Name: Biomarker 디스커버리를위한 Mesoporous 실리카 박막의 낮은 분자량의 단백질 농축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: 배우세요 메조포러스 실리카 박막을 이용한 저분자량 단백질 농축 기술로 혈청 프로테오믹스 프로파일링을 개선하는 방법입니다. 이 기술은 바이오마커 발견 및 진단 능력 향상에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 NanoHealth 예약 센터 수상 (W81XWH-11-2-0168)과 암 Nanomedicine을위한 텍사스 센터 (1U54CA151668-01)의 연합에 의해 재정 지원되었다.

1. 칩 제작 <ol><li> 분해 규산 전구체 용액으로 시작하여 칩위한 코팅 솔루션을 만듭니다. 에탄올 17 ML과 tetraethylorthosilicate (TEOS)의 14 ML를 혼용, 강한 저어 미만 탈이온수와 6M HCL 0.5 ML의 6.5 ML은 (1200 RPM)는 철판을 흔들어 사용합니다. 교반 상수를 유지, 2 시간 동안 80 ° C에서이 솔루션을 가열. </li><li> 강한 저어로 실온에서 에탄올의 10 ML에 원하는 트라이 - 블록 coploymer (pluronic F127, L121 및 P123)를 추가하여 폴리머 솔루션을 준비합니다. 상온에서 강한 저어 2 시간이어서 트라이 - 블록 공중 합체 용액으로 규산 용액 (1.1 단계에서)의 7.5 ML을 추가하여 혼합물을 완료합니다. 이것은 최종 코팅 솔루션을 대표한다. </li><li> 20 초 동안 1500 RPM의 속도로 스핀 코팅에 의한 4 인치 실리콘 웨이퍼에 코팅 용액 1 ML을 적용합니다. 80에서 다음 열을 ° 12 시간 C #. </li><li> 유기 통화를 제거하기 위해 필름을 가열425로 온도 1 ° C 분당을 늘리면 rfactant ° C에서 다음 5시간 동안 구워. </li><li> 산소 플라즈마 ashing (- 월 플라즈마 시스템 플라즈마 아셀)와 mesoporous 실리카 (MPS) 칩 표면을 Pretreat. (O 2 유량 : 80 sccm, 전력 : 300 W, 시간 : 10 분). </li><li> 선택적 표면 화학 수정 : 메탄올의 3 % organosilane의 silanate 칩 : DI 워터 (19시 1분) N이 장갑 상자에 상온에서 72 시간 동안 솔루션입니다. 메탄올 및 DI 워터로 순차적으로 씻어. 110에 ° C로 작동하는 팬을 오븐에 15 분 동안 칩 치료. </li></ol> 2. 샘플 사전 처리 <ol><li> 최종 농도가 0.01 %의 TFA와 5 %의 ACN 있는지 등 각각의 혈청 샘플에 TFA와 ACN을 추가합니다. 혼합할 수있는 와동. </li><li> 30 분간 실온에서 테이블 와동 흔드는에서 이러한 샘플을 흔들어. </li></ol> 3. 세럼 분별화 <ol><li> 160에 오븐에 하룻밤 이상 예약 베이킹 칩 ° C. 또는 storE 건조기에 파편 공중에 주위 물로 표면의 보습을 방지하기 위해 사용할 준비까지. </li><li> 칩의 표면에있을 수있는 입자를 좀 쓸 압축 공기를 사용하십시오. </li><li> 조립식를 자르고, 우물의 원하는 번호를 포함하도록 CultureWell chambered coverglass를 구입했습니다. MPS 칩 표면에 100 % 에탄올 다음 장소로 클린 coverglass. 칩과 완벽한 밀봉을 보장하기 위해 집게로 coverglass을 누르십시오. </li><li> 물론 각각 3mm로 혈청 시료의 피펫 10 μL. 상온에서 humidified 챔버에서 30 분간 부화. </li><li> 우물에서 혈청을 피펫 및 버리고. 각도에 탈이온수의 피펫 10 μL 더 큰 단백질 멀리 씻어합니다. 4 번 단계를 반복합니다. </li><li> 물론 각각의 샘플에 피펫 5 μL 용리 완충액 (0.1 % TFA + 50% ACN). 용출 버퍼를 섞어 잘 곳곳에 피펫 팁을 이동하는 동안 30 배 아래까지 피펫합니다. (단 용출 버퍼를 방지하기 위해 한 번에 1-2 시료에 용출 버퍼를 적용너무 빨리 증발에서). </li><li> 든-TOF 분석을 수행할 준비까지 믹싱 후 microcentrifuge 튜브의 모든 용출 버퍼와 장소를 피펫. </li><li> 생물 학적 시료의 복잡도를 흉내낸 우리의 온칩 분획화 시스템과 낮은 분자량 종 수확에 강화 효과를 평가하기 위해, 우리는 선택과 광범도 24 여섯 가지 종족을 계산 단백질과 펩티드의 표준 혼합 조립 분자 무게 (900-66 500 다)와 pIs (4.0-10.2) 및 농도 (0.5-8 pmol / μl)의 범위 (표 1의 단백질 목록을 참조). </li></ol> 4. 펩티드의 든-TOF 분석 <ol><li> 스팟 0.5 든 대상 플레​​이트에 샘플 μL 및 건조 수 있습니다. </li><li> 스팟 0.5 μL 매트릭스 (α-cyano-4-hydroxycinnamic 산성 (CHCA), 5 G / L) 또는 0.1 % TFA와를 포함하는 50 % acetonitrile의 횡단-3 ,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic 산성 (SA)의 포화 용액 공동 결정화 수 있습니다. &lt;/ 리&gt; <li> 스팟 0.5 각 교정 명소로 교정 솔루션의 μL 및 건조 수 있습니다. </li><li> 든 - TOF 질량 분석기로 표적 판을 삽입합니다. 기계는 샘플 당 4200 및 3000 샷을의 레이저 강도와 긍정적인 반사 모드로 설정되어야합니다. 선택된 질량 범위는 2000 다의 대상 집단과 800-5000 다 있어야합니다. </li><li> 선형 모드에서 동일한 든-TOF 분석을 수행하지만, 900 ~ 10,000 다이나 3000에 70000 다와 5000 다의 대상 미사 미사 범위를 변경합니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 원시 스펙트럼은 ConvertPeakList 소프트웨어로 처리되었으며 데이터는 전처리를위한 소프트웨어를 SpecAlign에 수출되었다. 모든 스펙트럼은 PAFFT 상호 관계 방법과 농도 각 해당 스펙트럼의 총 이온 전류 (TIC)에 정상화되었다를 사용하여 정렬되었습니다. 모든 스펙트럼은 smoothed 각각 4와 0.5의 계수로 드 noised되었다. 봉우리는 0.5, 대량 21 창 및 높이의 기준으로 발견되었습니다비율 1.5, 부정적인 값을 분석하기 전에 제거되었습니다. </li><li> 계층적 클러스터링은 클러스터 3.0을 사용하여 수행하고 MapleTree 소프트웨어로 시각되었다. 든 MS 데이터 (M / Z 피크 농도)는 로그인 변형, 표준, 그리고 중간 적이었다. 피어슨 상관 관계는 샘플 사이의 거리를 계산하는 데 사용되고, 완벽한 연동 클러스터링이 수행되었다. </li><li> 독립적인 학생 T-테스트는 사전 혼자 가잖아 계층적 클러스터링 분석에 대한 각 감지 MS 피크에 대한 그룹 (N = 2 그룹) 간의 비교를 위해 사용되었다. 0.02 이하의 P-값은 다른 mesoporous proteomic 칩 (대형 모공 대 작은 모공) 사이 differentially 수확 펩티드와 단백질을 선택할 상당한 여겨졌다. </li></ol> 6. 대표 결과 그림 1에 나타난 바와 같이, 본 연구에서 우리는 nanotextures의 다양한 mesoporous 실리카 박막의 일련의 조작하고 종합적으로 탐험선택 캡쳐하고 인간의 혈청에서 LMW의 펩티드와 단백질을 풍부하게. 그림 2A와 B의 IR 사용 900 ~ 10,000 다의 범위에서 펩티드를 위해 3000의 범위에있는 단백질을위한 처리되지 않은 혈청 시료 중의 MS 스펙트럼을 보여 ~ 70,000 다를 각각 . 이러한 스펙트럼에는 알부민. 그림 2C와 D 등 (HMW) 단백질 MPS L121 의해 분별화 후 혈청 시료 중의 MS 스펙트럼을 묘사 때문에 잘 이온화, 매우 풍부하고, 높은 분자량의 존재에 LMW 지역의 신호 억제를 보여주는 (기공 크기, 6 nm의). 큰 분자의 대부분은 LMW 구성 요소의 상당 농축 결과, 소진되었습니다. 컨트롤로서, 동일한 혈청 샘플 LMWP 복구를위한 MPS 박막의 특이성을 평가하기 위해 비유 공성 순수한 실리카 표면에 적용되었다. 그림 2e와 F에서 볼 수 있듯이, 응원의 더 큰 수확은 없었비유 공성 실리카의 조수 또는 단백질. 그러므로 그것은 그것이 mesoporous 건축과하지 LMWP의 농축에 predominate 요소를 구성 실리카 표면 친화력이라고 결론 수 있습니다. 기공 크기가 정확하게 조절 변형은 소수성 블록 길이를 다양한으로 공중 합체의 사용을 통해 달성될 수있다. 설계된 단백질 및 펩티드 혼합물을 사용하여 LMW의 펩타이드 및 단백질 복구 효능에 기공 크기 효과 MPS에게 다른 볼륨 비율도없이 네 Pluronic의 계면 활성제 (F127, P123, L121과 L121 플러스 붓기 대리인)에서 준비 박막을 사용하여 조사되었다 친수성과 소수성 컴포넌트로 각각 3.7 nm의 기공의 크기, 5.2 nm의, 7.4 nm의, 그리고 9.0 nm의를 형성합니다. 기공 크기의이 다양한 크기와 모양 제외 (그림 3)를 통해 펩티드와 같은 혈청 시료에서 단백질의 다양한 레퍼토리의 회복되었다. 높은 분자량 D의 단백질 스펙트럼칩의 각 유형의 컷 - 오프 분자를 emonstrate. HMW 단백질의 크기에 의존 고갈뿐만 아니라, 표준 솔루션의 온칩 분별화은 차등 및 기공 크기와 관련된 LMW 종의 선택적 농축을 표시합니다. 그림 3B로 제공 양방향 계층적 클러스터링은 서로 다른 MSC와 함께 얻은 LMW 표준 농축 패턴을 보여줍니다. 모든 펩티드가 칩의 컷 - 오프의 분자 이하의 경우에도 기공 크기와 갇힌 인류의 분자량 간의 긍정적인 상관 관계가있다. 작은 펩티드가 작은 모공과 칩하여보다 효율적으로 회수하는 동안 큰 모공, 최대 9 nm의와 MSC는 우선적으로, 더 큰 펩티드를 수확. mesoporous 배열의 구조 변화는 템플릿 고분자의 농도를 조정하여 실시되었다. 템플릿 고분자의 농도를 높이면 단계 사이의 낮은 계면 곡률 결과물, 공중 합체, 그리고 규산, 따라서 원통형 구조로 구형에서 상호 진행을 시작.의 Pluronic F127은 높은 분자량으로 구조적 주기성이 높은 수준을 가지고 있습니다. 솔루션을 시작으로 F127의 농도를 증가함으로써, 서로 다른 MPS 박막 정기 nanostructures는 2D nanostructure로 3D nanostructure에서 얻을 수있다. 3D 입체와 벌집 육각형 nanostructures 더 바람직 nanopore의 상호 연관성에 더 접근할 수 nanopore의 형태를 가진, 그들은 유사한 기공 크기 배포판과 혈청 컷 - 오프 동일한 분자를 공유하더라도, 선택적으로 2D 육각형 구조를보다 LMW 펩티드를 풍요롭게에서 뛰어난 성능을 전시 분별화 (그림 4). 칩 표면 pretreat하는 ashing 산소 플라즈마를 도입하여 MPS 칩에 organo - 실란의 우리도 간소 활용. 질적으로 선택의 정전 기적 효과를 연구하기 위해서는필자 온칩 농축, 우리는 단백질과 펩티드 혼합물을 사용합니다. L121 사용한 MPS 칩에 fractionated 및 화학 기능성 그룹과 복합 proteomic 표준 솔루션의 MS 분석은 그림 5에 표시됩니다. 긍정적 청구 및 부정 청구 펩티드와 LMW 단백질은 각각 음이온과 양이온 칩을에 캡처됩니다. 긍정적인 네트 요금과 펩티드를 복구하는 여러 MPS 칩의 정량 비교 그림 5A에 표시됩니다. 어떠한 수정 (원래 사소한 부정적 요금 포함)없이 부정적인 요금과 칩을 탑재한 칩은 APTES (-NH 2)와 함께 수정된 칩보다 이러한 펩티드에 대한 상당히 높은 농축을 나타냅니다. 그림 5B에 시연으로 반대로 긍정적인 충전 MPS 칩, 마이너스 순이익 요금으로 이러한 펩티드를 복구하기 위해 탁월한 능력을 가지고있다. α-엔돌핀은 상당한 변화 d를 표시하지 않지만6 주위의 PI에 월엔. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig1.jpg" /> 그림 1. MPS 칩 분별 (분리) 및 LMW 농축의 원리. 큰 종이가 모공 밖으로 유지하는 동안 시료가 표면에 야생 후에 LMW 단백질과 펩티드는 모공에 갇혀되고 세척 단계 동안 제거됩니다. 풍부한 분수는 다음 eluted 및 든에 의해 분석된다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig2.jpg" /> 그림 2. mesoporous 실리카 박막 칩을 사용하여 펩타이드 농축. 낮은 질량 범위 (900 10 000 다로)과 전에 높은 질량 범위 (3000-70 000 다) (A, B) 모두와 mesoporous 실리카 박막에 (C, D) 혈청 처리 (이후에 든 MS 프로파일 L121, 6 nm의). 빈 비유 공성 실리카 표면 (E, F)를 사용할 때 분자 회복이 크게 줄어 듭니다. <img alt="그림 3" src=&quot;/ files/ftp_upload/3876/3876fig3.jpg&quot;/&gt; 그림 3. MPS 칩의 분자 컷 - 오프와 크기에 의존 농축. 기공 크기로 연관 각 MPS 칩 절단 특성 분자를 시연 든의 스펙트럼의 () 확대보기. 다른 칩 간의 펩타이드 믹스 기능 (B) 양방향 계층적 클러스터링. 빨간색이나 노란 색상의 농도는 상대적 펩타이드 농도를 나타냅니다. 작은 펩티드가 (900-3500 다에서) 우선적 작은 모공과 칩에서 발견한 동안 큰 모공은 큰 펩티드 (3600부터 8500까지 다)의 수확을 향상. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig4.jpg" /> 그림 4. MPS 박막 및 다른 nanostructures와 선택적 복구 물리적 characterizations. XRD 패턴 (A, B, C), TEM (삽입된 페이지, B, C), 전구체 용액의 다양한 농도에서 Pluronic F127 : 4.0 ×10 -3 M (A), 6.0 × 10 -3 M (나) 및 8.0 × 10 -2 M (C). 3D 입체 및 3D 육각형 F127 proteomic 칩 (각각 새끼와 설사약)에 대한 선택적 펩티드 복구를 보여주는 검색의 강도의 (D) 막대 그래프. 다른 구조적 개조 선택적 농축을 제시. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig5_lg.jpg"><img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig5.jpg" /></a> 그림 5. 다른 표면 기능이있는 칩 충전 특정 복구. 작용 칩에 선택적으로 캡처한 펩티드의 감지 MS 강도의 막대 그래프. 그들의 ISO-전기 점에 따르면, 펩티드는 긍정적이거나 부정적인 산도 7.0에서 부과. () 긍정적인 펩티드 ((1) DES-Arg1-Bradykinin, (2) Bradykinin, (3) 물질 P-아미드, (4) Neurotensin, (5) ACTH (1-17), (6) ACTH (7 - 38)이) 특별히 부정 청구 쉬르에 풍부하고얼굴. (B) 부정적 펩티드 ((7) Glu1-fibrinopeptide B, (8) α-엔돌핀, (9) ACTH (18-39), (10) 인슐린, (11) EGF (12) 인슐린과 같은 GFII)가 있습니다 특히 긍정적 부과 표면에 풍부. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig6_lg.jpg"><img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig6.jpg" /></a> 그림 6. fractionated 혈청 온칩 안정화. () LMW의 펩티드와 단백질의 대표 든 프로파일은 즉시 혈청 분별화 (위) 이후에 또는 상온 (하단)에서 온칩 저장 3 주 후 eluted. (B) 머리부터 발끝까지 각 복제에서 발견 석사 봉우리의 평균 농도의 선형 회귀 분석은 실온에서 갓 fractionated 혈청 혈청 및 fractionated 후 3wk MPS 칩 저장 장치에 대해 1을 복제하는 데 비해. 수식, CV 및 결정 계수는 (R 2) 표시됩니다.

<ol><li>Wulfkuhle, J. D., Liotta, L. A., Petricoin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+applications+for+the+early+detection+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Proteomic applications for the early detection of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 267-275 (2003).</li>
<li>Etzioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+early+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The case for early detection.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 243-252 (2003).</li>
<li>Hanash, S. M., Pitteri, S. J., Faca, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+plasma+proteome+for+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mining the plasma proteome for cancer biomarkers.</a> Nature. 452, 571-579 (2008).</li>
<li>Liotta, L. A., Ferrari, M., Petricoin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+proteomics%3A+written+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clinical proteomics: written in blood.</a> Nature. 425, 905-905 (2003).</li>
<li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood+peptidome%3A+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 961-967 (2006).</li>
<li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+plasma+proteome%3A+history%2C+character%2C+and+diagnostic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell Proteomics. 1, 845-867 (2002).</li>
<li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).</li>
<li>Liu, H., Sadygov, R. G., Yates, J. R., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+random+sampling+and+estimation+of+relative+protein+abundance+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics.</a> Anal. Chem. 76, 4193-4201 (2004).</li>
<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics%3A+old%2C+old+fashioned%2C+but+it+still+climbs+up+the+mountains%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains.</a> Proteomics. 2, 3-10 (2002).</li>
<li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+of+the+nanotexture+of+mesoporous+silica+films+and+their+functionalized+derivatives+for+selectively+harvesting+low+molecular+weight+protein%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Tailoring of the nanotexture of mesoporous silica films and their functionalized derivatives for selectively harvesting low molecular weight protein.</a> ACS Nano. 4, 439-451 (2010).</li>
<li>Bouamrani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+silica+chips+for+selective+enrichment+and+stabilization+of+low+molecular+weight+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mesoporous silica chips for selective enrichment and stabilization of low molecular weight proteome.</a> Proteomics. 10, 496-505 (2010).</li>
</ol>

우리는 공개 할게 없다.

증거 순환 프로테옴의 낮은 분자 - 무게 영역이 질병의 조기 발견을위한 진단 생체 풍부한 원천임을 장착하고 있습니다. 이 기술에서 우리는 서로 다른 기공 크기, 기공 구조와 선택적으로 펩티드과 낮은 분자량의 단백질을 풍부하게하기 위해 수정과 mesoporous 실리카 칩 시리즈를 발표. 단백질의 안정성을 평가하기 위해 MPS 칩은 세척 후 건조 인간의 혈청과 incubated하고, 실온에서 3wk을 저장했다. 얻은 단백질 / 펩타이드 패턴은 그림 6B에서 보여준 통계 분석의 결과에 의해 확인 갓 fractionated 혈청 분들 (그림 6A)와 비교할 수 있었다. 평균 이력서로 측정 피크 신호​​의 변화는 원유 혈청 12.7 %로 그리고 fractionated 샘플 14.2 %로 추정되었다. 한계 유사 든 악기의 내부 변화로 인해이어야하며 추천 수 ON-칩 전처리 및 보관은 MS 단백질 프로파일의 중요한 변경을 유발하지 않았다. 같은 실험은 비 다공성 실리콘에서 수행되었습니다. 실리콘 표면에 저장 후 회복 건조 혈청이 든 분석하기 전에 MPS 칩에 fractionated했습니다. 가난한 석사 프로필 mesoporous 표면의 안정화 이점을 시연 획득하였습니다. 이전에 postulated 메커니즘과 비유에서 우리는 nanopores 안에 갇혀 LMW 종은 프로 테아제의 크기를 제외 통해 열화로부터 보존되었다는 가설, 또는 nanopores의 제한된 공간에서 자신의 proteolytic 활동의 steric 억제에 의해. MPS 칩 기반 방식은 복잡한 생물 학적 유체 연구의 펩타이드와 LMW 단백질 프로 파일링의 강력한 도구가 될 수 있습니다. MPS 칩은 답사의 선별 및 생물에 대한 유리한 기능을 제공, 샘플 다수의 동시 처리를 달성하기 위해 확장 생산을 위해 생산을 허용하는 저렴한 있습니다마커 발견.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Tetraethoxysilane </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 131,903 </td><td> 98% </td></tr><tr><td> 스핀 coater </td><td> 브루 과학 </td><td> 아싸 200X </td><td></td></tr><tr><td> 플라즈마 아셀 </td><td> Nordson 월 </td><td> AP-600 </td><td></td></tr><tr><td> Spectroscopic 타원계 </td><td> JA Woollam (주) </td><td> M-2000DI </td><td></td></tr><tr><td> 든-TOF </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 보이저-DE-STR </td><td></td></tr><tr><td> α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 (주) </td><td> C8982 </td><td> 든-TOF을위한 매트릭스 </td></tr><tr><td> 트랜스-3 ,5-dimethoxy -4 - 히드록시cinnamic 산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 (주) </td><td> 85,429 </td><td> 든-TOF을위한 매트릭스 </td></tr><tr><td> 핫 플레이트를 저어 </td><td> 써모 과학 </td><td> 11-475-30Q </td><td></td></tr><tr><td> CultureWell chambered coverglass </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> GBL103350 </td><td> 3mm의 diam. × 1 밀리미터 깊이 3-10 μL, 무균 </td></tr><tr><td> Pluronic F 127 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 106-PPO 70 PEO 106 </td></tr><tr><td> Pluronic L121 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 5-PPO 70 PEO 5 </td></tr><tr><td> Pluronic P123 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 20-PPO 70 PEO 20 </td></tr></tbody></table> 표 1. Physico - 화학적 특성 및 설계 농도 (분자량 및 ISO선택된 펩티드 및 단백질 표준 - 전기 점).

biomarker 디스커버리를위한 mesoporous 실리카 박막의 낮은 분자량의 단백질 농축

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

순환 생체 식별이 아닌 침략 조기 진단 및 예후에 접근뿐만 아니라, 치료 효율 모니터링을위한 큰 잠재력을 보유하고 있습니다. 1-3 또는 조직과 세포에서 흘리다 작은 단백질로 구성되어 순환 낮은 분자량의 프로테옴 (LMWP) 큰 단백질의 proteolytic 저하에서 파생된 펩타이드 조각, 환자의 병적 상태와 연관된와 가능성이 질병의 상태를 반영한다. 이러한 잠재적인 임상 응용에도 불구하고 4,5되었으며, 질량 분석법 (MS)의 사용은 LMWP에게서 프로필 생물 학적 체액은 매우 인해 혈청에있는 단백질과 펩타이드 농도의 넓은 다이나믹 레인지에 도전하는 것으로 증명되었습니다. 6 샘플 사전 처리없이,보다 높은 풍부한 단백질의 일부는 혈청 / 혈장의 낮은 풍요로움 종의 검출을 흐릿하게. 이러한 2 차원 polyacrylamide 겔 - 엘과 같은 전류 proteomic 기반 접근ectrophoresis (2D-PAGE)과 샷건 proteomics 방법은 임상 응용을위한 노동 집약, 낮은 처리량 및 제공 제한 적합성. 따라서 7-9이며,보다 효과적인 전략은 혈액에서 LMWP를 분리 및 임상 시료의 높은 처리량 검사를 허용하도록 필요한 . 여기서는 구체적으로 타겟팅하고 LMWP을 풍부하게하기 위해 mesoporous 실리카 칩을 기반으로 빠르고, 효율적이고 신뢰성있는 멀티 분획화 시스템을 제시한다. nanoscale에서 조정할 수있는 기능과 10,11 Mesoporous 실리카 (MPS) 박막이 트리 블록 공중 합체 템플릿 경로를 사용하여 조작했다 . 전구체 용액에서 다른 폴리머 템플릿과 폴리머 농도를 사용하여 다양한 기공 크기 배포판, 기공 구조, 연결 및 표면 특성 결정과 낮은 대량 단백질의 선택적 복구를 위해 적용되었다. 다른 서브 클래스로 풍부한 펩티드의 선택적 파싱들은 물리 특성에 따른 것이다 EN복구 및 낮은 풍부한 수종의 탐지의 효율성을 hance. 질량 분광법과 통계 분석과 함께, 우리는 mesoporous 실리카 박막의 nanophase 특성과 낮은 대량 프로테옴의 수확의 특이성과 효능 간의 상관 관계를 보여주었다. 결과는 여기에서 복잡한 생물 학적 체액에서 LMWP의 수확을위한 기존의 방법에 대한 강력한 대안을 제공하기 위해 나노 기반 기술의 잠재력을 공개 발표. 재료의 속성을 조정할 수있는 능력, 저비용 생산을위한 능력 때문에, 샘플 수집 및 분석을위한 획기적으로 줄일 샘플 요구 사항의 단순 성과 급속,이 소설 나노기술은 크게 proteomic biomarker 연구 및 임상 proteomic 분야에 영향을 미칠 것이다 평가.

우리는 인간의 혈청에서 낮은 분자량의 단백질과 펩티드의 선택적 회수를위한 mesoporous 실리카 박막을 기반으로 기술을 개발했습니다. 우리 mesoporous 칩 physico - 화학적 성질은 잘게 펩타이드 강화에 실질적인 컨트롤을 제공하며, 결과적으로 진단을 위해 혈청 프로테옴을 프로파일하기 위해 조정되었습니다.

Biomarker 디스커버리를위한 Mesoporous 실리카 박막의 낮은 분자량의 단백질 농축

혈중 바이오마커의 식별은 조기 진단 및 예후를 위한 비침습적 접근 방식뿐만 아니라, ...를 위해서도 매우 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

본 실험 절차의 전반적인 목표는 인간 혈청으로부터 저분자 단백질과 펩타이드를 선택적으로 회수하기 위한 메조다공성 실리카 박막 기반의 기술을 개발하는 것입니다. 이를 위해 먼저 메조다공성 실리카 박막 칩을 제작하고 산소 플라즈마 애싱(ashing)으로 전처리합니다. 두 번째 단계로 혈청에 간단한 전처리를 수행한 후, 칩 상의 분획화를 통해 혈청 내의 저분자 단백질과 펩타이드를 농축합니다.칩에서 저분자량 단백질과 펩타이드를 용출시킨 후, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간형 질량 분석법을 이용하여 분자 프로파일링을 수행합니다. 마지막 단계로 전문 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 실시합니다. 최종적으로, 질량 분석 스펙트럼과 통계 분석 결과는 저분자량 프로테옴 수집의 특이성과 효율성을 보여줍니다.이 기술의 주요 장점은 2D-PAGE나 Western blot과 같은 기존 기술과 비교하여, 혈청 내 저농도의 저분자량 단백질 및 펩타이드를 농축하는 강력한 능력, 높은 처리량과 시간 효율성, 혈청 시료 요구량의 감소 및 저렴한 비용 등이 있습니다. 이 과정에서 가장 까다로운 측면 중 하나는 공극 크기 분포, 공극 모양 및 공극 간 연결성과 같은 나노공망의 형태를 제어하는 것입니다. 이러한 특징들이 표적 혈액 시그니처 프로파일링의 민감도와 특이도를 결정하기 때문입니다.실험의 정확성을 보장하기 위해, 시작 물질의 모델 비율을 세심하게 제어하고 칩 코팅 용액 제조 지침을 정확히 따르는 것을 목표로 합니다. 먼저 가수분해된 실리케이트 전구체 용액을 제조합니다. 강하게 교반하면서 14 mL의 teos를 17 mL의 200 proof 에탄올, 6.5 mL의 탈이온수 및 0.5 mL의 6 M 염산과 혼합합니다.강하게 계속 교반하면서 생성된 용액을 80 °C에서 2시간 동안 가열합니다. 다음으로, 선택한 고분자 용액을 실온에서 10 mL의 에탄올에 넣고 격렬하게 교반하여 트리블록 공중합체 용액을 준비합니다. 본 시연에서는 onic F1 27이 사용되었습니다.이 삼블록 공중합체에 실리케이트 용액을 첨가하여 혼합물을 완성한 후, 실온에서 2시간 동안 강하게 교반합니다. 결과물인 코팅 용액 1 mL를 4인치 실리콘 웨이퍼에 1,500 RPM의 속도로 20초 동안 스핀 코팅합니다. 다음으로, 웨이퍼를 80 °C에서 12시간 동안 가열합니다.그런 다음 425 °C에 도달할 때까지 분당 1 °C씩 온도를 높이고, 이 온도에서 5시간 동안 베이킹합니다. 다음으로, 생성된 메조다공성 실리카 또는 MPS 칩 표면을 산소 플라스마 애싱으로 전처리합니다. 그 후, 옥소미터를 사용하여 박막 두께와 기공률을 측정합니다.한편, 각 혈청 샘플에 최종 농도가 0.01%가 되도록 트리플루오로초산(trifluoroacetic acid)을 첨가하고, 최종 농도가 5%가 되도록 아세토니트릴(acetonitrile)을 첨가합니다. 그 후, 칩을 오븐에서 160 °C로 하룻밤 동안 사전 베이킹한 다음, 이 샘플들을 테이블 볼텍스 쉐이커(table vortex shaker)를 사용하여 실온에서 30분 동안 흔들어 줍니다. 압축 공기를 사용하여 칩 표면에 있을 수 있는 입자들을 제거합니다. 커버슬립을 100% ethanol로 세척하여 NPS 칩 표면에 배치함으로써 샘플 웰(well)을 생성합니다.포셉으로 커버슬립을 눌러 칩과 완전히 밀봉되었는지 확인합니다. 다음으로, 각 웰에 10 µL의 혈청 샘플을 피펫으로 분주합니다. 저분자량 단백질이 기공으로 들어갈 수 있도록 습윤 챔버 내 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 웰에서 혈청을 흡입하여 제거합니다.그런 다음 각 웰에 탈이온수를 10 µL씩 피펫팅하여 크기가 큰 단백질들을 씻어냅니다. 한 번에 1~2개의 웰씩만 작업하며 이 세척 과정을 4회 반복합니다. 증발을 방지하기 위해 각 샘플에 용출 버퍼 5 µL를 빠르게 첨가합니다.피펫 팁을 웰 내에서 움직이며 30회 정도 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 혼합 후, 용출 버퍼를 모두 흡입하여 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 분석(matrix assisted laser desorption ionization time of flight analysis)을 수행할 때까지 마이크로 원심분리 튜브에 보관합니다. MALDI-TOF 분석을 위해 시료 0.5 µL를 MALDI 타겟 플레이트에 점적하고 건조시킵니다. 그다지 0.1% TFA가 포함된 50% acetonitrile 매트릭스 0.5 µL를 점적하고 공결정화(co crystallize)되도록 둡니다. 이어서 캘리브레이션 용액 0.5 µL를 캘리브레이션 지점에 점적합니다. 완전히 건조되면 타겟 플레이트를 MALDI-TOF 질량 분석기에 삽입합니다.장비는 레이저 강도 4, 샘플당 203,000 shot의 양성 리플렉터 모드로 설정해야 합니다. 먼저, 표적 질량을 2,000 Daltons으로 설정하고 선택 질량 범위를 800에서 5,000 Daltons으로 지정하여 분석을 수행합니다. 그 다음, 동일한 MALDI TOF 분석을 리니어 모드에서 수행하되, 질량 범위를 900에서 10,000 Daltons 또는 3,000에서 70,000 Daltons으로 변경하고 표적 질량은 5,000 Daltons으로 설정합니다.multi top 분석 프로세스 이후, convert peak list 소프트웨어를 사용하여 원시 스펙트럼을 처리한 다음 specal로 내보냅니다. 전처리를 위해 Align 소프트웨어를 사용하여 고속 푸리에 변환 또는 P-A-F-F-T 상관법을 통한 피크 정렬로 모든 스펙트럼을 정렬하고, 강도를 총 이온 전류(total ion current)로 정규화합니다. 높이 비율 2와 질량 윈도우의 0.3% 설정을 적용하여 피크 검출을 수행합니다.분석 전 베이스라인을 보정하고 음수 값을 제거하십시오. T 2D 파일을 마커 뷰(marker view)로 가져오는 것은 서로 다른 그룹의 MALDI 데이터를 지도 학습 방식으로 처리하기 위한 첫 번째 단계입니다. 먼저 마커 뷰 소프트웨어를 실행한 후, T 2D 파일을 가져오십시오.T 2D 파일이 포함된 폴더를 선택하고 스펙트럼 분석을 위한 파라미터를 설정하십시오. 다음으로 샘플 테이블을 엽니다. 동일한 그룹의 샘플들을 하이라이트하고 그룹 라벨을 지정하십시오.총 면적 합계를 사용하여 샘플을 표준화하십시오. 그런 다음 옵션 창을 엽니다. 각 그룹에 대해 고유한 색상과 기호를 설정하십시오.그 후, PC1 및 PC2 점수에 의해 활성 데이터 샘플이 서로 다른 그룹으로 나뉘는 것에 대해 주성분 분석(PCA)과 T-검정을 수행합니다. 선택된 피크의 프로필 플롯을 클릭하여 선택된 바이오마커의 강도 프로파일 요약을 보여주는 PC 로딩 플롯에 따라 바이오마커 후보를 찾을 수 있습니다. 값이 더 큰 지점들이 서로 다른 그룹을 구분할 수 있습니다.T-검정으로 그룹 간 비교를 수행한 후, 표를 P 값의 오름차순으로 정렬하여 다양한 그룹을 구분할 수 있는 피크를 결정합니다. 여기에 제시된 것은 900에서 10,000 Daltons 범위의 펩타이드와 3000에서 70,000 Daltons 범위의 단백질에 대한 혈청 시료의 MS 스펙트라입니다. 전처리하지 않은 시료의 스펙트라는 알부민과 같이 이온화가 잘 되고 함량이 높은 고분자량 단백질의 존재로 인해 저분자량 영역에서 신호 억제가 일어남을 보여줍니다. MPS 박막을 통해 분획한 후에는 대부분의 거대 분자가 제거되어 저분자량 성분이 상당히 농축되었습니다. 대조군으로서 동일한 혈청 시료를 비다공성 순수 실리카 표면에 적용하였습니다.저분자량 프로테옴 회수에 대한 MPS 박막의 특이성을 평가한 결과, 비다공성 실리카에서는 펩타이드나 단백질의 유의미한 수집이 일어나지 않았습니다. 따라서 LMWP 농축의 지배적인 요인은 실리카 표면의 친화력이 아니라 메조다공성 구조라는 결론을 내릴 수 있습니다. 소수성 블록 길이가 서로 다른 공중합체를 사용함으로써 기공 크기를 정밀하게 제어하여 변화시킬 수 있습니다.소수성 및 친수성 성분의 부피 비율이 서로 다른 네 가지 이온성 계면활성제로 제조된 MPS 박막을 사용하여, 기공 크기가 저분자(LMW) 펩타이드 및 단백질 회수 효율에 미치는 영향을 조사하였습니다. 여기에서 MALDI 스펙트럼의 확대된 뷰는 각 MPS 칩의 기공 크기와 상관관계가 있는 특성 분자 컷오프를 보여줍니다. 기공 크기의 범위에 따라 크기 및 형태 배제 원리를 통해 동일한 혈청 시료로부터 서로 다른 종류의 펩타이드와 단백질이 회수되었습니다.이는 서로 다른 칩 간의 펩타이드 혼합물 특성에 대한 이원 계층적 군집 분석에서도 관찰할 수 있습니다. 빨간색 또는 노란색의 강도는 상대적인 펩타이드 농도를 나타냅니다. 기공이 클수록 더 큰 펩타이드의 수집이 향상되었으며, 작은 펩타이드는 기공이 작은 칩에서 우선적으로 회수되었습니다.전구체 용액 내의 폴리머 구성을 조정함으로써, 유사한 기공 크기 분포를 갖는 onic F1 27과 같은 고분자량 트라이블록 공중합체를 이용해 형성된 다양한 MPS 박막 주기적 나노구조를 얻을 수 있습니다. 3D 큐빅 및 허니콤 헥사고날 나노구조는 더 바람직한 나노기공 상호연결성과 더 접근 가능한 나노기공 형태를 보유하고 있습니다. 그 결과, 이러한 구조는 2D 헥사고날 구조보다 LMW 펩타이드를 선택적으로 농축하는 데 있어 더 우수한 성능을 나타냅니다.이는 이들이 유사한 공극 크기 분포와 혈청 분획을 위한 동일한 분자 컷오프를 공유함에도 불구하고 마찬가지입니다. MPS 칩 상의 Organy lane 접합은 칩 표면을 전처리하기 위해 산소 플라즈마 애싱을 도입함으로써 효율화되었습니다. 이 그림은 기능화된 칩에서 선택적으로 캡처된 펩타이드 검출의 MS 강도를 막대 그래프로 나타내어, 서로 다른 표면 기능을 가진 칩의 전하 특이적 회수율을 보여줍니다.고분자량 단백질의 제거와 더불어, 펩타이드는 등전점에 따라 pH 7.0에서 양전하 또는 음전하를 띱니다. 결과는 NPS의 구조적 설계와 화학적 기능화가 펩타이드 농축의 특이성을 더욱 증가시켰음을 보여줍니다. 이러한 발전을 통해.우리는 이 기술이 단백질체학 분야의 연구자들이 인간 및 동물 모델의 체액에서 조기 진단 또는 치료 평가를 위한 새로운 바이오마커를 탐색하는 길을 열어줄 것으로 기대합니다. 결과적으로, 이는 주요 질병에 대한 정밀 맞춤형 치료를 가능하게 할 것입니다.

low-molecular-weight-protein-enrichment-on-mesoporous-silica-thin

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 동영상에서는 SEC(Size-Exclusion Chromatography) 및 MALS(Multi-angle Light Scattering)의 기능을 활용하는 SEC-MALS에 대해 설명합니다. SEC-MALS에서 SEC는 크기에 따라 단백질 또는 단백질 복합체를 분리하고, MALS 검출기는 분자에 의해 산란되는 빛의 강도를 다양한 각도에서 측정하여 평균 분자량을 결정합니다.

단백질 올리고머를 위한 Multi-Angle Light Scattering을 사용한 크기 배제 크로마토그래피

제작의 새로운 핀 인쇄 방법을 사용하여 졸 - 겔 파생 된 단백질을 첨가 마이크로 어레이를 개발하는 안내 자료를 심사 방식이 설명되어 있습니다. 이 방법은 비용 효율적인 작은 분자 검사에 사용되는 아세틸 콜린과 multikinase 마이크로 어레이의 개발을 통해 설명된다.

양 졸 - 겔 파생 된 단백질 마이크로 어레이 개발을위한 안내 자료 심사 방식

몇몇 병리학적 바이오마커는 생물학적 유체의 농도가 낮고, 분해 효소가 존재하며, 다량의 고분자량 단백질이 있기 때문에 현재 기술로는 쉽게 검출할 수 없습니다. 화학적으로 기능화된 하이드로겔 나노입자는 저농도 단백질을 수확, 보존 및 농축할 수 있어 이전에는 검출할 수 없었던 바이오마커를 검출할 수 있습니다.

낮은 풍부 단백질을 검출하기위한 플라즈마 또는 소변의 하이드로 겔 나노 입자 수확

높은 표면적의 미세 다공성 배위 폴리머로 내부적으로 코팅된 거대 다공성 고분자 모놀리식으로 구성된 다공성 하이브리드 분리 매체의 준비 절차가 제시됩니다.

포스 포의 향상된 농축을위한 거대 다공성 고분자 모노리스에 다공성 조정 폴리머 코팅의 제조

이 프로토콜은 조직 또는 종양에서 ECM 단백질을 농축하고 ECM이 풍부한 제제를 펩타이드로 탈당화 및 분해하여 질량 분석법으로 단백질 구성을 분석하는 절차를 설명합니다.

질량 분석기 분석을위한 펩티드로 조직과 소화에서 세포 외 기질 단백질의 농축

구 균 에서 탄수화물 기질 의무적인 단백질의 광범위 한 생 화 학적 및 구조 특성화를 수행 하기 위한 효율적인된 프로토콜 제공 됩니다.

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

여기, 우리는 bioinspired 실리 카 재료를 합성 하 고 거기에 효소를 무력화 하는 프로토콜을 제시. 실리 카는 규 산 나트륨 및 '첨가제'는 아민 제어 속도로 중화 결합 하 여 합성 됩니다. 제자리에서 효소 동원 정지 또는 캡슐화 된 첨가제의 합성 후 산 차입 하 여 물성 및 기능을 변경할 수 있습니다.

Bioinspired 메서드를 사용 하 여 기능성 실리 카의 준비

여기, 우리는 높은 처리량 프로토콜 화면 extracellular 단백질 microarrays 소설 수용 체 ligand 상호 작용의 식별을 제시. 우리는 또한 단백질 microbead 복합물을 사용 하 여 일시적인 단백질-단백질 상호 작용의 탐지를 강화 하는 방법을 설명 합니다.

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

이 프로토콜은 용액에서 단백질과 복합체의 절대 특성화를 위한 다각형 광 산란(SEC-MALS)과 크기 배제 크로마토그래피의 조합을 설명합니다. SEC-MALS는 순수 단백질, 토착 올리고머, 이종 복합체 및 당단백질과 같은 변형 된 단백질의 분자량과 크기를 결정합니다.

다각형 광 산란에 결합된 크기 배제 크로마토그래피에 의한 단백질의 특성 (SEC-MALS)

이 프로토콜은 간단한 실험실 규모의 벤치탑 설정으로 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포의 작은 세포외 소포(hUC-MSC-sEV)를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 hUC-MSC-sEV의 크기 분포, 단백질 농도, sEV 마커 및 형태는 각각 나노입자 추적 분석, BCA 단백질 분석, 웨스턴 블롯 및 투과 전자 현미경으로 특성화됩니다.

인간 중간엽 줄기세포에서 작은 세포외 소포를 분리하는 간단한 탁상형 여과 방법

여기에서는 식수 내 오염 입자를 효율적으로 포집하고 분석하기 위해 광학적으로 투명하고 평평한 기판을 보여주는 프로토콜을 제시합니다. 여기에 제시된 것은 실리콘 나노멤브레인 분석 파이프라인(SNAP)입니다: 액체 매체에서 입자의 포집, 정량화 및 식별을 위한 유연한 파이프라인입니다.

실리콘 나노멤브레인 분석 파이프라인을 사용한 식수 내 미세 플라스틱의 멀티모달 분석

배우세요 메조포러스 실리카 박막을 이용한 저분자량 단백질 농축 기술로 혈청 프로테오믹스 프로파일링을 개선하는 방법입니다. 이 기술은 바이오마커 발견 및 진단 능력 향상에 활용됩니다.

Biomarker 디스커버리를위한 Mesoporous 실리카 박막의 낮은 분자량의 단백질 농축

더 많은 동영상 탐색