. 큰 세포 숫자의 경우 적절하게 볼륨을 잡고. 간단히, 5 초 동안 원심 분리기 FACS 튜브의 leukocytes에 추가 및 4시 15 분 ° 어둠 속에서 C에 대해 품어. </리&gt; <li> 5 분 용 12,000 RPM (250-300 XG)에 FACS 튜브, 원심 분리기에 MB 중 두 ML을 추가하고 뜨는 버리고. </li><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 안티 - 체육 MicroBeads의 MM을 준비합니다. 최대 10 7 세포에 대한 내용은 샘플 당 200 μl 메가바이트에 방지 PE MicroBeads의 1시 4분 희석을 사용합니다. 큰 세포 숫자의 경우 적절하게 볼륨을 잡고. 간단히, 5 초 동안 원심 분리기 FACS 튜브의 leukocytes에 추가 및 4시 15 분 ° 어둠 속에서 C에 대해 품어. </li><li> 5 분 용 12,000 RPM (250-300 XG)에 FACS 튜브, 원심 분리기에 MB 중 두 ML을 추가하고 뜨는 버리고. SB 3 ML에 Resuspend 펠릿. 새로운 라벨 50 ML 원뿔 튜브로 70 μm의의 스트레이너를 통해 필터링합니다. </li><li> 준비 및 주요 자동차 맥 프로 구분 기호. 적절한 솔루션과 비어있는 폐기물 용기와 리필은 모든 병, 필요한 경우. 악기에 관한 켜고 유체 용기 및 초기화 후 열 (들)의 상태를 검사합니다. 모든 기호가 녹색이어야합니다. 메뉴 상단에서 &quot;분리&quot;를 선택다음 메뉴 표시줄은 아래쪽 메뉴 표시줄에서 &quot;지금 씻으십시오.&quot; 마중물 프로세스를 시작하려면 &quot;실​​행&quot;다음에 팝업 옵션에서 &quot;린스&quot;를 선택하십시오. 마중물 프로세스가 성공적으로 완료되면 악기 그러면 그것 상태 메뉴에서 &quot;분리 준비&quot;이라고 표시됩니다. </li><li> 행 B의 부정적인 분획 수집 및 행 C. 긍정적인 분수 컬렉션 15 ML 원뿔 관을위한 행, 50 ML 원뿔 튜브의 자기 (磁 气)라고 표시된 셀로 튜브 크기와 장소에 적합한 냉장 튜브 랙 50 ML 원뿔 튜브를 선택하세요 </li><li> 샘플에서 민감한 모드에서 표시된 타겟 세포의 긍정적인 선택에 대해 &quot;POSSEL_S&quot;세포 분리 프로그램을 선택하십시오. 자기 (磁 气)라고 표시된 대상 세포 automats 칼럼에 보관되며, 레이블이 지정되지 않은 세포를 자석의 자동 철회에 행 B.에 부정적인 분수 수집 관으로 출시되며, 표시된 대상 세포는 튜브의 행 C에서 긍정적인 컬렉션 튜브에 발표 예정 랙. </li></ol>+ 농축 Leukocytes의 포스트 정렬 분석 <ol><li> GR-1을 재계산 +와 GR-1 - trypan 파란색 hemacytometer를 사용하여 분수. 3 % 염색법 매체에서 원하는 농도에서 Resuspend 세포가 50 μl가 5x10 5-1x10 6 전지 (1x10 7 셀 / ML - 2x10 7 세포 / ml) 쇼핑하는 것과 같습니다 있도록하고 correspondingly 분류 FACS 튜브 50 μl를 전송합니다. </li><li> 샘플 당 50 μl의 최종 볼륨 3 % SM에서 1시 25분 희석에서 유일한 맥-1의 MM을 준비합니다. 세포를 착색하고 유동세포계측법 분석 GR-PE, 맥-1 FITC와 DAPI의 단일 얼룩 보상을 준비합니다. 200 μl 3퍼센트 SM 및 DAPI의 생존을 염색하는 등 이전에 설명을 추가합니다. </li><li> 비율 또한 전후 autoMACS 농축이 MDSC 비율을 비교하는 - GR-1 +와 GR-1을 결정하는 흐름 cytometric 데이터 수집을 수행합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 여기에서 우리는 R을 보여<html> MDSC (그림 1)으로 분류 후속 FACS를위한 풀링, 순진 spleens에서 GR-1 + leukocytes의 autoMACS 농축을위한 epresentative 결과입니다. 1x10 6 나이브 leukocytes는 사전 autoMACS 정렬로, BD LSRII 악기를 사용하여 MDSC 비율을 식별하는 데 맥-1-FITC와 GR-1-APC의 항체 물들일되었다. 1x10 7 나이브 leukocytes 그 다음 autoMACS 프로 구분 기호를 사용하여 GR-1 + leukocytes의 농축을위한 안티 GR-1-체육 항체와 PE-MicroBeads 물들일되었다. 포스트 autoMACS 농축, GR-1의 GR-1 비율 +와 GR-1 - 수집의 분수가 유동세포계측법를 사용하여 평가되었다. 1x10 6 GR-1 + leukocytes는 유동세포계측법에 의해 종양 베어링 leukocytes를 풀링되지 않은 농축에 순진 leukocytes을 풀링된 농축의 MDSC 비율을 분석하고 비교할 맥-1-FITC 항체로 제거하고 물들어 있었다. fig1.jpg &quot;/&gt; 정렬 MDSC FACS에 대한 순진 GR-1 + leukocytes의 그림 1. AutoMACS 농축. Spleens는 췌장 종양 베어링과 순진 생쥐에서 수확 및 단일 세포 현탁액으로 처리되었다. 나이브 leukocytes 표면의 유동세포계측법 분석은 사전 autoMACS 농축 ()로, 맥-1과 GR-1 형광 - 복합 항체 물들일. 유동세포계측법의 GR-1 분석 + (B) 및 GR-1 - GR-1-체육 항체 및 안티 PE MicroBeads 물들일 풀링된 순진 leuckocytes에서 GR-1 + 세포 (C) 분수 포스트 autoMACS 농축. MDSC 및 GR-1 유동세포계측법 분석 GR-1 + 비율 후 autoMACS 농축 종양 베어링 생쥐 (E)에서 비 농축 풀링된 leukocytes (순진 마우스, N = 5에 비해 풀링된 순진 leukocytes (D)에서 + 세포 ; 종양 베어링 마우스, N = 3). MDSC 및 GR-1 비율은 대표적인 윤곽 플롯과 histograms의 문이 있습니다.

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이것은 여러 동물 모델에서 다른 림프 조직에 적용 MDSC 인구를 처리하고 immunophentyping에 대한 자세한 방법입니다. 특히 autoMACS 농축은 splenocytes 4 GR-1 고갈, splenocytes과 림프절에서 5 골수양 하위 집합의 정화, CD8의 골수 neutrophils 14 분리와 정제 + 비장에서 T 세포 등 각종 백혈구 인구의 격리에 사용될 수 있습니다 및 림프절 15. 에 관계없이 관심있는 세포 인구, 원하는 림프 조직에서 leukocytes의 단일 세포 현탁액을 생성하는가 최적의 표면 염색법, 유동세포계측법 분석, autoMACS 농축 및 FACS 정렬이 필요합니다. 이 프로토콜에서는 leukocytes의 단일 세포 현탁액을 만드는 기계적인 분리를 사용했습니다. 그러나 이러한 Collagenase D와 같은 소화 효소를 사용하면 높이기 위해이 프로토콜에 대한 적절한 대안입니다spleens이나...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> # 카탈로그 </td><td> 의견 </td></tr><tr><td> 1X 인산은 염분 버퍼 </td><td> 써모 과학 Hyclone </td><td> SH30028.02 </td><td> 칼슘 2 + / MG 2 + / 페놀 레드 부담 </td></tr><tr><td> 소 혈청 (BSA)로부터 알부민 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A7906 </td><td> BSA는 PBS에 그대로 녹아하자, 무균 환경 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> 써모 과학 Hyclone </td><td> SV3001403HI </td><td> Inactivated 열, 무균 환경 </td></tr><tr><td> 쥐 안티 마우스 CD16/32 단클론 항체 (FC 블록) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553,142 </td><td> 멸균 환경 </td></tr><tr><td> 안티 마우스 CD11b (Mac 용-1) FITC </td><td> eBiosciences </td><td> 11-0112 </td><td> 불모의환경 </td></tr><tr><td> 안티 마우스 Ly6G (GR-1) APC </td><td> eBiosciences </td><td> 17-5931 </td><td> 멸균 환경 </td></tr><tr><td> 안티 마우스 Ly6G (GR-1) PE </td><td> eBiosciences </td><td> 12-5931 </td><td> 멸균 환경 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D1306 </td><td> 시리얼 희석 무균 환경 </td></tr><tr><td> 세포 분리 체 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> CD1-1KT </td><td> 사용하기 전에 압력솥 </td></tr><tr><td> 70 μm의 제품 스트레이너 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352,350 </td><td> 멸균 환경 </td></tr><tr><td> 1X RBC의 용해 완충액 </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td> 무균 환경, 사용하기 전에 실온에 따뜻한 </td></tr><tr><td> 배양 접시 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08-757-12 </td><td> 멸균 환경 </td></tr><tr><td> 50ml 죄수ICAL 튜브 </td><td> 써모 과학 </td><td> 339,652 </td><td> 멸균 환경 </td></tr><tr><td> 5ml 12X75mm 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352,054 </td><td> FACS 튜브로 알려진, 무균 환경 </td></tr><tr><td> 96도 V-하단 플레이트 </td><td> 코닝 </td><td> 3897 </td><td> 멸균 환경 </td></tr><tr><td> Trypan 블루 </td><td> Cellgro </td><td> 25-900-CI </td><td> 멸균 환경 </td></tr><tr><td> PE MicroBeads </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-048-801 </td><td> 멸균 환경 </td></tr><tr><td> AutoMACS 프로 구분자 </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS 열 </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-021-101 </td><td></td></tr><tr><td> 버퍼를 실행 AutoMACS </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-221 </td><td&gt; </td></tr></tbody></table>

유동세포계측법 및 자동화된 마그네틱 활성화 셀 정렬 (automacs)를 사용 나이브 및 췌장 종양 베어링 마우스에서 골수양 파생 억제 세포 (mdsc)의 작성

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC이지나 macrophages, 돌기 세포 및 기생충 감염, 염증, 외상 스트레스, 그라 프트 - 대 - 숙주 질환, 당뇨병 및 암 1-7 포함한 병리 학적 조건에서 림프 장기에 축적 granulocytes의 이기종 인구입니다. 생쥐에서 MDSC 특급 맥-1 (CD11b)과 GR-1 (Ly6G 및 Ly6C) 표면 항원 7. 그것은 MDSC 잘 그들이 크게 확장되는 다양한 종양 베어링 호스트에서 공부하고 있습니다 그리고 7-10 순진 대응에 비해 안티 종양 면역 반응을 억제하는 것이 중요합니다. 그러나 병적인 상태에 따라 억제 11,12의 독특한 메커니즘과 목표가있는 MDSC의 다른 subpopulations가 없습니다. 따라서 가능한 MDSC 인구를 분리하는 효과적인 방법은 시험 관내 및 생체내의 억제 그들의 서로 다른 분자 메커니즘을 elucidating에 중요하다. 최근에는 Ghansah 그룹은 murine 췌장암 모델에서 MDSC의 확장을 보도했다. 우리의 종양 - 베어링 MDSC은 항상성의 손실을 표시하고 순진 MDSC 13에 비해 진압 기능을 향상시켰습니다. MDSC 비율은 순진 대 종양 베어링 생쥐의 림프 구획에 훨씬 적습니다. 이것은 종종 이러한 MDSC의 정확한 비교 분석을 방해 주요 경고입니다. 따라서 사전에 형광 활성 세포 정렬 (FACS)으로 순진 생쥐에서 GR-1 + leukocytes을 풍부하게하는 것은 순결, 생존을 향상하고 크게 정렬 시간을 줄여줍니다. 이들은 정렬 빠른 FACS에 대한 풍부한있다 그러나 종양 베어링 생쥐에서 GR-1 + leukocytes의 농축은 선택 사항입니다. 따라서이 프로토콜에서는, 우리는 MDSC을 immunophenotyping하고 적시에 MDSC 정렬을위한 나이브 생쥐의 spleens에서 GR-1 + leukocytes을 풍요로운의 매우 효율적인 방법을 설명합니다. 면역 적격 C57BL / 6 마​​우스는 murine Panc02 CE로 주사하고재편은 subcutaneously 순진 마우스 1XPBS을받을 반면. 약 30 일 접종을 게시할 spleens는 세포 분열 체를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 수확과 처리됩니다. Splenocytes 그러면 적혈구 (RBC)은 lysed되며 이러한 leukocytes의 나누어지는은 유동세포계측법을 사용 immunophenotype MDSC 비율에 맥-1과 GR-1에 대해 fluorochrome - 복합 항체를 사용하여 묻은 게있다. 병렬 실험에서, 순진 생쥐에서 전체 leukocytes는 자동 마그네틱 활성화 셀 정렬 (autoMACS) 프로 구분 기호를 사용하여 PE-MicroBeads 함께 incubated하고 긍정적으로 선택된 형광등-복합 GR-1 항체, 물들일 수 있습니다. 다음으로, GR-1 + leukocytes의 나누어지는은 유동세포계측법를 사용 MDSC 비율의 증가를 식별하는 맥-1 항체 물들일 수 있습니다. 이제 이러한 Gr1 + 농축 leukocytes는 생체내 및 시험 관내의에서 (순진 대 종양 베어링) 비교 분석에 사용되는 MDSC의 분류 FACS 준비 </em&gt;를 assays.

이것은 골수양 유래 억제 세포 (MDSC)를 immunophenotyping 및 GR-1 풍요로운의 신속하고 포괄적인 방법입니다<sup&gt; +</sup마우스 spleens에서&gt; leukocytes. 이 방법은 실용적 GR-1에 대한 풍부 정렬 유동세포계측법 및 AutoMACS 전지를 사용<sup&gt; +</sup용도 MDSC으로 정렬 FACS로 사전&gt; leukocytes<em&gt; 생체내에서</em&gt;과<em&gt; 체외에서</em&gt; assays.

유동세포계측법 및 자동화된 마그네틱 활성화 셀 정렬 (AutoMACS)를 사용 나이브 및 췌장 종양 베어링 마우스에서 골수양 파생 억제 세포 (MDSC)의 작성

MDSC는 병리적 상태에서 림프 기관에 축적되는 미성숙 대식세포, 수지상세포 및 과립구의 이질적인 집단으로...

다음 실험의 전반적인 목표는 in vivo 및 in vitro 분석에 사용하기 위해 생쥐 비장에서 생존 가능한 골수 유래 억제 세포(myeloid derived suppressor cells) 또는 MDSC를 포함하는 GR1 양성 농축 백혈구 집단을 신속하게 생성하는 것입니다. 먼저 여러 마리의 생쥐에서 비장을 수집하여 통합한 후, 단일 세포 현탁액을 생성하도록 처리합니다. 농축 전 MDSC의 비율을 정량화하기 위해, 통합된 세포의 소량을 96-웰 V-bottom 플레이트에 옮깁니다.MAC-1 및 GR-1 표면 항원을 표지하고, 표지된 세포를 유세포 분석을 위해 팩스 튜브로 옮깁니다. 남은 혼합 백혈구를 GR-1에 대한 형광색소 결합 항체로 염색한 후, 항 GR-1 항체의 형광색소에 결합하는 자성 마이크로비즈와 함께 배양합니다. 그 후 AutoMax pro 분리기를 사용하여 GR-1 양성 및 GR-1 음성 집단을 분리함으로써, 해당 집단의 GR-1 농축 성공 여부를 평가합니다.소량의 분취액을 취하여 GR one 및 MAC one 발현을 분석함으로써 MDSC 백분율을 평가합니다. 결과로 얻은 면역표현형 분석 데이터를 비교하면, 비농축 집단에 비해 GR one이 농축된 백혈구 집단에서 MDSC 백분율이 증가했음을 알 수 있습니다. 또한, naive MDSC가 증가하여 종양 보유 MDSC와 유사한 수준의 집단이 형성됩니다.기존의 일반적인 유세포 분석 염색이나 림프 조직 내 mDSC를 분리하는 고속 유세포 분석 기반 소팅과 같은 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 마스터 믹스 기법을 통해 풀 백혈구의 표면 염색을 균일하게 하여 결과의 상당한 편차를 방지하고, mDSC 및 GR1 양성 세포 각각에 대한 정확한 타이핑과 AutoMax 소팅을 보장한다는 점입니다. 시연은 본 연구실의 대학원생인 Nadine Nelson과 USF 유세포 분석 코어 시설 책임자인 Dr. Haw sra가 진행하겠습니다. 다음 절차는 생물학적 안전 작업대(biological safety hood) 내의 멸균 환경에서 수행해야 하며, 세포와 항체는 얼음 위에 보관하십시오.가능한 경우, 메시 스크린을 컵 하단 방향의 개구부에 삽입하여 세포 해리 체를 조립하십시오. 그런 다음 리테이닝 링의 슬롯 부분이 위를 향하게 하여 나사산 부위에 삽입하고, 링 키를 사용하여 리테이닝 링을 조여 스크린을 고정하십시오. 조립된 체를 10 milliliters의 XPBS 풀이 담긴 페트리 접시에 놓으십시오.종양을 가진 또는 대조군인 6~8주령의 C 57 black six 마우스에서 비장을 적출하여 세포 해리 체의 메쉬 스크린에 놓습니다. 그 다음 유리 페스틀을 사용하여 비장을 메쉬 스크린을 통해 페트리 접시에 갈아 넣습니다. 마우스의 각 처리군에 대해 이 과정을 반복합니다.다음으로, 5 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너에 도포하고 50 mL 원추형 튜브에 여과시킵니다. 250~300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고, 비장 하나당 5 mL의 RBC lysis buffer를 첨가한 후 피펫팅으로 강하게 섞어 펠렛을 재현탁합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후, 20 mL의 PBS를 첨가하고 피펫팅으로 강하게 섞어 반응을 중단시킵니다.그 후 250 ~ 300 ×g에서 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 펠렛을 20 mL의 멸균 PBS에 재현탁한 후 세포 수를 측정합니다. 트라이판 블루(trypan blue)와 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 3% 염색 배지에서 세포 농도를 1 × 10⁷ ~ 2 × 10⁷ cells/mL로 조정합니다. 최적의 염색 상태를 구현하는 것이 이 절차에서 가장 어려운 부분입니다.이는 사전에 항체 적정을 수행함으로써 성공적으로 진행할 수 있습니다. 본 프로토콜에 기술된 대로 소량의 부피로 마스터 믹스를 준비하고 표면 염색을 수행하십시오. 유세포 분석을 위해 세포를 염색하려면, 96-웰 V-bottom 플레이트의 웰에 대조군, 실험군 및 단일 염색 샘플을 표시하십시오.보정 대조군을 위해, 라벨링된 각 웰에 50 µL의 부피로 5 × 10⁵ ~ 1 × 10⁶개의 세포를 추가합니다. 그 후, 플레이트를 250 ~ 300 ×g에서 5분간 원심 분리합니다. 원심 분리가 끝나면 플레이트의 하단을 관찰합니다.웰 내에 펠렛이 존재하는지 확인한 후, 3% 염색 배지에 희석된 rat anti muse CD 1632 단클론 항체가 포함된 마우스 BDFC 블록 마스터 믹스를 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 얼음 위에서 볼텍싱하여 준비합니다. 그 다음, 96-well V-bottom 플레이트를 폐기물 컨테이너나 싱크대 위에 둔 상태로 5초 동안 짧게 원심분리합니다. 세포 펠렛이 손상되지 않도록 플레이트를 빠르게 뒤집었다가 다시 원래대로 돌려 상층액을 제거합니다.그 다음, 96-well V-bottom 플레이트의 모든 펠릿에 FC block master mix 50 µL를 첨가하고 피펫팅을 통해 부드럽게 혼합합니다. 플레이트를 얼음에 올리고 암소에서 15분 동안 배양한 후, 원심분리 플레이트를 250~300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 얼음 위에서 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 3% Staining medium으로 희석한 Mac one fitzy 및 GR one A PC 항체 master mix를 준비합니다.5초 동안 짧게 원심분리합니다. 원심분리 후, 플레이트를 뒤집어 각 웰에서 상층액을 제거한 다음, 대조군 또는 실험군 펠렛에 항체 혼합물 50 microliters를 첨가합니다. 부드럽게 파이펫팅하여 잘 섞어줍니다. 단일 염색 보정의 경우, 3%staining medium에 희석된 MAC one F GR one A PC 또는 DPI 50 microliters를 해당 웰에 첨가합니다. 무염색 대조군의 경우, 해당 웰에 3%staining medium 50 microliters를 첨가하고 섞어줍니다.그 다음, 플레이트를 얼음 위 암실에서 30분 동안 배양합니다. 배양하는 동안 플레이트의 각 웰에 대응하도록 FACS 튜브에 라벨을 붙이고, 각 FACS 튜브에 3% 염색 배지 200 µL를 넣습니다. 30분간의 배양 시간이 지나면, 플레이트를 250~300 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다.원심분리 후, 이전과 동일하게 상층액을 제거합니다. 그 다음, 각 펠렛에 3% 염색 배지 100 µL를 첨가하여 펠렛을 세척합니다. 피펫팅을 통해 부드럽게 섞어줍니다.플레이트를 다시 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 세척 단계를 한 번 더 반복하고, 이전과 동일하게 natin을 제거한 다음 각 펠릿을 100 µL의 3% 염색 배지에 재부유시켜 잘 섞어줍니다. 다음으로, 플레이트의 각 웰에서 재부유된 세포 100 µL를 각각 라벨이 부착된 fax 튜브로 옮깁니다.그다음 대조군, 실험군 샘플 및 DPI 단일 염색 보정 대조군에 75 ng/mL의 DPI를 첨가합니다. 동반 문서에 설명된 대로 유세포 분석 데이터를 획득하여 MDSC 비율을 결정합니다. 다음으로, 남은 미염색 백혈구 중 1 × 10⁷개의 분량을 적절하게 라벨링된 FACS 튜브에 넣고 250 ~ 300 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 GR-1 양성 백혈구를 농축합니다. Max 버퍼에 1:10으로 희석한 GR-1 PE 항체 50 µL를 첨가하고 4 °C의 암소에서 15분 동안 배양합니다.배양 후, 각 fax 튜브에 max buffer 2 mL를 추가하고 250~300 ×g에서 5분간 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거합니다. 그다음 max buffer로 1:4 희석한 anti PE microbeads 200 µL를 각 튜브에 추가하고 4 °C의 암소에서 15분간 배양합니다.max buffer 2 mL을 fax 튜브에 넣고 250~300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 다음 펠렛을 staining buffer 3 mL에 재부유시킨 후, 70 µm 스트레이너로 걸러 라벨이 부착된 새로운 50 mL 원추형 튜브에 옮깁니다. 본 프로토콜에서는 자동 자기 분리 방식을 사용합니다.자기 분리는 매우 훌륭한 선택지입니다. 표면 마커를 기반으로 다량의 세포를 빠르고 비용 효율적으로 분리해야 하는 경우, 작업 종료 후 유세포 분석법으로 결과를 반드시 확인하십시오. AutoMax pro 분리기를 준비하고 프라이밍하려면, 모든 병에 적절한 용액이 채워져 있는지 확인하십시오.기기를 켭니다. 초기화가 완료되면 액체 용기와 컬럼의 상태를 확인하십시오. 모든 기호가 녹색으로 표시되어야 합니다.다음으로 상단 메뉴 바에서 separation을 선택한 후 wash를 선택하십시오. 이제 하단 메뉴 바의 팝업 옵션에서 rinse를 선택하고 run을 눌러 프라이밍 과정을 시작하십시오. 프라이밍 과정이 성공적으로 완료되면, 기기에 separation 준비가 되었다는 메시지가 표시됩니다.상태 메뉴에서, 자성 표지된 세포가 담긴 50 milliliter 원심분리관을 적절한 크기의 냉각 튜브 랙 A열에 배치합니다. 그다음 음성 분획 수집용 50 milliliter 원심분리관을 B열에, 양성 분획 수집용 15 milliliter 원심분리관을 C열에 배치하고, 샘플 내 표지된 표적 세포의 양성 선택을 위한 민감 모드의 POS cell S cell separation 프로그램을 선택합니다. 프로그램이 시작되면, 자성 표지된 표적 세포는 AutoMax 컬럼에 유지되고, 표지되지 않은 세포는 B열의 음성 분획 수집관으로 방출됩니다. 이후 자석이 후퇴하면서 표지된 표적 세포가 튜브 랙 C열의 양성 수집관으로 방출됩니다.농축 후, 트라이판 블루(trypan blue)와 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 GR1 양성 및 GR1 음성 분획의 세포 수를 다시 측정합니다. 그 다음, 세포를 3% 염색 배지에서 1 × 10⁷ cells/mL에서 2 × 10⁷ cells/mL 농도로 재현탁하고, 각각 라벨이 부착된 FACS 튜브에 50 µL씩 옮깁니다. 유세포 분석 및 단일 염색 보정(single stain compensation)을 위해 MAC-1 및 DPI 생존능 염색약으로 세포를 염색합니다.GR1 양성과 GR1 음성 백분율을 결정하고, AutoMax 및 농축 전후의 MDSC 백분율을 비교하기 위해 유세포 분석 데이터 획득을 수행합니다. 췌장 종양 유도 마우스와 정상 마우스로부터 비장을 적출하고, 본 비디오 논문에서 설명한 대로 단일 세포 현탁액으로 처리하였습니다. MAC1 및 GR1 형광 결합 항체로 표면 염색된 정상 백혈구를 조사하기 위해 유세포 분석을 수행한 결과, 여기에서 보는 바와 같이 AutoMax 농축 전에는 MAC1 및 GR1 양성 MDSC의 비율이 1.19%로 매우 낮게 나타납니다. 그러나 GR1 양성 집단을 농축한 후, 이 세포 하위 집단은 정상 마우스에서 10.5%로 유의하게 증가하였으며, 이제 종양 유도 마우스의 25.3%와 비교 가능한 수준이 되었습니다.본 절차 이후, MDSC 확장, 이동, 분화 및 면역 반응 억제에 관여하는 분자적 기전에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 가속화된 MDSC 분석, 유세포 분석 기반 소팅 및 in vivo 입양 전이 실험, 정량적 실시간 PCR 및 웨스턴 블로팅을 포함한 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 보고서에서는 종양에 침투 leukocytes의 고도 정화 인구를 분리를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 복잡한 종양 조직에서 세포를 분리에 대한 수율과 순도를 향상시키기 위해 Miltenyi 생명 공학 프로토콜에서 적응하고 있습니다.

일차 종양에서 면역 세포의 분리

뚜렷한 수지상 세포 부분 집합은 림프 기관에서 드문 집단으로 존재하므로 면역학 실험을 위한 충분한 수와 순도로 분리하기가 어렵습니다. 여기에서는 현재 알려진 마우스 비장 수지상 세포의 모든 주요 부분 집합을 분리하기 위한 고효율, 고수율 방법에 대해 설명합니다.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

우리는 PDC의 기능 연구를위한 루푸스 발생하기 쉬운 마우스의 골수로부터 고순도 형질 수지상 세포 (PDC)를 분리 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여 프로토콜을보고합니다.

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

우리는 유전자 조작된 조 혈 모 세포의 악성 잠재력을 평가 하기 위해 조 혈 모 세포 이식 (HSCT)의 사용을 설명 합니다. HSCT 소설 치료를 평가 하 형성 증후군 (MDS) 또는 백혈병 생쥐의 대형 코 호트 생성 뿐만 아니라 다양 한 악성 조 혈 모 세포에 vivo에서 평가 대 한 유용 합니다.

조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

여기의 미리 활성화 CD8 세포 독성을 조사 하는 프로토콜 설명 apoptotic 암 세포를 통해 실시간으로 현미경을 감지 하 여 암 세포에 대 한+ T 세포. 이 프로토콜 골수성 세포 유도 된 T 세포 억제 뒤에 메커니즘을 조사 하 고 면역 진압 골수성 세포의 봉쇄를 통해 T 세포를 보충 하기 위한 화합물을 평가할 수 있습니다.

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

여기에서, 우리는 원주형 자기 활성화 세포 분류를 활용하여 탈수초성 질환의 동물 모델에서 원발성 미세아교세포를 분리하고 정제하는 프로토콜을 제시한다.

탈수초화의 동물 모델에서 자기 활성화 세포 분류에 의한 마우스 일차 미세아교세포의 분리

우리는 양자 세포 전달을 위해 유세포 분석을 통해 마우스의 종양 침윤 림프구(TIL)를 활용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 syngeneic pancreatic cancer 마우스 모델에서 종양에 대한 TIL의 특정 세포 독성을 검증하여 췌장암에 대한 입양 세포 요법 개발에 대한 통찰력을 제공하는 것을 목표로 합니다.

췌장암의 마우스 모델에서 종양 침윤 림프구의 유세포 분석 기반 분리 및 치료 평가

심근 조직의 변형과 같은 매개 변수를 측정하는 정확하고 실용적인 방법은 그것이 게재되어 있기 때문에, 그 변형이 자주 사용하는 매개 변수 EF보다 수축성 장애에 대한보다 민감한 이전 마커이며, 훌륭한 임상 가치입니다.

기능 추적을 사용하여 자기 공명이 유래 심근 스트레인 평가

뇌 종양 세포 시작 (BTICs), 이기종 종양이 가진 줄기 세포의 속성 내에있는 희귀 한 세포의 식별은 인간의 뇌 종양의 pathogenesis에 새로운 통찰력을 제공합니다. 우리는 BTICs에 풍부하게 특정 문화 조건을 정제 한, 우리는 정기적으로 더 이러한 인구 풍부 유동 세포 계측법을 사용합니다. 단일 셀 RT-PCR에 의한 자기 갱신 assays 및 성적표 분석은 이후 이러한 절연 셀에 수행 할 수 있습니다.

정렬 줄기 세포 Assays 및 흐름에 대한 기본 뇌 종양 조직의 처리

배우세요 유동세포계측법과 AutoMACS를 활용하여 마우스 비장에서 골수양 파생 억제 세포(MDSC)를 분리하고 Gr-1 양성 백혈구를 농축하는 방법을. 이 기술은 면역학 및 종양 연구에 활용됩니다.

유동세포계측법 및 자동화된 마그네틱 활성화 셀 정렬 (AutoMACS)를 사용 나이브 및 췌장 종양 베어링 마우스에서 골수양 파생 억제 세포 (MDSC)의 작성

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