Name: 실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 10 s
Description: 배우세요 TIRF 현미경을 활용한 T세포 수용체 신호 전달 이벤트 추적 방법입니다. GFP 표지 ZAP-70을 이용한 이중 채널 동시 취득 기술로 면역 세포 신호 전달 메커니즘을 실시간 관찰할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 알레르기 및 감염성 질병, 건강의 국립 연구소의 국립 연구소의 교내 연구 부문에 의해 지원되었다. 우리는이 연구에서 사용 H57의 scFv으로 우리를 제공하는 요하네스 Huppa과 마크 데이비스에게 감사합니다. RV가이 기술의 개발시 유용한 논의 Keir 노이만 감사드립니다.

<ol><li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+cell+receptor%3A+critical+role+of+the+membrane+environment+in+receptor+assembly+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The T cell receptor: critical role of the membrane environment in receptor assembly and function.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 101-125 (2005).</li>
<li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S.T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">S.T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 591-619 (2009).</li>
<li>Bezbradica, J. S., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+cytokine+and+heterologous+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integration of cytokine and heterologous receptor signaling pathways.</a> Nat. Immunol. 10, 333-339 (2009).</li>
<li>Fraser, I. D., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+the+network%3A+signaling+cross-talk+in+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Navigating the network: signaling cross-talk in hematopoietic cells.</a> Nat. Immunol. 10, 327-331 (2009).</li>
<li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Curr. Protoc. Immunol. Chapter 18, 13-13 (2007).</li>
<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li>
<li>Yokosuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat. Immunol. 6, 1253-1262 (2005).</li>
<li>Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463, 963-967 (2010).</li>
<li>Tolar, P., Pierce, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conformation-induced+oligomerization+model+for+B+cell+receptor+microclustering+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A conformation-induced oligomerization model for B cell receptor microclustering and signaling.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 340, 155-169 (2010).</li>
<li>Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+skeleton+controls+diffusion+dynamics+and+signaling+through+the+B+cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The membrane skeleton controls diffusion dynamics and signaling through the B cell receptor.</a> Immunity. 32, 187-199 (2010).</li>
<li>Treanor, B., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insight+into+lymphocyte+activation+through+quantitative+imaging+and+theoretical+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insight into lymphocyte activation through quantitative imaging and theoretical modelling.</a> Curr. Opin. Immunol. 19, 476-483 (2007).</li>
<li>Sylvain, N. R., Nguyen, K., Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vav1-mediated+scaffolding+interactions+stabilize+SLP-76+microclusters+and+contribute+to+antigen-dependent+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Vav1-mediated scaffolding interactions stabilize SLP-76 microclusters and contribute to antigen-dependent T cell responses.</a> Sci. Signal. 4, ra14-ra14 (2011).</li>
<li>Purbhoo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+subsynaptic+vesicles+and+surface+microclusters+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Dynamics of subsynaptic vesicles and surface microclusters at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 3, ra36-ra36 (2010).</li>
<li>Lasserre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezrin+tunes+T-cell+activation+by+controlling+Dlg1+and+microtubule+positioning+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">Ezrin tunes T-cell activation by controlling Dlg1 and microtubule positioning at the immunological synapse.</a> EMBO. J. 29, 2301-2314 (2010).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+7%3A+Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).</li>
<li>Williamson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+clusters+of+the+adaptor+Lat+do+not+participate+in+early+T+cell+signaling+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pre-existing clusters of the adaptor Lat do not participate in early T cell signaling events.</a> Nat. Immunol. 12, 655-662 (2011).</li>
</ol>

이 실험에 사용된 모든 동물들은 무균 환경에서 유지되었으며, 실험은 보건 동물 관리 및 사용위원회의 국립 연구소에 의해 승인되었다.

우리는 여기서 TIRFM과 인조 APCs과 같은 유리를 지원 지질 bilayers를 사용하여 항원에 특정한 기본 마우스 T 세포에 신호를 공부하는 시스템을 설명합니다. 기술은 성공적으로 이들 세포에 GFP 태그가 단백질을 표현에 의존합니다. T 세포를 Transfecting 것은 언제나 어려운 작업입니다. 일반적으로 retroviruses 또는 lentiviruses을 사용하여 electroporation이나 유전자 전달이 사용됩니다. 한 기술은 다른여 우수하지 않으며 모두 자신의 한계와 장점이 있습니다. 1) 이는 retroviruses 아니지만 lentiviruses 필요로 세포가 활발히 분열하는 것이 필요하지 않습니다, 그리고 2) 표현 수준이 세포 이미징 전에 incubated되는 시간을 변화하여 제어할 수 있습니다 : 우리는 electroporation은 다음과 같은 장점이있다 찾습니다. 가장 큰 단점은 우리가 매우 어려운 일차 세포의 크기가 큰 단백질을 표현하는 것입니다. 우리는 electroporation 이후 우리에게 아주 좋은 세포 생존 능력을 제공 방법을 제시했습니다. 결과적으로 그것은 applicab입니다siRNA의 중재 유전자 입을를 달성하기 위하여 그것을 사용 르. 우리는 또한 여기서 chromatically 수정하고 다른 파장에 대해 별도의 정렬이 필요없는 맞춤형 두 채널 동시 수집 TIRF 현미경을 설명합니다. 이러한 기능은 있지만 상업적으로 사용할 수 있습니다. 저희 시스템은 TIRF 현미경 분야의 전문가에 의해 출판 및 상업 대안보다 저렴의 원리에 근거한다. 우리 디자인의 한 가지 비판은 우리가 다른 여기 파장에 대한 발생률의 동일한 각도를 사용하고있다는 것입니다. 이것은 다른 여기 파장에 대해 다른 TIRF의 침투 깊이가 나타날 수 있습니다. 우리는 지극히 미미한 파도가 기하 급수적으로 부패 분야이며 TIRF 필드의 깊이가 파장의 선형 함수이기 때문에 이러한 효과가 작기 생각합니다. 유리 표면에 가까운 Fluorophores는 두 파장 사이의 레이저 농도에는 차이가 발생할하지 않습니다. PE 근처 fluorophores위한netration 깊이는 강도 차이는 두 파장 488 및 561 nm의를위한 두 파장 488 및 640 nm의 및 1.15 배위한 1.3 배 될 것입니다. 동일한 시스템 TIRF 조명을 사용하게 수퍼 해상도 기술과 함께 사용될 수 있습니다. 우리는 또한 사용자 정의 내장입니다 두 카메라의 시스템을 설명했습니다. TIRF 시스템과 마찬가지로 유사한 apparatuses 또한 상업적으로 사용할 수 있습니다. Google 시스템은 파장의 서로 다른 조합과의 사용할 수 있도록 필터와 dichroics을 변경하는 유연성을 제공합니다. 시스템의 단점은 두 이미지를 정렬하는데 필요한 회전 한 정도입니다. 이 문제는 압전 구동과 정렬의 회전 정도를 제공하고 있습니다 카메라 스탠드를 사용하여 해결할 수 있습니다. 우리는 또한 성공적으로 카메라는 다른 서로 다른 픽셀 크기를 가지고있는이 현미경에 두 개의 카메라 시스템을 구축했습니다. 하나 하나의 채널에서 민감도와 대형 다이 필요한 경우이 같은 시스템이 있으면 좋을 텐데또 다른 namic 범위는, 둘 다 같은 카메라에 거의 사용할 수 없습니다. 우리는 16 μm의의 픽셀 크기를 가지고 Photometrics 양의-EM 카메라와 12.9 μm의의 효과적인 픽셀 크기를 제공 2x2 binning에 Photometrics HQ-2 카메라를 사용했습니다. 180mm 초점 거리 튜브 렌즈는 양의-EM에 사용되었으며, 145mm 초점 거리 튜브 렌즈는 HQ-2 카메라 사용되었다. HQ-2 Metamorph 소프트웨어와 양의-EM은 외부 트리거 모드에서 별​​도의 컴퓨터에 마이크로 매니저 소프트웨어를 통해 제어습니다을 사용하여 통제되었다. 외부 트리거는 Metamorph의 구성 조명 설정에서 추가로 셔터로 구현된 측정 컴퓨팅 DAC 보드의 디지털 출력을 사용하여 양의-EM 카메라에 제공되었다. 튜브 렌즈의 초점 길이의 비율은 유효 픽셀 크기의 비율과 일치합니다. 대표 정렬은 그림 5에 표시됩니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 마우스 T 세포에 대한 Amaxa Nucleofector 키트 </td><td> Lonza 주식 회사 </td><td> VPA-1006 </td><td></td></tr><tr><td> PureLink HiPure 플라스미드 Midiprep 키트 </td><td> 생명 기술 </td><td> K2100-05 </td><td> 내독소 무료 디엔에이 preps위한 </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector 장치 </td><td> Lonza 주식 회사 </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> 재조합 Murine IL-2 </td><td> Peprotech 주식 회사 </td><td> 212-12 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent Microspheres 0.20μm </td><td> Polysciences 주식 회사 </td><td> 24050-5 </td><td></td></tr><tr><td> 실험실 - 테크 II 8-잘 chambered coverglass </td><td> 써모 과학, Nunc </td><td> 155,409 </td><td></td></tr></tbody></table>

실시간, tcr의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 tirf 현미경 기법

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

그것이 주요 Histocompatibility 컴플렉스 (pMHC) 항원 제시 세포 (APCs)의 표면에 표현 단백질에 의해 구속 antigenic의 펩타이드 조각으로 종사하는 경우 신호는 T 세포 수용체 (TCR)를 통해 시작됩니다. TCR 복합은 리간드 바인딩 TCRαβ의 heterodimer로 구성되어 있으며 그 동료 인 경우에는 3 번 CD dimers (εδ 및 εγ heterodimers 및 ζζ homodimer) 1 비 covalently. 수용체의 교전시 인 경우에는 3 번 CD의 ζ 체인은 Lck, SRC 가족 키나제에 의해 phosphorylated된다. 이것은 그때 Lck 의해 phosphorylated 및 활성화 Syk 가족 키나제, Zap70의 채용으로 연결됩니다. 그 후, Zap70 다른 신호 분자 2의 다수를 포함하는 근위 신호 단지의 형성을 시작, 어댑터 단백질 LAT와 SLP76을 phosphorylates. 칼슘과 RAS 종속 tra이 복잡한 결국 결과의 형성nscription 요소 활성화 및 T 세포 분화 2 야기할 유전자 발현 프로그램의 복잡한 일련의 논리상 필연의 개시. TCR 신호 (및 분화의 결과 상태)는 항원 힘 및 누화 co-stimulatory/co-inhibitory와 케모카인 및 3-4 시토킨 수용체를 포함한 기타 여러 요인에 의해 변조된 있습니다. 다양한 자극 조건에서 근위 신호 복합 공간과 시간적 조직을 공부한다는 것은 따라서, TCR 신호 경로뿐만 아니라 다른 신호 전달 경로에 의해 그 규정을 이해하는 열쇠입니다. T 세포의 플라즈마 막에서 TCR에 의해 시작 신호를 공부하는 한 매우 유용한 모델 시스템은 이전에 설명한 5-6 유리 지원 지질 bilayers입니다. 그들은 인공 APCs으로 T 세포 자찬에 antigenic의 pMHC 단지, 접착 및 공동 stimulatory 분자를 제시 활용할 수 있습니다. 영상으로 T 세포와 상호 작용총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)를 사용하여 지질 이중층, 우리는 7-8 유리와 세포 표면 사이의 공간을 100 nm의 범위까지 여기를 제한할 수 있습니다. 이것은 우리가 이미지에 주로 신호​​ 이벤트 플라즈마 막에서 발생하실 수 있습니다. 우리 이미징에서 TCR은 복합 단백질 신호의 채용에 관심이있다, 우리는 두 카메라 TIRF 이미징 시스템을 설명하는 어떤 점에서 H57 항체의 형광 팹으로 표시 TCR은 (단편 항원 결합) 조각 (하이 브리 도마 H57-597에서 정화 , ATCC, ATCC 번호 : GFP 태그가 TCRβ에 대한 구체적인 HB-218), 그리고 신호 전달 단백질은, 동시에 실시간으로 몇 군데있을 수 있습니다. 이 전략은 T 세포 모두와 TCR에서 발생하는 신호 이벤트의 높은 동적 특성으로 인해 필요합니다. 이 영상 양상 이미지 단일 리간드 9-11뿐만 아니라 활성화된 수용체에 분자를 신호 모집과 연구자를 허용하고있다12-16 원위치에서 생화학을 공부하는 훌륭한 시스템입니다.

따라서, 그것이 관여 단백질의 공간적 및 시간적 행위를 파악하는 것이 중요 신호 전달 이해하기 위해, 플라즈마 막 내에서 또는 세포 내 위치에 두 단백질의 compartmentalization 크게 신호 결과에 영향을 미칠 수있는 규제 메커니즘입니다. 우리는 여기서 T 세포의 신호 전달을 연구하는 TIRF 현미경 기반 시스템을 설명하지만, 광범위하게 적용됩니다.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

신호 전달은 주요 조직 적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex)에 결합된 항원성 펩타이드 단편에 의해 T 세포 수용체(T Cell Receptor, TCR)가 결합될 때 시작됩니다.

이 영상에서는 이중 채널 동시 획득 방식을 이용하여 T-세포 수용체 신호 전달 이벤트를 추적하는 절차를 설명합니다. 전반사 형광 현미경(TIRF microscopy)을 사용하며, 먼저 T-세포에 GFP 태그가 붙은 ZAP 70을 인코딩하는 플라스미드를 형질전환합니다. 지질 고정 펩타이드-MHC 복합체, 접착 분자 및 공자극 분자가 포함된 유리 지지 지질 이중층을 준비합니다.T-세포 수용체가 펩타이드 MHC 복합체와 결합할 때 ZAP 70이 형질전환된 T 세포를 이중층에 추가합니다. T-세포 수용체와 연관된 CD3 사슬은 SRC 가족 키나아제인 LCK에 의해 인산화되며, 키나아제 ZAP 70이 세포질에서 모집됩니다. 그 후 T-세포 수용체를 형광 표지하고 이미징을 수행하는데, 이때 세포는 커버 글라스보다 굴절률이 낮은 배지에 침전되며 전반사 현상이 일어나는 각도로 레이저 빔을 조사합니다.이는 유리-물 계면에서 소멸파를 생성하며, 이 파동은 매질 내로 지수함수적으로 감쇠하여 100에서 200 nanometers의 침투 깊이를 갖게 합니다. 따라서 형질막에 있거나 그에 매우 인접한 형광체만이 여기됩니다. 결과 이미지의 분석을 통해 T 세포 수용체 마이크로 클러스터에서 신호 전달이 일어남을 알 수 있습니다.TIRF 현미경 또는 일반적인 공초점 현미경의 주요 장점은 해상도가 더 뛰어나기 때문에 TCR 마이크로 클러스터와 같은 신호 전달 클러스터나 신호 전달 복합체를 쉽게 시각화할 수 있다는 점입니다. 저희 실험실의 박사후 연구원인 Travis Crites와 Chen이 maxi nucleo affection 기술을 사용하여 일차 마우스 T 세포를 형질전환하는 방법과, 항원을 포함하는 유리 지질 이중층으로 자극한 후 전반사 형광 현미경(TIRF M)을 사용하여 이를 이미징하는 방법을 시연할 것입니다.이 방법은 T 세포, B 세포, 자연 살해 세포 및 비만 세포를 포함한 다양한 면역 세포의 신호 전달을 연구하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 본 방법은 범용성이 넓어 포유류 세포의 대부분의 수용체 시스템, 특히 신호 전달이 클러스터 형태로 일어나는 경우를 연구하는 데 유용합니다. T 세포는 형질전환이 매우 어렵기 때문에 이 방법이 생소한 사용자는 초기에 어려움을 겪을 수 있습니다.또한 T세포의 생존율과 형질전환 효율, bilar 품질 및 현미경 정렬이 기준치에 도달할 수 있도록 정밀한 조정이 필요합니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 AM maxa mouse T-cell nucleo effector kit를 사용하여 나이브 T세포 또는 인 비트로(in vitro) 활성화된 일차 T세포에 발현 플라스미드와 GFP가 태그된 코딩 신호 분자를 형질전환하는 것입니다. 본 연구에 사용된 모든 T세포는 K의 MHC 분자 IE에서 발견되는 MCC 펩타이드를 인식하는 A-N-D-T-C-R을 발현하였습니다. 여기에 제시된 형질전환 절차는 제조사의 권장 사항에 따라 수행되었습니다.하지만, transfection 이후 T 세포의 생존능을 높이기 위한 몇 가지 팁을 제시합니다. 생존능과 transfection 효율 모두 naive 세포보다 in vitro 활성화된 T 세포에서 더 높기 때문에, 본 프로토콜에서는 시작 전 in vitro 활성화된 T 세포를 사용합니다. 2 mL 튜브에 키트에 제공된 배지 1.9 mL, 성분 A 20 µL, 성분 B 20 µL, 그리고 fetal bovine serum 100 µL를 혼합하여 각 transfection당 2 mL의 보충된 T-cell medium을 준비하십시오.12-웰 플레이트의 각 웰에 배지 2 mL를 분주합니다. 배지가 평형 상태에 도달할 수 있도록 플레이트를 37 °C의 습윤 배양기에 최소 1시간 동안 둡니다. 차갑거나 pH 7.2가 아닌 배지에 형질전환된 세포를 재현탁하면 세포 사멸이 일어납니다. 형질전환 혼합물을 준비하려면, 마우스 T-세포 nucleo effector 용액 82 µL와 supplement two 18 µL, 그리고 0.5 µg/µL 이상의 농도로 준비된 엔도톡신 프리 플라스미드 DNA 5 µg을 혼합한 후 가볍게 쳐서 충분히 섞어줍니다.500만에서 1,000만 개의 세포를 15 milliliter 원심분리관으로 옮긴 후, 상온에서 75 ×g로 5분간 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 진공 흡입기를 사용하여 상층액을 최대한 제거하고, 세포 펠릿을 transfection 혼합액에 부드럽게 재현탁하며, 세포 덩어리가 남지 않을 때까지 세포 펠릿을 3~4회 천천히 흡입합니다. 피펫을 사용하여 현탁액을 인증된 amaxa vete로 조심스럽게 옮기며, 이때 기포가 생기지 않도록 주의합니다.nucleo effector 장치에서 qve select nuclear effector 프로그램 X 0 0 1을 선택하십시오. vete를 Q vete 홀더에 삽입하고 버튼을 눌러 선택한 프로그램을 적용하십시오. 그 후 vete와 사전 평형화된 배양 배지를 즉시 후드로 옮기십시오.제공된 플라스틱 피펫을 사용하여, 미리 평형을 맞춘 배지 약 500 µL를 웰에 첨가합니다. 그 다음, 플레이트 내의 배지에 세포 현탁액을 한 방울씩 떨어뜨려 첨가합니다.GFP 태그 단백질의 낮은 수준의 발현을 유도하고 과발현으로 인한 아티팩트의 발생을 최소화하기 위해 세포를 37 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 이 섹션에서는 현미경의 모든 구성 요소의 전원을 켜기 전에, 2채널 동시 이미징을 위한 현미경 정렬 방법을 설명합니다. 컴퓨터와 소프트웨어를 실행하십시오.그 다음 모든 하드웨어 구성 요소가 소프트웨어에 의해 인식되는지 확인하십시오. 소프트웨어가 오류 메시지 없이 시작되었다면 모든 구성 요소가 감지된 것입니다. sub resolution 1 µL를 희석하십시오.공국소화 표준으로 사용하기 위해 형광 밝은 다중 형광 마이크로스피어를 2 mL의 PBS에 분산시킵니다. 그런 다음, Lab Tech 8-웰 챔버 커버글라스 시스템의 각 웰에 마이크로스피어 현탁액 0.25 mL를 첨가합니다. 챔버 슬라이드 시스템을 대물렌즈 위의 플랫폼에 놓습니다.그다음 라이브 미리보기 화면에서 유리 위의 비드 흡착 부위에 초점을 맞춥니다. 왼쪽 창은 GFP가 형질전환된 세포가 관찰되는 채널입니다. 오른쪽 창은 살아있는 세포 이미징 실험 중에 표지된 TCR을 보여줍니다.XY, Z 광섬유 런치의 Y축 정렬을 사용하여, 레이저 빔이 대물렌즈 밖으로 나와 천장에 투사되도록 빔의 위치를 조정하십시오. 이때 대물렌즈가 유리 평면의 초점이 맞는 위치에 있어야 합니다. 천장에 투사된 빔이 퍼져 보인다면, 빔이 평행하게 정렬되지 않은 것입니다.실험에 사용할 각 레이저 라인에 대해 완전한 콜리메이션 테스트 콜리메이션을 달성하도록 Z 마이크로미터를 조정하십시오. 그런 다음 레이저 파워 미터를 사용하여 각 채널의 레이저 출력을 20 to 30 µW로 조정하십시오. T 세포는 레이저 방사에 매우 민감하므로 조명은 합계 총 50 µW로 제한됩니다.다음으로 turf의 각도를 설정합니다. 대물렌즈의 광축과 빔의 각도가 90도에 가까워질 때까지 파이버 런치의 Y 정렬 마이크로미터를 돌려 빔을 천장에서 멀어지게 이동시킵니다.전반사를 위한 임계각에 도달하면 레이저 광은 더 이상 대물렌즈 밖으로 나오지 않습니다. 터프 정렬(turf alignment)이 이루어졌는지 확인하려면 커버 글라스 평면을 기준으로 초점을 위아래로 조절하십시오. 이때 표면에 흡착된 비드들의 초점이 흐려지면서 많은 비드들이 용액 속에 떠 있는 것이 관찰되는 것을 확인할 수 있습니다. 양호한 터프 정렬을 달성하려면 대물렌즈에 대한 빔의 각도를 증가시켜야 합니다.빔의 각도가 증가함에 따라 표면 근처에 떠 있는 비드들은 사라지기 시작하고, 계면에 흡착된 비드들의 강도는 증가합니다. 이제 계면에 흡착된 비드들을 초점에서 벗어나게 하면, 용액에 떠 있는 비드들은 더 이상 보이지 않게 됩니다. 이 시점에서 커버슬립에 흡착된 비드들만 초점에 맞을 수 있으므로, 터프(turf)가 적절하게 정렬된 것입니다.다음으로, 적색 및 녹색 형광 채널의 정렬을 맞추기 위해 비드에 초점을 맞추고 두 채널에서 생성된 이미지의 식별 가능한 특징들의 위치를 비교합니다. 한쪽 카메라 스탠드의 X 및 Y 마이크로미터 나사를 사용하여 비드의 상대적 위치를 최대한 가깝게 맞춥니다. 두 채널 간의 공간적 정렬을 확인하기 위해 두 이미지의 왼쪽 하단 사분면에 있는 밝은 비드를 확인하십시오.이 특징을 두 이미지 모두에서 동일한 상대적 위치에 맞춥니다. 두 채널 모두에서 이미지를 캡처하고 저장합니다. 이 이미지들은 두 채널을 정렬하기 위한 공국소화 표준으로 사용됩니다.이러한 정렬의 예시로, 정렬 전의 상태가 여기에 나타나 있습니다. 서브 해상도 비즈의 두 채널 이미지가 중첩된 이 이미지에서 보는 바와 같이, 한 채널이 다른 채널에 대해 회전되어 있습니다. 조정 후의 이미지는 여기에 표시된 것처럼 정렬됩니다.GFP가 형질전환된 살아있는 세포의 이미지를 비교함으로써 정렬 품질을 추가로 정밀하게 검토할 수 있습니다. 두 채널의 Laila podium이 완벽하게 정렬되어 있는지 확인하십시오. 이는 형광 마이크로비즈를 사용하여 설정한 보정 값을 통해 두 이미지를 정렬한 결과입니다.현미경 설정이 완료되면, 항원을 제시하는 유리 지지 지질 이중층이 포함된 유동 챔버를 준비하고, 먼저 기질과 상호작용하는 형질전환 T 세포를 시각화하기 위해 turf M을 수행합니다. Ana와 Dustin이 기술한 프로토콜에 따라, Ni-NTA 지질, 접착 분자인 ICAM-1 및 펩타이드 MHC 복합체가 포함된 유리 커버슬립 위에 평면 지질 이중층으로 구성된 유동 챔버를 조립합니다. MCC가 로딩된 IEFK는 히스티딘 태그를 통해 이중층에 통합됩니다.공동 자극 분자인 CD 80을 도입합니다. GPI 앵커를 사용하여 플로우 셀을 현미경 스테이지 위에 놓고, 텐션 바를 이용해 챔버를 현미경 스테이지의 어댑터 플레이트에 부착하여 고정함으로써 안정화합니다. 다음으로, 온도를 제어하기 위해 제조사에서 제공한 가열 장치를 플로우 셀에 부착합니다.대물렌즈를 이중층(bilayer) 위에 배치하고 이중층 평면에 초점을 맞춥니다. 대물렌즈와 플로우 셀의 가열을 위해 플로우 셀 및 대물렌즈 히터를 켜서 챔버 온도를 37 °C로 맞춥니다. 4시간 동안 배양한 후, 분리된 T 세포를 15 mL 튜브로 옮기고 80 ×g 속도로 원심분리합니다. 세포를 300 µL의 H-B-S-B-S-A 버퍼에 재현탁합니다. 그런 다음 TCR을 라벨링하기 위해 H 57 FAB(최종 농도 10 µg/mL) 또는 H 57 단쇄 가변 단편(최종 농도 20 µg/mL)을 첨가합니다.세포를 5 mL 팍스 튜브(fax tube)로 옮깁니다. 다음으로, 1 mL 슬립 팁 시린지를 사용하여 3방향 밸브를 통해 세포를 유량 챔버(flow chamber)에 주입합니다. 듀얼 채널 라이브 획득(dual channel live acquisition)에서 TCR 및 GFP 채널의 라이브 미리보기가 나타나도록 이미징 조건을 설정하고, 형질전환된 세포가 있는 영역을 찾습니다.TCR과 GFP의 강도 차이로 인해, 두 채널 모두에서 세포를 시각화할 수 있도록 이미지 스케일링을 실시간으로 조정해야 할 수도 있습니다. 여기에서와 같이, 유리 평면의 초점을 위로 올려 측면 막 염색 여부를 확인하여 turf 조명을 확인하십시오. 측면 막의 초점이 잡히지 않는다면 turf 정렬이 양호한 상태입니다.이 라이브 프리뷰에서는 커버슬립 평면과 커버슬립의 초점을 벗어나 현미경의 turf 정렬 상태를 최적화했을 때 모두 측면 막 염색이 뚜렷하게 나타납니다. 대물렌즈에 대한 레이저 각도가 증가하면 측면 막의 초점이 흐려집니다. 10초 간격으로 개별 이미지와 타임랩스 시퀀스 캡처를 시작하십시오.세포를 유리 지지체 및 제곱 마이크로미터당 6개의 펩타이드가 로드된 hist-tagged IEFK 분자, 제곱 마이크로미터당 100개의 Alexa 647 접합 hist-tagged ICAM-1 분자, 그리고 제곱 마이크로미터당 100개의 GPI 앵커 CD80 분자가 포함된 INTA 이층막 위에서 5분 동안 배양하였습니다. Alexa 546 접합 H57 FAB 단편을 지속적으로 처리한 상태에서 듀얼 채널 동시 획득 TIRF 현미경 관찰을 수행하였습니다.TCR을 염색하기 위해, 이층막과 처음 접촉한 후 최대 1시간까지 세포를 이미지화하였습니다. 세포당 ZAP 70 클러스터의 수는 자동 클러스터 계수 소프트웨어를 사용하여 분석하였습니다. 각 사례마다 최소 40개의 세포를 분석하였습니다.로딩된 펩타이드는 삽입 그림에 표시되어 있습니다. ICAM one은 Alexa 6 4 7이 결합된 His tagged ICAM one이 제곱 마이크로미터당 100개 분자 포함된 이중층 위의 세포를 의미합니다. 그림에 표시된 바와 같이, 프레임당 10초로 촬영된 이 영상에서 볼 수 있듯이 zap 70 의존적 신호 전달은 TCR 마이크로 클러스터에서 발생하며, 오직 작용제 리간드에 반응하여 나타납니다.작용제 펩타이드에 반응하는 TCR 신호 전달은 ZAP 70을 모집하는 TCR 마이크로 클러스터가 접촉 영역의 주변부에서 지속적으로 생성됨으로써 유지됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 맥시맥스 핵 도입 기술을 사용하여 일차 T세포를 형질전환하는 방법과 터프 현미경을 사용하여 TCR 마이크로 클러스터로의 GFPT 신호 분자 모집을 적절하게 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙련되면, 이 기술은 적절히 수행될 경우 7시간 이내에 완료할 수 있습니다.본 절차를 수행할 때, 일차 세포(primary cells)를 매우 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다. 실험의 각 단계에서 세포가 건강할수록 형질전환 효율이 높아지며, 이미지 캡처 시 더 많은 세포를 확보할 수 있습니다. T 세포는 운동성이 매우 높으며, 그 결과 TCR 및 GFP 채널을 순차적으로 이미징하면 TCR 마이크로 클러스터와 세포의 이동으로 인해 두 이미지가 완벽하게 일치하지 않을 수 있습니다.이 문제를 해결하기 위해, 저희는 이중 채널 동시 획득 터프 현미경(dual channel simultaneous acquisition turf microscope)을 개발하였습니다.

a-tirf-microscopy-technique-for-real-time-simultaneous-imaging-tcr

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 가까이 높은 콘트라스트와 시간적 해상도의 세포 표면 구조를 관찰하기위한 강력한 방법입니다. 우리는 TIRF은 세포 벽 - 동봉된 세균과 곰팡이 세포의 피질에서 단백질 역학을 공부 고용 수있는 방법을 보여줍니다.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

이 동영상은 액틴 및 미세소관 중합 역학을 시각화하기 위한 전반사 현미경 기반 기술인 TIRF에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하면 액틴과 미세소관 결합 역학의 고해상도 이미징을 실시간으로 수행할 수 있으며, 이는 세포 누화를 이해하는 데 필수적입니다.

액틴과 미세소관 결합 역학을 시각화하기 위한 TIRF 현미경 검사

출처: Daniele, F., et. SH-SY5Y 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 평가하기 위한 al TIRFM 및 pH 민감성 GFP 프로브: 세포 이미징 및 데이터 분석. J. Vis. 특급. (2015). 이 동영상은 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용하여 형광단 태그가 지정된 시냅스 소포를 시각화하는 인간 신경모세포종 세포의 이미징을 보여줍니다. 세포는 먼저 형광 모드에서 초점을 맞춥니다. 그런 다음 내부 전반사를 달성하기 위해 조정이 이루어지며, 멤브레인 근처의 형광단을 선택적으로 여기시키는 소멸파를 생성합니다. TIRF 이미징 전에 획득 매개변수가 구성되고 샘플링 주파수가 설정됩니다.

전반사(Total Internal Reflection) 형광 현미경을 사용한 세포 이미징

우리는 T 세포 활성화 과정 중에 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공하는 라이브 세포 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 정량적 인 결과는 T 세포 활성화에 걸쳐 복잡한 형성 신호를 따라 열매를 산출하는 T 세포의 확산 분석, 공 촛점 현미경 및 이미징 분석의 결합 사용을 보여줍니다.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Clathrin-mediated endocytosis는 빠르고 매우 역동적인 과정으로 신호 수용체를 포함한 많은 단백질을 내부화합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 개별 내포세포 이벤트의 동역학을 직접 시각화합니다. 이는 내포세포 기전의 핵심 구성원이 서로 어떻게 협력하는지, 그리고 단백질 화물이 이 과정에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데 필수적입니다.

TIRF 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

이 원고는 기능화된 평면 지지 지질 이중층과 접촉하는 T 세포의 면역학적 시냅스 내에서 발생하는 T 세포 항원 수용체(TCR)와 항원 펩타이드 적재 MHC 분자 사이의 결합 역학을 측정하기 위해 (단일 분자) Förster Resonance Energy Transfer(FRET) 기반 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

TCR-pMHC 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

이 프로토콜 photoactivatable 펩 티 드-MHC T 세포 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 활성화를 사용 하 여 T 세포를 활성화 하는 영상 기반 방법을 설명 합니다.

Photoactivatable 길 항 제를 사용 하 여 T 세포 활성화의 공간 및 시간 제어

여기서, TIRF 현미경 기반 시험관내 재구성 분석법이 제시되어 두 미세소관 집단의 역학을 동시에 정량화하고 비교한다. 가교된 미세소관 다발 및 단일 미세소관 상에서 다수의 미세소관-관련 단백질의 집단 활성을 동시에 보는 방법이 기술된다.

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

우리는 동적 미세 소관 및 형광 표지 된 미세 소관 관련 단백질의 동시 이미징을 위해 간섭 반사 현미경 검사 및 전체-내부-반사-형광 현미경을 구현하기위한 프로토콜을 제시합니다.

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

이 프로토콜은 시험관내 총 내부 형광 (TIRF) 현미경 분석을 사용하여 동적 액틴 및 미세 소관을 시각화하기위한 가이드입니다.

액틴과 미세소관 커플링 다이내믹스 를 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 시각화

배우세요 TIRF 현미경을 활용한 T세포 수용체 신호 전달 이벤트 추적 방법입니다. GFP 표지 ZAP-70을 이용한 이중 채널 동시 취득 기술로 면역 세포 신호 전달 메커니즘을 실시간 관찰할 수 있습니다.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

더 많은 동영상 탐색