Name: Nanodisc 지질 입자로 ABC의 전송의 Reconstitution을위한 단계별 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 배우세요 막단백질을 나노디스크에 재구성하는 방법을 MalFGK2 수송체를 사용하여. 이 기술은 막생물학 및 생화학 연구에서 용해된 환경에서 막단백질 기능을 연구하는 데 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. CSC는 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회에서 박사 친목의 지원을받는되었다. FD는 등급 II 캐나다 연구 의자입니다.

<html> 전체 Reconstitution 프로세스 reconstitution 과정은 세제 - solubilized phospholipids의 존재에 정화 MalFGK이 컴플렉스로 ​​막 비계 단백질 (MSP)를 혼합하여 시작합니다. 단계는 바이오 비즈 나 Amberlite (그림 1)라는 흡착제 폴리스티렌 소재로 세제의 느린 제거을합니다. 자동 조립 공정 때문에 소수성 phospholipids, MalFGK이 복잡하고 MSP amphipathic 단백질의 표면 사이의 apolar 상호 작용의 가능성이 가장 높은 발생합니다. 최종 제품은 MalFGK이 복잡한 주변 MSP 포장의 두 분자로 만든 원반 모양의 입자입니다. 입자는 초 원심 분리 및 분석 크기 배제 크로마토 그래피에 의한 알데히드 부가 물 및 집계에서 구분됩니다. 입자는 기본 - 겔 전기 영동 및 동적 광 산란 분광법을 특징으로하고 있습니다. 막의 제목 &quot;&gt; 1. 준비 비계 단백질, MSP <ol><li> 자신의 태그 MSP는 (버전 MSP1D1 1) E.의 플라스미드 pMSP1D1에서 생산됩니다 대장균 37 3 시간 0.5 MM 이소 프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside와 OD 600 ~ 0.5에서 유도 BL21 (DE3) ° C. </li><li> 셀은 4시 10 분 ° C에 5,000 XG에서 원심 분리하여 수확, 100 μM의 phenylmethanesulfonyl 불화를 포함하는 TSG10 버퍼에 resuspended 있습니다. </li><li> 세포는 8,000 PSI에 프랑스 프레스 (3 배)으로 lysed하고 불용성 물질은 4 ° C.에서 10 분 동안 5,000 XG에서 원심 분리에 의해 제거됩니다 MSP를 포함하는 수용성 분율은 45 분에 125,000 XG에 초 원심 분리에 의해 분리된다. </li><li> MSP는 니켈 - 상기 킬레이트 화 크로마토 그래피는 TSG10 버퍼에 ~ 1.5 ML 니켈 세 파로스 HP를 사용하여 정화되어 있습니다. 오염 물질은 50 MM 이미 다졸을 포함하는 TSG10 버퍼로 씻어 수 있습니다. MSP는 600 MM를 포함하는 TSG10 버퍼로 용출되어이미 다졸. 정화 단백질은 TSG10 버퍼에 dialyzed와 ~ 10-15 MG / ML의 단백질 농도에서 -70 ° C에 저장됩니다. </li></ol> 2. MalFGK이 단지의 작성 <ol><li> MalFGK이 단지는 MalK의 C-말단에 자신의 태그, E.의 플라스미드 pBAD22 - FGK에서 표현됩니다 대장균 BL21 (DE3)와 37 3 시간에 0.2 % L-arabinose와 OD 600에서 ~ 0.5 유도 ° C. </li><li> 단계 1.3에서와 같이 세포 용해 및 원심 분리 후, 막 펠릿은 5 MG / ML의 최종 농도에 TSG20 버퍼에 resuspended 있습니다. 자료는 부드러운 진동과 4에 3 시간에 1 % W / V N-dodecyl-β-maltopyranoside (DDM) ° C로 solubilized 있습니다. </li><li> 불용성 물질은 단계 1.3에서와 같이 초 원심 분리에 의해 제거하고 표면에 뜨는는 solubilized을 포함하고 있습니다 MalFGK이 단지는 수집 단계 1.4에서와 같이 정화하지만, 투석하지 않고 있습니다. </li><li> FurtheR 정화는 0.5 ML / 분의 유량에서 Superdex 200 HR 3백분의 10 열 TSGD 버퍼에 겔 여과 크로마토 그래피에 의해 달성된다. </li></ol> 3. Phospholipids의 작성 <ol><li> E. 대장균 총 지방질은 클로로포름에 용해 추출하는 것은 나사 캡 microfuge 튜브 1,000 nmol aliquots로 구분됩니다. 용매는 질소의 완만 한 흐름에 따라 증발 진공 건조기에서 추가 하룻밤 건조합니다. </li><li> 지질 필름은 5 nm의 최종 농도에서 TS 버퍼에 용해하고 힘차게 vortexed와 sonicated 수 있습니다. 용해 지질 인해 수성 TS 버퍼에서의 일반 불용성으로 약간 불투명 나타납니다,하지만 그들은 정지에 남아 있어야합니다. DDM은 해결책이 분명해진다되는 0.5 % (~ 10 ㎜)의 최종 농도에 추가됩니다. </li><li> 지질 혼합물은 물 목욕에 배치 및 펄스는 ~ 5 초 동안 5 회에 sonicated 수 있습니다. 지질 혼합물은 1 꼬마의 최대 4 ° C에 저장됩니다K. </li></ol> 4. 바이오 비즈의 작성 <ol><li> 약 10-15 ML은 (드라이 볼륨) 바이오 비즈는 50 ML 튜브에 배치됩니다. </li><li> 구슬이 연속 100 % 메탄올, 95 % 에탄올, milliQ H 2 O, 그리고 마지막으로 TS 버퍼 (두 번 각)의 50 ML에 세척되어 있습니다. </li><li> 세척 구슬은 4에 저장됩니다 ° C ~ 10 ML TS 버퍼 인치 </li></ol> 5. Nanodisc의 Reconstitution <ol><li> MSP는 ~ 7 MG / ML (~ 0.3 ㎜)의 최종 농도에 TSGD 버퍼에 희석되어 있습니다. </li><li> MSP : TSGD 버퍼에 1:3:60 또는 1:3:400의 지질 비율 정화 MalFGK이 복합 ~ 2 nmol은 단백질에 혼합되어 있습니다. 최종 농도는 6 μM MalFGK 2, 18 μM의 MSP와 360 μM의 지질 (1:3:60) 또는 2.4 밀리미터 지질 (1:3:400)입니다. 최종 볼륨은 300 μl입니다. 최종 DDM 농도는 0.08 % (~ 1.6 ㎜)이다. 글리세롤의 마지막 농도가 지질의 양에 따라 달라집니다 추가 주변을 5~10% V / 대 유지 </lI&gt; <li> ~ 바이오 비드 정지의 50 μl는 튜브에 추가되고 혼합은 4 ° C.에 흔들 테이블에 하룻밤 incubated 수 있습니다 </li><li> 구슬이 중력에 의해 sedimented되며 솔루션은 가능한 한 많은 바이오 비즈를 피하기 위해 좁은 팁을 통해 pipetted 있습니다. </li><li> 침전물 대형은 20 분에 100,000 XG에 초 원심 분리에 의해 제거됩니다. 디스크는 TSG10 버퍼에 단계 2.4에서와 같이 겔 여과 크로마토 그래피에 의해 정화되어 있습니다. 디스크를 포함하는 분수는 풀링하고 나누어지는이 준비의 안정성을 테스트하기 위해 동일한 겔 여과 칼럼에 다시 주입해야합니다. </li><li> 정화 디스크는 오랜 기간 동안 -70 ° C에 저장 할 수 있습니다. 얼음에 해동 후, 디스크는 가능성이 침전물 제거하는 단계 5.5에서와 같이 초 원심 분리를 받게해야합니다. 나누어지는이 중요한 집계 나 강수량은 해동하는 동안 발생하지 않았 음을 보장하기 위해 겔 여과 크로마토 그래피에 의해 분석되어야한다과정입니다. </li></ol> 6. 기본 젤 전기 영동 <ol><li> nanodiscs 1 μM (~ 0.2 MG / ML)은 reconstitution (그림 3A)의 품질을 평가하는 기본 PAGE 6, 7 (트리스 - HCL 산도 8.8, 4-12 %)에 의해 분석됩니다. </li><li> 2 단지 MalFGK 남성과의 바인딩 (1 μM)가 nanodiscs에서 재구성은 기본 페이지 (그림 3A)에 의해 평가된다. </li><li> 전기 영동 후, 젤은 10 분에 Coomassie 파란색으로 물들어있는 것, 그리고 ~ 1 시간에 destained. </li></ol> 7. 동적 광 분산 (DL을) <ol><li> Nanodiscs는 0.1 ML / 분의 유량에서 Superdex 200 HR 300분의 10 열을 사용하여 TSG10 버퍼에 단계 2.4에서와 같이 겔 여과 크로마토 그래피에 의해 정화되어 있습니다. nanodiscs를 포함하는 분수는 풀링과 Amicon 원심 필터 ~ 10 MG / ML에 집중되어있다. </li><li> 샘플을 사용하여 DL을 분석하기 전에 (0.22 μm 필터) 두 번 필터링1 μl 내부 볼륨 석영 큐벳에서 DynaPro nanostar 악기 (와이어트 기술). 데이터는 직경과 입자의 분자량을 추정하기 위해 역학 소프트웨어 (와이어트 기술)를 사용하여이 마련되어 있습니다. </li></ol> 8. ATPase 측정 <ol><li> MalFGK 2 재구성 nanodiscs의 ATPase 활동이 colorimetric 분석 8을 사용하여 결정하고 있습니다. </li><li> 정화 디스크와 1 ㎜ ATP의 1 μM는 20 분에 대한 남성과 37 incubated ° C의 증가 금액과 함께 혼합되어 있습니다. 무기 인산염의 릴리스는 660 nm의에서 측정된다. </li><li> 출시 인산염의 금액은 인 표준 솔루션으로 생성 된 표준 곡선과 비교됩니다. </li></ol> 9. 대표 결과 nanodiscs는 겔 여과 크로마토 그래피 (그림 2A, 왼쪽)에 의해 정화되어 있습니다. 크로마토 그램은 보여줍니다 재구성 D의 대부분iscs (검은 색 추적) 하나의 피크로 elute, 반면에 과잉 지질 (빨간색 추적) 무효 볼륨의 elute로하고 폭 넓은 봉우리의 연속으로 만들어 디스크. nanodiscs의 품질은 더욱 네이티브 겔 전기 영동 및 동적 광 산란 분광법 (DL을)에 의해 분석됩니다. 지질의 과잉의 존재의 재구성 사람들은 비방 (그림 2A, 오른쪽)으로 마이그레이션 반면에 적절히 재구성 디스크는 젤에 날카로운 밴드로 마이그레이션됩니다. DL을하여 분석 디스크 인구가 11.4 nm의 (그림 2B)의 평균 직경이 균일 한 것을 보여줍니다. 재구성 디스크 DL을의 근사치에 따라 215 kDa의 명백한 분자량 있습니다. 초과 지질의 면전에서 재구성 샘플은 널리 비 균일 한 샘플에 대한 일반적인입니다, 100 nm의 주위 반경을 배포 표시됩니다. MalFGK이 단지의 품질은 ATPase의 기본 - 겔 전기 영동과 그 활동에 의해 평가된다측정 (그림 3). 말토오스 결합 단백질 남자는 MalFGK이 전송 9, 10에 높은 친 화성을 ​​바인딩합니다. 사용하지 않는 denaturing 겔 전기 영동,이 남성과 MalFGK 2 (그림 3A) 사이에 복잡한을 감지 할 수 있습니다. 수컷이 MalK이 ATPase 활동의 자극은 그림 3B에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig1.jpg" alt="그림 1"/> 1 그림. reconstitution 프로토콜에 대한 일반적인 흐름도. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. nanodisc 준비. A. 품질 관리 또는 높은 지질 비율 (1/3/400, 붉은 색 추적), nanodiscs의 젤 여과 분석 (Superdex 200 HR 3백분의 10 열)은 낮은 지질 비율 (검은 색 추적 1/3/60)에서 재구성. 동일한 디스크 준비 기본 겔 전기 영동. 몰kDa의 ecular 중량 표시가 표시됩니다. 동일한 디스크 준비 B. 동적 광 산란 분석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3910/3910fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. MalFGK 2 nanodisc 입자의 분석. A. 남성의 젤 이동 분석은 MalFGK 2 nanodisc 입자의 증가 금액과 incubated. MalFGK의 B. ATPase 활동 2 nanodisc 남성 농도의 함수로 입자.

<ol><li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li>
<li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li>
<li>Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotropic+cooperativity+of+monomeric+cytochrome+P450+3A4+in+a+nanoscale+native+bilayer+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment.</a> J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).</li>
<li>Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+unravel+the+interaction+between+the+SecYEG+channel+and+its+cytosolic+partner+SecA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA.</a> EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).</li>
<li>Mi, L. -Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+stability+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+detergent+micelles+and+phospholipid+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs.</a> Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).</li>
<li>Dalal, K., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+SecY+translocon+in+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs.</a> Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).</li>
<li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).</li>
<li>Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+evolution+of+bacterial+ATP-binding+cassette+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).</li>
<li>Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maltose+ATP-binding+cassette+transporter+in+the+21st+century-towards+a+structural+dynamic+perspective+on+its+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action.</a> Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).</li>
<li>Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+an+ABC+transporter+for+use+in+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).</li>
<li>Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).</li>
<li>Glück, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li>
<li>Wan, C. -P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein-induced+conversion+of+phosphatidylcholine+bilayer+vesicles+into+nanodisks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+%28BBA%29%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks.</a> Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).</li>
<li>Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+spectroscopy+using+phospholipid+bilayer+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).</li>
<li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochromes+P450+in+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li>
<li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

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우리는 nanodiscs에 말토오스 수송의 reconstitution에 대한 간단한 절차를 설명합니다. 전송은 ATPase 활성 상태이며 수용성 바인딩 파트너 남성과의 상호 작용은 (그림 3) 재현 할 수 있습니다. nanodiscs에 전송의 성공 reconstitution 추가 biophysical 및 생화학 분석 방법을 엽니 다. 특히 관심 MalK ATPase 및 세제의 말토오스 수송 활동, 리포좀과 nanodiscs 체계적인 분석됩니다. ABC의 이동 장치는 전송 사이클 동안 conformations을 변경할 수 있지만, 이러한 conformational 변화에 지질의 기여는 탐험 할 수 남아 있습니다. nanodisc의 제작은 비교적 간단하면서도 최적의 조건에서 작은 편차는 단백질 집계를 돌이킬 수없는 될 수 있습니다. 지질의 초과 금액 productio로 이어질 것이기 때문에 지질 비율 :이 보고서에서, 우리는 올바른 단백질을 선택의 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Amicon 울트라-4 50K 원심 필터 </td><td> Millipore </td><td> UFC805008 </td><td> 적절한 사용을 위해 제조업체의 규정을 따르 </td></tr><tr><td> 바이오 비즈 SM-2 흡착제 </td><td> 바이오 RAD </td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> 대장균 총 지질 </td><td> 벤티 폴라 지질 </td><td> 100500C </td><td> 클로로포름에 용해, 유기 용매에 따라 처리 </td></tr><tr><td> 니켈 세 파로스 HP 수지 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td> 인 표준 솔루션 </td><td>시그마 - 알드리치 </td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20,061 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR 3백분의 10 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 I. 특정 시약. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 구성 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> DDM 주식 </td><td> 10% w / V DDM </td><td> -20 ° C에서 milliQ 물과 저장소에 Resuspend </td></tr><tr><td> MalFGK이 주식 </td><td> 1-2 MG / ML 50 MM 트리스 - HCL, pH7.9 100 MM NaCl 10% 브이 / v 글리세롤 0.03 % w / V DDM </td><td> -70에서 저장 ° C 정화 후 </td></tr><tr><td> MSP 주식 </td><td> 10-15 MG / ML 50 MM 트리스 - HCL, pH7.9 100 MM NaCl 10% 브이 / v 글리세롤 </td><td> -70에서 저장 ° C &lt;1 ML의 aliquots에서 정화 이후 과도한 동결 / 해동 사이클을 방지 </td></tr><tr><td> 인지질 재고 </td><td> 5 NM E. 대장균은 지질를 집계 0.5 % w / V (10 ㎜) DDM 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.9 50 MM NaCl </td><td> 일주 4 ° C에서 저장 </td></tr><tr><td> TS 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.9 50 MM NaCl </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> TSG10 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 - HCL, pH7.9 100 MM NaCl 10% 브이 / v 글리세롤 </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> TSG20 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 - HCL, pH8 100 MM NaCl 20% 브이 / v 글리세롤 </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> TSGD 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 - HCL, pH7.9 100 MM NaCl 10% 브이 / v 글리세롤 0.03 % w / V DDM </td><td> 4 ° C에서 저장 불과 사용하기 전에 DDM을 추가 </td></tr><tr><td colspan="3"> 표 II. 솔루션 요리. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

nanodisc 지질 입자로 abc의 전송의 reconstitution을위한 단계별 방법

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

nanodisc는 discoidal 입자 (~ 10-12 nm의 넓은)는 트랩 막 단백질 인지질 이중층의 작은 패치로.입니다 nanodisc 특히 리간드 - 수용체 상호 작용의 맥락에서, 막 단백질을 공부에 특히 매력적인 옵션입니다. 방법은 Sligar에 의해 개척 및 동료는 apolipoprotein A1에서 파생 설계 높은 - 나선형 비계 단백질의 amphipathic 특성에 기반을두고 있습니다. 극지방의 수성 환경에 직면 반면 비계 단백질의 소수성 얼굴은 지질 이중층의 지방산 아실 사이드 체인과 상호 작용할 수 있습니다. 입자가 작은 균질하고 수용성이기 때문에 nanodiscs의 막 단백질의 분석은 리포좀에 비해 상당한 장점이 있습니다. 또한, 일반적으로 수용성 단백질에 예약 생​​화학 및 biophysical 방법이 적용하고 막 양쪽에서 할 수 있습니다. 이 시각 프로토콜에서, 우리는 잘 charac의 단계별로 reconstitution을 제시terized 세균 ABC의 전송, 남성 MalFGK이 복잡. 디스크의 형성은 세제의 진보적 인 제거에있어 소수성 상호 작용에 따라 자기 조립 과정입니다. 우리는 필수적인 단계를 설명하고 우리는 집계 및 큰 polydisperse 리포좀과 같은 입자의 형성을 제한하기 위해 올바른 단백질 - 투 - 지질의 비율을 선택의 중요성을 강조 표시합니다. 간단한 품질은 디스크가 올바르게 재구성되었는지 확인 겔 여과 크로마토 그래피, 기본 겔 전기 영동 및 동적 광 산란 분광법으로 제어합니다.

Nanodiscs는 인지질 이중층의 작은 패치로 막 단백질을 포함 작은 원반 모양의 입자입니다. 우리는 디스크에 MalFGK2 수송의 단계별 설립을 보여줍니다 시각적 프로토콜을 제공합니다.

Nanodisc 지질 입자로 ABC의 전송의 Reconstitution을위한 단계별 방법

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 A, b, C 수송체, 여기서는 수용성 막 나노디스크 입자 내로 말토스 수송체 malf GK two를 통합하는 것입니다. 이는 먼저 막 스캐폴드 단백질 MSP를 수송체 및 적정량의 지질과 함께 계면활성제 마이셀 상태에서 혼합함으로써 수행됩니다.두 번째 단계는 폴리스티렌 비즈를 추가하고 혼합물을 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 주는 것이며, 이 과정에서 계면활성제가 비즈에 점진적으로 흡수되어 나노 디스크 입자가 형성됩니다. 다음으로, 침전법을 통해 비즈를 제거합니다. 마지막 단계는 젤 여과 크로마토그래피를 통해 적절하게 형성된 디스크를 응집체 및 조립되지 않은 스캐폴드 단백질로부터 분리하는 것입니다.마지막으로, 네이티브 겔 전기영동(native gel electrophoresis) 또는 광산란 분광법(light scattering spectroscopy)을 통해 디스크의 품질을 평가합니다. 리포좀(liposomes)과 같은 다른 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 막 단백질과 디스크가 수용액에서 완전히 용해된다는 점입니다. 또한, 이제 단백질 도메인에 양방향에서 접근할 수 있습니다.이제 막성 구획이 없으므로, 서로 다른 길이의 막 스캐폴드 단백질을 사용하여 막 단백질의 다양한 리간드 상태를 포착하고 연구할 수 있었습니다. 무엇보다 중요한 것은, 이 방법이 abc 수송체의 새로운 결합 파트너 식별과 같이 막 프로테오믹스 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있다는 점입니다. 실제로 이 기술의 영향은 치료 영역까지 확장되는데, 이는 막 단백질 및 수용체의 활성제 또는 억제제 발견을 도울 수 있기 때문입니다.이 방법은 간단해 보이지만, 적절한 단백질 대 지질 비율을 선택할 때 주의해야 합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 정확한 몰 비율을 계산하거나 조제물의 품질을 보장하는 적절한 대조군 실험을 수행하는 데 어려움을 겪습니다. 따라서 이 방법의 시각적 시연은 새로운 학생들이 다양한 단계와 잠재적인 문제점을 학습하는 데 매우 유용합니다.플라스미드 P MSSP 1D one을 이용하여 e coli strain BL 21 DE three에서 hexa histidine tagged MSP를 배양하기 시작합니다. 600 nanometers에서의 흡광도(optical density)가 약 0.5일 때 단백질 생산을 유도하고, 37 degrees Celsius에서 3시간 동안 배양한 후, 4 degrees Celsius에서 5,000 Gs로 10분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 100 micromolar PMSF가 포함된 TSG 10 버퍼에 펠릿을 재현탁합니다. French press를 사용하여 8,000 PS.I에서 세 번 세포를 파쇄합니다. 4 degrees Celsius에서 5,000 Gs로 10분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거합니다. 그 후 125,000 Gs에서 45분간 초원심분리하여 MSP가 포함된 가용성 분획을 분리합니다.TSG 10 버퍼에 담긴 약 1.5 milliliters의 nickel seros high performance를 사용하여 니켈 킬레이트 크로마토그래피로 MSP를 정제하십시오. 50 millimolar ILE elute가 포함된 T SG 10 버퍼로 오염 물질을 세척하십시오. 투석 후, 600 millimolar I midaz가 포함된 TSG 10 버퍼로 MSP를 용리하십시오.TSG 10 버퍼 MSP 내의 정제된 단백질은 -70°C에서 약 10~15 mg/mL의 단백질 농도로 보관할 수 있습니다. MAL K의 C-말단에 His-tag이 붙은 MALF GK 2 복합체는 플라스미드 pED 22 FG K로부터 발현됩니다. E. coli BL21(DE3) 균주에서 배양하여 600 nm에서의 측정 광학 밀도가 약 0.5가 되었을 때 0.2% L-Arabinose를 첨가하여 37°C에서 3시간 동안 단백질 생산을 유도한 후, 세포 용해 및 원심분리를 수행합니다.이전과 마찬가지로, 멤브레인 펠릿을 TSG 20 버퍼에 현탁하여 최종 농도를 5 mg/mL로 맞춥니다. 다음으로, 1% (w/v) GDM을 사용하여 4 °C에서 3시간 동안 부드럽게 흔들어주며 물질을 가용화합니다. MAL FTK 2의 정제 과정과 동일하게 초원심분리를 통해 불용성 물질을 제거합니다.그 후 용해된 mal FTK two 복합체가 포함된 상층액을 수집하고 니켈 킬레이트 크로마토그래피로 다시 정제합니다. SUEx 200, HR ten three hundred 컬럼을 사용하여 0.5 milliliters per minute의 유속으로 TSGD 버퍼 내에서 젤 여과 크로마토그래피를 통해 복합체를 추가로 정제합니다. 인지질을 준비하기 위해, 클로로포름에 용해된 e coli 총 지질 추출물을 스크류 캡 마이크로 튜브에 1000 anomal 분량으로 나누어 담고, 완만한 질소 기류 하에서 용매를 증발시킨 후 진공 상태에서 하룻밤 동안 추가로 건조합니다.다음으로 건조한 후, 최종 농도가 5 NMO가 되도록 TS 버퍼에 지질 막을 녹이고 강하게 볼텍싱한 뒤, 약 5초 동안 5회 펄스 초음파 처리합니다. 용해된 지질은 수성 TS 버퍼에 일반적으로 불용성이기 때문에 약간 불투명하게 보일 수 있으나, 현탁 상태를 유지해야 합니다. DDM을 최종 농도 0.5%가 되도록 첨가합니다. 이 시점에서 용액이 투명해집니다. 지질 혼합물을 항온 수조에 넣고 약 5초 동안 5회 펄스 초음파 처리합니다.지질 혼합물은 4°C에서 최대 일주일 동안 보관할 수 있습니다. Bio-beads를 준비하려면 50mL 튜브에 약 10~15mL의 bio-beads를 넣으십시오. 먼저, 100% methanol 50mL로 비즈를 세척합니다.비즈가 중력에 의해 가라앉을 때까지 기다린 후 용액을 조심스럽게 따라냅니다. 이 과정을 메탄올에 대해 한 번, 그 다음 95%Ethanol, milli Q water, 그리고 마지막으로 TS buffer에 대해 각각 두 번씩 반복합니다. MSP를 TSGD buffer에 희석하여 최종 농도가 약 7 mg/mL 또는 0.3 mM이 되도록 하여 나노 불연속 구조 형성을 시작합니다.성공적인 실험을 위해서는 혼합할 지질과 단백질의 정확한 비율을 선택하는 것이 중요합니다. TSGD 버퍼를 사용하여 단백질:MSP:지질 비율을 1:3:60으로 하여 정제된 malf GK2 복합체 약 2 µM을 최종 부피 300 µL가 되도록 혼합하십시오. 여기서는 음성 대조군으로서 지질 과량 비율인 1:3:400의 샘플도 함께 준비합니다. 튜브에 bio-bead 현탁액 50 µL를 넣고, 4 °C의 rocking table에서 하룻밤 동안 혼합물을 배양하십시오. 다음 날, 중력을 이용하여 비드를 침전시킵니다. 비드가 가라앉으면 narrow tip을 사용하여 bio-beads가 최대한 포함되지 않도록 용액을 파이펫으로 옮깁니다.100,000 GS에서 20분간 초원심분리를 하여 커다란 침전물을 제거합니다. 이전에 TSG 10 버퍼로 수행한 것과 같이 겔 여과 크로마토그래피를 통해 디스크를 정제하십시오. 다음으로, 준비물의 안정성을 테스트하기 위해 동일한 겔 여과 컬럼에 Eloqua를 주입합니다.그 다음 디스크가 포함된 분획들을 모읍니다. 준비된 시료의 품질은 네이티브 젤 전기영동으로 평가합니다. 재구성 품질을 평가하기 위해 1 µM의 나노 디스크를 분석합니다.또한 나노디스크(nano discs)로 재구성된 mal ftk two 복합체에 대한 mal E의 결합을 평가하십시오. 전기영동 후, 겔을 kumasi blue로 10분 동안 염색하고 약 1시간 동안 탈색하십시오. 동적 광산란법(dynamic light scattering) 또는 DLS를 수행하려면, 이전과 같이 0.1 milliliters per minute의 유속으로 SUEx 200 HR ten three hundred 컬럼을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피로 나노디스크를 먼저 정제하십시오.나노 디스크가 포함된 분획들을 모으고, AmCon 원심 여과 장치를 사용하여 약 10 mg/mL로 농축합니다. 그 후 샘플을 두 번 여과합니다. 1 µL 내부 부피의 쿼츠 큐벳을 사용하여 dynapro nano star 장비로 DLS 분석을 수행합니다.동적 소프트웨어를 사용하여 입자의 직경과 분자량을 추정한 후, 콜로리메트릭 분석법(colorimetric assay)을 통해 재구성된 mal FTK two 나노디스크의 ATPase 활성을 결정합니다. 먼저 1 $\mu$M의 정제된 디스크와 1 mM의 ATP를 말레온산(mal e)의 양을 점차 늘려가며 혼합합니다. 시료를 37 °C에서 20분 동안 배양합니다.그런 다음 660 nanometers에서 무기 인산의 방출량을 측정합니다. 방출된 인산의 양을 인 표준 용액으로 작성한 표준 곡선과 비교합니다. 나노 디스크는 겔 여과 크로마토그래피로 정제합니다.크로마토그램을 통해 재구성된 디스크의 대부분이 단일 피크로 용출되는 것을 확인할 수 있는 반면, 과량의 지질로 제작된 디스크는 void volume에서 용출되며 일련의 넓은 피크로 나타납니다. 디스크 조제의 품질은 native gel electrophoresis를 통해 추가로 분석하며, 제한된 양의 지질로 재구성된 디스크는 native gel 상에서 날카로운 밴드 형태로 이동하는 반면, 과량의 지질 존재 하에 재구성된 디스크는 스미어(smear) 형태로 이동합니다. DLS 분석 결과, 디스크 집단은 평균 반경 5.0 nanometers로 균일함을 보입니다. DLS 근사치에 기반하면 재구성된 디스크의 겉보기 분자량은 215 kilodaltons입니다. 과량의 지질 존재 하에 재구성된 샘플은 비균질 샘플의 전형적인 특징인 100 nanometers 부근의 넓게 분포된 반경을 나타냅니다.MAL FTK 2 복합체의 활성은 TP 가수분해 속도와 말토스 결합 단백질인 MAL E와 같은 상호작용 파트너에 대한 친화력을 측정하여 평가합니다. 비변성 겔 전기영동을 사용하여 MAL E가 MAL FTK 2 수송체와 높은 친화력으로 결합함을 확인하였습니다. MAL E와 MAL FTK 2 사이의 복합체 형성을 검출할 수 있으며, 여기에서는 MAL E 농도에 따른 MAL KA TPA 활성의 촉진 정도를 보여줍니다.나노 디스크의 제작은 비교적 간단하지만, 최적 조건에서 조금만 벗어나도 단백질의 가역적이지 않은 응집으로 이어질 수 있으며, 일단 숙달되면 이 기술은 이틀 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 적절한 단백질-지질 비율을 선택하는 것이 중요하다는 점을 기억해야 합니다. 지질의 양이 과도하면 다분산된 커다란 리포좀 유사 입자가 생성되기 때문입니다. 따라서 겔 여과 외에도 광산란 분광법, 분석용 초원심분리법 또는 더 간단하게는 네이티브 겔 전기영동과 같은 기술을 사용하여 재구성된 물질의 품질을 세밀하게 분석하는 것이 매우 중요합니다.디스크에 포함되는 인지질의 종류와 막 스캐폴드 단백질의 종류가 재구성 효율에 영향을 줄 수 있음을 기억하십시오. 이 영상을 통해 원하는 막 단백질을 포함하는 가용성 및 균질한 나노디스크를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하셨기를 바랍니다. 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

지질 세포막에 프로토 타입 전압 문이 칼륨 채널의 완전한 재구성에 대한 절차를 설명합니다. 재구성 채널은 생화학 적 분석, 전기 녹음, 리간​​드 스크리닝 및 전자 결정학 연구에 적합합니다. 이러한 방법은 다른 막 단백질의 구조 및 기능 연구에 일반적으로 응용 프로그램이있을 수 있습니다.

구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성

많은 단백질이 막 표면에 부착될 때 기능을 수행합니다. 나노 디스크 막에 대한 외인성 단백질의 결합은 투과 전자 현미경에 의해 간접적으로 이미지화될 수 있습니다. 우리는 음성 염색 인산 텅스텐 산 나트륨에 의해 유도 된 나노 디스크의 특징적인 적층 (rouleau)이 외인 단백질의 결합에 의해 방지된다는 것을 보여줍니다.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

솔리드-지원, 단백질-무료, 이중 인지질 bilayer 막 (DLBM) 복잡 하 고 동적 지질 나노튜브 네트워크로 변형 될 수 있다 고 바인딩과 그물의 2D 상향식 모델로 사용할 수 있습니다.

자발적인 형성 및 바인딩과 그물에 대 한 상향식 모델로 인공 지질 나노튜브 네트워크의 재배치

미토콘드리아 융합은 미토콘드리아 역학의 근본적인 중요한 정동성 반응입니다. 여기에 설명된 시험관 내 재통합 시스템은 막 테더링, 도킹, 혈전 및 모공 개방을 해결할 수 있는 미토콘드리아 내막 융합을 연구한다. 세포막 시스템을 탐구하는 이 접근의 다양성은 토론됩니다.

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

사전 형성된 나노디스크에 공동 번역하여 삽입하면 세제와의 접촉 없이 정의된 지질 환경에서 무세포 합성된 막 단백질을 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 필수 시스템 구성 요소의 준비와 발현 효율성 및 샘플 품질을 개선하기 위한 중요한 파라미터를 설명합니다.

막 단백질을 미리 형성된 나노디스크에 공동 번역 삽입

이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

여기에서는 나노디스크를 포함하는 생리활성제의 생산 및 특성화에 대해 설명합니다. 암포테리신 B 나노디스크는 프로토콜을 단계적으로 설명하기 위한 예로 사용됩니다.

나노디스크를 함유하는 생리활성제의 제형 및 특성화

이 프로토콜은 스테롤 수송체 ABCG5/G8의 결정화를 위한 설정을 설명합니다. ABCG5/G8은 행잉 드롭 결정화를 위해 이셀로 재구성됩니다. 이 프로토콜은 특수 재료나 기질이 필요하지 않으므로 X선 결정학을 통해 단백질 구조를 결정하기 위한 모든 실험실에서 쉽게 접근할 수 있고 적용할 수 있습니다.

X선 결정학을 위한 지질 이중세포 환경에서의 ABCG5/G8 결정화

우리는 막 단백질을 재구성하고 효소 및 기타 수용성 구성 요소를 마이크로미터 미만 및 마이크로미터 크기의 지질 소포에 캡슐화하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

나노미터 및 마이크로미터 크기의 소포에서 평형을 벗어난 대사 네트워크 구축

본 연구는 TWIK 관련 산에 민감한 K+ 채널 2(Task2)를 나노디스크로 재구성하는 절차를 설명합니다. 이 성공적인 조립은 단일 입자 크라이오전자 현미경으로 확인되었으며, 명확한 2차원 클래스 평균을 얻었다.

나노디스크 내 막 단백질 안정화 기법

배우세요 막단백질을 나노디스크에 재구성하는 방법을 MalFGK2 수송체를 사용하여. 이 기술은 막생물학 및 생화학 연구에서 용해된 환경에서 막단백질 기능을 연구하는 데 필수적인 도구를 제공합니다.

Nanodisc 지질 입자로 ABC의 전송의 Reconstitution을위한 단계별 방법

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