기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

본 실험의 목적은 다양한 생리학적 및 병리학적 조건에서 세포의 점탄성 특성을 분석하는 것입니다. 이는 마이크로 피펫 풀러를 이용해 유리 모세관으로 제작하고 압력 변환기에 연결된 유리 마이크로 피펫을 통해 세포막에 음압을 가함으로써 달성됩니다. 피펫은 도립 현미경 스테이지에 위치한 정밀 마이크로 매니퓰레이터에 장착되며, 피펫의 팁을 세포에 가깝게 접근시킵니다.

다음으로, 피펫 팁과 세포막 사이에 씰(seal)을 형성한 후, 음압 단계(step of negative pressure)를 가했을 때 피펫 내부로 발생하는 세포막 변형을 측정합니다. 이를 통해 정의된 힘에 대한 막 변형 정도를 바탕으로 다양한 처치가 세포의 생체역학적 특성에 미치는 영향에 대한 결과를 얻습니다. 저희 연구실의 목적은 이상지질혈증이 혈관 내피세포의 생물물리학적 및 생체역학적 특성에 미치는 영향을 조사하는 것이며, 오늘은 세포 강성을 측정하기 위해 사용하는 마이크로피펫 흡입법(micropipet aspiration)이라는 방법에 대해 설명해 드리겠습니다.

이 기술의 함의는 혈관 신생, 기계적 감지 및 이동 등 다양한 메커니즘에서의 세포 생체역학에 대한 기초적 이해로 확장됩니다. 이 방법은 세포 생체역학에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라 모델 막, 세포 내 소기관 또는 조직과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 세포막을 시각화하고 피펫 내부로 돌출된 막을 관찰하기 위해, 혈관 내피 세포막을 친지성 형광 염료로 염색합니다.

먼저, 가온된 PBS 용액을 사용하여 스톡 염료를 작업 농도로 희석한 다음, 혼합물을 5분 동안 초음파 처리하여 D 응집체를 분해하십시오. 마이크로 원심분리기로 5분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 0.5 mL의 PBS를 첨가하여 혈관 내피세포를 세척하십시오. 5분 후, 용액을 흡입하여 제거하고 이 과정을 두 번 더 반복하여 세척하십시오.

그 다음 다이s(dice) 용액을 세포에 첨가하고 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 이전과 동일하게 PBS로 세포를 다시 세척합니다. 마이크로 피펫은 유리 모세관의 중앙 부분을 가열하여 당겨서 제작합니다.

유리가 녹기 시작하면 모세관의 두 반쪽을 서로 당겨 두 개의 마이크로 피펫을 생성합니다. 본 실험에서 사용되는 피펫 팁의 크기는 일반적으로 2~6 µm 범위입니다. 세포 크기에 따라 외경이 결정되며, 팁의 모양은 유리 모세관을 피펫 풀러(pipette puller)에 삽입하기 시작할 때 원통형 튜브와 유사해야 합니다.

본 시연에서는 최적화된 프로그램을 적용한 Suter P 97 수평 피펫 풀러를 사용합니다. 이 풀러는 풀링 속도 및 기타 파라미터를 조정할 수 있는 다양한 프로그래밍 옵션을 제공합니다. 풀 프로그램을 활성화하여 진행하십시오.

각 마이크로 피펫을 뽑아낸 후, 현미경으로 팁의 모양을 확인하십시오. 팁을 화염 폴리싱한 후, PBS와 같은 생리 식염수 또는 비형광 성장 배지로 마이크로 피펫을 채웁니다. 이때 세포막이 피펫 내부로 부드럽게 이동할 수 있도록 용액에 30% serum을 첨가하는 것이 중요합니다. 본 시연에서는 3D 디콘볼루션 기능이 있는 도립 형광 현미경과 컴퓨터에 연결된 비디오 카메라, 압력 트랜스듀서, 진동 방지 스테이션 및 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여, 기질에서 세포를 들어 올려 도립 형광 현미경에 장착된 얕은 종방향 챔버로 피펫팅함으로써 세포를 마이크로 흡입 챔버에 마운트하는 과정을 시작합니다.

얕은 세로형 챔버를 사용하는 이유는 마이크로 피펫이 세포에 가능한 한 수평에 가깝게 매우 낮은 각도로 접근할 수 있도록 하기 위함입니다. 이는 마이크로 피펫 내부로 흡입된 막을 단일 초점 평면에서 시각화하기 위해 수행됩니다. 충전된 마이크로 피펫을 유연한 튜브로 전력 트랜스듀서에 연결된 피펫 홀더에 장착하되, 피펫 홀더의 커넥터에 맞게 직경을 조절하여 단단히 고정하십시오.

각 실험 시작 시, 피펫 내부의 압력을 대기압과 평형 상태로 맞춘 후, 마이크론 단위의 정밀한 피펫 이동 제어가 가능한 마이크로 매니퓰레이터에 피펫을 장착합니다. 피펫을 챔버 바닥과 얕은 각도가 되도록 배치하고, 피펫 팁을 시야의 중앙으로 이동시킵니다. 막이 흡입되는 피펫 팁의 원통형 부분인 피펫 샹크(shank)는 초점 평면에 대해 수평으로 정렬되어야 합니다.

첫 번째 위치를 잡기 위해, 피펫을 가능한 한 가장 낮은 각도로 기울인 다음 피펫의 섕크(shank) 부분을 챔버 바닥에 밀착시켜 굴곡시킵니다. 섕크는 매우 얇기 때문에 세포에 접근하는 동안 챔버 바닥 위에서 부드럽게 미끄러질 만큼 유연합니다. 조작기(course manipulator)를 사용하여 마이크로 피펫을 단일 세포의 측면으로 천천히 내리며, 세포의 초점 평면에 가까워질 때까지 이동시킵니다.

그 다음 미세 조작기를 사용하여, 피펫 팁이 세포막에 살짝 닿을 때까지 마이크로 피펫을 세포 가장자리로 이동시킵니다. 피펫의 위치를 관찰하기 위해 이미지를 한 장 촬영하십시오. 피펫 팁 전체가 세포 표면에 완전히 접촉하고 그 접촉 상태가 안정적일 때 양호한 씰(seal)이 형성됩니다.

다음으로, 트랜스듀서를 사용하여 음압을 가하고 막 돌출부가 안정될 때까지 이를 유지합니다. 막을 피펫 내부로 흡입하는 데 필요한 압력의 양은 세포 유형 및 특정 실험 조건에 따라 다릅니다. 일반적으로 -2에서 -15 mmHg 범위의 압력을 가할 때 초기 변형이 관찰됩니다.

압력이 가해지면 막은 일정 길이에 도달하여 안정화될 때까지 피펫 쪽으로 서서히 변형됩니다. 이 과정은 보통 2~3분 정도 소요되며, 이 시간 동안 피펫 내부로 끌려 들어가는 막의 진행 상황을 추적하기 위해 30초마다 막 변형 이미지를 촬영해야 합니다. 마지막으로, 압력을 2~5 mmHg 단계로 다음 수준까지 높입니다.

막 돌출부가 세포에서 떨어져 피펫 안으로 들어갈 때까지 전체 과정을 반복하며, 이 시점에서 실험을 중단합니다. 막 변형 정도를 정량화하기 위해, 피펫 끝에서 막 돌출부 원주의 정점까지의 흡입 길이를 측정합니다. 피펫 직경 간의 가변성을 고려하여, 동일한 압력 수준에서 더 큰 피펫을 사용하면 세포막에 더 큰 힘이 가해집니다.

기질 부착 세포에 대한 미세 흡입 기술의 사용을 검증하기 위해, 흡입 길이는 각 실험에서 측정된 피펫 직경에 대해 정규화되었습니다. 이 방식으로 추정한 결과, F actin의 붕괴가 bovine aortic endothelial cells의 세포 강성 감소를 초래한다는 것이 테스트되었습니다. 여기에는 마이크로 피펫을 통해 가해진 음압에 반응하여 점진적인 변형이 일어나는 내피막의 전형적인 형광 이미지 시리즈가 예상대로 표시되어 있습니다. 막은 점차 피펫 내부로 흡입되며, 흡입 길이는 가해진 압력의 함수로 증가합니다. 변형의 시간 경과에 따른 분석 결과, F actin의 붕괴가 모든 압력 조건에서 돌출부의 흡입 길이를 유의미하게 증가시키는 것으로 나타났습니다.

이러한 접근 방식을 통해 세포막의 콜레스테롤이 고갈되면 세포 강성이 증가하는 반면, 콜레스테롤을 풍부하게 하는 것은 아무런 영향이 없음을 발견하였습니다. 여기 콜레스테롤이 풍부한 세포, 대조군 세포, 그리고 콜레스테롤이 고갈된 세포가 -15 mmHg의 최대 흡입 길이에 도달한 후의 모습이 나타나 있습니다. 돌출부는 일반적으로 -10 mmHg에서 발달하기 시작했으며, -10, -15, -20 mmHg의 음압에서 막 변형의 시간 경과를 측정할 수 있었습니다.

여기에서는 최대 흡입 길이가 인가된 압력의 함수로 도식화되었습니다. -15 mmHg 및 -20 mmHg의 압력에서 고갈된 세포의 최대 정규화된 길이는 대조군 세포보다 유의하게 낮았습니다. -25 mmHg 이상의 음압을 인가하면 흡입된 돌기가 떨어져 나가 별도의 소낭이 형성되었습니다.

막 박리를 유발한 압력 수준은 서로 다른 콜레스테롤 조건 하에서 비슷하게 나타났으며, 이는 예상치 못한 결과였습니다. 이전 연구들에 따르면 막 콜레스테롤의 증가는 막 지질 이중층의 강성을 높이는 것으로 알려져 있습니다. 숙달되고 나면, 이 기술은 적절히 수행될 때 2~3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 기술을 시도할 때, 본 실험이 개별 세포를 대상으로 수행된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

따라서 각 실험 조건당 3~5개의 세포를 분석해야 하며, 총 3회의 실험을 수행해야 합니다.