유동세포계측법 및 자동화된 마그네틱 활성화 셀 정렬 (AutoMACS)를 사용 나이브 및 췌장 종양 베어링 마우스에서 골수양 파생 억제 세포 (MDSC)의 작성

다음 실험의 전반적인 목표는 in vivo 및 in vitro 분석에 사용하기 위해 생쥐 비장에서 생존 가능한 골수 유래 억제 세포(myeloid derived suppressor cells) 또는 MDSC를 포함하는 GR1 양성 농축 백혈구 집단을 신속하게 생성하는 것입니다. 먼저 여러 마리의 생쥐에서 비장을 수집하여 통합한 후, 단일 세포 현탁액을 생성하도록 처리합니다. 농축 전 MDSC의 비율을 정량화하기 위해, 통합된 세포의 소량을 96-웰 V-bottom 플레이트에 옮깁니다.

MAC-1 및 GR-1 표면 항원을 표지하고, 표지된 세포를 유세포 분석을 위해 팩스 튜브로 옮깁니다. 남은 혼합 백혈구를 GR-1에 대한 형광색소 결합 항체로 염색한 후, 항 GR-1 항체의 형광색소에 결합하는 자성 마이크로비즈와 함께 배양합니다. 그 후 AutoMax pro 분리기를 사용하여 GR-1 양성 및 GR-1 음성 집단을 분리함으로써, 해당 집단의 GR-1 농축 성공 여부를 평가합니다.

소량의 분취액을 취하여 GR one 및 MAC one 발현을 분석함으로써 MDSC 백분율을 평가합니다. 결과로 얻은 면역표현형 분석 데이터를 비교하면, 비농축 집단에 비해 GR one이 농축된 백혈구 집단에서 MDSC 백분율이 증가했음을 알 수 있습니다. 또한, naive MDSC가 증가하여 종양 보유 MDSC와 유사한 수준의 집단이 형성됩니다.

기존의 일반적인 유세포 분석 염색이나 림프 조직 내 mDSC를 분리하는 고속 유세포 분석 기반 소팅과 같은 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 마스터 믹스 기법을 통해 풀 백혈구의 표면 염색을 균일하게 하여 결과의 상당한 편차를 방지하고, mDSC 및 GR1 양성 세포 각각에 대한 정확한 타이핑과 AutoMax 소팅을 보장한다는 점입니다. 시연은 본 연구실의 대학원생인 Nadine Nelson과 USF 유세포 분석 코어 시설 책임자인 Dr. Haw sra가 진행하겠습니다. 다음 절차는 생물학적 안전 작업대(biological safety hood) 내의 멸균 환경에서 수행해야 하며, 세포와 항체는 얼음 위에 보관하십시오.

가능한 경우, 메시 스크린을 컵 하단 방향의 개구부에 삽입하여 세포 해리 체를 조립하십시오. 그런 다음 리테이닝 링의 슬롯 부분이 위를 향하게 하여 나사산 부위에 삽입하고, 링 키를 사용하여 리테이닝 링을 조여 스크린을 고정하십시오. 조립된 체를 10 milliliters의 XPBS 풀이 담긴 페트리 접시에 놓으십시오.

종양을 가진 또는 대조군인 6~8주령의 C 57 black six 마우스에서 비장을 적출하여 세포 해리 체의 메쉬 스크린에 놓습니다. 그 다음 유리 페스틀을 사용하여 비장을 메쉬 스크린을 통해 페트리 접시에 갈아 넣습니다. 마우스의 각 처리군에 대해 이 과정을 반복합니다.

다음으로, 5 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너에 도포하고 50 mL 원추형 튜브에 여과시킵니다. 250~300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고, 비장 하나당 5 mL의 RBC lysis buffer를 첨가한 후 피펫팅으로 강하게 섞어 펠렛을 재현탁합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후, 20 mL의 PBS를 첨가하고 피펫팅으로 강하게 섞어 반응을 중단시킵니다.

그 후 250 ~ 300 ×g에서 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 펠렛을 20 mL의 멸균 PBS에 재현탁한 후 세포 수를 측정합니다. 트라이판 블루(trypan blue)와 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 3% 염색 배지에서 세포 농도를 1 × 10⁷ ~ 2 × 10⁷ cells/mL로 조정합니다. 최적의 염색 상태를 구현하는 것이 이 절차에서 가장 어려운 부분입니다.

이는 사전에 항체 적정을 수행함으로써 성공적으로 진행할 수 있습니다. 본 프로토콜에 기술된 대로 소량의 부피로 마스터 믹스를 준비하고 표면 염색을 수행하십시오. 유세포 분석을 위해 세포를 염색하려면, 96-웰 V-bottom 플레이트의 웰에 대조군, 실험군 및 단일 염색 샘플을 표시하십시오.

보정 대조군을 위해, 라벨링된 각 웰에 50 µL의 부피로 5 × 10⁵ ~ 1 × 10⁶개의 세포를 추가합니다. 그 후, 플레이트를 250 ~ 300 ×g에서 5분간 원심 분리합니다. 원심 분리가 끝나면 플레이트의 하단을 관찰합니다.

웰 내에 펠렛이 존재하는지 확인한 후, 3% 염색 배지에 희석된 rat anti muse CD 1632 단클론 항체가 포함된 마우스 BDFC 블록 마스터 믹스를 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 얼음 위에서 볼텍싱하여 준비합니다. 그 다음, 96-well V-bottom 플레이트를 폐기물 컨테이너나 싱크대 위에 둔 상태로 5초 동안 짧게 원심분리합니다. 세포 펠렛이 손상되지 않도록 플레이트를 빠르게 뒤집었다가 다시 원래대로 돌려 상층액을 제거합니다.

그 다음, 96-well V-bottom 플레이트의 모든 펠릿에 FC block master mix 50 µL를 첨가하고 피펫팅을 통해 부드럽게 혼합합니다. 플레이트를 얼음에 올리고 암소에서 15분 동안 배양한 후, 원심분리 플레이트를 250~300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 얼음 위에서 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 3% Staining medium으로 희석한 Mac one fitzy 및 GR one A PC 항체 master mix를 준비합니다.

5초 동안 짧게 원심분리합니다. 원심분리 후, 플레이트를 뒤집어 각 웰에서 상층액을 제거한 다음, 대조군 또는 실험군 펠렛에 항체 혼합물 50 microliters를 첨가합니다. 부드럽게 파이펫팅하여 잘 섞어줍니다. 단일 염색 보정의 경우, 3%staining medium에 희석된 MAC one F GR one A PC 또는 DPI 50 microliters를 해당 웰에 첨가합니다. 무염색 대조군의 경우, 해당 웰에 3%staining medium 50 microliters를 첨가하고 섞어줍니다.

그 다음, 플레이트를 얼음 위 암실에서 30분 동안 배양합니다. 배양하는 동안 플레이트의 각 웰에 대응하도록 FACS 튜브에 라벨을 붙이고, 각 FACS 튜브에 3% 염색 배지 200 µL를 넣습니다. 30분간의 배양 시간이 지나면, 플레이트를 250~300 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다.

원심분리 후, 이전과 동일하게 상층액을 제거합니다. 그 다음, 각 펠렛에 3% 염색 배지 100 µL를 첨가하여 펠렛을 세척합니다. 피펫팅을 통해 부드럽게 섞어줍니다.

플레이트를 다시 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 세척 단계를 한 번 더 반복하고, 이전과 동일하게 natin을 제거한 다음 각 펠릿을 100 µL의 3% 염색 배지에 재부유시켜 잘 섞어줍니다. 다음으로, 플레이트의 각 웰에서 재부유된 세포 100 µL를 각각 라벨이 부착된 fax 튜브로 옮깁니다.

그다음 대조군, 실험군 샘플 및 DPI 단일 염색 보정 대조군에 75 ng/mL의 DPI를 첨가합니다. 동반 문서에 설명된 대로 유세포 분석 데이터를 획득하여 MDSC 비율을 결정합니다. 다음으로, 남은 미염색 백혈구 중 1 × 10⁷개의 분량을 적절하게 라벨링된 FACS 튜브에 넣고 250 ~ 300 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 GR-1 양성 백혈구를 농축합니다. Max 버퍼에 1:10으로 희석한 GR-1 PE 항체 50 µL를 첨가하고 4 °C의 암소에서 15분 동안 배양합니다.

배양 후, 각 fax 튜브에 max buffer 2 mL를 추가하고 250~300 ×g에서 5분간 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거합니다. 그다음 max buffer로 1:4 희석한 anti PE microbeads 200 µL를 각 튜브에 추가하고 4 °C의 암소에서 15분간 배양합니다.

max buffer 2 mL을 fax 튜브에 넣고 250~300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 다음 펠렛을 staining buffer 3 mL에 재부유시킨 후, 70 µm 스트레이너로 걸러 라벨이 부착된 새로운 50 mL 원추형 튜브에 옮깁니다. 본 프로토콜에서는 자동 자기 분리 방식을 사용합니다.

자기 분리는 매우 훌륭한 선택지입니다. 표면 마커를 기반으로 다량의 세포를 빠르고 비용 효율적으로 분리해야 하는 경우, 작업 종료 후 유세포 분석법으로 결과를 반드시 확인하십시오. AutoMax pro 분리기를 준비하고 프라이밍하려면, 모든 병에 적절한 용액이 채워져 있는지 확인하십시오.

기기를 켭니다. 초기화가 완료되면 액체 용기와 컬럼의 상태를 확인하십시오. 모든 기호가 녹색으로 표시되어야 합니다.

다음으로 상단 메뉴 바에서 separation을 선택한 후 wash를 선택하십시오. 이제 하단 메뉴 바의 팝업 옵션에서 rinse를 선택하고 run을 눌러 프라이밍 과정을 시작하십시오. 프라이밍 과정이 성공적으로 완료되면, 기기에 separation 준비가 되었다는 메시지가 표시됩니다.

상태 메뉴에서, 자성 표지된 세포가 담긴 50 milliliter 원심분리관을 적절한 크기의 냉각 튜브 랙 A열에 배치합니다. 그다음 음성 분획 수집용 50 milliliter 원심분리관을 B열에, 양성 분획 수집용 15 milliliter 원심분리관을 C열에 배치하고, 샘플 내 표지된 표적 세포의 양성 선택을 위한 민감 모드의 POS cell S cell separation 프로그램을 선택합니다. 프로그램이 시작되면, 자성 표지된 표적 세포는 AutoMax 컬럼에 유지되고, 표지되지 않은 세포는 B열의 음성 분획 수집관으로 방출됩니다. 이후 자석이 후퇴하면서 표지된 표적 세포가 튜브 랙 C열의 양성 수집관으로 방출됩니다.

농축 후, 트라이판 블루(trypan blue)와 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 GR1 양성 및 GR1 음성 분획의 세포 수를 다시 측정합니다. 그 다음, 세포를 3% 염색 배지에서 1 × 10⁷ cells/mL에서 2 × 10⁷ cells/mL 농도로 재현탁하고, 각각 라벨이 부착된 FACS 튜브에 50 µL씩 옮깁니다. 유세포 분석 및 단일 염색 보정(single stain compensation)을 위해 MAC-1 및 DPI 생존능 염색약으로 세포를 염색합니다.

GR1 양성과 GR1 음성 백분율을 결정하고, AutoMax 및 농축 전후의 MDSC 백분율을 비교하기 위해 유세포 분석 데이터 획득을 수행합니다. 췌장 종양 유도 마우스와 정상 마우스로부터 비장을 적출하고, 본 비디오 논문에서 설명한 대로 단일 세포 현탁액으로 처리하였습니다. MAC1 및 GR1 형광 결합 항체로 표면 염색된 정상 백혈구를 조사하기 위해 유세포 분석을 수행한 결과, 여기에서 보는 바와 같이 AutoMax 농축 전에는 MAC1 및 GR1 양성 MDSC의 비율이 1.19%로 매우 낮게 나타납니다. 그러나 GR1 양성 집단을 농축한 후, 이 세포 하위 집단은 정상 마우스에서 10.5%로 유의하게 증가하였으며, 이제 종양 유도 마우스의 25.3%와 비교 가능한 수준이 되었습니다.

본 절차 이후, MDSC 확장, 이동, 분화 및 면역 반응 억제에 관여하는 분자적 기전에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 가속화된 MDSC 분석, 유세포 분석 기반 소팅 및 in vivo 입양 전이 실험, 정량적 실시간 PCR 및 웨스턴 블로팅을 포함한 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.