실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

이 동영상은 이중 채널 동시 획득을 사용하여 T 세포 수용체 신호 전달 이벤트를 추적하는 절차를 설명합니다. 전반사 형광 현미경 또는 잔디 현미경 첫 번째 T 세포는 지질 고정 펩타이드를 통합한 유리 지지 지질 이중층인 GFP 태그가 지정된 ZAP 70을 인코딩하는 플라스미드로 형질 주입됩니다. MHC 복합체, 접착 분자 및 공동 자극 분자가 준비됩니다.

ZAP 70 형질주입된 T 세포는 T 세포 수용체가 펩타이드 MHC 복합체에 의해 결합될 때 이중층에 추가됩니다. T세포 수용체와 관련된 CD 3쇄는 SARC 패밀리 키나아제 LCK에 의해 인산화되고, 키나아제 zap 70은 세포질에서 모집됩니다. 그런 다음 T 세포 수용체를 형광 표지하고 세포를 커버 유리보다 굴절률이 낮은 매체에 담그고 내부 전반사를 겪는 각도로 레이저 빔에 의해 조명되는 이미징을 수행합니다.

이것은 유리 물 계면에서 소멸파를 생성하고, 이 파동은 매체 내부로 기하급수적으로 감소하여 100-200나노미터의 침투 깊이를 허용합니다. 따라서 원형질막에 있거나 매우 가까운 fluoro fours만 여기됩니다. 결과 이미지를 분석한 결과, T 세포 수용체 미미 클러스터에서 신호 전달이 이루어지는 것으로 나타났습니다.

잔디 현미경 검사 또는 기존 컨포칼 현미경의 주요 장점은 신호 클러스터 또는 TCR 마이크로 클러스터와 같은 신호 복합체를 쉽게 시각화할 수 있도록 더 나은 해상도를 얻을 수 있다는 것입니다. 트래비스 크리츠와 첸. 제 연구실의 두 박사후 연구원 모두 maxi nucleo affection 기술을 사용하여 일차 마우스 T 세포를 transfection한 다음 전반사 형광 현미경 또는 항원이 포함된 새 지질 담즙층 유리로 자극한 잔디 M을 사용하여 이미지화하는 방법을 시연할 것입니다.

이 방법은 T 세포, B 세포, 자연 살해 및 마스터 세포를 포함한 다양한 면역 세포의 신호 전달을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 이 방법은 광범위하게 적용할 수 있으며 특히 신호전달이 클러스터에서 발생하는 경우 포유류 세포에서 대부분의 수용체 시스템을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법을 처음 접하는 개인은 T 세포가 transfection이 매우 어렵기 때문에 처음에는 어려움을 겪을 수 있습니다.

또한 T 세포 생존율과 transfection 효율, bilar 품질 및 현미경 정렬이 목표에 부합하도록 정밀한 조정이 필요합니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 AM maxa 마우스 T세포 핵 효과기 키트를 사용하여 GFP에 의해 태그된 발현 플라스미드 및 코딩 신호 분자로 비접촉 또는 체외로 활성화된 1차 T 세포를 transfection하는 것입니다. 본 연구에서 사용된 모든 T세포는 K의 MHC 분자 IE에서 발견된 MCC 펩타이드를 인식하는 A-N-D-T-C-R을 발현했으며, 여기에 나타난 형질주입 절차는 제조사의 권고에 따라 수행된다.

그러나, transfection 후 T cell의 생존력을 촉진하는 몇 가지 팁이 제시되어 있습니다. 생존율과 transfection 효율은 모두 in vive 세포보다 in vitro activated T cell에서 더 높기 때문에 이 프로토콜은 시작하기 전에 in vitro activated T cell을 사용합니다. 20 마이크로리터 구성 요소, A 20 마이크로리터 구성 요소, B 20 마이크로리터 키트에 제공된 1.9 ml의 배지 및 100 마이크로리터의 소 태아 혈청을 2 밀리리터 튜브에 결합하여 각 transfection에 대해 2 밀리리터의 보충된 T 세포 배지를 준비합니다.

2ml의 매체를 12웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 플레이트를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 최소 한 시간 동안 두어 배지가 평형을 이루도록 합니다.세포가 평형을 이루도록 하면 차갑거나 pH 7.2가 아닌 배지에서 형질주입된 세포의 Resus 현탁액이 발생합니다. transfection 혼합물을 준비하기 위해 82마이크로리터의 마우스 T-세포 핵 효과기 용액을 18마이크로리터의 보충제 2 및 5마이크로그램의 내독소 유리 플라스미드 DNA를 태핑으로 철저히 혼합하여 마이크로리터당 0.5마이크로그램 이상의 농도로 결합합니다.

5-1,000만 개의 세포를 15ml 원심분리기 튜브로 옮기고, 스핀 후 실온에서 5분 동안 75배 G로 원심분리합니다. 진공 흡입기를 사용하여 가능한 한 많은 상층액을 제거하여 형질주입 혼합물에 세포 펠렛을 재현탁시키고, 큰 세포 덩어리가 남지 않을 때까지 세포 펠렛을 3-4회 천천히 흡인합니다. 피펫을 사용하여 현탁액을 인증된 amaxa vete로 조심스럽게 옮겨 기포가 없는지 확인했습니다.

핵 효과기 장치에서 qve select 핵 효과기 프로그램 X 0 0 1을 닫습니다. 큐베트 홀더에 베트를 삽입하고 버튼을 눌러 선택한 프로그램을 적용하세요. 그런 다음 즉시 vete 및 사전 평형 배양 배지를 후드로 옮깁니다.

제공된 플라스틱 피펫을 사용하여 약 500마이크로리터의 사전 평형 매체를 vete에 추가합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 플레이트의 배지에 추가합니다. 한 방울 한 방울.

GFP 표지된 단백질의 낮은 수준 발현을 허용하고 과발현으로 인한 인공물의 출현을 최소화하기 위해 섭씨 37도에서 4시간 동안 세포를 배양합니다. 이 섹션에서는 현미경의 모든 구성 요소에서 전원을 켜기 전에 2채널 동시 이미징을 위해 현미경을 정렬하는 방법에 대해 설명합니다. 컴퓨터와 소프트웨어를 시작합니다.

그런 다음 모든 하드웨어 구성 요소가 소프트웨어에서 인식되는지 확인합니다. 오류 메시지 없이 소프트웨어가 시작되므로 모든 구성 요소가 감지되었습니다. 1마이크로리터의 하위 해상도를 희석합니다.

Flores는 공동 국소화 표준으로 사용하기 위해 2밀리리터의 PBS로 밝은 다중 형광 마이크로스피어를 만듭니다. 그런 다음 0.25 밀리리터의 마이크로 스피어 현탁액을 lab tech 8 웰 챔버 커버 유리 시스템의 각 웰에 추가합니다. 챔버 슬라이드 시스템을 대물렌즈 위의 플랫폼에 놓습니다.

그런 다음 구슬이 유리에 흡수되어 라이브 미리보기에 초점을 맞춥니다. 왼쪽 창은 GFP 형질주입된 세포가 표시되는 채널입니다. 오른쪽 창에는 살아있는 세포 이미징 실험 중에 레이블이 지정된 TCR이 표시됩니다.

XY, Z 파이버 발사의 Y 정렬을 사용하여 빔이 대물렌즈에서 나와 천장에 투사되도록 레이저 빔의 위치를 조정합니다. 대물렌즈가 유리 평면의 초점이 맞춰진 위치에 있을 때 이 작업을 수행하는 것이 중요합니다. 천장의 빔이 확산되면 빔이 정렬되지 않습니다.

Z 마이크로미터를 조정하여 실험에 사용할 각 레이저 라인에 대한 전체 대조 테스트 대조를 달성합니다. 그런 다음 레이저 파워 미터를 사용하여 각 채널에 대해 레이저 파워를 20-30마이크로와트로 조정합니다. T cell은 레이저 방사선에 매우 민감하며 조명은 총 50 마이크로 와트로 제한됩니다.

다음으로 잔디의 각도를 설정합니다. 파이버 런치에서 Y 정렬 마이크로미터를 돌려 빔이 각도가 될 때까지 천장에서 멀어지도록 이동합니다. 대물렌즈와 관련하여 광축은 90도에 접근합니다.

내부 전반사에 대한 임계각에 도달하면 레이저 광이 더 이상 대물렌즈를 벗어나지 않습니다.잔디 정렬이 이루어졌는지 여부를 평가하려면 커버 유리의 평면을 통해 위아래로 초점을 맞춥니다. 여기서 표면에 흡수된 구슬이 초점에서 벗어날 때 많은 구슬이 용액에 떠 있는 것을 볼 수 있습니다. 좋은 잔디 정렬을 얻으려면 대물렌즈에 대한 빔의 각도를 증가시켜야 합니다.

빔의 각도가 증가함에 따라 표면 근처에 떠 있는 비드가 사라지기 시작하고 계면에서 흡수된 비드의 강도가 증가합니다. 이제 계면에 흡수된 비드가 초점에서 벗어나면 용액에 떠 있는 비드가 보이지 않습니다. 이 시점에서 잔디는 커버 슬립에 흡수된 비드만 들어갈 수 있으므로 적절하게 정렬됩니다. 초점.

다음으로, 적색 및 녹색 형광 채널을 서로에 대해 정렬하려면 비드에 초점을 맞추고 두 채널에서 생성된 이미지에서 식별 가능한 특징의 위치를 비교합니다. 한 카메라 스탠드에 있는 X 및 Y 마이크로미터 나사를 사용하여 비드의 상대 위치를 가능한 한 가깝게 가져옵니다. 여기. 두 채널 간의 공간 정렬을 보장하기 위해 두 이미지의 왼쪽 하단 사분면에 있는 밝은 구슬을 주목하십시오.

이 기능은 두 이미지에서 동일한 상대 위치로 가져옵니다. 두 채널 모두에서 이미지를 캡처하고 저장합니다. 이러한 이미지는 두 채널을 정렬하기 위한 공동 국소화 표준으로 사용됩니다.

이 정렬의 예는 정렬 전에 여기에서 볼 수 있습니다. 채널 중 하나는 이 이미지에서 볼 수 있듯이 다른 채널에 대해 회전하며, 여기서 하위 해상도 비드의 두 채널로부터의 이미지가 중첩됩니다. 조정 후 이미지가 여기에 표시된 대로 정렬됩니다.

정렬의 품질은 GFP 형질주입된 살아있는 세포의 이미지를 비교함으로써 더 면밀히 조사할 수 있습니다. 두 채널의 Laila 포디움이 어떻게 완벽하게 정렬되어 있는지 확인하십시오. 두 이미지를 정렬한 후 형광 마이크로비드를 사용하여 설정된 보정을 사용합니다.

현미경이 설정되면 항원을 나타내는 유리 지지 지질 이중층을 포함하는 플로우 챔버를 준비하고 TRANSFECTED T 세포가 기질과 상호 작용하는 것을 먼저 시각화하기 위해 잔디 M을 수행합니다. Ana와 Dustin이 설명한 프로토콜에 따라 NI NTA 지질, 접착 분자 ICAM ONE 및 펩타이드 MHC 복합체를 포함하는 유리 커버 슬립에 형성된 평면 지질 이중층이 있는 플로우 챔버를 조립합니다. MCC 로드 IEFK는 히스티딘 태그를 통해 이중층에 통합됩니다.

공동 자극 분자 CD 80이 포함되어 있습니다. GPI 앵커를 사용하여 플로우 셀을 현미경 스테이지에 놓고 텐션 바를 사용하여 챔버를 현미경 스테이지의 어댑터 플레이트에 부착하여 고정시켜 안정화합니다. 다음으로, 제조업체가 제공한 발열체를 플로우 셀에 부착하여 온도를 제어합니다.

대물렌즈를 이중층에 배치하고 이중층 평면에 초점을 맞춰 대물렌즈를 가열하고 플로우 셀과 대물렌즈 히터의 플로우 셀 스위치를 사용하여 챔버의 온도를 섭씨 37도까지 끌어올립니다. 4시간의 배양 후, 형질주입된 T 세포를 15ml 튜브에 옮기고 G의 80배 속도로 원심분리합니다.300마이크로리터의 H-B-S-B-S-A 완충액에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 H 57 FAB 또는 H 57 단쇄 가변 단편을 추가하여 TCR을 fab의 경우 밀리리터당 10마이크로그램, 단일 쇄 가변 단편의 경우 밀리리터당 20마이크로그램의 최종 농도로 표시합니다.

셀을 5밀리리터 팩스 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 1밀리리터 슬립 팁 주사기를 사용하여 3방향 밸브를 통해 세포를 플로우 챔버에 주입합니다. 이중 채널 라이브 획득이 TCR 및 GFP 채널의 실시간 미리보기를 표시하고 형질주입된 세포가 있는 필드를 찾을 수 있도록 이미징 조건을 설정합니다.

TCR과 GFP 간의 강도 차이로 인해 두 채널 모두에서 셀을 시각화할 수 있도록 이미지의 스케일링을 실시간으로 조정해야 할 수 있습니다. 여기의 경우와 같이 측면 멤브레인 염색을 감지하기 위해 유리 평면의 초점을 맞춰 잔디 조명을 확인합니다. 측막에 초점이 맞지 않으면 잔디 정렬이 양호한 것입니다.

이 실시간 미리보기에서는 현미경을 양호한 잔디 정렬로 만들기 위해 커버 슬립의 평면과 커버 슬립의 초점을 벗어날 때 모두 측면 멤브레인 염색이 분명합니다. 대물렌즈에 대한 레이저의 각도가 증가하고 측면 멤브레인이 초점을 벗어납니다. 개별 이미지와 타임랩스 시퀀스를 10초 간격으로 캡처하기 시작합니다.

5분 동안, 세포를 유리로 지지되고 제곱당당 6개의 분자를 포함하는 INTA 이중층에서 배양했습니다. 펩타이드가 로드된 히스트 태그가 지정된 마이크로미터의 IEFK, Alexa 6, 4, 7, 공액 히스트 태그 ICAM 1개 및 제곱당 분자 100개. GPI 앵커 CD 80 듀얼 채널 동시 수집 잔디 현미경의 마이크로미터는 Alexa 5 46 conjugated H five seven FAB fragment의 연속적인 존재 하에서 수행되었습니다.

염색하기 위해 TCR 세포를 이중층과의 초기 접촉 후 최대 1시간까지 이미지화했습니다. 셀당 ZAP 70 클러스터의 수는 자동화된 클러스터 카운팅 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. 각 사례에서 최소 40개의 세포를 분석했습니다.

로드된 펩타이드는 삽입물에 표시되어 있습니다. ICAM one은 Alexa 6, 4, 7 conjugated의 제곱 마이크로미터당 100개의 분자를 포함하는 이중층 상의 세포를 말합니다. 그림에서 볼 수 있듯이 그의 태그가 붙은 ICAM 1은 ZAP 70 의존 신호전달이 TCR 마이크로 클러스터에서 발생하며 이 영화에서 볼 수 있듯이 프레임당 10초로 촬영된 작용제 리간드에만 반응합니다.

작용제 펩타이드에 대한 반응으로 TCR 신호전달은 ZAP 70을 모집하는 접촉 영역의 주변부에서 TCR 마이크로 클러스터의 지속적인 생성에 의해 유지됩니다. 이 동영상을 시청한 후에는 maxa nuclear affection 기술을 사용하여 primary T cell을 transfection하는 방법과 잔디 현미경을 사용하여 GFPT 신호 분자를 TCR 마이크로 클러스터로 동원하는 방법을 적절하게 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 7시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 일차 세포를 매우 부드럽게 다루어야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 실험의 각 단계에서 세포가 건강할수록 transfection 효율이 높아지고 이미징에서 더 많은 세포를 포착할 수 있습니다. T cell은 mt가 높기 때문에 TCR 및 GFP 채널의 순차적 이미징으로 인해 TCR 마이크로 클러스터 및 세포의 이동으로 인해 두 이미지가 완벽하게 정렬되지 않습니다.

이 문제를 극복하기 위해 당사는 이중 채널 동시 획득 잔디 현미경을 개발했습니다.