역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용 생체 내

이 절차의 전반적인 목표는 비유전적 모델 시스템에서 식별된 뉴런 집단으로부터 생체 내 단일 단위 반응을 기록하는 것입니다. 이것은 먼저 개두술을 수행하여 관심 있는 뇌 영역을 노출시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 텅스텐 와이어를 사용하여 표적 뉴런이 돌출된 영역에 형광 염료를 배치하는 것입니다.

다음으로, 염료는 역행 수송되어 투영 뉴런의 선택적 라벨링을 초래합니다. 마지막 단계는 개별 투영 뉴런의 표지된 축삭돌기에서 기록하는 것입니다. 궁극적으로, 단일 단위 세포 외 기록은 온전한 회로의 중앙 감각 뉴런이 evo의 감각 자극에 어떻게 반응하는지 보여주는 데 사용됩니다.

이 방법은 신경 회로가 시냅스 입력 타이밍에서 밀리초 미만의 차이를 감지하는 방법과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 개별 뉴런 또는 축삭돌기 및 유전적으로 접근할 수 없는 시스템을 표적으로 삼을 수 있다는 것입니다. 매주 전기 물고기는 통신 및 탐색을 위해 전기 신호를 사용합니다.

그들은 시냅스 입력의 타이밍에서 밀리초 미만의 차이를 사용하여 다른 물고기의 신호를 구별합니다. 우리는 전기 감각 회로에 있는 추정되는 시간 비교기 뉴런이 어떻게 그러한 작은 타이밍 차이를 감지할 수 있는지 물었습니다. 그러나 이 기술은 시각 및 청각 감각 경로와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

이 세포에서 액체를 추출하는 것은 특히 어렵기 때문에 주변 조직과 전체 세포 기록 중 세포 배의 대부분을 덮고 있는 시냅스전 말단이 조밀하기 때문입니다. 시험관(In vitro)은 해당 축삭돌기에서 표적화된 기록을 안내하기 위해 단일 세포에 레이블을 지정합니다. 유사하게, 세포외 염료 주입 후 역행성 수송은 표재성 뇌 영역의 투영 뉴런을 선택적으로 라벨링하는 수단을 제공합니다.

이는 생체 내 단일 장치 녹음을 위한 시각적 지침을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. D 코드 바늘을 준비하려면 먼저 160 마이크로 미터 직경의 텅스텐 와이어를 5-50 마이크로 미터의 최종 바늘 팁 직경으로 전해 연마합니다. 그런 다음 실험 코드 전날 밤 10, 000 분자량 덱스트란의 2 밀리몰 용액으로 바늘 끝을 사용하여 전신 마취를 유도하기 위해 Alexa 바닥 염료를 활용했습니다.

물고기를 리터당 300밀리그램의 MS 2 22 용액과 함께 수조 물에 넣고 물고기를 움직이지 못하게 하고 전기적으로 침묵시킵니다. 다음으로, 기록 챔버에 탱크 물을 채우고 물고기 복부 쪽을 아래로 향하게 하여 챔버 중앙의 플랫폼에 놓습니다. 그런 다음 피펫 팁을 입에 넣어 분당 1-2밀리리터씩 리터당 100mg의 폭기된 MS 2 22 용액을 전달합니다.

그 후, 몸의 양쪽에 고정 된 막대와 왁스로 물고기를 안정시킵니다. 안구 혈관의 지속적인 혈류와 정상적인 체색을 확인하여 물고기의 건강 상태를 모니터링합니다. 그런 다음 수직 축을 따라 플랫폼을 회전합니다.

플랫폼의 한쪽 끝을 조정하여 물고기 머리의 등쪽 표면의 한쪽이 물 위로 노출되고 물고기 몸의 나머지 부분은 물에 잠긴 상태로 유지되도록 합니다. 건조를 방지하기 위해 피부의 물에 잠기지 않은 부분에 작은 김 물티슈 조각을 놓습니다. 이 절차에서는 Q-tip을 사용하여 노출된 머리 표면에 0.4% 리도카인을 도포합니다.

그런 다음 메스 날을 사용하여 6.2cm 물고기의 경우 약 3mm x 5mm의 직사각형 피부 조직을 자릅니다. 사각형의 측면 가장자리는 눈의 중심과 정렬되어야 합니다. 직사각형의 앞쪽 가장자리는 눈의 바로 뒤쪽에 있어야 하고 사각형의 내측 가장자리는 정중선의 바로 옆에 있어야 합니다.

그런 다음 한 쌍의 집게를 사용하여 사각형을 제거합니다. 두개골이 노출되도록 2.5mm 정사각형의 전방을 추가로 자릅니다. 메스 날을 사용하여 여분의 조직을 긁어내어 노출된 두개골 표면을 완전히 제거합니다.

그런 다음 Kim 물티슈와 강제 공기로 표면을 완전히 건조시킵니다. 다음으로, 슈퍼 접착제로 전방 내측에 노출된 두개골 부위에 금속 기둥을 붙입니다. 접착제가 완전히 마를 때까지 기다리십시오.

직경 0.5mm의 볼 밀 카바이드 팁이 있는 치과용 드릴을 사용하여 6.2cm 물고기의 두개골에 약 2mm x 4mm의 직사각형을 그립니다. 그런 다음 메스와 집게로 직사각형의 둘레를 자릅니다. 그런 다음 두개골을 벗겨냅니다.

뇌를 노출시키려면 스프링 가위나 바늘을 사용하여 색소가 있는 경막과 투명한 경막을 모두 자릅니다. 그런 다음 한 쌍의 집게로 절단된 부분을 제거하여 전방 외측 핵과 후방 외 외측 핵을 노출시킵니다. 이제 관심 축삭을 포함하는 대상 영역 위에 이전에 준비된 D 코팅 바늘이 있는 매니퓰레이터를 배치합니다.

우리의 경우 후방 외측 핵은 바늘을 약 25마이크로미터 정도 조직에 신속하게 삽입합니다. 염료가 15-30초 동안 확산된 후 바늘을 집어넣습니다. 필요에 따라 새 바늘로 반복하십시오.

염료가 대상 영역 전체에 분포되도록 각각을 다른 위치에 놓습니다. 그런 다음 hickman's ringer solution으로 캐비티에서 여분의 염료를 헹구고 염료 흡수 및 운반을 위해 최소 2시간 동안 기다립니다. 관심 있는 축삭돌기를 시각화하려면 물고기와 함께 기록 챔버를 직립 고정 스테이지 에피 형광 현미경의 대물렌즈 아래에 놓습니다.

호흡 용액을 담수 탱크 물로 전환하고 동일한 유속을 유지하십시오. 그런 다음 접지선의 한쪽 끝을 노출된 뇌강에 놓고 다른 쪽 끝을 녹음 헤드 스테이지의 접지에 연결합니다. 다음으로, 꼬리 바닥 옆에 한 쌍의 기록 전극을 놓습니다.

그런 다음 전극을 차동 증폭기 및 녹음 장치에 연결합니다. 전기 장기 방전 명령 또는 EODC를 모니터링하기 위해 표지된 축삭돌기의 정확한 위치를 식별하기 위한 랜드마크로 주요 혈관을 포함하여 저배율에서 본 뇌 영역의 축소된 스케치를 준비합니다. 먼저 D 배치를 확인하려면 명시야 조명으로 전체 조직을 보고 방향을 파악합니다.

그런 다음 형광등으로 보십시오. 후방 외측핵(posterior extra lateral nucleus)은 확산 표지(diffuse labeling)를 보여야 한다. 그 후, 고배율 하에서, 혈관을 랜드 마크로 사용하여 전방 여분의 측면 핵을 찾습니다.

형광등으로 비추면서 1mm 외경 0.58mm 내경을 사용하여 표면 근처에서 레이블이 지정된 축삭을 찾습니다. 필라멘트가 있는 Bo 규산염 모세관 유리. 5mm 길이의 좁은 생크와 약 1-2.4마이크로미터의 팁 직경이 있는 기록 전극을 당깁니다.

여과된 hickman's ringer 용액으로 전극을 채웁니다. 최종 팁 저항은 16에서 155메가옴 범위여야 합니다. 압력 포트가 있는 전극 홀더에 전극을 놓습니다.

매니퓰레이터에 장착된 헤드 스테이지에 연결합니다. 그런 다음 헤드 스테이지를 amp리퍼에. 표시되지 않은 아날로그-디지털 수집 장치는 증폭기를 컴퓨터에 연결합니다.

그런 다음 전극 라인에 30mbar 양압을 가합니다. 조직 표면에서 축삭돌기 쪽으로 전극을 천천히 전진시킵니다. 전극이 축삭돌기에 가깝기 때문에 양압은 전극이 축삭돌기 옆에 있는 동안 축삭돌기의 약간이지만 눈에 띄는 움직임을 유발해야 합니다.

테스트 자극 프레젠테이션 중 활동을 기록합니다. 전기 인공물이 적절한 기록과 자극을 확인하지만 활동 전위가 없어야 합니다. 전극의 외압을 해제하고 자극과 녹음을 반복합니다.

그런 다음 축삭돌기가 전극 안으로 이동하도록 약간 흡입합니다. 자극과 녹음을 다시 반복합니다. 이제 자극에 대한 반응으로 몇 가지 활동 전위를 볼 수 있습니다.

활동 전위가 보이면 압력 라인을 닫습니다. 원하는 모든 기록이 완료되면 리터당 100밀리그램의 MS 2 22를 사용하여 탱크 물을 호흡 용액으로 다시 전환하여 물고기가 완전히 마취되었는지 확인합니다. 물고기를 안락사시키기 전에 최소 10분 동안은 EODC가 감지되지 않아야 합니다.

다음은 0.1 밀리초 6 밀리볼트 센티미터, 단상 대변 포지티브 가로 사각형 펄스 자극에 의해 유발되는 활동 전위를 보여주는 5개의 샘플 트레이스이며, 다음은 센티미터당 6밀리볼트 자극으로 0에서 자극된 동일한 단위에 대한 75밀리초 기록 창을 20회 반복하는 동안 스파이크 시간을 보여주는 래스터 플롯입니다. 지속 시간 범위는 오른쪽에 나열되어 있습니다. 여기에 표시된 것은 자극 반복 당 스파이크로 응답을 정량화하는 자극 지속 시간 튜닝 곡선입니다.

이 기법에 나타난 수술 및 염료 주입은 제대로 수행되면 1시간 이내에 완료할 수 있으며, 염료 주입 후 2-3시간 후에 기록을 시작할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 절차를 따르는 실험 동물의 건강을 주의 깊게 모니터링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 두 개의 광자 이미징과 같은 다른 방법은 훨씬 더 깊은 뇌 구조의 뉴런에서 기록하기 위해 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 식별된 뉴런 모집단에서 단일 단위 반응을 레이블링하고 기록하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.