낮은 친화력 세포 수용체 - 리간드 상호 작용의 확장 가능한 감지를위한 욕망 기반의 세포 상호 작용 검사 (AVEXIS)

이 절차의 전반적인 목표는 세포 인식 과정, 특히 막 내장 수용체 단백질과 관련된 새로운 세포 외 단백질 상호 작용을 발견하는 것입니다. AveXis 접근법은 이러한 종류의 단백질 상호작용을 대표하는 매우 약한 상호작용 친화성과 막 단백질이 생화학적으로 조작하기 어렵다는 사실을 우회하도록 설계되었습니다. 이것은 먼저 세포 표면 수용체의 세포 외 영역의 재조합 단백질 라이브러리를 컴파일함으로써 달성됩니다.

이는 수용체의 ecto domain 영역을 monomeric biotinylated baits 및 pentamer enzyme tagged praise와 같은 용해성 단편으로 생성하도록 발현 플라스미드를 설계함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 상호 작용 스크리닝을 위해 준비하기 위해 단백질을 발현하고 정규화하는 것입니다. 모든 단백질은 포유류 세포에서 생산되어 diss, sulfide, bonds 및 glycosylation과 같은 번역 후 변형이 추가되도록 합니다.

프로토콜의 중요한 단계는 라이브러리 내의 미끼 및 먹이 단백질이 모두 임계값 수준 내로 정규화되도록 하는 것입니다. 다음은 새로운 상호 작용을 선별하는 흥미로운 부분입니다. Bates는 마이크로 플레이트의 개별 웰에 배열된 다음 Praise를 사용하여 상호 작용을 조사합니다.

그런 다음 세척 단계가 수행됩니다. 마지막 단계는 효소의 기질을 추가하여 미끼 단백질 배열에서 포착된 칭찬을 감지하는 것입니다. 궁극적으로 VEX 스크리닝의 결과는 어떤 세포 서퍼 수용체가 결합 파트너를 형성할 수 있는지 보여줄 수 있으므로 세포 간의 인식 및 통신 과정에 관여할 수 있습니다.

효모 두 가지 하이브리드 또는 생화학적 정제와 같은 인기 있는 단백질 추출 방법의 이 기술의 주요 장점은 세포 외 단백질 상호 작용을 감지하도록 특별히 설계되었다는 것입니다. 특히 막에 묶인 수용체 단백질 간의 새로운 상호 작용을 발견하는 데 적합합니다. 이러한 상호 작용은 막 단백질은 생화학적으로 조작하기 어렵고 일반적으로 반수용체 상호 작용이 매우 약하기 때문에 다른 기술을 사용하여 감지하기 어렵습니다.

이 방법은 세포가 서로를 인식하고 소통하는 방법과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 분자 수준에서는 난자와 정자 표면에 표시되는 수용체 단백질이 서로 결합하거나 수용체 리간드 상호 작용이 근세포 융합 또는 신경능선 형성과 같은 세포 행동을 담당하는 것과 같은 기본적인 생물학적 과정과 관련된 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 이 접근법의 주요 과제는 상호작용을 스크리닝할 수 있는 미끼와 기도 단백질 라이브러리를 컴파일하는 것입니다.

또한 미끼 및 먹이 단백질이 분석에 필요한 임계값 수준 내에서 정규화되었는지 확인하는 것도 매우 중요합니다. 이렇게 하면 거짓 부정 및 거짓 긍정 빈도가 줄어듭니다. 이 방법에 대한 아이디어는 박사 과정 시절 CD 200 세포 표면 단백질에 대한 결합 파트너를 식별하려고 할 때 처음 떠올랐습니다.

본질적으로, 저는 이 특정 세포 표면 수용체의 결합 패턴이 무엇인지에 대한 질문을 하고 있었습니다. 오늘날에도? 이것은 그 당시에는 기술적으로 대답하기 어려운 질문으로 남아 있었지만, 인간 게놈은 거의 완성 단계에 있었고 저는 이제 게놈의 모든 세포 표면 수용체에 대한 완전한 목록을 가지고 있기 때문에 기술적으로 상호 작용할 수 있는 수용체 단백질 세트 내에서 질문할 수 있다는 것을 깨달았습니다.

이것은 훨씬 더 쉽게 대답할 수 있는 질문이며, AveXis는 우리가 이 질문에 답하기 위해 개발한 방법이었습니다. 미끼 및 사전 발현 벡터의 라이브러리가 설정되면, HEC 2 9 3 E 세포로 형질 주입 전날 세포를 50 밀리리터의 자유형 2 9 3 배지에서 밀리리터당 250, 000 세포의 밀도로 시딩하여 효율적인 비오틴 엘레이션을 보장하기 위해 세포를 형질 주입할 준비를 합니다. 먹이 단백질이 아닌 미끼 단백질을 생산하는 데 사용되는 배지를 모든 플레이트가 준비된 d 비오틴으로 보충하고 표준 조건에서 밤새 세포를 배양합니다.

비오틴은 용해도가 낮고 용액이 정확하기 때문에 추가 비오틴의 무게를 측정한 다음 배지에 첨가하고 다음 날 격렬하게 흔드는 것을 선호합니다. 50ml의 배양된 세포를 25마이크로그램의 미끼 또는 먹이 플라스미드로 transfection하여 적절한 transfection 시약을 사용하여 biotinylated baits cot transfection을 생성합니다. 미끼는 수확당 ELI 단백질 비오틴 리가제의 분비된 형태를 인코딩하는 플라스미드를 사용하여 10:1 비율로 구성합니다.

배양은 형질 주입 5일 후 먼저 3000배 중력에서 20분 동안 원심분리하여 세포를 창백하게 하고 두 번째로 0.22 미크론 필터를 통해 S 상층액을 여과합니다. AveXis의 주요 특징 중 하나는 재조합 단백질이 분비되기 때문에 역치 활성 내로 희석되거나 농축될 수 있다는 것입니다. 우리는 재조합 단백질이 최대 4자릿수까지 다양한 발현을 갖는다는 것을 발견했기 때문에 정규화 단계는 스크리닝 단계에서 위양성의 발생을 줄입니다.

미끼의 정상화를 시작하려면 투석을 통해 비오틴화된 미끼 단백질을 사용하여 결합 부위에 결합하기 위해 경쟁하기 때문에 투석을 통해 배지에서 미끼를 제거해야 합니다. 재조합 단백질의 효과적인 투석을 보장하기 위해 당사는 투석 튜브에 과도한 표면적을 제공하는 것이 중요하다는 것을 발견했습니다. 일반적으로 당사는 투석되는 양에 실제로 필요한 것보다 2-3배 더 많은 튜브를 제공합니다.

24시간 동안 투석 후 PBS와 같은 적절한 완충액에 대해 미끼를 광범위하게 투석했습니다. ELIZA는 BSA가 포함된 PBST로 연쇄상구균으로 인코딩된 마이크로 플레이트의 웰을 15분 동안 차단하는 것으로 시작합니다. 그 사이에, 청결한 판에 2%BSA를 가진 PBST에 있는 미끼 단백질의 4개의 1개에서 3개의 희석의 시리즈를 만드십시오.

15분 배양 후, 희석액을 연쇄상구균 TTR 인코딩 플레이트로 옮기고 1시간 후 실온에서 1시간 동안 플레이트를 배양하고 웰을 세척한 다음 각각에 OX 68 밀리리터당 2마이크로그램의 100마이크로리터를 추가합니다. 플레이트를 실온에서 한 시간 더 배양합니다. 두 번째 배양 후 다른 세척 시리즈를 수행하고 플레이트에 항미 알칼리성 인산가수분해효소를 로드합니다.

접시를 실온에서 세 번째 시간 동안 배양합니다. 이제 PBST에서 플레이트를 세 번 세척하고 최종 세척 PBS를 수행합니다. 잔류 세제를 제거하려면 한 시간 후에 디 에탄올 아민 버퍼에 밀리리터 기질 1 0 4 밀리그램 100 마이크로 리터를 첨가하십시오.

실온에서 4 0 5 나노미터의 흡광도를 측정하고, anti CD 4 tag monoclonal antibody를 사용하여 Eliza에 의해 4가지 다른 투석 미끼 supinate의 희석 시리즈를 검출했습니다. 희석되지 않은 특급 미끼 단백질이 연쇄상구균 avid ENC 코팅 플레이트의 모든 비오틴 결합 부위를 포화시키기에 충분하지 않은 경우, Viva 스핀 농축기를 사용하여 단백질을 농축합니다. 그렇지 않으면 2% BSA가 포함된 PBST에서 희석된 농도의 미끼 단백질을 사용하십시오.

이는 분석의 비오틴 결합 부위를 포화시키기에 충분합니다. beta lactamase 효소 활성을 사용하여 pre 단백질이 발현되는 상대적 수준을 정량화합니다. PBST 2%BSA 완충액에 파라단백질을 함유한 supinate의 희석 시리즈를 만드는 것으로 시작합니다.

그런 다음 플레이트에 적재된 60마이크로리터의 아질소 스테핀 용액에 20마이크로리터의 희석액을 추가합니다. 즉시 플레이트를 플레이트 리더로 옮기고 원심 농축기 또는 2% BSA로 희석 PBST를 사용하여 다음 20분 동안 1분에 한 번씩 4-85나노미터의 흡광도를 측정합니다. 샘플의 최종 농도를 설정하여 약 7분 내에 분석의 모든 니트로를 가수분해하며, 이는 분당 약 2ol 니트로 회전율입니다.

PBST에서 연쇄상구균 TAVR ENC 코팅 플레이트를 세척하고 종이 타월로 플레이트를 두드려 건조시켜 AveXis 스크린을 시작합니다. 다음으로, 각 웰에 BSA가 포함된 PBST를 추가하고 플레이트를 30분 동안 배양합니다. 이것은 스퓨리어스 단백질 결합 부위를 차단합니다.

각 웰 내에서 싱크대 위의 플레이트를 스마트하게 튕겨 차단 용액을 제거하고 100마이크로리터 정규화 비오틴화 단량체 미끼를 적절한 웰에 추가합니다. 실온에서 한 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 한 번 더 튕겨 플레이트에서 미끼 샘플을 제거하고 PBST로 세 번 씻어냅니다.

그런 다음 세 번째 세탁 후 두드리다 건조시킵니다. 이제 정규화된 펜타머 먹이 구조체 100마이크로리터를 각 웰에 추가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 한 시간 후 PBST로 플레이트를 세 번 더 세척하고 PBS로만 마지막으로 세척합니다.

마지막으로, 60 마이크로리터의 아질로 7 용액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양하거나, 바람직하게는 4도 SIU에서 16시간 동안 플레이트를 배양합니다. 다음 날, 긍정적인 상호 작용은 빨간색으로 바뀔 것입니다. 시각적 기록을 위해 플레이트의 사진을 찍은 다음 플레이트 리더를 사용하여 4-85 나노미터의 흡광도에서 반응을 정량화합니다.

AveXis 스크리닝 반응이 시작된 후 약 10분 후, 항체 매개 피식자 포획 대조군과 양성 대조군 상호 작용 모두에서 노란색에서 빨간색으로의 변화가 관찰되었습니다. 이 색상 변화는 기질에서 아질로의 가수 분해를 나타냅니다. 이 시간 척도에서 일부 긍정적인 상호 작용을 관찰할 수 있지만 대부분은 나타나는 데 몇 시간이 걸렸습니다.

일반적으로 약 0.4에서 0.6%의 적중률이 관찰되었습니다. 단백질 라이브러리가 준비되면 이 기술의 스크리닝 부분을 신속하게 수행할 수 있습니다. 상호 작용을 식별한 후 하루에 최대 12개의 플레이트를 스크리닝하는 것이 가능합니다.

가장 중요한 다음 단계는 먼저 새로운 독립적인 단백질 제제를 사용하여 상호 작용을 반복할 수 있음을 보여주는 것입니다. 둘째, 우리는 항상 상호 작용이 미끼 먹이 방향과 독립적인지, 즉 상호 작용할 수 있는지 여부를 결정합니다. 여기에는 미끼 벡터 도메인을 먹이 벡터로 복제하거나 그 반대로 복제하는 것이 포함됩니다.

반복되고 보답될 수 있는 상호 작용은 높은 신뢰도로 간주되며 항상 긍정적인 것으로 나타났습니다. 표면 플라즈마 공명(surface plasma resonance)과 같은 다른 기술을 사용하여 우리는 공명(resonance)의 표면 플라즈마(surface plasma in resonance)를 사용하여 우리가 재식별하는 모든 상호 작용을 추가로 검증하는 것을 좋아합니다. 중요한 것은 이는 두 개의 정제된 성분이 직접 상호 작용할 수 있음을 입증하고 결합이 앉아 있으므로 특이적임을 보여주는 데 사용할 수도