Biomarker 디스커버리를위한 Mesoporous 실리카 박막의 낮은 분자량의 단백질 농축

이 절차의 전반적인 목표는 인간 혈청에서 저분자량 단백질 및 펩타이드를 선택적으로 회수하기 위해 메조 다공성 실리카 박막을 기반으로 하는 기술을 개발하는 것입니다. 이것은 먼저 메조 다공성 실리카 박막 칩을 제작하고 산소 플라즈마 애싱으로 전처리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 혈청의 간단한 전처리를 수행한 다음 온칩 분획을 통해 혈청에서 저분자량 단백질과 펩타이드를 농축

칩에서 저분자량 단백질과 펩타이드의 elucian에 이어, 분자는 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분석법을 사용하여 프로파일링됩니다. 마지막 단계는 전문 소프트웨어를 활용하여 데이터 분석을 수행하는 것입니다. 궁극적으로 질량 스펙트럼 및 통계 분석 결과는 저분자량 단백질체 수확의 특이성과 효능을 보여줍니다.

이 기술의 주요 장점 또는 2D 페이지 서양 혈액과 같은 기존 기술이 존재하며, 혈청의 저분자량 단백질 및 펩타이드를 풍부하게 하는 강력한 능력, 높은 처리량 및 시간 효율성, 혈청 샘플 요구 사항 감소 및 저렴한 비용을 포함합니다. 이 절차의 가장 어려운 측면 중 하나는 PO 크기 분포, PO 선박 및 열악한 상호 연결성과 같은 나노포어 그물 형태를 제어하는 것입니다. 이 기능은 프로파일링 대상 혈액 서명의 민감도와 특이도를 결정하기 때문입니다.

연습을 보장하기 위해 출발 물질의 모델 비율을 신중하게 제어하고 지침을 정확하게 따라 칩용 코팅 솔루션을 만드는 것을 목표로 합니다. 가수분해된 규산염 전구체 용액을 만드는 것으로 시작합니다. 14 밀리리터의 테오와 17 밀리리터의 200 프루프 에탄올, 6.5 밀리리터의 탈 이온수 및 0.5 밀리리터의 6 몰 염산을 강한 교반하에 혼합합니다.

강한 교반을 계속하고 결과 용액을 섭씨 80도에서 2 시간 동안 가열합니다. 다음으로, 선택한 고분자 용액을 실온에서 10ml의 에탄올에 넣고 격렬하게 교반하여 트라이 블록 공중 합체 용액을 준비합니다. 이 데모에서는 onic F1 27이 사용됩니다.

이 트라이 블록 공중 합체에 규산염 용액을 첨가하여 혼합물을 완성 한 다음 실온에서 2 시간 동안 강하게 교반합니다. 생성된 코팅 용액 1ml를 20초 동안 1, 500RPM의 속도로 스핀 코팅하여 4인치 실리콘 웨이퍼에 적용합니다. 다음으로 웨이퍼를 섭씨 80도에서 12시간 동안 가열합니다.

그런 다음 섭씨 425도에 도달할 때까지 온도를 분당 1°C 올리고 이 온도에서 5시간 동안 굽습니다. 다음으로, 생성된 메조 다공성 실리카 또는 MPS 칩 표면을 산소 플라즈마 애싱으로 전처리합니다. 그런 다음 산소 농도계를 사용하여 필름 두께와 다공성을 측정합니다.

한편, 각 혈청 샘플에 트리플루오로산을 최종 농도 0.01%로 추가하고 아세틸 니트릴을 최종 농도 5%로 첨가한 다음 섭씨 160도의 오븐에서 밤새 칩을 사전 구운 후 실온의 테이블 와류 셰이커에서 30분 동안 이 샘플을 흔듭니다. 압축 공기를 사용하여 칩 표면에 있을 수 있는 입자의 먼지를 털어냅니다. 커버 슬립을 100% 에탄올로 청소하고 NPS 칩 표면에 올려 샘플 웰을 만듭니다.

칩으로 덮개를 밀어 넣으십시오.칩이 완전히 밀봉되도록 합니다. 다음으로, 10마이크로리터의 혈청 샘플을 각각에 피펫팅합니다. 웰은 실온의 가습 챔버에서 30분 동안 배양하여 저분자량 단백질이 배양 후 기공으로 들어갈 수 있도록 하고 웰에서 혈청을 흡입하고 폐기합니다.

그런 다음 10마이크로리터의 탈이온수를 각 웰에 피펫으로 넣어 더 큰 단백질을 씻어냅니다. 한 번에 1-2개의 웰로 작업하면서 이 세척을 4번 반복합니다. 증발을 빠르게 방지하기 위해 각 샘플에 5마이크로리터의 용리 완충액을 첨가하십시오.

잘 피펫을 위아래로 30회 반복하면서 피펫 팁을 웰 안에서 움직여 혼합합니다. 혼합 후, 모든 엘루시안 완충액을 흡인하고 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 분석을 수행할 준비가 될 때까지 마이크로 원심분리기 튜브에 넣어 샘플의 0.5 마이크로리터를 MALDI 타겟 플레이트에 반점하고 건조시킨 다음 0.1% TFA를 함유하는 50%아세토 니트릴에서 0.5 마이크로리터의 매트릭스를 발견하고 다음 반점을 공동 결정화할 수 있도록 합니다. 0.5마이크로리터의 교정 용액을 교정 지점에 놓습니다. 건조되면 타겟 플레이트를 maloff 질량 분석기에 삽입합니다.

기계는 4, 203, 샘플당 000발의 레이저 강도를 가진 포지티브 리플렉터 모드로 보내야 합니다. 먼저, 800에서 5, 000 Dalton의 선택된 질량 범위와 2000 Dalton의 목표 질량으로 해석을 수행합니다. 그런 다음 선형 모드에서 동일한 MALDI toff 해석을 수행하되 질량 범위를 900 - 10, 000 Dalton 또는 3000 - 70, 000 Daltons로 변경하고 목표 질량은 5, 000 Dalton입니다.

multi top 분석 후 convert peak list 소프트웨어를 사용하여 원시 스펙트럼을 처리한 다음 specal로 내보냅니다. 사전 처리를 위한 정렬 소프트웨어: 고속 푸리에 변환 또는 P-A-F-F-T 상관 분석법에 의한 피크 정렬을 사용하여 모든 스펙트럼을 정렬하고 강도를 총 이온 전류로 정규화합니다. 높이 비율이 2이고 질량 창의 0.3%로 피크 검출을 수행합니다.

분석하기 전에 기준선을 수정하고 음수 값을 제거합니다. T 2D 파일을 마커 뷰로 가져오는 것은 서로 다른 그룹의 maldi 데이터를 감독 처리하기 위한 첫 번째 단계입니다. 먼저 마커 보기 소프트웨어를 연 다음 T 2D 파일을 가져옵니다.

T 2D 파일이 포함된 폴더를 선택하고 스펙트럼 처리를 위한 매개변수를 설정합니다. 다음으로, 샘플 테이블을 엽니다. 동일한 그룹의 샘플을 강조 표시하고 그룹 레이블을 디자인합니다.

총 면적 합을 사용하여 표본을 정규화합니다. 그런 다음 옵션 창을 엽니다. 각 그룹에 대해 고유한 색상과 기호를 설정합니다.

그런 다음 활성 데이터에 대한 주성분 분석 및 T-검정을 수행하고 표본을 PC 1 점수와 PC 2 점수에 따라 다른 그룹으로 나눕니다. 바이오마커 후보는 PC 로딩 플롯에 따라 찾을 수 있으며, 선택한 피크에 대한 플롯 프로파일을 클릭하여 선택한 바이오마커의 강도 프로파일 요약을 보여줍니다. 값이 더 큰 점은 서로 다른 그룹을 구별할 수 있습니다.

그룹을 T-test와 비교한 후, 다양한 그룹을 구별할 수 있는 피크를 결정하기 위해 P 값을 오름차순으로 테이블을 정렬하고, 여기에 표시된 다양한 그룹을 구별할 수 있는 피크는 900-10, 000 Daltons 범위의 펩타이드와 3000-70, 000 Daltons 범위의 단백질에 대한 혈청 샘플의 MS 스펙트럼입니다. 처리되지 않은 샘플의 스펙트럼은 MPS 박막에 의한 분별 후 알부민과 같은 잘 이온화되고 매우 풍부한 고분자량 단백질의 존재로 인해 저분자량 영역에서의 신호 억제를 보여주며, 대부분의 큰 분자가 고갈되어 저분자량 성분이 크게 농축되었습니다. 대조군으로서, 동일한 혈청 샘플을 비다공성 순수 실리카 표면에 도포했습니다.

저분자량 단백질체 회수를 위한 MPS 박막의 특이성을 평가하기 위해 비다공성 실리카에서 펩타이드 또는 단백질을 유의미하게 수확하지 않았습니다. 따라서, LMWP의 농축에 주된 요인을 구성하는 것은 실리카 표면 친화도가 아니라 중다공성 구조였다는 결론을 내릴 수 있습니다. 기공 크기의 정밀하게 제어된 변화는 소수성 블록 길이가 다른 공중합체를 사용하여 달성할 수 있습니다.

LMW 펩타이드 및 단백질 회수 효능에 대한 기공 크기의 영향은 소수성 및 친수성 성분의 부피 비율이 다른 4개의 오닉 계면활성제로부터 제조된 MPS 박막을 사용하여 조사되었습니다. 여기에 표시된 것은 공극 크기와 관련된 각 MPS 칩의 특징적인 분자 컷오프를 보여주는 maldi 스펙트럼의 확대 보기입니다. 공극 크기의 범위는 크기 및 모양 배제를 통해 동일한 혈청 샘플에서 펩타이드 및 단백질의 다른 레퍼토리를 회수하도록 이끌었습니다.

이것은 또한 서로 다른 칩 간의 펩타이드 혼합 특징의 양방향 계층적 클러스터링에서 관찰될 수 있습니다. 빨강 황색 색깔의 강렬은 관계되는 펩티드 농도를 나타냅니다. 더 큰 공극은 더 큰 펩타이드의 수확을 향상시켰고, 작은 펩타이드는 더 작은 공극을 가진 칩에서 우선적으로 회수되었습니다.

유사한 por 크기 분포를 갖는 onic F1 27과 같은 고분자량 트라이 블록 공중합체를 사용하여 형성된 다양한 MPS 박막 주기적 나노 구조는 전구체 용액에서 고분자 구조를 조정하여 얻을 수 있습니다. 3D 입방체 및 벌집 모양의 육각형 나노 구조는 더 바람직한 나노 기공 상호 연결성과 더 접근하기 쉬운 나노 기공 형태를 가지고 있습니다. 그 결과, LMW 펩타이드를 선택적으로 농축한 다음 2D 육각형 구조에서 우수한 성능을 보여줍니다.

이는 혈청 분획을 위한 유사한 공극 크기 분포와 동일한 분자 컷오프를 공유하더라도 마찬가지입니다. MPS 칩에서 Organy lane의 접합은 칩 표면을 전처리하기 위해 산소 플라즈마 애싱을 도입하여 간소화되었습니다. 이 그림은 기능화된 칩에서 선택적으로 포획된 펩타이드의 MS 검출 강도의 막대 그래프를 통해 표면 기능이 다른 칩에 대한 전하 특정 회수를 보여줍니다.

그들의 등전점에 따르면, 펩티드는 고분자량 단백질의 고갈의 옆에 pH 7.0에 양전하를 띱니다. 결과는 NPS의 구조적 설계와 화학적 기능화가 펩타이드 농축의 특이성을 더욱 증가시켰다는 것을 보여줍니다. 이 개발과 함께.

우리는 이 기술이 단백질체학 분야의 연구자가 인간 및 동물 모델에서 신체 플루트의 조기 진단 또는 치료적 평가를 위한 새로운 바이오마커를 탐구할 수 있는 길을 열 것으로 기대합니다. 결과적으로, 그리드는 주요 질병에 대한 맞춤형 치료를 강화했습니다.