Name: 역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용 생체 내 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: 학습하세요 역행 형광 염료를 이용한 생체 내 특정 신경 세포 표적 세포 외 단일 단위 기록 기법을. 비유전적 모델 시스템에서 투영 뉴런을 선택적으로 라벨링하여 신경 회로 연구에 활용합니다.

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TK에 G2205 (과학 진흥을 위해 국립 과학 재단 (BAC에 IOS-1050701), 건강의 국립 연구소 (SM에 NS54174과 AML-W에 F30DC0111907.), 우에하라 기념 재단과 일본 사회에 의해 제공하는 자금 조달 ). 우리는 세포 축삭 녹화의 주제에 대한 자신의 지원과지도를 위해 율리우스 믹스 감사합니다. 우리는 프로토 기록 챔버를 제공하기 위해 칼 홉킨스 감사합니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

일단 마스터,이 기술 한 여러 모델 시스템에서 생체 기록에 대한 개별 축삭 등의 확인 뉴런, 대상 수있게됩니다. 또한,이 기술은 하나의 안정적 도전 생체 녹화 방법에서 전통적인 만드는 독특한 해부학 적 특성을 가진 뉴런의 스파이크 출력을 기록 할 수 있습니다. 우리는 mormyrid 약하게 전기 물고기 ELA &quot;작은 세포&quot;에서 기록하려면이 기술을 활용했다. &quot;작은 세포&quot;의 튜닝 특성을 연구하는 이전 시도는 어려운 촬영 조건 11, 14로 인해 실패했다. 비슷한 해부학 적 특징은 여러 가지 척추 동물의 청각 electrosensory 신경 8-10에서 단일 단위 기록을 얻기 장벽을 만들 수 있습니다. 우리의 시스템에서 이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 &quot;작은 세포가&quot;그 ELA에서 유일한 세포가 있다는 사실을 이용했다 ELP하는 프로젝트입니다. 따라서, ELP에 ​​배치 염료의 역행 전송 &quot;작은에 ELA의 표시를 제한셀 &quot;somas와 축삭. 축삭의 형광 라벨에 액세스 할 somas에도 불구하고 가능한 확인 된 세포에서 단일 단위 녹음을하고, 레이블 축삭 옆에 정확한 전극의 배치를 허용했다. 우리는 주변 침몰 시냅스 11에 의해 아마, 체세포 녹음을 시도했지만 실패했다 17. 그러나 체세포 라벨은 분명히이 기술은 다른 세포 유형과 다른 회로의 체세포 녹음을 대상으로 사용될 수 있다고 제안 볼 수 있었다. 생체 내에서 역행 전송을 통해 신경 세포의 형광 라벨이 생체 19-21 표적으로 녹음을 안내하는 데 사용되었습니다 . 유사한 기술은 제브라 피쉬의 척수 22 모터 뉴런의 생체 녹음에서 대상을 위해 사용되었다. 우리의 작업 표시와 기록이 모두 뇌에서 생체 내에서 수행되는이 방법의 새로운 확장을 나타냅니다. 우리의 방법을 보여주는 생체 내 역행 T로 CNS 영역의 레이블레이서는 유사 선택적 투사 뉴런과 다른 그대로 회로의 연구에 확장 할 수 있습니다. 예를 들어, 포유류의 청각 처리, 하부 둔덕 (IC)는 여러 rhombencephalic 구조 23 입력의 중요한 중계 센터의 역할을합니다. IC에 염료를 주입 선택적으로 이러한 핵에서 각각 투사 세포를 레이블합니다. 우수한 둔덕 (SC)는 비전 24 유사한 기능을 제공합니다. 척수 준비는 특히 척수 쉽게 액세스로, 염료 주입까지 녹화 현장에서 발생할 수 있습니다,이 기술에 적합, 그것은 더 자세한 해부학 적 정보에게 25를 획득하도록 선택 뉴런의 세포 내 기록 및 작성과 결합 할 수 있습니다. 마지막으로, 요로-추적 복잡한 회로에게 26 매핑하는 중추 신경계 전반에 걸쳐 사용 잘 설립 된 기술입니다. 우리의 방법은 w를 수행 한 이러한 연구에 대한 기능 정보를 추가하기 위하여 이용 될 수있다고양이 시각 피질 27 i 번째 칼슘에 민감한 지표. 잘 설립 된 수술은, 안정적이고 정기적으로 생체 녹음 16 장님에 사용되는 최소한의 출혈과 동물과 생존을 위해 조직을 허용하는 두뇌의 표면에 손상없이 완료해야합니다. 연습으로, 수술 및 염료 응용 프로그램 30~45분에 완료 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 준비 67 %의 &quot;작은 셀&quot;축삭 표시. 대부분의 준비는 1 개 또는 2 개 표시 레이블 축삭을 가지고 있지만, 일부는 많은 8로되어 있습니다. 시도 119 표시 단위, 우리는 12 준비 (표 2)에 분산 된 26 대에서 단일 단위 기록을 얻었다. 따라서, 데이터는 28 %의 성공률에 대한 레이블 축삭과 준비의 41 %에서 수집되었다. 염료 응용 프로그램의 중요한 측면은 깊이 라벨입니다. 텅스텐 와이어의 얕은 삽입 세척 아우되는 염료가 발생합니다AY. 침투가 너무 깊은 경우, 레이블 축삭 타겟팅 표시되지 않습니다. 또한, 세포에 약간의 기계적 손상 적절하게 25, 28까지 수행 할 염료 발생해야합니다. 그러나 너무 많은 손상은 세포를 죽일 것입니다. 우리는 ELP에 표시된 축삭 (표 3) 기록과 짝 ELA에 염료를 주입을 통해 선행 성 라벨 등 다른 염료 및 다른 방법 (표 2)로 라벨을 시도했다. 우리는 라벨이 그들에게 응답하고, 신체적 손상과 세포에 국한 되었기 때문에 선행 성 라벨이 성공적으로 완료되지 않은 가설. 또한, 사전 시냅스 터미널이 방해되었을 수 있습니다. 대조적으로, 역행 표지는 이러한 문제를 모두 최소화합니다. 금액과 염료 응용 프로그램의 위치를​​ 연구하는 특정 회로에 따라 변경 될 수 있습니다. 최대 라벨은 우리가 코팅 된 텅스텐 와이어를 사용하여 달성 큰 염료 농도가 발생합니다. 그러나 드와 축삭 레이블을그것은 진보로 경과 예측, 염료 텅스텐 바늘을 올 수 있습니다. 이러한 경우, 압력 주입 더 적합 할 것이다. 염료 흡수 및 수송 2 시간 주입 후 6 시간 후 주사로 늦게 나타나는 레이블이있는 추가 축삭 빠르면으로 표시되는 우리의 준비에 표시된 축삭과 급속한 있습니다. 따라서, 표시 및 기록은 생존 수술과 관련된 기술적 인 문제를 제거, 하루에 수행 할 수 있습니다. 타이밍 염료 전송에 필요한 거리에 따라 각 응용 프로그램에 따라 다를 것입니다. 또 다른 중요한 측면은 전극 배치됩니다. 이 팁의 막힘 방지하기 위해 레이블 축삭의 사이트에 조직 가까이를 입력하는 것이 중요합니다. 같은 ELA에서와 같이 밀도가 조직의 경우, 기록 전극에 긴 얇은 정강이 주변 조직의 과도한 움직임을 최소화합니다. 성공적으로 녹음 기록을 얻을 때까지 신선한 전극 첫 번째 시도, 반복에 달성하거나, 담배 마는되지 않는 경우UE는 축삭이 더 이상 표시되는 시점에 중단됩니다. 그러나 신속하게 표백 광독성을 일으킬 수 형광 노출의 양을 최소화하고 세포 29-31의 생리적 특성에 영향을 미칠 수있는 축삭 옆에 전극을 배치하는 것이 중요하다. 축삭의 세그먼트가 성공적으로 기록 전극에 흡입되면 녹음은 몇 시간 동안 얻을 수 있습니다. 단위는 일관되게 1 시간 미만에 분실되는 경우에, 밖으로 미끄러지는 축삭을 방지하기 위해 작은 전극의 끝 부분을 만드는 것이 좋습니다. 반면에, 팁이 너무 작은 축삭에 막힘 낮은 신호 대 잡음이나 손상을 초래할 수 있습니다. 스파이크 진폭과 추가 흡인 장치의 &#39;리턴&#39;의 꾸준한 감소는 끝이 너무 크다는 표시입니다. 너무 많은 흡입 축삭에 치명적인 손상을 줄 수 있습니다. 하나의 솔루션은 압력이 천천히 제로 반환되도록 공기 라인의 작은 누출을 허용하는 것입니다. 빠르게 일 동점 골전자 압력은 축삭을 추방 될 수있는 일시적인 상대적으로 안쪽에서 바깥쪽으로 &#39;푸시&#39;가 발생합니다. 이 기술은 확인 투사 뉴런에서 대상 레코딩을 얻기위한 중요한 이점을 나타냅니다 있지만 염료를 주입 사이트에있는 모든 세포 유형에 의해 촬영 될 것이라고, 그것은 지역의 interneurons을 구별하는 데 유용하지 않습니다. 이론적으로, 별도의 주사 부위 여러 ​​형광 물질의 사용이 메서드가 확장 할 수 있습니다. 예를 들어, 단일 대 이중 라벨의 비교 회로에 32 개의 지점에서 이중 주사를 따라 투영 뉴런에서의 interneurons을 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 역행 추적자는 얼룩말 핀치 높은 보컬 센터 (HVC) 32 최근에 수행 된 같은 두 광자 이미징과 같은 다른 고급 이미징 기법과 결합 할 수 있습니다. epifluorescence에 현미경을 사용하는 경우 또한, 녹화 영역은 우리가 단지 &amp; 1를 해결 할 수 있었다로서, 표면 근처로 제한됩니다무, 조직의 처음 30 μm의에서 M 구조. 그러나이 깊이는 이러한 두 광자 현미경 33 또는 목적 결합 평면 조명 현미경 34와 같은 다른 현미경 기술의 사용을 통해 확장 할 수 있습니다. 상대적으로 접근 할 수없는 것을 포함하여 - 그것은 모델 시스템의 다양한 여러 회로에서 하나의 뉴런에서 기록하는 데 사용할 수 있기 때문에 전반적으로,이 기술은 생체 내에서 신경 회로의 연구에 중요한 진보를 나타냅니다.

<table><tbody><tr><td>Tricaine Methanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>Gallamine Triethiodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8134</td><td>Flaxedil</td></tr><tr><td>Lidocaine Hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5647</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hickman&amp;rsquo;s 링거액</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 (0.29 g/l), MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0.12 g/l), NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (0.084 g/l), NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0.06 g/l)</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Gilson 또는 Rainin</td><td>Minipulse 3 Model 312; RP-1</td><td>10.0 &amp;plusmn; 1.0 rpm, 또는 유량계가 포함된 중력 공급 라인</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>순간접착제</td><td>Super Glue Corporation</td><td>SGH2</td><td>2g 튜브</td></tr><tr><td>Omni Drill 35</td><td>World Precision Instruments</td><td>503-598</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>볼 밀 초경 드릴 비트 #1/4</td><td>World Precision Instruments</td><td>501860</td><td>0.19 DIA (비트 직경 = 0.48 mm)</td></tr><tr><td>저온 소작 키트</td><td>World Precision Instruments</td><td>500391</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>수동 마이크로 조작기</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dextran 결합 Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>D-22912</td><td>2mM 농도; 10,000MW 염료 파장은 현미경 필터 설정에 맞춰 선택해야 함</td></tr><tr><td>에피 형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>E600 FN</td><td>미세 초점을 위해 원격 초점 액세서리가 유용함, TRITC 필터 또는 다양한 염료 파장의 초점 평면에 맞는 적절한 필터</td></tr><tr><td>저배율 대물렌즈</td><td>Nikon</td><td>93182</td><td>CFI Plan Achromat 시리즈, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm</td></tr><tr><td>고배율 대물렌즈</td><td>Nikon</td><td>93148</td><td>CFI Fluor 시리즈, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm</td></tr><tr><td>백색광 광원</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Model 190</td><td>광섬유 조명기</td></tr><tr><td>형광 광원</td><td>Lumen Dynamics</td><td>X-Cite 120Q</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>저조도 카메라</td><td>Photometrics</td><td>CoolSnap ES</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>디지털 압력계</td><td>Omega Engineering</td><td>HHP-201</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>전동 마이크로 조작기</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>헤드스테이지</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>증폭기</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>데이터 수집 시스템</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>절연 펄스 자극기</td><td>A-M Systems</td><td>2100</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>화염/브라운 마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>본 응용 분야의 프로그램 설정: Heat: ramp + 1, Pull: &amp;rsquo;0&amp;rsquo;, Velocity: 60, Time: 90 박스 필라멘트</td></tr><tr><td>피펫 유리</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>필라멘트가 포함된 붕규산 모세관 유리 (1 mm OD, 0.58 mm ID)</td></tr></tbody></table>

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

이 방법의 전반적인 목표는 뉴런의 확인 인구에서 하나의 단위 반응을 기록하는 것입니다. 개별 뉴런의 생체 전기 생리학 녹음에서 신경 회로는 자연 조건 하에서 작동 방법을 이해하기위한 중요합니다. 전통적으로,이 기록은 기록 된 셀의 ID가 녹음 시작시 알 수없는 의미 &#39;블라인드&#39;수행되었다. 세포 신원은 이후 세포 juxtacellular 1, 2, 느슨한 패치 염료의 3 이온 도입을 통해 확인할 수 있지만,이 기록은 기능적으로 서로 다른 세포 유형과 지역의 특정 신경 세포에 사전에 대상이 될 수 없습니다. 형광 단백질은 시각적으로 유도 한 세포 전기 생리학 4-6을 허용 셀 타입 특정 방식으로 표현 될 수 있습니다. 그러나 이러한 유전 적 도구를 사용할 수 없습니다하는 여러 모델 시스템이 있습니다. 심지어 유전자 접근 모델 시스템에서 원하는 프로moter를 알 수있을 수 있습니다 또는 유 전적으로 균일 한 신경 돌기 패턴을 다양한있을 수 있습니다. 마찬가지로, 바이러스 성 벡터를 투사 뉴런 7의 특정 하위 레이블로 사용되었지만,이 방법의 사용은 횡단 시냅스 특이 독성과 부족에 의해 제한됩니다. 따라서, 생체 내에서 확인 된 하나의 뉴런에서 기록하는 특정 사전 시각화를 제공하는 추가적인 기술이 필요합니다. 대상 신경 세포의 사전 시각화 고전 단일 셀 녹음은 종종 8-11 엄청나게 어려운하는 어려운 촬영 조건에 특히 유용합니다. 이 문서에 설명 된 새로운 기술은이를 대상으로 전기 생리학 녹음을 얻기 위해 시각적으로 제공하는 신속하고 선택적으로 그들의 독특한 축삭 돌기를 기반으로 특정 뇌 영역 내에서 세포의 특정 부분 집합에 레이블을 텅스텐 바늘을 사용하여 형광 염료의 역행 전송을 적용된 사용 그대로 회로 withi에서 확인 뉴런NA는 CNS 척추. 우리의 방법의 가장 중요한 새로운 발전이 아닌 유전자 접근 모델 시스템의 특정 세포 유형을 대상으로 형광 라벨의 사용이다. 약한 전기 물고기 동물 12 행동, 깨어있는 신경 회로를 공부를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 우리는 약한 전기 mormyrid 물고기의 전방 exterolateral 핵에서 &quot;작은 세포&quot;(ELA)의 감각 처리를 연구하는이 기술을 활용. &quot;작은 세포는&quot;연접 스파이크 (13)의 도착 시간의 밀리 초 이하의 차이를 검출하기위한 중요한 시간을 비교 뉴런으로 가설되어 있습니다. 그러나, 밀도 수초, 침몰 시냅스 작은 세포 기관으로 해부학 적 기능은 매우 어려운 전통적인 방법 11, 14를 사용하여 이러한 세포에서 기록을 만들었습니다. 여기에 우리가 신뢰할 수있는 강력한 레코딩 및 characte을 허용, 우리의 새로운 방법은 선택적 준비의 28 %에서 이러한 세포를 레이블 입증electrosensory 자극에 대한 응답 rization.

형광 염료의 역행 전송 해부학 적 투사에 따라 신경 세포의 하위 인구 레이블. 레이블 축삭은 시각적 대상이 될 수 있습니다<em&gt; 생체 내</em&gt; 확인, 축색 돌기에서 세포 녹음을 허용. 이 기술은 신경 세포가 유전자 조작을 통해 표시하거나 분리하기 어려운 할 수없는 경우 &#39;블라인드&#39;를 사용하여 녹화를 촉진<em&gt; 생체 내</em&gt; 방법.

이 방법의 전반적인 목표는 확인된 신경세포 집단으로부터 단일 단위 반응을 기록하는 것입니다. ...로부터의 생체 내 전기생리학적 기록은...

이 절차의 전반적인 목표는 비유전적 모델 시스템에서 확인된 신경세포군으로부터 생체 내(in vivo) 단일 단위 반응을 기록하는 것입니다. 이는 먼저 두개골 절개술을 수행하여 관심 뇌 영역을 노출시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 텅스텐 와이어를 사용하여 표적 신경세포가 투사되는 영역에 형광 염료를 배치하는 것입니다.다음으로 염료가 역행성으로 수송되어 투사 뉴런이 선택적으로 표지됩니다. 마지막 단계는 개별 투사 뉴런의 표지된 축삭으로부터 기록하는 것입니다. 최종적으로, 단일 단위 세포외 기록을 통해 온전한 회로 내의 중추 감각 뉴런이 evo의 감각 자극에 어떻게 반응하는지 보여줍니다.이 방법은 신경 회로가 시냅스 입력 타이밍의 1ms 미만 차이를 어떻게 감지하는지에 관한 핵심적인 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 개별 뉴런이나 심지어 축삭, 그리고 유전적 접근이 불가능한 시스템까지 표적으로 삼을 수 있다는 점입니다. 약전어(Weakly electric fish)는 통신과 항해를 위해 전기 신호를 사용합니다.이들은 시냅스 입력 타이밍의 밀리초 미만 차이를 이용하여 서로 다른 물고기에서 오는 신호를 구분합니다. 연구진은 이들의 전기 감각 회로에 있는 추정 시간 비교 뉴런이 어떻게 그렇게 작은 타이밍 차이를 감지할 수 있는지 연구했습니다. 또한, 이 기술은 시각 및 청각 감각 경로와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.주변 조직에 조밀하게 얽혀 있는 작은 크기와 세포체의 대부분을 덮고 있는 시냅스 전 말단으로 인해 이 세포들로부터 액체를 추출하는 것은 특히 어렵습니다. 전세포 기록(whole cell recording) 중 세포 내 염료 주입을 통해 인비트로(In vitro)에서 단일 세포를 표지함으로써 해당 축삭으로부터의 표적 기록을 유도할 수 있습니다. 마찬가지로, 세포 외 염료 주입 후의 역행성 수송은 뇌 표면 영역의 투사 뉴런을 선택적으로 표지하는 수단을 제공합니다.이는 체내 단일 단위 기록(in vivo single unit recordings)을 위한 시각적 안내를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. D-코딩 바늘을 준비하려면, 먼저 직경 160 µm의 텅스텐 와이어를 전해 연마하여 바늘 끝의 최종 직경을 5~50 µm로 만듭니다. 그 후, 실험 전날 밤에 10,000 molecular weight dextran이 결합된 2 mM Alexa fluor dye 용액으로 바늘 끝을 코팅하여 전신 마취를 유도합니다.물고기를 300 mg/L의 MS 222 용액이 포함된 수조수에 넣고, 3 mg/mL의 flail 100 µL를 등쪽 체벽 근육에 주입하여 물고기를 고정시키고 전기적으로 진정시킵니다. 다음으로, 기록 챔버에 수조수를 채우고 물고기의 배측이 아래로 향하게 하여 챔버 중앙의 플랫폼 위에 놓습니다. 그런 다음, 피펫 팁을 물고기의 입에 배치하여 100 mg/L의 폭기된 MS 222 용액을 분당 1~2 mL 속도로 공급합니다.그 후, 고정봉과 왁스를 사용하여 물고기 몸의 양측을 고정합니다. 안구 혈관의 지속적인 혈류와 정상적인 체색을 확인하여 물고기의 건강 상태를 모니터링합니다. 그런 다음 플랫폼을 수직축을 따라 회전시킵니다.플랫폼의 한쪽 끝을 조절하여 물고기 머리 등쪽 표면의 한쪽 면은 수면 위로 노출되고, 몸의 나머지 부분은 잠겨 있도록 합니다. 피부의 노출된 부위가 마르는 것을 방지하기 위해 잠기지 않은 피부 부위에 킴와이프(Kim wipe) 조각을 작게 잘라 얹어 둡니다. 이 과정에서 면봉을 사용하여 노출된 머리 표면에 0.4% lidocaine을 도포합니다.그런 다음 메스 날을 사용하여 6.2 cm 크기의 물고기에서 약 3 mm x 5 mm 크기의 직사각형 피부 조직 조각을 절개합니다. 직사각형의 외측 가장자리는 눈의 중심과 일치해야 합니다. 직사각형의 전측 가장자리는 눈의 바로 후방에 위치해야 하며, 내측 가장자리는 정중선의 바로 외측에 위치해야 합니다.그 후, 포셉을 사용하여 직사각형 조각을 제거합니다. 두개골을 노출시키기 위해 전방 뇌수막 쪽으로 2.5 mm 크기의 정사각형 부위를 추가로 절개합니다. 메스 날을 사용하여 과도한 조직을 긁어내어 노출된 두개골 표면을 완전히 깨끗하게 정리합니다.그런 다음 Kim wipe와 강제 공기를 사용하여 표면을 완전히 건조시킵니다. 다음으로, 순간접착제를 사용하여 노출된 두개골의 전내측 부위에 금속 포스트를 접착합니다. 접착제가 완전히 마를 때까지 기다립니다.0.5 millimeter 직경의 볼 밀 카바이드 팁이 장착된 치과용 드릴을 사용하여 6.2 centimeter 크기 물고기의 두개골에 약 2 millimeter x 4 millimeter 크기의 직사각형을 그립니다. 그 후, 메스와 포셉을 이용해 직사각형의 외곽선을 절개합니다. 그런 다음 두개골을 벗겨냅니다.뇌를 노출시키기 위해 스프링 가위나 바늘을 사용하여 색소가 있는 경막(dura mater)과 투명한 연막(pia mater)을 모두 절개합니다. 그런 다음 핀셋으로 절개된 부분을 제거하여 전외측핵(anterior extra lateral nucleus)과 후외측핵(posterior extra lateral nucleus)을 노출시킵니다. 이제 미리 준비한 D 코팅 바늘이 장착된 매니퓰레이터를 관심 대상인 축삭이 포함된 표적 영역 위에 배치합니다.본 사례에서 후외측핵(posterior extra lateral nucleus)에 바늘을 조직 내로 약 25 micrometers 깊이로 빠르게 삽입합니다. 염료가 15 내지 30초 동안 확산된 후, 바늘을 뽑아냅니다. 필요한 경우 새 바늘을 사용하여 이 과정을 반복합니다.염료가 표적 영역 전체에 분포하도록 각각 다른 위치에 배치하십시오. 그런 다음 hickman's ringer solution으로 공동 내의 과잉 염료를 헹구어 내고, 염료의 흡수 및 이동을 위해 최소 2시간 동안 기다립니다. 관심 있는 축삭을 시각화하려면, 물고기가 들어 있는 기록 챔버를 정립 고정 스테이지 형광 현미경의 대물렌즈 아래에 배치하십시오.호흡 용액을 신선한 수조수로 교체하고 동일한 유량을 유지하십시오. 그런 다음 접지선의 한쪽 끝을 노출된 뇌강에 넣고 다른 쪽 끝을 기록 헤드 스테이지의 접지에 연결하십시오. 다음으로, 꼬리 기저부 옆에 한 쌍의 기록 전극을 배치하십시오.그 다음 전극을 차동 증폭기와 기록 장치에 연결합니다. 전기기관 방전 명령(EODC)을 모니터링하기 위해, 저배율에서 관찰한 뇌 영역의 축척 스케치를 준비하며, 이때 표지된 축삭의 정확한 위치를 식별할 수 있도록 주요 혈관을 랜드마크로 포함시킵니다. 먼저 D의 배치를 확인하기 위해, 명시야 조명으로 전체 조직을 관찰하여 방향을 잡습니다.그런 다음 형광 조명으로 관찰합니다. 후외측핵(posterior extra lateral nucleus)에 확산된 라벨링이 나타나야 합니다. 그 후 고배율에서 혈관을 지표로 삼아 전외측핵(anterior extra lateral nucleus)의 위치를 찾습니다.외경 1mm, 내경 0.58mm의 붕규산염 모세관 유리와 필라멘트를 사용하여 표면 근처의 표지된 축삭을 찾는 동안 형광등으로 조명합니다. 좁은 샹크의 길이가 5mm이고 팁 직경이 약 1~2.4µm인 기록 전극을 제작합니다.여과된 hickman's ringer 용액을 전극에 채웁니다. 최종 팁 저항은 16에서 155 mega ohms 범위 내에 있어야 합니다. 전극을 압력 포트가 있는 전극 홀더에 거치합니다.이를 매니퓰레이터에 장착된 헤드 스테이지에 연결합니다. 그런 다음 헤드 스테이지를 증폭기에 연결합니다. 그림에는 표시되지 않았으나, 아날로그-디지털 획득 장치가 증폭기를 컴퓨터에 연결합니다.그 후, 전극 라인에 30 millibar의 양압을 가합니다. 조직 표면에서 축삭 방향으로 전극을 천천히 전진시킵니다. 전극이 축삭에 가까워지면, 전극이 축삭 옆에 위치했을 때 양압으로 인해 축삭이 약간이지만 눈에 띄게 움직여야 합니다.테스트 자극 제시 중의 활동을 기록하십시오. 전기적 아티팩트(artifact)는 기록과 자극이 적절히 이루어지고 있음을 확인시켜 주지만, 활동 전위는 나타나지 않아야 합니다. 전극의 외압을 해제하고 자극 및 기록을 반복하십시오.그 다음, 가벼운 흡입력을 가하여 축삭이 전극 안으로 들어가게 합니다. 자극과 기록을 다시 반복합니다. 이제 자극에 반응하는 활동 전위가 관찰될 것입니다.활동 전위가 관찰되면 압력 라인을 닫습니다. 원하는 모든 기록이 완료되면, 물고기가 완전히 마취되도록 탱크의 물을 100 mg/L의 MS 222가 포함된 호흡 용액으로 다시 교체합니다. 물고기를 안락사시키기 전 최소 10분 동안은 EODC가 검출되지 않아야 합니다.여기에 0.1 millisecond, 6 mV/cm의 단상 대측 양성 횡단 사각 펄스 자극에 의해 유발된 활동 전위의 다섯 가지 샘플 트레이스가 있으며, 여기에는 0 mV/cm 자극으로 동일한 단위를 20회 반복하여 75 millisecond 기록 창 동안 측정한 스파이크 시간을 나타내는 래스터 플롯이 있습니다. 지속 시간의 범위는 오른쪽에 나열되어 있습니다. 여기에 표시된 것은 자극 반복당 스파이크 수로 반응을 정량화한 자극 지속 시간 튜닝 곡선입니다.본 기술에서 보여주는 수술과 염료 주입은 숙달되어 적절히 수행된다면 1시간 이내에 완료할 수 있으며, 염료 주입 후 2~3시간 뒤부터 기록을 시작할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 수술 후 실험 동물의 건강 상태를 주의 깊게 모니터링하는 것이 중요합니다. 더 깊은 뇌 구조에 있는 뉴런으로부터 기록하기 위해 이광자 이미징과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 확인된 뉴런 집단으로부터 단일 단위 응답을 라벨링하고 기록하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

retrograde-fluorescent-labeling-allows-for-targeted-extracellular

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

이 문서는 그대로 마우스 망막에서 찬란 태그의 연결 인구에서 각각의 세포의 녹음을 묘사. 두 광자 여기 적외선을 사용하여 transgenetically 라벨이 세포들은 빛의 반응, 수용 필드 속성 및 형태학을 연구하기 위해 패치 - 클램프 녹음 대상으로했다.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

우리는 뉴런이나 폴리에틸렌 흡입 피펫을 사용하여 모든의 연결을 요로에 형광등과 칼슘에 민감한 염료의 높은 농도를 도입을위한 간단하고 저렴한 비용으로 기술을 설명합니다.

신경, 책자, 그리고 형광 염료와 척수 뿌리 역행로드

출처: Inal, M. A. et. al., Retrograde tracing of Drosophila Embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes(유성필 형광 염료를 사용한 {{}}초파리{{}} 배아 운동 뉴런의 역행 추적. J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 친유성 염료를 사용하여 Drosophila 운동 뉴런의 역행 표지 방법을 보여줍니다. 염료는 축삭돌기로 들어가 역행적으로 이동하고 뉴런을 녹색으로 표시하여 컨포칼 현미경 하에서 뉴런의 형태와 투영을 자세히 시각화할 수 있습니다.

Retrograde Labeling of Drosophila Motor Neurons Using Fluorescent Lipophilic Dyes (형광 친유성 염료를 사용한 초파리 운동 뉴런의 역행 라벨링)

방법은 네크로의 미리 결정된 기능 마이크로 도메인에 형광 염료와 뉴런을 라벨에 설명되어 있습니다. 첫째, 고유 신호 광학 이미징은 기능지도를 얻을하는 데 사용됩니다. 그런 다음 두 광자 현미경은지도의 마이크로 도메인 내에서 라벨 및 이미지 뉴런하는 데 사용됩니다.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

이 프로토콜은 경보를 발하는 쥐의 피질하 뇌 구조에서 신경 세포 활동을 모니터링하기 위한 머리 억제 메커니즘의 설계 및 외과적 이식을 설명합니다.  이 책은 병치세포 구성에서 단일 뉴런을 분리하고 해부학적 위치를 효율적으로 식별하는 절차를 설명합니다.

경고, 헤드 억제 쥐의 하위 대뇌 피질의 뇌 구조 내에서 Juxtacellular 모니터링 및 현지화 단일의 뉴런

우리는 체외 준비를 사용하여 뇌의 핵에 선행 성 또는 역행 추적 주사를 통해 신경 세포와 그 프로세스 레이블을하는 기술에 대해 설명합니다. 우리는 내가 N 표시 정확도를 높이기 위해 유리의 형광 표지 된 마우스 돌연변이 및 기본 광학 기기를 복용하여 추적 전기를 체외의 기존 방법을 수정했습니다.

레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

우리는 친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 운동 뉴런의 역행 추적방법을 기술한다.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

여기에서, 우리는 시간 경과 공초점 현미경에 의해 산후 마우스 망막 외식편에서 신경돌기 형태 형성을 조사하는 방법을 제시한다. 우리는 Cre 의존성 방식으로 막 표적화된 형광 단백질을 발현하는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터를 사용하는 망막 세포 유형의 희소 표지 및 획득 및 이들의 미세 공정에 대한 접근법을 기술한다.

유전자 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노-연관 바이러스 표지를 이용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징

여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

학습하세요 역행 형광 염료를 이용한 생체 내 특정 신경 세포 표적 세포 외 단일 단위 기록 기법을. 비유전적 모델 시스템에서 투영 뉴런을 선택적으로 라벨링하여 신경 회로 연구에 활용합니다.

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용

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