역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용 생체 내

이 절차의 전반적인 목표는 비유전적 모델 시스템에서 확인된 신경세포 집단으로부터 생체 내(in vivo) 단일 단위 반응을 기록하는 것입니다. 이는 먼저 개두술을 수행하여 관심 뇌 영역을 노출시킴으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 텅스텐 와이어를 사용하여 표적 신경세포가 투사되는 영역에 형광 염료를 배치하는 것입니다.

다음으로 염료가 역행성으로 운반되어 투사 신경세포가 선택적으로 표지됩니다. 마지막 단계는 개별 투사 신경세포의 표지된 축삭으로부터 기록하는 것입니다. 최종적으로, 단일 단위 세포외 기록을 통해 온전한 회로 내의 중추 감각 신경세포가 evo의 감각 자극에 어떻게 반응하는지 보여줍니다.

이 방법은 신경 회로가 시냅스 입력 타이밍의 밀리초 미만 차이를 어떻게 감지하는지에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 개별 뉴런이나 심지어 축삭, 그리고 유전적 접근이 불가능한 시스템을 표적으로 삼을 수 있다는 점입니다. 약전어(Weekly electric fish)는 통신과 항해를 위해 전기 신호를 사용합니다.

이들은 시냅스 입력 타이밍의 밀리초 미만 차이를 이용하여 서로 다른 물고기에서 오는 신호를 구분합니다. 우리는 이들의 전기 감각 회로에 있는 추정된 시간 비교 뉴런이 어떻게 그렇게 작은 타이밍 차이를 감지할 수 있는지 연구하였습니다. 또한, 이 기술은 시각 및 청각 감각 경로와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

세포의 크기가 작고 주변 조직에 조밀하게 얽혀 있으며, 세포체의 대부분을 시냅스 전 단말이 덮고 있기 때문에 이 세포들로부터 액체를 추출하는 것은 특히 어렵습니다. 전체 세포 기록(whole cell recording) 중 세포 내 염료 주입을 통해 인비트로(In vitro)에서 단일 세포를 표지함으로써 해당 축삭으로부터 표적 기록을 수행할 수 있습니다. 이와 유사하게, 세포 외 염료 주입 후의 역행성 수송은 뇌 표면 영역의 투사 뉴런을 선택적으로 표지하는 수단을 제공합니다.

이는 생체 내 단일 단위 기록을 위한 시각적 가이드를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. D 코딩된 니들을 준비하려면, 먼저 160 µm 직경의 텅스텐 와이어를 전기분해로 연마하여 최종 니들 팁 직경이 5~50 µm가 되도록 합니다. 그 다음 실험 전날 밤에, 전신 마취를 유도하기 위해 10,000 분자량의 덱스트란이 결합된 Alexa floor 염료 2 mM 용액으로 니들 팁을 코딩합니다.

물고기를 300 mg/L의 MS 2 22 용액이 포함된 수조 물에 넣고, 3 mg/mL의 flail 100 µL를 등 쪽 체근에 주입하여 물고기를 고정시키고 전기적으로 비활성화합니다. 다음으로, 기록 챔버에 수조 물을 채우고 물고기의 배 부분이 아래로 향하도록 챔버 중앙의 플랫폼 위에 놓습니다. 그 후, 피펫 팁을 물고기의 입에 넣어 100 mg/L의 공기 포화 MS 2 22 용액을 분당 1~2 mL의 속도로 투여합니다.

그 후, 고정봉과 왁스를 사용하여 물고기의 몸 양측을 고정해 안정화합니다. 안구 혈관의 지속적인 혈류와 정상적인 체색을 확인하여 물고기의 건강 상태를 모니터링합니다. 그런 다음 플랫폼을 수직축을 따라 회전시킵니다.

물고기의 머리 등쪽 표면의 한쪽 면은 수면 위로 노출되고 나머지 몸통은 잠겨 있도록 플랫폼의 한쪽 끝을 조절합니다. 피부가 건조해지는 것을 방지하기 위해 잠기지 않은 피부 부위에 킴와이프(Kim wipe) 조각을 작게 잘라 올려둡니다. 이 과정에서는 면봉을 사용하여 노출된 머리 표면에 0.4% lidocaine을 도포합니다.

그런 다음 메스 날을 사용하여 6.2 cm 크기의 물고기에서 약 3 mm x 5 mm 크기의 직사각형 피부 조직 조각을 절개합니다. 직사각형의 가쪽 가장자리는 눈의 중심과 일치해야 합니다. 직사각형의 앞쪽 가장자리는 눈의 바로 뒤쪽에, 안쪽 가장자리는 중앙선의 바로 가쪽에 위치해야 합니다.

그 후, 핀셋을 사용하여 직사각형 부위를 제거합니다. 두개골을 노출시키기 위해 앞쪽 뇌수막을 2.5 mm 정사각형 크기로 추가로 절개합니다. 메스 날을 사용하여 과도한 조직을 긁어내어 노출된 두개골 표면을 완전히 깨끗하게 정리합니다.

그런 다음 Kim wipe와 강제 공기로 표면을 완전히 건조시킵니다. 다음으로, 순간접착제를 사용하여 노출된 두개골의 전내측 부위에 금속 포스트를 접착합니다. 접착제가 완전히 마를 때까지 기다립니다.

직경 0.5 millimeter의 볼 밀 카바이드 팁이 장착된 치과용 드릴을 사용하여, 6.2 centimeter 크기 물고기의 두개골 위에 약 2 millimeter x 4 millimeter 크기의 직사각형을 그립니다. 그 후, 메스와 핀셋을 이용하여 직사각형의 외곽선을 따라 절개합니다. 그런 다음 두개골을 벗겨냅니다.

뇌를 노출시키기 위해 스프링 가위나 바늘을 사용하여 색소가 있는 경막과 투명한 연막을 모두 절개합니다. 그런 다음 핀셋으로 절개된 부분을 제거하여 전외측핵과 후외측핵을 노출시킵니다. 이제 앞서 준비한 D 코팅 바늘이 장착된 매니퓰레이터를 관심 액손이 포함된 표적 영역 위에 배치합니다.

본 사례의 후외측핵(posterior extra lateral nucleus)에서는 바늘을 조직 내로 약 25 micrometers 깊이로 빠르게 삽입합니다. 염료가 15에서 30초 동안 확산된 후 바늘을 뽑아냅니다. 필요한 경우 새로운 바늘을 사용하여 이 과정을 반복합니다.

염료가 표적 영역 전체에 분포될 수 있도록 각각을 서로 다른 위치에 배치합니다. 그런 다음 Hickman's ringer solution으로 공동 내의 과잉 염료를 씻어내고, 염료의 흡수 및 수송을 위해 최소 2시간 동안 기다립니다. 관심 있는 축삭을 시각화하려면, 물고기가 들어 있는 기록 챔버를 정립 고정 스테이지 형광 현미경의 대물렌즈 아래에 배치합니다.

호흡 용액을 신선한 수조수로 교체하고 동일한 유량을 유지합니다. 그런 다음 접지선의 한쪽 끝을 노출된 뇌강에 넣고 다른 쪽 끝을 기록 헤드 스테이지의 접지에 연결합니다. 다음으로, 꼬리 기저부 옆에 한 쌍의 기록 전극을 배치합니다.

그 다음 전극을 차동 증폭기와 기록 장치에 연결합니다. 전기기관 방전 명령(EODC)을 모니터링하기 위해, 표시된 축삭의 정확한 위치를 식별할 수 있도록 주요 혈관을 랜드마크로 포함하여 저배율로 관찰한 뇌 영역의 축척 스케치를 준비합니다. 먼저 D의 배치를 확인하기 위해, 방향 설정을 위해 명시야 조명으로 조직 전체를 관찰합니다.

그런 다음 형광 조명으로 관찰합니다. 후외측핵(posterior extra lateral nucleus)에서 확산된 표지가 나타나야 합니다. 그 후 고배율에서 혈관을 지표로 삼아 전외측핵(anterior extra lateral nucleus)의 위치를 찾습니다.

외경 1 mm, 내경 0.58 mm의 붕규산염 모세관 유리를 사용하여 필라멘트를 이용해 표면 근처의 표지된 축삭을 찾으면서 형광등으로 조명합니다. 좁은 섕크의 길이가 5 mm이고 팁 직경이 약 1~2.4 µm인 기록 전극을 제작합니다.

여과된 hickman's ringer solution으로 전극을 채웁니다. 최종 팁 저항은 16에서 155 mega ohms 범위 내에 있어야 합니다. 전극을 압력 포트가 있는 전극 홀더에 장착합니다.

이를 매니퓰레이터에 장착된 헤드 스테이지에 연결하십시오. 그런 다음 헤드 스테이지를 증폭기에 연결하십시오. 그림에는 표시되지 않은 아날로그-디지털 획득 장치가 증폭기를 컴퓨터에 연결합니다.

그 후, 전극 라인에 30 millibar의 양압을 가합니다. 조직 표면에서 축삭 방향으로 전극을 천천히 전진시킵니다. 전극이 축삭에 가까워지면, 전극이 축삭 옆에 위치해 있을 때 양압으로 인해 축삭이 약간이지만 눈에 띄게 움직여야 합니다.

테스트 자극 제시 동안의 활동을 기록하십시오. 전기적 아티팩트(artifact)를 통해 기록과 자극이 적절히 이루어졌음을 확인할 수 있으나, 활동 전위는 나타나지 않아야 합니다. 전극의 외압을 해제한 후 자극과 기록을 반복하십시오.

그 다음, 가벼운 흡입력을 가하여 축삭이 전극 내부로 이동하도록 합니다. 자극과 기록을 다시 반복합니다. 이제 자극에 반응하여 일부 활동 전위가 관찰될 것입니다.

활동 전위가 관찰되면 압력 라인을 닫으십시오. 원하는 모든 기록이 완료되면, 물고기가 완전히 마취되도록 탱크의 물을 100 mg/L의 MS 222가 포함된 호흡액으로 다시 교체하십시오. 물고기를 안락사시키기 전 최소 10분 동안은 EODC가 검출되지 않아야 합니다.

여기에 0.1 millisecond, 6 mV/cm의 단상성 대측 양성 횡단 사각 펄스 자극에 의해 유발된 5개의 샘플 트레이스가 있으며, 여기에는 동일한 유닛에 대해 0 millisecond 시점에 6 mV/cm 자극을 주었을 때, 75 millisecond 기록 창의 20회 반복 동안 발생한 스파이크 시간을 나타내는 래스터 플롯이 있습니다. 지속 시간의 범위가 오른쪽에 나열되어 있습니다. 여기에 자극 반복당 스파이크 수로 반응을 정량화한 자극 지속 시간 튜닝 곡선이 표시되어 있습니다.

본 기술에서 보여주는 수술과 염료 주입 과정이 숙달되면, 적절하게 수행될 경우 1시간 이내에 완료할 수 있으며, 염료 주입 2~3시간 후부터 기록을 시작할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 수술 후 실험 동물의 건강 상태를 주의 깊게 모니터링하는 것이 중요합니다. 더욱 깊은 뇌 구조에 있는 뉴런으로부터 기록하기 위해 이광자 이미징(two-photon imaging)과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 확인된 뉴런 집단으로부터 단일 단위 반응을 라벨링하고 기록하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.