Name: 기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 배우세요 마이크로피펫 흡입법을 이용하여 기판에 부착된 세포의 강성을 측정하는 방법을. 음압을 가해 세포막 변형을 관찰하고 생물역학적 특성을 정량화하여 혈관 내피세포의 물리적 변화를 분석할 수 있습니다.

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1. 유리 Micropipettes를 당기는 장비 : Micropipette 풀러, Microforge. 유리 : Boroscillicate 유리 모세관 (~ 1.5 mm 외경 ~ 1.4 mm 내경). <ol><li> Micropipettes는 전기 생리학 녹음을 위해 유리 microelectrodes를 준비하는 데 사용되는 것과 동일한 기본 접근 방법을 사용하여 뽑아 있습니다. 간단히, 모세관 유리는 중간에 가열되어 유리가 녹기 시작할 때 모세의 두 절반은 두 명의 micropipettes을 생성 당겨 있습니다. 여러 상업 pullers는 풀의 속도 및 기타 매개 변수를 변경할 수있는 여러 프로그램 옵션을 제공합니다 높은 정교한 수평 pullers에 두 피펫를 분열하기 위해 중력을 이용해서 비교적 간단 수직 pullers 이르기까지이 과정을 수행 할 수 있습니다. pullers의 두 종류의 실험에 사용 하였다. </li><li> 요구 사항S는 피펫 팁의 형상에 대한 이러한 실험에 사용 된 피펫의 팁은 일반적으로 6-2 사이 μm 세포의 크기에 따라 외부 직경을 다양합니다. 또 다른 중요한 매개 변수는, 끝의 모양입니다해야 대략 원통형 관 (그림 1 참조). 이것은 풀의 매개 변수를 최적화하고 원하는 형태를 얻을 때까지 현미경 팁의 모양을 확인하여 달성 될 수있다. 피펫 생크의 최적 길이는 예상 변형의 양에 따라 달라집니다 변형이 작은 &lt;10 μm 경우,이 피펫의 실린더와 같은 부분이 짧은 (크기의 순서와 동일), 큰에도 상대적 것을 충분 변형이 적절하게 조정합니다. 일반적으로, &quot;풀&quot;에 열 및 / 또는 증가를 늘리면 끝의 직경을 감소시킵니다. &quot;풀&quot;의 증가는 더 이상 테이퍼가있는 팁을 생성합니다. 우리의 실험에서, 셔터 P-97 수평 피펫 풀러를 사용하여 프로그램이었습니다, 끌어 오기 22, 속도 22 시간 200, 압력 500 473의 열 다음 매개 변수를 최적화. 그것은 아주 긴 칼을 당겨하고 파괴하고 연마하여 원통형 팁을 생성 할 수도 있습니다. 피펫의 다른 유형을 준비하는 방법에 대한 자세한 지침은 셔터 설명서에 부여됩니다. </li><li> Microforge : 그것은 또한 플라즈마 막에 좋은 실을 만드는 부드러운 유리 표면을 생성 할 수있는 피펫의 팁을 발사 - 폴란드어하는 것이 좋습니다. 이것은 microforge를 사용하여 두 번째의 아주 일부에 대한 온수 유리 공의 주변에 피펫의 팁을 가져 통해 이루어집니다. 비슷한 기술은 정기적으로 electrophysiological 레코딩을위한 microelectrodes을 준비하는 데 사용됩니다. </li><li> Micropipette를 채운 : Micropipettes 이러한 PBS 또는 비 형광 성장 미디어와 같은 생리 생리 식염수, 가득해야합니다. 중요한 솔루션은 휴대 가상 할 수 있도록 그 30 %의 혈청 보충해야피펫으로 원활하게 이동 brane. 두 접근 방식은 피펫의 끝에서 기포를 제거하는 데 사용할 수 있습니다 :은 (i) 피펫의 팁은 액체가 피펫을 backfilling 다음 모세관 힘에 의해 팁을 작성 할 수 있도록 먼저 솔루션에 몰두 할 수 있습니다 다른 끝에서 또는 (ii) 전체 피펫은 부드럽게 끝에서 거품을 제거하기 위해 피펫의 칼에 활용하여 백 엔드에서 작성하실 수 있습니다. </li><li> 참고 : 피펫은 실험 당일 준비해야합니다. </li></ol> 2. 셀의 준비 <ol><li> 셀을 퍼 뜨리고 : Microaspiration이 중 정지 유지 또는 기판에 연결된 하나의 셀에 수행됩니다. 정지 세포를 대기음하기 위해 세포들은 기판에서 채취 오른쪽 실험 전에 역 현미경에 장착되어있는 얕은 세로 챔버에 pipetted 있습니다. 기판에 연결된 세포, 세포를 대기음하려면작은 커버 - 전표에 놓는 아르도 실험 전에 microaspiration 챔버에 배치 할 수 있습니다 (직경 ~ 10 ㎜). 얕은 종 방향 챔버를 사용하는 근거는 micropipette 가능한 수평에 가까이 아주 얕은 각도에서 셀을 접근 할 수 있도록하는 것입니다. 이것은 (그림 2 참조) 초점의 단일 비행기 시각화 될 수있는 micropipette으로 당겨 멤브레인을 허용하기위한 것입니다. </li><li> 세포막 시각화 : 피펫에 막 투영을 관찰하기를, 휴대 멤브레인는 표준 얼룩 프로토콜을 사용하여 같은 diI 같은 lipophilic 형광 염료, 물들입니다. <ol type="i"><li> 따뜻한 PBS 솔루션입니다. </li><li> 예열 PBS 솔루션으로 작업 농도 (5 μM)에 재고 diI을 희석. </li><li> 염료 집계을 깨고 5 분에 Sonicate. </li><li> 5 분을 위해 스핀 다운하고 표면에 뜨는보십시오. </li><li> PBS 3 회, 5 분 각 셀을 씻으십시오. </li><li> 그래서 염색으로 세포를 배양37 ° C 배양기에서 30 분에 lution. </li><li> 5 분 각각에 대한 PBS 3 회와 세포를 씻으십시오. </li></ol></li><li> 참고 : 또한 피펫으로 막과 함께 당겨되고있는 서브 막 세포 골격을 시각화와 멤브레인의 diI의 착색을 대체 할 수 있습니다. 이 세포 골격을 perturbing하면 셀의 biomechanical 속성을 변경할 수 그러나, 고려되어야합니다. 또한, 기판 첨부 된 셀과 microaspiration 실험을 수행 할 때, 그것은 세포의 초점 평면에 각도로 위치 피펫으로 막 투영의 길이를 추정하기 위해 3D 이미지를 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 3. Microaspiration 및 이미지 수집 장비 : 역 형광 현미경, 바람직하게는 3D deconvolution 기능 (objectiv의 컴퓨터 제어 Z-축 운동과 Zeiss Axiovert 200M로ES 또는 이에 상응하는 금액), manipulators, 컴퓨터 (AxioCam MRM 또는 이에 상응하는 금액), 압력 변환기 (BioTek 또는 이에 상응하는 금액), 진동이없는 역 (TMD 또는 이에 상응하는 금액), Micromanipulator (Narishige, 셔터, Burleigh 또는 동급에 연결 videocamera ), 기계 유압 또는 압전 수 있습니다. 그렇게 microaspiration 이러한 적혈구의 1,2 또는 호중구 3 등 핵 4 인조 liposomes 5와 절연 세포 소기관과 같은 정지 세포의 강성을 추정하기 위해 3D 기능이없는 현미경을 사용하여 수행 할 수 있습니다 강조하는 것도 중요합니다. 이미지 수집 소프트웨어 : Zeiss AxioVision 또는 유사한. <ol><li> 위에서 설명한대로 역 형광 현미경에, microaspiration 챔버에 세포를 탑재합니다. 실험을 위해 셀을 선택 셀을 위치와 시야의 중심에 배치합니다. 이 perfo 중요합니다특히 기판에 연결된 세포와 실험을위한 진동없는 환경에서 RM이 실험 일반적으로 벤치 및 정기적 인 테이블에서 발생하는 분 진동은 완전히 인감의 작성을 손상에 micropipette 또는 결과의 끝을 깰 가능성이 있기 때문에 결과의 분석됩니다 스큐 끝의 위치에 중대한 변화. </li><li> 꼭 피팅을위한 피펫 소유자의 connecter으로 조정 직경 유연한 튜브하여 전력 변환기에 연결 피펫 홀더에 PBS / 미디어 w / 혈청 솔루션으로 가득한 micropipette를 놓습니다. 각 실험의 시작 부분에서 피펫의 압력이 대기 압력 equilibrated입니다. 피펫은 마이크론 범위에서 피펫 운동의 미세 제어를 할 수있는 micromanipulator에 장착된다. 챔버의 바닥에 얕은 각도로 피펫을 배치하고 시야의 중심에 피펫의 팁을 가져. 일피펫의 전자 생크, 멤브레인가 흡입되는에 피펫 팁의 원통형 부분은 가능한 가장 얕은 각도 (10-15 °)에서 (1) 위치 피펫으로 (2)에 의해 초점 평면에 수평으로 정렬되어 있습니다 챔버의 바닥에 대한 피펫의 칼을 flexing. 생크가 매우 얇은이기 때문에 그림 1에 개략적으로 도시 된 바와 같이 그것은 세포에 접근하는 동안 챔버의 하단에 밀어 정도로 유연하다. 천천히 셀에 대해 초점 비행기 근처까지 코스 속이는를 사용하여 단일 셀의 옆에 micropipette 내려 보내. 피펫의 끝이 부드럽게 막에 닿는 때까지, 좋은 속이는를 사용하면 셀의 가장자리에 micropipette 이동합니다. 피펫의 위치를​​ 관찰 한 이미지를보세요. 피펫의 전체 끝이 세포 표면 전체에 접촉하고 연락이 안정되면 좋은 바다 표범이 만들어집니다. 더 강한 객관적인 기준은 봉인 실이 얼마나 좋은 약하지만,이 없습니다시각적 시험 ept. </li><li> 변환기를 사용하여 부정적인 압력의 단계를 적용하고 막 프로젝션이 안정 될 때까지 그것을 유지하고 있습니다. 피펫으로 멤브레인을 대기음에 필요한 압력의 양이 세포 유형과 특정 실험 조건에 따라 다릅니다. -2로 - 15mm HG 사이의 범위에 압력을 적용 할 때 우리의 실험에서는 초기 변형은 일반적으로 관찰된다. 이 특정 길이, 일반적으로 2-3 분 소요하는 과정에서 안정화 될 때까지 압력이 적용되면, 멤브레인은 점차 피펫으로 변형된다. 이 기간 동안 막 변형의 이미지는 피펫으로 당겨 멤브레인의 진행을 추적 할 때마다 30 초를 획득합니다. </li><li> 2~5mm HG 단계에서 다음 단계로 압력을 높이고 막 투영이 실험이 중지되는 시점에서 피펫으로 셀 이동에서 분리 될 때까지 모든 절차를 반복합니다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. 분석 막 변형의 정도를 수량화하기 위해 흡입 길이 (L)은 피펫의 끝에서 막 투영의 둘레의 정점에 측정됩니다. 그것은 큰 피펫은 압력의 동일한 수준에있는 세포막에 대한 자세한 힘을 적용 할 그러나, 유의하는 것이 중요합니다. 피펫의 직경 사이의 다양성을 위해 계정에 따라서, 흡입 길이는 각 실험 측정 피펫 직경 (D)에 대한 표준화되어 있습니다. 데이터는 더로 이전 연구 6,7에 설명 된 내피 세포의 표준 선형 점탄성 반 공간 모델을 사용하여 분석 할 수 있습니다. 특히, 세포의 탄성 계수는​​ 식을 사용하여 추정되었다 : <img alt="수식 1" src="/files/ftp_upload/3886/3886eq1.jpg" /> E는 영의 계수이고,이 내부입니다피펫 반경이 Δp는 압력 차이며, L은 해당 흡입 길이이며, φ (η)은 기능이 아니라 Theret 외 7에서 설명 된 힘 모델을 사용하여 계산 벽입니다. 그것은 여러 모델 셀 세포가 구형 모양을 형성 그 가정 등방성과 균일 한 재료 특성 및 액체 방울 모델과 변형 영역이 있다고 가정 유한 요소 모델을 포함하여 microaspiration 데이터를 분석하는 데 사용 된 점에 유의하는 것이 중요합니다 지속적으로 변형, 등 여러 뛰어난 리뷰에 설명 된 릴리스에 따라 복구 할 수 있습니다 : 8-10. Microaspiration는 또한 휴대 점탄성 특성, 세포 및 조직 biomechanics (자세한 내용은 위에 나열된 리뷰를 참조) 다른 구조 요소의 대뇌 피질의 긴장과 공헌 등의 세포와 조직의 다른 biomechanical 매개 변수를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 5. 대표하는결과 이전 연구에서, micropipette의 열망은 liposomes 5 일 또는 기판 2,11-13에 부착되지 않은 세포에서 중 수행되었다. 우리의 연구에서, 그러나, 세포는 일반적으로 세포가 14-16를 분리 할 때 발생할 가능성이있는 cytoskeletal 구조의 변화를 방지하기 위해 기판에 부착 유지됩니다. 기판에 연결된 셀에 대한 microaspiration 기술의 사용을 확인하기 위해, 우리는 예상과 같이,이 같은 이러한 접근 방식에 의해 추정 소 대동맥 내피 세포 (BAECs)의 세포 강성의 감소에 F-고를 결과의 장애가 발생했습니다. 그림 3 쇼 여부를 테스트 이 참 경우가 있습니다. 특히, 그림 3A는 micropipette를 통해 적용 부정적인 압력에 대응하여 점진적으로 변형을 겪고 내피 멤브레인의 형광 이미지의 전형적인 시리즈를 보여줍니다. 예상대로, 멤브레인은 점차 피펫과 aspirat에 흡입되어에드 길이는 적용 압력의 함수로 증가한다. F-고를의 중단이 크게 모든 압력 조건 (그림 3B) 14 세 미만 예측의 흡입 길이를 증가하는 변형 쇼의 시간 코스. 이 방법을 사용하여 우리는 콜레스테롤 강화가 더 효과가 14 없었다 반면에 세포 멤브레인은 콜레스테롤 고갈 될 때 세포 강성이 증가 발견했다. 그림 4에서 최대 흡인 길이에 도달 한 후 콜레스테롤 강화 셀, 제어 셀 및 콜레스테롤 고갈 세포를 보여줍니다 -15 mm HG (4A). 예측은 일반적으로-10mmHg에서 개발하기 시작하고 막 변형의 시간 코스는 -10, -15 및 -20 mm HG (4B)의 부정적인 압력에 대한 측정 될 수 있습니다. - 25mmHg 이상 압력의 적용은 별도의 소포를 형성 흡입 투영의 부대있었습니다. 막 분리의 결과 압력 수준은 simila했습니다다른 콜레스테롤 조건에서 연구. 이전 연구 막 지질 bilayers에 막 콜레스테롤의 증가는 막 5,17의 강성을 증가 것으로 나타났다 때문 관찰 매우 예기치했다. 우리 더 연구가 원자 힘 현미경 18,19 및 강제 견인 현미경 20 등 여러 가지 독립적 인 방법을 사용하여 이러한 관찰을 확인했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig1.jpg" /> 1 그림. 녹음 피펫의 개략적 인 측면보기는. 피펫은 팁 (사이드 뷰)에 원통형 칼을 생성하기 위해 당겨 있습니다. Micropipette 매개 변수 : D = 2A = 내부 직경 ED = 2B = 외부 직경. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig2.jpg" /> 그림 2. Micropipette은 기판에 연결된 셀을 접근 (A) 도식 쪽보기,. micropipette s의 (B) 밝은 명암 이미지행크는 흡인 실험에 사용되는 일반적으로 모양의 셀을 터치, DiIC 18라는 동일한 세포의 (C) 형광 이미지입니다. micropipette는 여전히 존재하지만, (14에서) 보이지 않는 것입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig3.jpg" /> 그림 3. microaspiration를 사용하여 기판에 연결된 셀에 셀 강성을 측정의 유효성을 검사. A : 제어 조건 및 latrunculin에 노출 후 BAECs의 진보적 인 막 변형의 이미지가 형광을하지 않기 때문에 피펫은 이미지에 보이지 않는 수 있습니다.. 세포는 같은 rhodamine-phalloidin 형광에 의해 측정 극적 F-고를의 양을 감소 10 분, (표시되지 않음)에 대해 2 μM latrunculin에 노출 된 셀 모양에 아무런 상당한 효과가 없습니다. latrunculin - 처리 셀에 흡입 투영의 중간에 막의 숱이 있지만 투영 여전히 C에 부착되는이있다ells. B. L은 막 투영 및 D의 길이를 흡입되어 막 변형의 시간 코스에 latrunculin의 효과는 제어 세포에 대한 피펫의 직경 (N = 14), 2 μM의 latrunculin에 노출 세포입니다 10 분에 (N = 5). 세포는 -10 mm HG (다이아몬드), -15 mm HG (광장) 및 -20 mm HG (삼각형)로 흡입했다. (14 일부터). <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig4.jpg" /> 4 그림. BAECs의 막 변형에 대한 세포 콜레스테롤 수준의 효과. . 콜레스테롤 강화, 콜레스테롤 소모 및 제어 셀 (제어 세포의 막 변형의 전형적인 이미지는 MβCD에 노출 된 : 셀에서 무료 콜레스테롤의 수준에 아무런 영향을 미치지 않았다 1시 1분 비율 MβCD-콜레스테롤 혼합 (참조 ) 삽입. 표시된 이미지가 -15 mm HG에서 최대 변형을 도시한다. 화살표는 흡입 투영의 위치를​​ 나타냅니다. 바는 30 μm이다. B는. 세 실험 세포 인구를위한 흡입 길이의 평균 시간 코스. C. 최대 흡입 길이는 적용 압력의 함수로 꾸몄다. 소진 셀의 최대 정규화 된 길이는 압력 -15 mm HG와 -20 mm HG (P &lt;0.05)에 대한 제어 세포에 비해 훨씬 낮았다. (14 일부터).

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</ol>

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Microaspiration는 세포막에 제외 압력을 적용하고 잘 정의 된 압력에 대한 응답으로 막 deformability을 측정하여 세포 강성 / deformability을 추정 할 수있는 간단하고 높은 재현 방법을 제공합니다. 그것은 첫째 세포 분열 21 다음 적혈구 1 기계적 성질을 살펴 보의 메커니즘에 통찰력을 제공하기 위해 바다 성게 알의 탄성 속성을 특성화 Mitchison와 스완 (1954)에 의해 개발되었습니다. 이 방법은 다양한 세포 유형 (예 : 2,3,12,13)의 biomechanical 속성을 평가하기 위해 여러 연구에 사용되었습니다. 최근 연구는 3D 영상 14,15,22과 microaspiration를 결합하여 기판에 연결된 세포의 강성을 추정하기 위해이 방법을 확장. 막 강성과 탄성이 세포 표현형에 대한 중요한 정보를 제공하는 방법과 셀은 특히 기계 단서의 다양한, 동적 인 환경에 대응혈액 흐름의 hemo...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 / 모델 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 셔터 피펫 풀러 </td><td> 셔터 악기 </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Microforge </td><td> Narishige </td><td> MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> 역 형광 현미경 </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert 200M </td><td> 현미경은 바람직 3D/deconvolution 기능을 갖추고 있어야합니다. </td></tr><tr><td> Videocamera </td><td> Zeiss </td><td> AxioCam MRM </td><td></td></tr><tr><td> 이미지 수집 sotware </td><td> Zeiss </td><td> AxioVision </td><td></td></tr><tr><td> 공압 압력 변환기 </td><td> BioTek </td><td> DPM-1B </td><td> DPM1B 공압 변환기 테스터는 이제 우연으로 볼 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 피펫 유리 </tD&gt; <td> 리치 랜드 </td><td> 사용자 정의 유리 </td><td> 피펫은 1.2 내경 1.6 외경으로 정의했다. </td></tr><tr><td> DiI 염료 </td><td> Invitrogen </td><td> D282 </td><td> DMSO에 잘 녹여 </td></tr></tbody></table>

기판에 연결된 전지의 micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

연구 증가는 개별 세포의 biomechanical 속성이 세포 증식, 분화, 마이그레이션 및 세포 세포 상호 작용 등 여러 가지 세포 기능에 중요한 역할을 것으로 나타났습니다. 세포 biomechanics의 두 가지 주요 매개 변수 세포 deformability 또는 강성과 힘을 계약 생성하는 세포의 능력입니다. 여기 우리는 세포 표면에 유리 micropipette, Micropipette의 흡인 또는 Microaspiration라고 기술로 적용 부정적인 압력에 대한 응답으로 막 변형의 정도를 측정하여 세포 강성을 추정 할 수있는 빠르고 간단한 방법을 설명합니다. Microaspiration는 다음 공기 압력 변환기에 연결 가까이로 이동하는 아주 작은 팁 (셀 또는 조직 샘플의 크기에 따라 2-50 μm의 직경)로 micropipette을 만들 모세관 잔을​​ 당겨 수행 현미경으로 세포의 주변. 때피펫의 팁은 공기 압력 변환기는 세포막에 잘 정의 압력을 생성하여 피펫에 적용되는 셀, 부정적인 압력의 단계를 감동. 압력에 대응하여, 멤브레인은 피펫 및 프로그레시브 막 변형 또는 피펫은 시간의 함수로 측정됩니다에 &quot;막 투사&quot;로 흡입된다. 이 실험 방법의 기본 원리는 정의 된 기계 힘에 대한 응답으로 막 변형의 정도가 막 강성의 기능이라는 것입니다. 엄격한 멤브레인은 느린 막 변형의 속도와 짧은 정상 상태 흡인 length.The 기술은 정지하고 기판에 연결된, 큰 세포 소기관의 두 절연 셀에 수행 할 수 있으며, liposomes입니다. 분석은 다른 세포 집단 또는 실험 조건에 주어진 압력 하에서 달성 최대 막 변형을 비교하여 수행됩니다. A &quot;강성 계수는​​&quot;에스입니다적용 압력의 함수로 막 변형의 흡입 길이를 음모에 의해 timated. 또한, 데이터는 더욱 세포의 영 계수 (E), 재료의 강성을 특징하는 가장 일반적인 매개 변수를 추정하기 위해 분석 할 수 있습니다. 이 진핵 세포의 플라즈마 멤브레인은 막 지질 이중층은 하위 막 세포 골격으로하고 멤브레인의 기계적 비계를 구성 세포 골격이며, deformability을 지배 해당 underlied되어있는 이중 구성 요소 시스템으로 볼 수 있습니다하는 것이 중요합니다 세포 봉투. 이 방법은, 따라서, 서브 막 세포 골격의 biomechanical 속성을 탐색 할 수 있습니다.

여기 셀 강성을 측정 할 수있는 빠르고 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법의 일반적인 원리는 세포 표면에 micropipette를 통해 적용 잘 정의 된 부정적인 압력에 대한 응답으로 막 변형을 측정하는 것입니다. 이 방법은 기판에 연결된 세포의 biomechanical 속성을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

점점 더 많은 연구를 통해 개별 세포의 생체역학적 특성이 세포 ...을 포함한 다양한 세포 기능에서 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀지고 있습니다.

본 실험의 목적은 다양한 생리학적 및 병리학적 조건에서 세포의 점탄성 특성을 분석하는 것입니다. 이는 마이크로 피펫 풀러를 이용해 유리 모세관으로 제작하고 압력 변환기에 연결된 유리 마이크로 피펫을 통해 세포막에 음압을 가함으로써 달성됩니다. 피펫은 도립 현미경 스테이지에 위치한 정밀 마이크로 매니퓰레이터에 장착되며, 피펫의 팁을 세포에 가깝게 접근시킵니다.다음으로, 피펫 팁과 세포막 사이에 씰(seal)을 형성한 후, 음압 단계(step of negative pressure)를 가했을 때 피펫 내부로 발생하는 세포막 변형을 측정합니다. 이를 통해 정의된 힘에 대한 막 변형 정도를 바탕으로 다양한 처치가 세포의 생체역학적 특성에 미치는 영향에 대한 결과를 얻습니다. 저희 연구실의 목적은 이상지질혈증이 혈관 내피세포의 생물물리학적 및 생체역학적 특성에 미치는 영향을 조사하는 것이며, 오늘은 세포 강성을 측정하기 위해 사용하는 마이크로피펫 흡입법(micropipet aspiration)이라는 방법에 대해 설명해 드리겠습니다.이 기술의 함의는 혈관 신생, 기계적 감지 및 이동 등 다양한 메커니즘에서의 세포 생체역학에 대한 기초적 이해로 확장됩니다. 이 방법은 세포 생체역학에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라 모델 막, 세포 내 소기관 또는 조직과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 세포막을 시각화하고 피펫 내부로 돌출된 막을 관찰하기 위해, 혈관 내피 세포막을 친지성 형광 염료로 염색합니다.먼저, 가온된 PBS 용액을 사용하여 스톡 염료를 작업 농도로 희석한 다음, 혼합물을 5분 동안 초음파 처리하여 D 응집체를 분해하십시오. 마이크로 원심분리기로 5분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 0.5 mL의 PBS를 첨가하여 혈관 내피세포를 세척하십시오. 5분 후, 용액을 흡입하여 제거하고 이 과정을 두 번 더 반복하여 세척하십시오.그 다음 다이s(dice) 용액을 세포에 첨가하고 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 이전과 동일하게 PBS로 세포를 다시 세척합니다. 마이크로 피펫은 유리 모세관의 중앙 부분을 가열하여 당겨서 제작합니다.유리가 녹기 시작하면 모세관의 두 반쪽을 서로 당겨 두 개의 마이크로 피펫을 생성합니다. 본 실험에서 사용되는 피펫 팁의 크기는 일반적으로 2~6 µm 범위입니다. 세포 크기에 따라 외경이 결정되며, 팁의 모양은 유리 모세관을 피펫 풀러(pipette puller

micropipette-aspiration-substrate-attached-cells-to-estimate-cell

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 세포 굽힘 강성을 측정 광학 트랩과 커버 - 미끄럼 방지 표면에 부착된 굽힘 filamentous 박테리아 세포에 대한 프로토콜을 제시한다.

광학 트랩을 사용하여 박테리아 세포의 굽힘 강성을 측정

우리는 글로벌 또는 지역화된 스트레인 응용 프로그램에 대한 응답으로 하나의 살아있는 자기편 세포에서 유도된 핵 및 cytoskeletal deformations을 측정하기 위해 두 개의 독립적인, 현미경 기반의 도구를 제시한다. 이러한 기술은 핵 강성 (즉, deformability)을 확인하고 핵과 cytoskeleton 세포 사이에 강제로 전송을 탐사하는 데 사용됩니다.

계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작

두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 - 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette - 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 - 1을 사용하여 exemplified입니다.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

내피 glycocalyx의 기계적 특성은 AFM의 cantilevers에 마이크론 크기의 영역을 사용하여 들여 쓰기에 의해 측정되었다. 내피 세포는 glycocalyx 식을 유도하기 위해 생리 흐름 조건에서 사용자 정의 챔버에 배양 하였다. 데이터는 glycocalyx 두께와 탄성 계수를 결정하기 위해 박막 모델을 사용 분석 하였다.

원자 힘 현미경과 내피 Glycocalyx의 기계적 성질을 정량화

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

여기에서는 멀티웰 플레이트 형식의 폴리아크릴아미드 겔을 빠르고 효율적이며 저렴하게 준비할 수 있는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 특수 장비가 필요하지 않으며 모든 연구 실험실에서 쉽게 채택할 수 있습니다. 경직성 의존적 세포 반응을 이해하는 데 중점을 둔 연구에 특히 유용할 것입니다.

간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석

Kilopascal 범위에 있는 강성과 기판은 순수 관련 마이크로 환경 강성을 세포의 반응을 유용 합니다. Widefield 형광 현미경을 사용 하 여, 소프트 실리콘 젤의 영의 계수는 들여쓰기를 사용 하 여 적합 한 영역을 확인할 수 있습니다.

Widefield 형광 현미경을 사용 하 여 Mechanobiology 연구에 대 한 부드러운 실리콘 기판의 강성 측정

기계적 힘은 세포 이동을 제어하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 유리 마이크로파이펫 및 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 변형될 수 있는 탄성 하이드로겔의 사용을 입증하여 세포 구조 및 이동의 변화를 유도하기 위해 국소 강성 구배를 가진 세포를 자극한다.

세포 운동 및 관련 신호 이벤트의 기계적 제어를 평가하기위한 단일 세포 Durotaxis 분석

여기에 제시된 것은 mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)라고하는 전자 기반 미세 유체 플랫폼을 사용하여 단일 세포를 기계적으로 표현형하는 방법입니다. 이 플랫폼은 1-10 cells/s의 적당한 처리량을 유지하면서 세포의 탄성 및 점성 생물물리학적 특성을 모두 측정합니다.

Mechano-Node-Pore 감지: 다중 파라미터 단일 셀 점탄성 측정을 위한 신속한 무표지 플랫폼

기계적 스트레스 하에서의 세포 거동에 대한 탐구는 세포 역학 및 기계생물학의 발전에 중추적인 역할을 합니다. 당사는 단일 세포에서 세포 내 신호의 포괄적인 분석과 제어된 기계적 자극을 결합하는 새로운 방법인 형광 마이크로피펫 흡인(fMPA) 기법을 소개합니다. 이 기술은 살아있는 세포 기계생물학에 대한 새로운 심층 연구를 조사합니다.

적혈구 메카노센싱을 조사하기 위한 형광 마이크로피펫 흡인 분석

배우세요 마이크로피펫 흡입법을 이용하여 기판에 부착된 세포의 강성을 측정하는 방법을. 음압을 가해 세포막 변형을 관찰하고 생물역학적 특성을 정량화하여 혈관 내피세포의 물리적 변화를 분석할 수 있습니다.

기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

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