Name: Polyanhydride의 Nanoparticles에 의해 유도된 Murine Macrophages 폐포 수확 및 평가 세포 활성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 학습하세요 murine 폐포 대식세포 수확 및 폴리앤하이드라이드 나노입자에 의한 세포 활성화 평가 방법을. 면역학 및 나노기술 연구에 활용할 수 있는 이 프로토콜은 유세포 분석 기술을 포함합니다.

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저자를 위해 아이오와 주립 대학 유동세포계측법 시설에서 재정 지원과 박사 션 Rigby 위해 미군 의료 연구 및 Materiel 명령 (부여 번호 W81XWH-09-1-0386 및 W81XWH-10-1-0806)에 감사드립니다 그의 전문 기술 지원.

1. 폐 세척을 사용하여 마우스에서 폐포 Macrophages을 (AMɸ) 수확 <ol><li> 이러한 실험 복, 일회용 장갑, 적절한 눈 보호 등 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오. </li><li> 수확 개시 전에 전체 AMɸ (cAMɸ) 매체를 준비합니다. 페니실린 / 스트렙토 마이신 Dulbelcco의 수정일 독수리 중간 (DMEM)의 222.25 ML에 (펜 / strep) 솔루션, β-메르 캅 토 에탄올 250 μL (2 - 메르 캅 토 에탄올) 및 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS)의 25 ML 2.5 ML을 추가합니다. 진공 하에서 0.2 μm의 기공 크기의 병 최고의 필터를 사용 cAMɸ 매체를 필터 - 소독. </li><li> euthanization 챔버의 CO 2 질식하여 건강한 마우스를 안락사. C57BL / 6 마​​우스 (6-8주 오래된)는이 프로젝트의 목적으로 사용되었지만,이 폐 세척 기술은 마우스의 어떤 변형을 수행할 수 있습니다. 압축 가스 실린더를 사용하여 채널에 마우스를 배치하기 전에 1 분 동안 챔버로 가스 흘러가게챔버가 완전히 CO 2로 기소되어 있는지 확신하기 위해 호박. 마우스를 안락사시키려는 적어도 한 분만 챔버에서 마우스를 놓으십시오. 또한, 1.4에서 설명한대로 마우스 사망을 확인하는 물리적인 방법으로 심장 주사를 통해 각 마우스를 ...에게서 피를 뽑다. </li><li> 그 뒤로 (지느러미 쪽), 70 % 에탄올로 스프레이에 마우스를 쌓고, 흉골을 찾아, 복부에서 30도 각도로, 흉강으로 50mm에 대해 23 게이지 바늘 (1 ML의 주사기에 부착된)를 삽입 . 바늘의 적절한 배치와 함께, 그것은 마우스의 크기에 따라 혈액의 1-0.4 사이 ML를 수집할 수 있어야한다. 생체 신호의 정지를위한 동물을 검사합니다. </li><li> 그것이 그 복부 (복부 측면)에 거짓말을하고 있도록 실험실 벤치에서 플레이스 마우스. 작업 환경을 소독하기 위해 70 %의 에탄올과 스프레이 마우스. 거의 반쯤 마우스 척추 아래 피부를 꼬집어. 70 % 에탄올로 소독되어 해부 가위를 사용하여 피부를 통해 작은 절개를합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 절개의 양쪽 피부를 잡고 마우스 두개골 - 꼬리 축을 따라 반대 방향으로 피부를 당기십시오. 제대로하면 피부가 기본 시체에서 제거됩니다. </li><li> 마우스의 목은 이제 노출된 근육과 땀샘을 표시해야합니다. 그거 조심해서 조직을 잘라내어함으로써 마우스 후두, 기관 및 식도를 노출, 집게를 사용하여 마우스의 앞부분으로 그것을 당기십시오. 경정맥 정맥 또는 경동맥을 절단하지 마십시오. </li><li> 호흡 관은 이제 볼 수 있으며 주변의 연골 고리와 조직 등 식별할 수있다. 정교한 포셉 함께 호흡 관을 보유하고 부드럽게 리프트와 지느러미 측면에있는 식도에서 호흡 관을 분리. </li><li> 하나가기도하지만, 후두의 뒷부분을 보유한 곳으로 작은 절개의 앞부분을 만듭니다. 절개는 약 45 ° 정도의 각도로하여야한다. 또한, 완전히 이것으로 retracting에서 차단하므로 호흡 관을 가로로 쪼개다 없습니다바디 캐비티. </li><li> 기도의 루멘에 카테터를 삽입하기 위해 준비 멸균 PBS와 톰 고양이 카테터를 들으며 한 CC의 주사기를 채우십시오. 집게를 사용하여기도를 잡고 손으로 통제를 증가시키고 부드럽게 tracheal 절개 사이트에 삽입하기 위해 가까운 끝에 카테터를 개최. 부드럽게 20mm에 대해 기관에 카테터를 삽입합니다. 다른 손을 자유롭게, 카테터 튜브 주위 기관 잡아. </li><li> 카테터를 들으며 1 ML의 주사기를 사용하여 부드럽게 폐로 실내 온도, 멸균 PBS의 0.75 ML을 불어 넣다 후 부드럽게 PBS에 다시 주사기로를 기음. 외부 가슴을 마사지하는 동안이 과정을 세 번 반복합니다. 카테터에서 주사기를 분리하고 15 ML의 원심 관에 세척 유체 분배. 신선한 PBS의 0.75 ML로 주사기를 작성하고 카테터에 주사기를 다시 연결 후, 각각의 마우스에 대해 두 번 단계 1.9 1.10를 반복합니다. 유체 복구 덜 조종 이상을 획득, 부분 수lume는 풍의. 하나 이상의 마우스 세포를 수집하는 경우 모든 폐 lavages이 수행될 때까지, 얼음에 수확 세포와 함께 15 ML 튜브를 넣습니다. </li></ol> 2. 폐 세척 AMɸ 수확 가공 <ol><li> 4에 10 분 ° C. 250 X g에서 폐 세척 액체를 원심 분리기 </li><li> biosafety 캐비닛 내부의 적절한 폐기물 용기에 무균 기술, 가만히 따르다 뜨는 사용하기. 부드럽게 테스트 튜브 랙 상단에 걸쳐 원심 튜브를 긁어하여 세포 펠렛을 Resuspend. 세포를 resuspend하는 cAMɸ 매체의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 카운터 유리병에 Isoton II 희석제의 10 ML로 세포의 20 μL를 pipetting하여 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 입자 카운터 Z1을 사용하여 세포를 열거합니다. , 유리병으로 보내겠-oglobin II lytic 시약을 3-4 방울을 추가 부드럽게 반전 3-4 회 후 세포 농도를 얻기 위해 카운터로 샘플 병을로드합니다. 를 표시하는 2 × 10 4 희석 요인으로 카운터를 프로그래밍하십시오ML 당 세포의 숫자와 같은 세포 농도. </li><li> cAMɸ 매체를 사용하는 ML 당 2.5 × 10 5 세포를 희석. </li><li> 6 잘 조직 문화 요리의 각도에 2.5 × 10 5 세포 / ML 2 ML 하는걸. </li><li> 세포가 잘 하단을 준수하도록 6 H에 대한 5 % CO 2 분위기로 37 ° C humidified 인큐베이터 안에서 AMɸ, 품어 문화 요리 풍성합니다. 부드럽게 점착 성의 세포를 방해하지 않도록로 뜨는을 기음. </li><li> 비 점착 성의 세포 파편을 제거하는 무균 PBS를 (칼슘과 무료 마그네슘)를 사용하여 우물을 씻어. 각도에 cAMɸ 중간 2 ML을 추가합니다. </li><li> 각성제의 또한 이전에 5 % CO 2 분위기 37 ° C humidified 인큐베이터 안에서 하룻밤 세포를 품어. 이 농축 단계 후, 세포의 약 87%는 대식 세포 마커 CD11b 및 F4/80 (그림 2C)에 대한 긍정적입니다. </li></ol> 3. Polyanhydrid의 추가전자 Nanoparticles 및 제어 트리 트먼트 <ol><li> polyanhydride 안티 솔벤트 nanoencapsulation 15를 통해 nanoparticles를 조작. 이 과정에서는 폴리머는 메틸렌 클로라이드에 녹아있다 (4 ° C에서 25 밀리그램 / ML의 농도에서)과 pentane (1:200 비율로 메틸렌 클로라이드에서 -20 ° C : pentane)에 시켰던. </li><li> 소독을 정확하게 마이크로 그램 금액을 측정할 수있는 균형에 종이를 무게를 사용하여 polyanhydride의 nanoparticles을 달다. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 입자를 추가합니다. </li><li> 얼음 추위 cAMɸ의 nanoparticles을 Resuspend. 계산은 매체의 더 이상은 0.3 이상의 ML은 nanoparticles의 원하는 농도를 얻기 위해 각도에 추가됩니다 있도록 만들어집니다. nanoparticles 잘 문화에 추가됩니다 때까지 얼음 resuspended 입자를 유지. </li><li> 이전 AMɸ 문화 nanoparticles를 추가하기 microtip으로 벤치 최고의 sonicator를 사용하여 입자를 sonicate. 70 % 에탄올과 wipin으로 분사하여 microtip 멸균을sonication 이전 멸균 Kimwipe과 g. 얼음 튜브를 유지하면서 30-45 s에 대한 10-20 쥴로에 Sonicate. macroscopically nanoparticle 현탁액을 관찰. 입자가 충분히 분산되지 않으면 정지가 nanoparticles은 30-45 초 동안 다시 sonicating 전에 폴리머의 유리 전이 온도 이하 있도록 데는 1-2 분 동안 얼음을 설정할 수 있습니다. 이 sonication 단계의 목적은 충분히 50:50 CPTEG으로 nanoparticles를 분산하는 것입니다 : 수성 환경에 노출되면 CPH nanoparticles는 누계로 경향이 있습니다. 그러나, nanoparticles의 작은 집계는 아직 정학에 남아있을 수 있습니다. </li><li> Nanoparticle 서스펜션은 (적절히 분산) 얼음에 보관해야하며 조기 표면 침식이나 집합을 방지하기 위해 즉시 사용되지도 않습니다. </li><li> 인큐베이터에서 AMɸ과 biosafety 캐비닛의 장소를 포함하는 문화 요리를 제거합니다. 메디의 양이 떨어져 약 45도 각도와 피펫의 틸트 플레이트어 그는 nanoparticle 현탁액 (이것은 0.3 ML을 초과해서는 안)에 추가됩니다. 매체를 제거하면 자기편 세포를 방해하지 마십시오. </li><li> 와동 전에 적절한 우물에 추가로 간략히 polyanhydride의 nanoparticle 현탁액. 특정 잘 (들)로 nanoparticle 현탁액 (더 이상은 0.3 이상 ML)의 양을 피펫 있지만, 최대 피펫하지 않으며 다운 믹스합니다. 이 작업은 우물에서 AMɸ 자기편를 분리 수 있습니다. 입자는 잘 하단에 정착하고 세포를 연락 드리겠습니다. 이 보고서에 제시된 연구 내용 nanoparticles의 최종 농도 AMɸ와 공동 배양해 125 μg / ML했습니다. 후속 우물과 원하는 치료 그룹을 진행합니다. 이러한 매체에만 200 NG / ML lipopolysaccharide (LPS) 지정된 우물에 대해서 긍정적이고 부정적인 컨트롤 그룹을 포함합니다. </li><li> 37에 문화 요리를 반환 ° C 48 H에 대한 5 % CO 2 분위기 humidified 인큐베이터. 우리 laborator의 운동 연구Y는 전사하고 발생하는 단백질 합성을 위해 충분한 시간을 허용으로 셀 표면 마커의 표현과 시토킨 분비를 모두 평가를위한 최적의 문화 시대로 48 시간 증명하고있다. 크린 시토킨보다 수준이 확장된 문화 기간 (즉, 72 시간) 동안 축적하지만이 시점에서 세포 표면 마커 표현을 평가할은 크린 시토킨의 상승된 수준의 기여에 의해 실마리를 못찾고 수 있습니다. 표면 마커 표현의 변화 nanoparticles 자체로 자극에 직접적으로 기인하지 않을 수 있습니다 관찰했다. </li></ol> 4. 유동세포계측법를 사용 AMɸ 활성화 평가 <ol><li> 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS) 버퍼 (0.1 %의 나트륨 azide와 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)) 0.1에서 M 인산 이전 nanoparticles O와 공동 배양해 왔습니다 도금 macrophages 수확에 (산도 7.4) 염분 버퍼를 준비합니다R의 각성제. </li><li> 차단 버퍼와 단클론 항체의 솔루션을 작동 준비합니다. 블록 버퍼를 준비하려면, FACS 버퍼에 각각 쥐 IgG (시그마)과 anti-CD16/32 (eBioscience) 1 밀리그램 / ML 및 10 μg / ML을 희석. 제조 업체가 권장 농도 또는 사용자에게 최적화된 농도 중 하나에 FACS 버퍼의 표면 마커 항체 패널을 희석. 이 작품에서 제시된 결과를 얻으려면 표면 마커 패널 MHC II, CD86, CD40 및 CIRE (CD209)에 대한 항체로 구성되어 있습니다. 대식 세포 마커 F4/80 및 CD11b에 대한 안티 - 마우스 항체는 또한 긍정적으로 데이터 분석 중에 대식 세포 표현형을 확인하기 위해 패널에 포함되어 있습니다. 근친 마우스 종자 종종 자신의 MHC II의 haplotypes에 차이로 MHC II 분자에 대한 항체를 선택할 때주의해야합니다. 선택된 항체가 관심 마우스 변형에 의해 표현된 특정 MHC alloantigens으로 반응해야합니다. </li><li> 48 nanoparticles와 인큐베이션의 H ​​및 / 또는 후각성제, 20 분 얼음에 적절한 세포 배양 요리. 접시에서 자기편 macrophages를 제​​거하려면 부드럽게 24cm 셀 스크레이퍼로 우물을 다쳤어요. </li><li> 5 ML serological 피펫을 사용하여 부드럽게 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 다섯 번이나 다운 세포와 매체를 대기음합니다. 별도 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 각각 우물의 내용을 피펫 그래서 등 다양한 실험적 치료에서 세포를 함께 섞어 없습니다. </li><li> 각 튜브에 FACS 버퍼 2 ML을 추가합니다. </li><li> 10 분 동안 4 ° C에서 250 X g에서 세포의 튜브를 원심 분리기. </li><li> 가만히 따르다 테스트 튜브 랙 상단을 가로질러 튜브를 긁어하여 잔류 유체의 표면에 뜨는 부드럽게 resuspend 세포 펠릿. </li><li> 단클론 항체의 비 특정 바인딩을 방지하기 위해서는 세포의 각각의 튜브에 차단 버퍼 10 μL를 (4.2 년 대비) 추가합니다. 와동 튜브 30 분 얼음에 품어. </li><li> 각각의 튜브와 incub로 희석된 단클론 항체의 적절한 볼륨을 추가15 분 동강에 어둠 속에서 먹었습니다. 분석하는 시료를 포함 튜브 polycromatic 패널 (이전 항체의 조합 최적화 개별 연구소에 의해 수행되어야한다)의 항체의 조합을 수신해야합니다. 추가 제어 그룹이 올바르게 각각 단일 색상을 사용하여 레이블 셀에 해당 분류되지 않은 세포의 튜브를 포함 흐름 cytometer에 인수 매개 변수, 그리고 보상 튜브를 설정하는 데 포함되어야합니다. 제대로 흐름 cytometric 분석을위한 게이트를 설정하려면 형광 빼기 1은 (FMO) 컨트롤은 인수시 포함되어야합니다. FMO 컨트롤은 각 isotype 컨트롤로 대체됩니다 제외한 패널에 사용되는 모든 fluorochrome-복합 항체로 분류 세포입니다. 긍정과 부정적인 인구 (즉, 혼자 긍정적인 제어 흥분제와 매체로 치료 세포의 별도 aliquots)도 FMO 및 보상 제어 튜브에 포함되어야한다. </li><lI&gt; 10 분에 대해 4 250 X g에서 각 튜브, 와동 및 원심 ° C로 FACS 버퍼 2 ML을 추가합니다. </li><li> 테스트 튜브 랙 상단을 가로질러 튜브를 긁어하여 잔여 액에 가만히 따르다 뜨는 및 resuspend 세포 펠릿. </li><li> 항체 패널 fluorochrome에 직접 복합없는 항체로 구성되어 있지만 비오틴 대신 복합 경우 fluorochrome - 복합 streptavidin은 표면 마커를 시각화하는 데 필요합니다. 이 단계에서 희석 fluorochrome-복합 streptavidin의 적절한 볼륨을 추가하고 얼음에서 15 분 동안 짙은 어둠 속에서 알을 품다. 4.2에서와 마찬가지로, streptavidin은 제조 업체에서 권장하는 농도 또는 사용자에 의해 최적화된 하나 희석됩니다. 이 단계는 biotinylated 일차 항체를 포함하는 패널이 필요합니다. </li><li> 같은 4.10에서 설명한 세차 단계를 수행합니다. </li><li> BD는 탈이온수에서 정착액 1시 3분을 안정화의 적절한 볼륨을 희석. 각각의 튜브로 희석 정착액의 100 μL를 추가 부드럽게 조종하는 동안세포 clumping 방지하기 rtexing. 라벨 및 고정 세포는 안정적으로 ° C 유동 cytometer에 인수 이전 약 1 주일 동안 4에 어둠 속에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 데이터 단계 3.1 가공 Nanoparticles은 163의 평균 직경이 ± 24 nm의 이전의 연구 5,16에서 구한와 일치하는 형태했다. 이전 sonication과 이후 솔루션 Nanoparticles은 입자의 적절한 분산을 보장하기 위해 sonication의 필요성을 입증하기 위해 그림 1에 표시됩니다. 폐 세척을 통해 얻은 수확 AMɸs의 흐름 cytometric 분석은 그림 2에 표시됩니다. 안티 마우스 CD11b 및 안티 마우스 F4/80 항체뿐만 아니라 해당 FMO 컨트롤의 조합으로 세포를 레이블링하는 것은 자세한 분석을위한 AMɸs 및 게이팅 파악, 배경 라벨링 설립을 허용합니다. polyanhydride와 폐포 macrophages의 치료MHC II, CD40, CD86, 그리고 CIRE (그림 3)의 증가 평균 형광 강도에 의해 그림과 같이 nanoparticles는 활성을 향상시킵니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig1.jpg" /> . 그림 1 50:50 CPTEG : CPH 사전 (A)과 sonication의 (B) 30의 후 nanoparticles. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig2.jpg" /> 그림 2. 흐름 cytometric () 알렉사 형석 700 안티 CD11b 및 PE-Cy7 FMO 제어, (B) 알렉사 형석 700 FMO 제어 및 PE-Cy7 anti-F4/80으로 표시 수확 폐포 macrophages의 분석과 (C ) 알렉사 형석 700 안티 CD11b 및 PE-Cy7 anti-F4/80. 오른쪽 상단 모서리에있는 숫자는 이중 긍정 세포의 비율을 나타냅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig3.jpg" /> 그림 3. Histograms은 형광 inten의 증가를 보여주는50:50 CPTEG와 폐포 macrophages의 공동 문화 이후에 MHC II (), CD40 (B), CD86 (C)와 CIRE (D) 표면 표현 sity : CPH polyanhydride은 48 시간 동안 nanoparticles. Histograms은 FMO 컨트롤로 표시 AMɸ에 대한 검색 결과 (묘사 <img alt="그래프 1 호선" src="/files/ftp_upload/3883/3883line1.jpg" /> ), 치료하지 AMɸ 모든 세포 표면 마커에 대한 항체로 분류 ( <img alt="그래프 입력란 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883line3.jpg" /> )과 AMɸ nanoparticles와 함께 배양해 및 모든 세포 표면 마커에 대한 항체로 분류 ( <img alt="그래프 2 호선" src="/files/ftp_upload/3883/3883line2.jpg" /> ).

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<li>Irvin, C. G., Bates, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+lung+function+in+the+mouse%3A+the+challenge+of+size%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size.</a> Respir. Res. 4, 4(2003).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

단일 선량 regimens 5 intranasally 실시하면 Polyanhydride의 nanoparticle 백신 플랫폼은 효능을 보여주었다. 이 백신 전달 플랫폼에 의해 유도된 폐의 주민 phagocytic 세포 인구의 활성화를 측정하는 것은 그것의 잠재적인 능력의 평가는 궁극적으로 적응 면역 반응을 촉진하도록 허용합니다. 특히, 폐 세척 유체에서 폐포 macrophages를 수확하고 nanoparticles의 다른 공법으로 그들을 치료하는 것은 항원 프레 젠 테이션 6,8로 이어지는, macrophages를 활성화하기 위해 서로 다른 입자 화학의 능력으로 통찰력을 제공합니다. 또한, 체외 연구에서 이들이 생체내 연구에 크고 더 복잡한에 착수하기 전에 폐포 macrophages를 활성화하기 위해 이러한 미립자 도움이되는 공법의 용량을 평가하는 데 유용합니다. 실험은 항상 surfac에 대한 긍정적인 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> CAM 미디어 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15-013 - 이력서 </td><td></td></tr><tr><td> 50 MM 2 - 메르 캅 토 에탄올 </td><td> 시그마 </td><td> M3148-25ML </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 10,000 μg / ML 솔루션 </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> FACS 버퍼 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 염화나트륨 (소금) </td><td> 피셔 과학 </td><td> S671-500 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 나트륨 </td><td> 피셔 과학 </td><td> MK7868500 </td><td></td></tr><tr><td> 염화칼륨 </td><td> 피셔 과학 </td><td> P217500 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 칼륨 </td><td> 피셔 과학 </td><td> P288-200 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (소 혈청 알부민) </td><td> 시그마 </td><td> A7888 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 Azide </td><td> 시그마 </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td> 항체 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 쥐 IgG </td><td> 시그마 </td><td> I4341 </td><td></td></tr><tr><td> 안티-MS CD16/32 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0161 </td><td></td></tr><tr><td> 안티-MS MHC II의 haplotype 플루오레신 isothiocyanate (FITC)에 아이오와 / 즉, 클론 M5/114.15.2, 복합 </td><td> eBioscience </td><td> 11-5321 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 마우스 CD86, allophycocyanin에 복합 클론 GL-1, (APC) Cy7 </td><td> Biolegend </td><td> 105,030 </td><td></td></tr><tr><td> APC에 복합 방지 마우스 CD40, 클론 1C10, </td><td> eBioscience </td><td> 17-0401 </td><td></td></tr><tr><td> 비오틴의 복합 안티 - 마우스 CD209, 클론 5H10, </td><td> eBioscience </td><td> 13-2091 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 형석 700 복합 방지 마우스 CD11b, 클론 M1/70, </td><td> eBioscience </td><td> 56-0112 </td><td></td></tr><tr><td> phycoerythrin까지 복합 방지 마우스 F4/80, 클론 BM8 (PE) Cy7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801 </td><td></td></tr><tr><td> PE-텍사스 붉은 복합 Streptavidin </td><td> BD Biosciences </td><td> 551,487 </td><td></td></tr><tr><td> 기타 소모품 및 시약 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A405-20 </td><td> 70% (V / V)로 사용 </td></tr><tr><td> 압축된 CO 2 </td><td> Linweld </td><td> 16000060 </td><td></td></tr><tr><td> 한 ML의 주사기 </td><td> BD Biosciences </td><td> 309,659 </td><td></td></tr><tr><td> 국왕 3 ½ &quot;천을 톰 Catcatheter </td><td> 켄달 </td><td> 703,021 </td><td></td></tr><tr><td> Biosafety 내각 </td><td> NUAIRE </td><td> 시리즈 22 </td><td></td></tr><tr><td> 해부의 가위 </td><td> 어부 </td><td> 138,082 </td><td></td></tr><tr><td> 집게 </td><td> Roboz </td><td> RS-8254 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 칼슘 및 마그네슘없이 1X </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> 스크류 캡으로 15 ML 원심 분리기 튜브 </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> 21008-216 </td><td></td></tr><tr><td> 여섯 - 잘 조직 문화 번호판 치료 </td><td> Costar </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> 플라스틱 튜브 랙 </td><td> Nalgene </td><td> 5970 </td><td></td></tr><tr><td> 셀 스크레이퍼 24cm </td><td> TPP </td><td> 99,002 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ML의 폴리스티렌 라운드 - 히프 튜브 </td><td> 매 </td><td> 352,008 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet-원조 XL </td><td> Drummond </td><td> 4-000-105 </td><td></td></tr><tr><td> 10, 5, 2 ML의 Pipettes </td><td> 어부 </td><td> 13-675 </td><td></td></tr><tr><td> 200과 10 μL micropipettors </td><td> Gilson Pipetman </td><td> F123601 </td><td></td></tr><tr><td> 200와 10 μL 피펫 팁 </td><td> 어부 </td><td> 02-707 </td><td></td></tr><tr><td> BD는 고정식정착액 </td><td> BD Biosciences </td><td> 338,036 </td><td></td></tr><tr><td> Isoton II 희석제 </td><td> Beckman - 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 8,546,719 </td><td></td></tr><tr><td> 적과의 대결 - oglobin II Lytic 시약 </td><td> Beckman - 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 7,546,138 </td><td></td></tr><tr><td> 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 카운터 폴리스티렌 튜브 </td><td> Beckman - 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 14310-684 </td><td></td></tr><tr><td> 테스트 튜브 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352,008 </td><td></td></tr><tr><td> 장비 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 냉장 원심 분리기 </td><td> Labnet </td><td> 50075040 </td><td></td></tr><tr><td> Humidified 보육 CO 2 </td><td> Nuaire </td><td> 모델 Autoflow 8500 </td><td></td></tr><tr><td> FACSCanto 흐름 Cytometer </td><td> BD Biosciences </td><td> 338,960 </td><td></td></tr><tr><td> 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 입자 카운터 Z1 </td><td> Beckman - 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> WS-Z1DUALPC </td><td></td></tr><tr><td> Microtip있는 Sonicator 액체 처리 장치 </td><td> Misonix </td><td> 모델 번호 S-4000 </td><td></td></tr></tbody></table>

polyanhydride의 nanoparticles에 의해 유도된 murine macrophages 폐포 수확 및 평가 세포 활성화

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

생분해성 nanoparticles는 호흡기 감염증에 대한 새로운 비강 백신의 설계 및 구현을위한 다목적 플랫폼으로 등장했습니다. 특히, polyanhydride는 지방족 sebacic 산성 (SA), 방향족 1,6 - 비스 (파라 - carboxyphenoxy) 헥산 (CPH) 또는 amphiphilic 1,8 - 비스 (파라 - carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane 구성되어 nanoparticles (CPTEG) 독특한 벌크 및 표면 부식 속도론 1,2을 표시하고 천천히 생체내 3,4,5의 기능 biomolecules (예, 단백질 항원, 면역 글로불린 등) 출시될 악용될 수 있습니다. 이러한 그들 백신 전달 플랫폼 6,7,8을위한 탁월한 선택하고, 또한 소유 내장 도움이되는 활동 nanoparticles. 비강 점막 접종에 따라 타고난 면역의 활성화를 지배하는 메커니즘을 명료하게하다하기 위해, 하나는 항원 P의 분자 및 세포 반응을 평가한다면역 반응을 시작 책임을 원망​​ 세포 (APCs). 폐포 macrophages는 (AMɸ) 폐 실질 조직 9,10,11에 predominate 동안 돌기 세포는기도를 실시 발견 교장 APCs 있습니다. AMɸ 미생물 병원균과 세포 잔해 12,13의 폐를 청소에 매우 효율적입니다. 또한이 세포 유형은 적응 면역 반응 9 개시에 중요한 첫 걸음이다 배수 림프절에 미생물 항원의 수송에 중요한 역할을한다. AMɸ 또한 타고난 패턴 인식 및 청소 수용체, 분비 프로 염증 중재자, 및 주요 나이브 T 세포 12,14의 높은 수준을 표현. AMɸ (예,보다 큰 80 %)의 비교적 순수한 인구는 쉽게 연구실에서 공부를 위해 폐 세척을 통해 얻을 수있다. AMɸ 면역 능력이 동물로부터 수확 거주 encounte됩니다 macrophages의 대표적인 표현형를 제공합니다생체내의 R은 입자 기반의 백신. 여기, 우리는 생쥐에서 수확과 문화 AMɸ에 사용되는 프로토콜을 설명하고 체외에서 polyanhydride의 nanoparticles와 치료에 따라 macrophages의 활성화 표현형 검사합니다.

여기, 우리는 폐에 타고난 면역 세포를 거주하고 polyanhydride의 nanoparticles와 공동으로 문화에 대한 응답으로 자신의 활성화를 검토하고 있습니다 murine 폐포 macrophages를 수확을위한 프로토콜을 설명합니다.

Polyanhydride의 Nanoparticles에 의해 유도된 Murine Macrophages 폐포 수확 및 평가 세포 활성화

생분해성 나노입자는 호흡기 질환에 대응하는 새로운 비강 내 백신의 설계 및 구현을 위한 다각적인 플랫폼으로 부상했습니다...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 폴리무수물(poly anhydride) 나노입자가 정제된 폐포 대식세포를 활성화하는 능력을 평가하는 것입니다. 먼저, 마우스의 기관을 외과적으로 노출시킨 후 세척액 세척을 수행하여 호흡기에서 세포를 수집합니다. 그 후 폐포 대식세포를 원심 분리하여 분리하고 하룻밤 동안 배양합니다.그 후 폴리무수물(poly anhydride) 나노입자 현탁액을 조제하여 폐포 대식세포에 첨가합니다. 대식세포를 48시간 동안 배양하여 활성화시킵니다. 세포 표면 마커 발현은 유세포 분석법으로 분석합니다.데이터 분석을 통해 폐포 대식세포를 활성화할 수 있는 폴리무수물(Polly Anhydride) 나노입자의 제형을 식별할 수 있습니다. 이러한 방법은 생체 재료 및 면역학 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 구체적으로, 폐포 대식세포를 포함한 항원 제시 세포를 활성화하는 능력을 통해 내재적 보조제 활성을 가진 생체 재료를 식별할 수 있습니다.우리는 호흡기 병원체에 대한 폴리 무수물 나노 백신 플랫폼이 세균성 폐렴에 대해 완전한 보호 효과를 제공한다는 것을 발견했을 때, 우리 연구에 이 방법을 사용할 아이디어를 처음 얻었습니다. 본 연구에서 우리는 백신 플랫폼과 호흡기 면역 세포 간의 특이적 상호작용을 조사하고자 했습니다. 안락사시킨 마우스를 등 쪽이 바닥에 닿게 놓는 것으로 이 절차를 시작하십시오.마우스에 70% ethanol을 분무합니다. 여기서는 6~8주령의 C 57 BL six 마우스를 사용하였으나, 이 기술은 모든 계통의 마우스에 적용 가능합니다. 흉골의 위치를 확인하고 복부에서 30도 각도로 1 mL 주사기에 23 gauge 바늘을 장착하여 삽입합니다. 흉강 내로 약 50 mm 정도 삽입하여, 일반적으로 흉강 내에서 0.4~1 mL의 혈액을 채취합니다.이 절차를 수행할 때 실험을 위한 오프 세일(off sale)을 얻는 데 어려움이 있을 수 있습니다. 따라서 여기에서 시연하는 것과 같이 주의 깊게 수행하는 것이 매우 중요합니다. 세척을 수행하려면 마우스를 복와위로 눕히고 70% ethanol을 분사하십시오.그런 다음 70% ethanol로 멸균한 해부 가위를 사용하여 척추의 중간 지점쯤에서 피부를 집어 올립니다. 피부를 따라 작게 절개합니다. 절개 부위 양쪽의 피부를 잡고 생쥐의 두측-미측 축(cranial caudal axis)을 따라 서로 반대 방향으로 당깁니다.목의 근육과 샘이 노출되면 근육 조직을 조심스럽게 절개합니다. 그런 다음 포셉을 사용하여 조직을 마우스의 앞쪽으로 당겨 후두, 기관 및 식도를 노출시킵니다.경정맥이나 경동맥을 절단하지 않도록 주의하십시오. 기관은 주변에 연골 고리가 있는 조직으로 식별할 수 있습니다. 포셉을 사용하여 기관을 조심스럽게 잡고, 등쪽에 위치한 식도에서 부드럽게 들어 올려 분리하십시오.Tomcat 카테터가 장착된 1 cc 주사기에 멸균 PBS를 채웁니다. 다음으로 45도 각도로, 포셉의 앞쪽이면서 후두의 뒤쪽인 기관에 작은 절개를 가합니다.기관이 체강 내로 함몰되는 것을 방지하기 위해 기관을 완전히 절단하지 않도록 주의하십시오. 포셉을 사용하여 기관을 잡고 카테터를 기관 절개 부위로 약 20 millimeters 정도 조심스럽게 삽입합니다. 그런 다음 카테터 튜브 주변의 기관을 잡아 한 손을 자유롭게 하여 외부에서 흉부를 마사지합니다.카테터가 장착된 1 mL 주사기를 사용하여 실온의 멸균 PBS 0.75 mL를 폐로 천천히 주입합니다. 그런 다음 PBS를 다시 주사기로 천천히 흡입합니다. 이 과정을 3회 반복합니다.카테터에서 주사기를 분리하고 세척액을 15 milliliter 원심분리 튜브에 분주합니다. 주사기에 0.75 milliliters의 신선한 PBS를 채운 후 카테터에 다시 연결하여 세척을 반복합니다. 액체 회수가 부분적으로 이루어질 수 있으므로, 주입한 부피보다 적은 양이 얻어질 수 있습니다.두 마리 이상의 마우스에서 세포를 수집할 경우, 모든 폐 세척(lung lavage)이 완료될 때까지 수집된 세포가 담긴 15 milliliter 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 수집된 세포 내 폐포 대식세포(alveolar macrophages)의 비율을 높이려면, 폐 세척액을 4 °C에서 250 ×g로 10분간 원심 분리하십시오.무균 조작법을 사용하여, 생물안전작업대 내에서 상층액을 적절한 폐기물 용기에 따라냅니다. 원심분리 튜브를 시험관 랙 상단에 가볍게 문질러 세포 펠렛을 재부유시킵니다. 세포 수를 측정하기 위해 완전 폐포 대식세포 배지 1 mL를 첨가하여 세포를 재부유시킵니다.배양 세포 계수용 바이알에 담긴 10 mL의 isotone two 희석액에 20 µL의 세포를 피펫으로 넣습니다. 바이알에 zog globin, two lytic 시약을 3~4방울 가한 후 가볍게 3~4회 전도 혼합합니다. 그런 다음 샘플 바이알을 colter particle counter Z one 계수기에 로딩합니다.세포 농도를 mL당 세포 수로 표시하려면 카운터에 희석 배수를 2 × 10⁴로 설정하십시오. 세포 농도가 결정되면, 15 mL 튜브에 담긴 완전 폐포 대식세포 배지를 사용하여 세포를 2.5 × 10⁵ cells/mL로 희석합니다. 그 다음, 이 용액 2 mL를 6-well 조직 배양 접시의 각 웰에 분주하십시오.폐포 대식세포를 농축하기 위해, 배양 접시를 37 °C, 5% CO2 분위기의 습윤 인큐베이터에서 6시간 동안 배양합니다. 배양 과정 동안 대식세포가 웰 바닥에 부착됩니다. 배양이 끝나면, 부착된 세포가 손상되지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 그 후, 멸균된 칼슘 및 마그네슘 프리 PBS를 사용하여 웰을 세척합니다.비부착 세포와 잔해물을 제거하기 위해, 각 웰(well)에 2 mL의 완전 폐포 대식세포 배지를 첨가합니다. 그 후 세포를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이 농축 단계를 거치면, 세포의 약 87%가 대식세포 마커인 CD 11 B 및 F four 80에 대해 양성 반응을 보입니다.폐포 대식세포 집단이 농축되면, 다음 절차 단계는 폴리무수물 나노입자를 추가하는 것입니다. 먼저 폴리무수물 반용매 나노 캡슐화를 통해 나노입자를 제조합니다. 이 과정에서 폴리머를 염화메틸렌에 용해시킨 후 펜탄에서 침전시킵니다. 멸균된 웨이 페이퍼를 사용하여 적절한 양의 폴리무수물 나노입자를 칭량합니다.여기서는 배양액 1 mL당 125 µg의 입자를 첨가합니다. 1.5 mL 미세 원심분리 튜브에 입자를 넣고, 적절한 양의 얼음처럼 차가운 완결된 폐포 대식세포 배지로 나노입자를 재현탁한 후 얼음에 둡니다. 다음으로, 벤치탑 초음파 세척기의 마이크로팁을 멸균합니다.튜브를 얼음에 박아둔 상태에서 70% ethanol을 분사하고 멸균된 kim wipe로 닦아냅니다. 10~20 joules의 강도로 30~45초 동안 초음파 처리합니다. 입자가 충분히 분산되지 않은 경우, 나노입자 현탁액을 육안으로 관찰합니다.나노입자가 폴리머의 유리 전이 온도 이하로 내려가도록 현탁액을 얼음 위에 1~2분 동안 둡니다. 그런 다음 30~45초 동안 다시 초음파 처리합니다. 초음파 처리 단계의 목적은 50 50 CCP 태그로서 나노입자를 적절하게 분산시키는 것입니다.CPH 나노입자는 수성 환경에 노출될 때 응집되는 경향이 있습니다. 그러나 나노입자의 일부 작은 응집체가 현탁액 내에 여전히 남아 있을 수 있습니다. 조기 표면 부식이나 응집을 방지하기 위해 나노입자 현탁액은 얼음 위에 보관하고 즉시 사용해야 합니다.폐포 대식세포가 포함된 배양 접시를 인큐베이터에서 꺼내 생물안전작업대(biosafety cabinet)에 놓습니다. 부착된 세포가 떨어지지 않도록 주의하며 플레이트를 기울인 다음, 나노입자 현탁액을 추가할 양만큼의 배지를 파이펫으로 제거합니다. 폴리안하이드라이드(poly anhydride) 나노입자 현탁액을 짧게 볼텍싱(vortex)한 후, 해당 웰에 나노입자 현탁액을 최대 0.3 milliliters까지 파이펫으로 분주합니다.이때 부착 세포가 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 입자들이 웰 바닥으로 가라앉아 세포와 접촉하게 됩니다. 나머지 웰과 원하는 처리군에 대해서도 동일하게 진행하십시오.배지만 사용한 군과 200 ng/mL의 Lipopolysaccharide를 처리한 군과 같은 양성 및 음성 대조군을 지정된 웰에 포함시킨 후, 37 °C에서 48시간 동안 배양합니다. 배양 후, 동봉된 문서에 설명된 대로 유세포 분석법을 통해 폐포 활성화를 평가할 수 있습니다.세포 활성화를 평가하기 위해 C 57 BL six 마우스로부터 폐포 대식세포를 얻어 비디오 논문에 기술된 대로 농축하였습니다. 농축된 폐포 대식세포 5 × 10⁵ cells/mL에 125 µg/mL의 50:50 CPT:CPH 폴리무수물 나노입자를 첨가하여 48시간 동안 배양하였습니다. 이후 이 히스토그램에서 볼 수 있듯이, 항체 염색 및 유세포 분석을 통해 폐포 대식세포 마커인 MHC II, CD 40, CD 86 및 sire의 발현을 평가하였습니다.실선 파란색으로 표시된 나노입자와 함께 배양된 폐포 대식세포는 예상대로 나노입자를 처리하지 않은 세포에 비해 CD 4 T 세포에 항원을 제시하는 데 필요한 분자인 MHC two의 표면 발현이 증가하였습니다. fluorescence minus one FMO 대조군에서는 염색 수준이 낮게 나타났으며, 이는 관찰된 신호가 자가형광에 의한 것이 아님을 나타냅니다. 실선 파란색으로 표시된 나노입자와 함께 배양된 폐포 대식세포는 처리되지 않은 세포에 비해 T 세포의 적절한 활성화에 필요한 공동 자극 분자인 CD 40의 발현이 강화되었습니다.또 다른 T세포 공동 자극 분자인 CD 86의 발현 또한 폴리 무수물 나노입자로 48시간 동안 처리한 후 증가하였습니다. 병원체 표면에 존재하는 탄수화물 모티프와 결합하는 C형 렉틴 수용체인 CY의 발현은 폴리 무수물 나노입자 처리 후 폐포 대식세포에서 크게 향상됩니다. 이 영상을 시청하고 나면, 폐포 대식세포를 수집하기 위한 폐 세척법(lung lavage) 수행 방법, 해당 세포의 배양 방법, 그리고 폴리 히드로 나노입자를 이용해 세포의 활성화를 측정하거나 평가하기 위해 세포를 자극하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 절차를 수행할 때는 수확하는 일차 세포의 오염을 방지하고 처리 과정에 오염 물질이 유입되는 것을 막기 위해 멸균 실험 기법을 사용하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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Polyanhydride의 Nanoparticles에 의해 유도된 Murine Macrophages 폐포 수확 및 평가 세포 활성화

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