Name: 백신에 마우스 응답 Nasopharyngeal - 관련 Lymphoreticular 조직 (NALT)의 역할을 검토 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 배우세요 마우스 NALT의 역할을 연구하는 외배양 및 수술적 절제 방법을 통해 비강 내 백신에 대한 면역 반응을 분석하는 기술입니다. 이 모델은 백신 효능 연구에 활용됩니다.

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지원 Becton 디킨슨 기술에 의해 제공되었다. 이 제출로 표현 전망 저자 분들이며 미국 정부의 공식 정책을 반영하는 취지하지 않습니다. 연구는 동물 복지 법령 및 동물 실험 동물의 관리 및 사용, 국립 연구 협의회, 1996을위한 가이드에 명시된 원칙을 준수를 포함한 동물 실험에 관련된 다른 연방 법령과 규정을 준수 실시되었다. 본 연구가 실시되었다 시설은 실험실 동물 케어 인터내셔널의 평가와 인증을위한 협회 완전히 인정하고 있습니다.

1. NALT 수집 및 Culturing <ol><li> 승인 IACUC지도를 사용하여 쥐를 안락사시켜야. NALT에 영향을 미칠 수있는 흡입 anesthetics의 사용을 피하십시오. 무균 작업 공간이나 biosafety 캐비닛에 마우스를 전송합니다. 마우스 아래턱를 제거하고 알코올 및 요오드 잎사귀와 위쪽 미각 영역을 청소하십시오. </li><li> 신중하게 마우스 incisors와 어금니 치아의 내부 등고선을 따라 상류 미각을 잘라내어 소비세하는 수술 칼 손잡이로 11 호 외과 칼날을 사용합니다. </li><li> 미각을 찢어하지 않도록 신중하다고 포셉로 부드럽게 돌려 껍질 구개. </li><li> 이 단계는 문화의 오염을 줄이기 위해 필요한 여러 입맛을 처리하도록 설계되었습니다. 장소 입맛 멸균 48 잘 플레이트 완전한 배지 250 μL으로 미리 채워져의 첫 번째 열에있는 각각의 우물로 (37 ° C) 10 % 태아 소 혈청, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 100와 함께 보충 RPMI 1640으로 구성된 UI / ML 페니실린, 50 μg / ML gentamicin1 μg / ML fungizone / amphotericin. 미디어 입맛이 5 % CO 2 / 95% 습한 공기 배양기 (37 ℃), 또는 양자 택일이 아닌 CO 2 문화 10 밀리미터 HEPES의 산도 7.4을 사용으로 배양해 경우 버퍼 탄산 있어야합니다. </li><li> 입맛을 씻으려면 구개 여덟 세차장 총 중이며 때까지 신중하게, 세차장 사이에 접시를 태핑, 행에있는 각 연속 잘으로 입맛을 이동 집게를 사용합니다. </li><li> 우물의 신선 전체 문화 매체 (37 ° C) 250 μL를 포함하는 새로운 멸균 48 잘 판으로 입맛을 전송합니다. </li><li> 연구 기간 동안 culturing에 대해 37 ° C 배양기에 입맛이 들어있는 접시를 놓습니다. </li><li> 무균 신선한 37 ° C 배지 100 μL로 교체, Eppendorf 튜브 24 시간마다로 문화 우물에서 매체의 100 μL를 전송하여 분석을 위해 샘플을 수집합니다. </li><li> 펠렛의 파편까지 10 분, 4 ° C를 위해 380 XG에 문화 미디어 샘플을 원심 분리기. </li><li> 분석 준비 때까지 -20 ° C에서 신선한 Eppendorf 튜브 및 저장소에 centrifuged 샘플에서 뜨는을 전송합니다. </li><li> 항원 특정 IgG, IgM, 그리고 이가, 또는 분비 크린 시토킨은 표준 효소 결합 면역 assays (엘리사)에 의해 조직 문화의 supernatants로 측정됩니다. </li></ol> 2. NALT의 외과 절제 <ol><li> 여자 BALB / C 마우스, 연령 7-9주은 적합한 과목이지만 다른 변종도 허용합니다. 수술 후 실시됩니다 음식과 물을 대체할 마우스를 적응 사흘 전에 수술로 겔형 서부 유럽 표준시 음식을 제공한다. </li><li> 수술 이전 구강에 Metacam 통증 구호 약품 (1.5 밀리그램 / ML 또는 0.05 밀리그램 / 드롭) 중 하나에 드롭을 관리할 수 있습니다. </li><li> 케타민을, acepromazine 및 xylazine 혼합물 (KAX)로 예를 들면, 승인 IACUC지도를 이용하여 생쥐를 마취하고 건조 방지하기 위해 눈 위에 Puralube 투어뇌려의 연고를 적용합니다. NALT에 영향을 미칠 수있는 흡입 anesthetics의 사용을 피하십시오.nesthesia은 발가락의 부드러운 곤란에 대한 반사 반응의 부재에 의해 확인할 수 있습니다. </li><li> subcutaneously 수술 후 마우스의 잠재적인 탈수증을 방지하기 위해 22-28 게이지 바늘과 주사기를 사용하여 양어깨 사이로 한 ML 식염수 (0.9 %의 나트륨 염화물 분사 USP)을 관리할 수 있습니다. 또한 수술 도중과 이후 건강한 호흡을 촉진 22-28 게이지 바늘과 주사기를 사용하여 양어깨 사이 subcutaneously Respiram의 0.1 ML을 관리할 수 있습니다. </li><li> 이후의 모든 조작 중에 마우스로 열 지원을 제공합니다. </li><li> 위로 향한 자세로 anesthetized 마우스를 놓고, 가볍게 상부 구개를 노출, 구강을 억지로 위턱과 아래턱 incisors 주위에 수술 봉합의 두개의 루프를 사용합니다. </li><li> NALT의 사이트에있는 상부 구개의 중간선 아래 길이의 절개를 약 3mm를 만들기 위해 11 호 외과 칼날을 사용합니다. </li><li> 절개로 0.5 밀리미터 microcurette를 넣고 부드럽게으로 가장자리 아래 다쳤어요NALT를 중단. </li><li> 열 소작 장치의 직선 벌금 루프와 함께 출혈을 멈추게하기 위해 절개를 부식. </li><li> 마우스가 완전한 의식과 활동을 복구하는 동안 열 지원을 계속합니다. </li><li> 삼일 포스트 수술을 하루에 한 번 필요하고 경구 진통제로 탈수를 방지하기 위해 염분 subcutaneously 최대 하루에 세 번, 양어깨 사이에 주입 당 1 ML와 마우스를 제공합니다. 피부 turgor를 확인하기 위해 피부 텐트 테스트를 수행하여 탈수를 결정합니다. 그것까지 덮고되도록 어깨 블레이드 사이의 피부와 모피를 파악. 피부가 빠르게 정상, 이전 위치로 반환하는 경우 마우스가 건조하지 않습니다. 피부가 상승된 남아 천천히 움직이면 마우스는 탈수 상태에 있으며 염분이 필요합니다. 회복을위한 충분한 시간을 허용하도록 수술 후 최소한 사흘 동안 서부 유럽 표준시 음식을 제공한다. </li><li> 모든 실험 절차에 앞서, 체중 증가를 추적하여 8~10일에 대한 쥐를 관찰합니다. 불쌍한 체중 회복보통 불완전한 구개의 치유를 나타내는,이 생쥐는 더 연구에서 철회되어야한다. </li></ol> 3. 조직학을 위해 NALT 준비하고 NALT 수술의 성공 여부를 평가 <ol><li> 아래에 설명된대로 NALT 수술의 성공은 조직학에 의해 ascertained이어야합니다. 모든 실험 연구를 완료하면 승인 IACUC지도를 사용 euthanizing하여 두개골 컬렉션을 위해 생쥐를 준비합니다. NALT에 영향을 미칠 수있는 흡입 anesthetics의 사용을 피하십시오. </li><li> euthanized 마우스 목 목덜미를 파악. 양쪽 가위로 condylar 프로세스를 통해 snipping 의해 두개골의 나머지 부분에서 낮은 아랫 턱이를 제거합니다. </li><li> 목 목덜미에서부터 천천히 필링과 두개의 복부 측면으로 절단하여 두개골로부터 피부와 모피를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 비강 주변 피부를 제거하고 완전히 제거하는 주둥이 끝의 오프 피부를 자르지. </li><li> 척추 지혜에서 두개를 분리가위 헥타르를 싹둑. </li><li> 구멍의 매그넘으로 가위를 삽입하고 고정하는 동안 부드러운 조직으로 포르말린의 침투를 허용하는 중간선에 따라 두개골 아래로 반을 잘라. </li><li> 중립 10 % 두개를 고정하는 것은 상온에서 24 시간 동안 (NBF) 포르말린 버퍼. </li><li> decalcify하려면 개미의 산성 혼합물과 병에 뼈를 만져서 Rexyn을 막기 위해 거즈에 싸서 샘플 및 별도의 카세트를 넣습니다. 상온에서 12 시간 동안 부화 후 약 20 분 동안 수돗물하에 지속 린스. </li><li> 면도날과 심장 그리고 과거 눈 궤도에 샘플을 트림. </li><li> 샘플 및 카세트는 10 % NBF에 단기간 동안 저장할 수 있습니다. </li><li> 하룻밤 처리를위한 조직 프로세서에 샘플을 놓습니다. 이것은 파라핀의 삽입을위한 준비 표본에서 물을 제거하기위한 것입니다. </li><li> 아래로 주둥이를 가진 파라핀 블록에 포함할 처리 조직을 제거하고 냉각 수 있습니다. </li><li> r을 손질NALT의 대략적인 위치를 접근하는 자동 마이크로톰있는 블록의 ough 15 μm의 크로스 - 섹션 다음, 44.3 ° C 물 목욕에 유리 슬라이드에 장착에 5 μm의 섹션에 절단 계속합니다. </li><li> Hematoxylin과 eosin (H &amp; E) 조직학의 염색법은 NALT 절제를 평가하는 데 사용해야합니다. </li></ol> 4. 마우스에서 생물 학적 샘플의 수집 4.1 세럼 <ol><li> 조심스럽게 가열 램프와 함께 체온을 앞질렀어 것은 혈액 흐름을 증가합니다. 수술용 칼날과 측면 꼬리 정맥을 nicking하여 혈액을 수집합니다. 혈액 Microtainer 혈청 분리관로 자유롭게 드립하도록 허용합니다. </li><li> 혈액의 흐름을 중지하는 등 거즈 또는 수건 등의 흡착제로 닉에 부드러운 압력을 적용합니다. </li><li> 30 분 Microtainers의 응고에 혈액을 허용 후 최소 90 초 동안 6-15 X 1,000그램 사이에 원심 분리기. </li><li> 위해 깨끗한 Eppendorf 튜브에 Microtainer에서 혈청 분리 전송보관 -80시 ° C. </li></ol> 4.2 타액 <ol><li> 20-30 μL 멸균 인산을 pipetting하면 뺨에와 잇몸 라인 사이에 식염수 (PBS)를 버퍼링하는 동안 수직 anesthetized 마우스를 잡아. 뺨에와 잇몸 라인 사이에 피펫 팁을 지시에 의해 희석 타액을 수집합니다. </li><li> -20 ° C.에 2X 테아제 억제제 및 매장의 10 μL를 포함하는 새로운 튜브로 희석 타액을 전송 </li></ol> 4.3 네이절 분비물 <ol><li> 승인된 IACUC지도를 이용하여 비강 분비물을 수집하기 전에 마우스를 안락사. NALT에 영향을 미칠 수있는 흡입 anesthetics의 사용을 피하십시오. </li><li> 마우스를 개최하는 것은 수직으로 조심스럽게 한 콧구멍에 무균 PBS의 30 μL를 피펫 및 기타 콧구멍에서 린스 수집합니다. </li><li> -20 ° C.에 2X 테아제 억제제 및 매장의 10 μL를 포함하는 새로운 튜브로 헹굼 전송 </li></ol> 4.4 질 분비물 <ol><li> 회의 개통으로 micropipette의 팁을 삽입euthanized 마우스의 전자 외음부는 멸균 PBS의 50 μL와 음부를 씻어 micropipette하여 모든 유체를 수집합니다. </li><li> -20 ° C.에 2X 테아제 억제제 및 매장의 10 μL를 포함하는 새로운 튜브로 헹굼 전송 </li></ol> 5. 수집된 샘플의 항원에 특정한 항체 또는 크린 시토킨은 엘리사 또는 다른 정량 방법에 의해 측정할 수있다. 6. 대표 결과 그림 1은 전직 생체내 분석을위한 NALT 함유 조직을 처리 관여 단계의 일반적인 설계도를 제공합니다. 그림 2 (A, B)에서 구개의 크기가 아니라 점선으로 표시, 절제 수술시 절개의 위치 (A)뿐만 아니라, 표시됩니다. NALT의 위치는 병렬 조직을 보여주는 그림 2에서 excised hematoxylin-스테인드 구개 (C)에 소구 치의 영역에서 화살표로 표시됩니다. 그림 3상단 NALT에 액세스 구개 (A, B), 절제 (C)와 절개 (D)의 최종 소작의 노출을 보여주 NALT 중단 수술의 단계를 제공합니다. 직접 수술 후 microcurette 의한 NALT 혼란의 이미지가 그림 3 층에 나타나는 동안 수술 전에 NALT를 둘러싼 비강 부비동 지역의 전형적인 H &amp; E 단면은 그림 3E에 표시됩니다. 수술에서 회복을위한 충분한 시간을 허용, incisions은 폐쇄되어야하고 NALT (그림 3G)의 비강 찾아볼 수없는. 이러한 기술을 사용하여 얻은 전형적인 실험 결과는 포도상 구균 subunit 백신 (STEBVax)의 연구에서 조직 문화 supernatants 및 생물 학적 샘플을 비교, 그림 4에 표시됩니다. 마우스는 비강 (IN) 또는 intraperitoneal (IP) 경로로 인해 STEBVax을 투여했다. 예방 접종은 수신자와 같은 수용체 4 통로 3,1를 활성화 도움이되는과 함께 공식화되었다<html> 4, 그리고 컨트롤은 염분이나 백신이 도움이되는없이 받았습니다. 실험 집단에서 얻은 교양 NALT는 엘리사에 의해 측정했습니다 중간에 항원에 특정한 면역 글로불린을 분비. 이 예제에서 (그림 4A), 결과는 이가의 가장 큰 금액이 도움이되는 결합 subunit 백신으로 예방 접종을 생쥐에서 얻은 NALT에 의해 발표된 것으로 나타났습니다. 컨트롤이나 NALT없는 생쥐에서 획득한 생물 학적 시료 (예 : 혈청, 타액, 비강 분비물, 질 분비물 등) 조직 배양 결과와 비교를위한 비강 항원에 대한 생체내 면역 반응 프로필에 사용할 수 있습니다. 예방 접종의에 대한 그림 4B에서 이가와 IgG는 응답이 크게 기능성 NALT없이 감소했다. 항원에 특정한 이가의 수준은 예방 접종을 생쥐의 점막 분비물의 IgG (타액, 비강의 세차장)보다 일반적으로 더 있었다. upload/3960/3960fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1. NALT 수집 및 전직 생체내의 culturing의 도식. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig2.jpg" /> 그림 2. NALT 및 수술 절개의 위치를 나타내는 마우스 구개의 시각화. 크기와 점선 ()으로 표시 수술 절개와 상부 구개의 위치, 상부 구개가 excised (B) 또는 구개의 소구치 영역 (구개의 앞부분 측면에 얼룩진 어두운 자주색으로 병렬 NALT를 볼 수 hematoxylin (C)에 묻다 ). NALT는 화살표로 표시. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig3.jpg" /> 그림 3. 외과 NALT 장애. NALT 중단 수술의 주요 단계 : 수술 전에 마우스 상부 구개의 나태한보기 (); NALT (B)를 액세스하는 상위 입맛에 만들어진 중간선 절개;에 NALT 구조를 방해하는 중간선 절개를 통해 삽입 microcurette 프로브tegrity (C), 수술 (D)의 끝 부분 절개의 소작. 수술 (E) 전에 비강 충치, H &amp; E 스테인드의 미세한 이미지, 즉시 수술 (F) 이후, 그리고 성공적으로 치유, NALT없는 마우스 (G). <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig4.jpg" /> 그림 4. 교양 NALT, 타액, 그리고 예방 접종을 생쥐에서 수집한 비강 분비물에서 백신에 특정한 항체. NALT - 무료 또는 정상적인 제어 생쥐에 또는 STEBVax과 IP를 접종하고, 생물 학적 샘플이 수집되었다. 세중의 샘플 항체 수준은 엘리사를 사용하여 측정되었다. () NALT는 컨트롤 마우스 (수술 조작되지 않음)에서 제거하고 항체 반응을 검사하는 배양해되었다. 예방 접종을 생쥐에서에 대한 문화의 백신 전용 이가 응답 (학생의 T-테스트, P ≤ 0.01, 아니 도움이되는 없거나 전혀없는 백신에 비해) 컨트롤에서 통계적으로 달랐어요. (B) NALT 장애는 크게 특정 항체 반응을 감소예방 접종 IN합니다. 특정 항체 수준 간의 큰 차이가있었습니다 NALT 및 NALT 타액 IgG 결과 (학생의 T-테스트, P ≤ 0.05)를 제외한 모든 비교 + 그룹 (아무 수술이나 컨트롤 수술).

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</ol>

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우리는 생물 학적 샘플 및 NALT - 관련 면역 반응에게 1-4 조사를위한 assays를 얻어, 동물 모델을 개발하기 위해 집단적 방법을 제시했습니다. 이러한 방법의 성능 기간 동안 고려해야 할 추가적인 요인이 있습니다. 수술 및 조직 배양을위한 표준 무균 기법을 따라야한다. 격리와 문화뿐만 아니라 소독기구, 작업 공간, 그리고 감염되지 않았소 입맛을 유지하는 동안 사용되는 항균 및 antifungal 대리인의 조합은 오염의 위험을 훨씬 줄일 수 있습니다. 혈청 항체는 일반적으로 높은 농도에서 발견되는대로 타액, 비강 세차장 및 유사한 점막 분비 샘플은 피로 잠재적인 오염 물질에 대한 검사를해야합니다. 항체의 낮은 농도는 혈청에 비해 이러한 샘플에 존재하기 때문에 또한, 점막 분비물은 약간 분석을 위해 희석되어야한다. 마우스는 사전에 직접 수술 후에 따뜻한 보관해야합니다잠재적인 마취 유도된 저체온증을 빼낼. 그들의 측면에서 대체 휴식 마우스는 수술 후 회복 기간 동안 불규칙한 호흡을 최소화합니다. 수술은 이러한 작업을 완료하기 위해 함께 일하는 세 개인가 더 효율적이다 : 쥐가 마취에서 회복으로 수술을 수행하는 하나 입을 열어 쥐고을 지원 하나, 그리고 하나는 사후 수술 치료를 제공합니다. 그것은 각각의 마우스에 대한 수술의 성공 여부를 확인하기위한 모든 실험 과정이나 연구 끝에 두개골 크로스 섹션의 H ​​&amp; E 염색법을 사용해야합니다. 가능한 수술 결과는 다음과 같습니다 완전하고 양국 NALT 절제, 불완전 절제하거나 손상되지 NALT. 모든 수술이 잔류하거나 그대로 NALT 갖춘 NALT 손실, 동물 얻을 수 있기 때문에이 내부 통제로 사용될 수 있습니다. 또 다른 잠재적인 결과는 구개는 비강 및 구강 충치를 연결 개통을 떠나, 완전히 치유하는 데 실패한다는 것입니다. 불완전한구개의 치유는 낮은 무게와 번성하는 고장의 원인이되며, 이러한 개인들은 연구에서 제외되어야한다. 마우스 모델 첫번째 백신 반응을 검사하는 것은 의도된 학습 결과 (항체 반응, 생존 등)에 NALT위한 역할을 확립하기 위해이 될 것입니다. 수술 NALT를 제거하면 로컬 및 전신 면역로 비강 기부의 결정을 용이하게합니다. 여기에 설명된 수술 접근법 NALT을 찾아볼 수없는이 마우스 모델을 얻기위한 가장 직접적인 방법입니다. 노크 아웃 선택 마우스 모델은 부족 NALT에게보고하지만,이 동물은 또한 크린 시토킨 또는 기타 보조 림프 조직의 발전에 필수적인 chemokines에 결함이며, 추가적인 결함에게 12,13을 품다 수있다. 또한, 여기에 설명된 방법은 비강 내에 발생하는 면역 반응의 여러 측면을 검토하기 위해 개발되었다. 우리의 실험 결과는 전체 상위 palat을 사용하여 연구를 기반으로조직 배양을위한 마우스에서 전자, 그것이 섹션 사용할 수있다는 것을 가능하지만. 마지막으로, 교양 NALT 모델은 조직 문화에 완전히 실험을 수행하는 데 유용합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 스테인레스 무균 외과 블레이드, 11 호 </td><td> Miltex </td><td> 4-311 </td><td></td></tr><tr><td> 칼 손잡이, 제 3 호 </td><td> Miltex </td><td> 4-7 </td><td></td></tr><tr><td> 48도 세포 배양 플레이트 </td><td> Costar </td><td> 3548 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청, Inactivated 히트 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> 최종 Conc : 문화 매체 볼륨에 의해 10% </td></tr><tr><td> 스트렙토 마이신 황산 </td><td> 시그마 </td><td> S9137 </td><td> 최종 Conc : 100 μg / ML </td></tr><tr><td> 페니실린 </td><td> 시그마 </td><td> P7794 </td><td> 최종 Conc : 100 UI / ML </td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G1397-10ML </td><td> 최종 Conc : 50 μg / ML </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td> 최종 Conc : 1 μg / ML </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H0887 </td><td> 최종 Conc : 10 MM </td></tr><tr><td> Eppendorf의 Microcentrifuge 튜브 </td><td> Eppendorf </td><td> 022,364,111 </td><td></td></tr><tr><td> Nutra-겔 체리 맛 마우스 습식 식품 </td><td> 바이오 서빙 </td><td> S4798-트레이 </td><td></td></tr><tr><td> Metacam </td><td> Boehringer Ingelheim </td><td> 601,531,000 </td><td> 1.5 MG / ML 사정 서스펜션 한방울 </td></tr><tr><td> 케타민을 </td><td> 화이자 </td><td> 00856440301 </td><td> 최종 공동NC : 6.06 밀리그램 / ML </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Vedco </td><td> VEDC207 </td><td> 최종 Conc : 0.061 밀리그램 / ML </td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> 로이드 </td><td> 4811 </td><td> 최종 Conc : 0.667 밀리그램 / ML </td></tr><tr><td> Puralube의 투어뇌려의 연고 </td><td> Pharmaderm 동물 건강 </td><td> 1621 </td><td></td></tr><tr><td> 0.9 %의 나트륨 염화물 사출 USP </td><td> 벡스터 </td><td> 2B1302 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5 mm Microcurette </td><td> Roboz </td><td> RS-6350 </td><td></td></tr><tr><td> 열 소작 단위 </td><td> 가이 </td><td> 150-S/150A-S </td><td></td></tr><tr><td> 통신실 교체 팁, 스트레이트 파인 루프 </td><td> 가이 </td><td> 214 </td><td></td></tr><tr><td> 외과 가위 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 중립 10 % 포르말린 버퍼 </td><td> 시그마 </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> 개미의 산성 </td><td> 어부 </td><td> A119P-4 </td><td> 1,047 ML의 수돗물로 426 ML 개미의 산성을 혼합 후 45 ML Rexyn 101 (H)을 추가 </td></tr><tr><td> Rexyn 101 (H) </td><td> 어부 </td><td> R231-500 </td><td></td></tr><tr><td> 조직 - 테크 VIP E150/E300 </td><td> 사쿠라 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 로타리 마이크로톰 </td><td> Leica </td><td> RM2255 </td><td></td></tr><tr><td> 메이어의 Hematoxylin </td><td> 시그마 </td><td> MHS16-500ML </td><td></td></tr><tr><td> 길 위 Hematoxylin </td><td> 시그마 </td><td> GHS116 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin B </td><td> 시그마 </td><td> 2853 </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer 세럼 구분 기호 </td><td> BD Medical </td><td> 365,956 </td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 염분 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 100 MM 아뇨 2 PO 4, 140 MM NaCl, 산도 7.4 </td></tr><tr><td> 테아제 억제제 칵테일, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 무료 </td><td> 써모 과학 </td><td> 78,415 </td><td></td></tr></tbody></table>

백신에 마우스 응답 nasopharyngeal - 관련 lymphoreticular 조직 (nalt)의 역할을 검토

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

인간, 설치류, 그리고 다른 포유류에서 발견 nasopharyngeal - 관련 lymphoreticular 조직 (NALT)는, 1-3 비강 sinuses의 면책 특권에 기여한다. NALT는 하드 구개 위의 비강에에 두개의 평행 종 모양의 구조물이며, 일반적으로 점막 - 관련 림프 시스템 4-6의 보조 구성 요소로 간주됩니다. 돌기 세포에게 4,7,8를 항원 제시와 함께 interspersed B 및 T lymphocytes의 이산 구획은 NALT 내에 위치하고 있습니다. 이러한 전지는 공기 통로 9,10의 점막 표면에서 항원 검색에 대한 책임은 M-세포와 intercalated 상피 세포 레이어로 둘러싸여있다. NALT 통해 순환 나이브 lymphocytes는 호흡기 병원균 7 첫번째 조우에 대응하기 위해 서 있습니다. NALT 두 세 의해 인간 사라지는 동안 Waldeyer의 반지와 마찬가지로 구조화된 림프 기관은 일을 지속 계속생활 6 roughout. 인간와는 달리, 생쥐 따라서 비강 sinuses 11 이내에 발생하는 면역 반응 연구를위한 편리한 동물 모델을 제공하고, 생명에 걸쳐 NALT을 유지합니다. NALT의 단일 세포 현탁액의 문화로 인해 mononuclear 세포의 낮은 수율에 대한 실용적 없습니다. 그러나 NALT 생물학은 그대로 기관의 전직 생체내의 culturing을 면밀히 검토하고,이 방법은 자연적인 조직 구조를 유지하는 추가적인 장점을 가지고 있습니다. 생체내 연구에 들어 NALT하도록 제한 결함을 보여주고 유전자 녹아웃 모델은 개발 경로의 가난한 이해로 인해 현재는 사용할 수 없습니다. 림프 독소-α 녹아웃 마우스는 NALT을 위축시키는 반면, 예를 들어, Peyer의 패치, 주변 림프절, follicular의 돌기 세포 및 다른 림프 조직은 또한이 유전자 조작 생쥐 12,13으로 변경됩니다. 유전자 녹아웃 마우스에 대한 대안, 수술 절제 P로ermanently 다른 조직에 영향을주지 않고 비강 통로에서 NALT을 없애줍니다. 그 결과 마우스 모델은 백신 1,3에 NALT와 면역 반응 간의 관계를 설정하는 데 사용되었습니다. 혈청, 타액, 비강 세차장과 질 분비물의 시리얼 컬렉션 NALT에서 직접 발생하는 면역 반응은 조직 배양에 의해 확인할 수 있습니다 반면, 예방 접종에 호스트 응답의 기초를 확립 필요합니다. 다음 절차는 필요 수술, 조직 문화 및 샘플 수집은 비강 (IN) 예방 접종에 대한 로컬 및 조직의 체액성 면역 반응을 조사하기 위해 설명합니다.

비강 백신에 대한 생쥐의 비강 및 전신 면역 반응에 nasopharyngeal - 관련 lymphoreticular 조직 (NALT)의 공헌을 검사하는 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 NALT 종속 마우스 모델을 수립하기 위해 수술을 발휘하고<em&gt; 예 생체내</em추출 NALT의&gt; 문화.

백신에 마우스 응답 Nasopharyngeal - 관련 Lymphoreticular 조직 (NALT)의 역할을 검토

인간, 설치류 및 기타 포유류에서 발견되는 비인두 관련 림프망상 조직(nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues, NALT)은 비강의 면역에 기여합니다1-3. ...

본 절차의 목적은 비강 내 백신 접종에 대한 마우스의 비강 및 전신 면역 반응에서 비인두 관련 림프 망상 조직인 nalt의 기여도를 조사하는 것입니다. 이는 온전한 nalt의 ex vivo 배양을 통해 수행하며, 마우스 모델을 이용하여 온전한 nalt를 적출한 후 순차적으로 세척하고 정제합니다. 이후 조직을 배양하고 일정 간격으로 분주물을 채취합니다.이 샘플들은 원심 분리하여 보관한 후, 나중에 면역 반응의 증거가 있는지 검사합니다. 주변 조직이 손상되지 않도록 주의하여 마우스 비강에서 Nat를 외과적으로 제거합니다. 외과적 처치를 받은 마우스를 대상으로 실험을 진행한 후, 조직학적 분석을 통해 수술의 성공 여부를 평가합니다.최종적으로, 결과는 비강 내 백신 접종에 대한 국소 및 전신 체액성 면역 반응을 평가하는 데 사용됩니다. null의 발달 경로가 어느 정도 설명되었음에도 불구하고, 단일 유전자 녹아웃에 기반한 null의 스토리를 위한 마우스 모델은 현재 이용 가능하지 않습니다. 단일 유전자 녹아웃의 대안으로, 외과적 절제술을 통해 조직에 영향을 주지 않고 비강에서 null을 완전히 제거하였습니다.이 마우스 모델은 보조제 및 백신 또는 항원과 국소 및 전신 면역 사이의 관계를 설명하는 데 사용되어 왔습니다. 이 방법은 마우스의 비강 내 백신 접종에 따른 숙주 반응의 기초에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 비강 면역에 영향을 미칠 수 있는 보조제 또는 기타 의약품 연구에도 적용될 수 있습니다. 수술 단계가 일반적이기는 하지만, 가시성이 낮은 좁은 부위에서 작업해야 하며 동물의 건강 상태를 유지하기 위해 정해진 짧은 시간 내에 절차를 완료해야 하므로 이 방법의 시각적 확인이 매우 중요합니다.alt fill을 수집하기 전, 250 µL의 가온된 배지가 담긴 48웰 배양 플레이트의 모든 웰을 동일하게 준비합니다. 두 번째 48웰 플레이트의 한 열에도 동일하게 처리한 후, 두 플레이트 모두 필요할 때까지 따뜻하게 유지합니다. 승인된 iacuc 지침에 따라 흡입 마취제가 아닌 주사 마취제를 사용하여 마우스를 안락사시킵니다. 무균 작업대에서 nalt를 수집하려면, 먼저 마우스의 하악골을 제거합니다.다음으로, 11번 외과용 메스를 사용하여 알코올과 요오드 솜으로 상구개 부위를 소독합니다. 생쥐의 절치와 구치 안쪽 윤곽을 따라 상구개를 조심스럽게 절개하여 적출합니다. 핀셋을 사용하여 구개를 부드럽게 벗겨냅니다.펠릿이 손상되지 않도록 주의하십시오. 배지가 채워진 48웰 플레이트의 첫 번째 열 웰에 각 펠릿을 수집합니다. 펠릿을 해당 행의 각 웰로 순차적으로 이동시켜 세척합니다.세척 단계 사이에 팰릿을 조심스럽게 탭핑합니다. 8회 세척 후, 팰릿을 두 번째 플레이트의 배지가 채워진 웰로 옮깁니다. 플레이트를 37 °C에서 배양합니다. 연구 기간 동안 24시간마다 각 배양물에서 100 µL의 배지 샘플을 수집합니다.플레이트를 인큐베이터에 다시 넣기 전에 배지를 100 µL의 신선하게 가온된 배양 배지로 교체합니다. 배양 배지 샘플을 원심분리하여 부유물을 펠렛화합니다. 상층액을 새 튜브로 옮기고 모든 샘플을 ELISA로 테스트할 수 있을 때까지 -20 °C에서 보관합니다.항원 특이적 IgG, IgM 및 IgA 또는 분비 사이토카인을 분석하기 위해, 수술 전 3일 동안 7~9주령 마우스에 젤 형태의 습식 사료를 급여하여 수술 후 투여될 음식 및 수분 대체제에 적응시킨 후 마취합니다. 7~9주령 마우스의 구강 내로 진통제를 투여합니다. 승인된 IUC 지침에 따라 마우스를 마취합니다.안구에 para lube veto 연고를 충분히 도포하십시오. 동물이 발가락 꼬집기 자극에 더 이상 반응하지 않을 때까지 흡입 마취제를 사용하지 마십시오. 22~28 gauge 바늘을 사용하여 견갑골 사이에 생리식염수 1 mL를 피하 투여하십시오. 이는 수술 후 마우스의 잠재적인 탈수를 방지하기 위함입니다. 동일한 방법으로, 견갑골 사이에 ream 0.1 mL를 피하 투여하십시오.이는 수술 중 및 수술 후 건강한 호흡을 촉진합니다. 마우스를 열 지지 장치와 함께 앙와위로 배치하십시오. 수술 전 과정 동안 열 지지 상태를 유지하십시오.상악 및 하악 절치 주변에 외과용 봉합사를 두 개의 별도 루프로 걸어 입을 조심스럽게 벌려 상악 구개부를 노출시킵니다. 11번 외과용 메스를 사용하여 상악 구개부 정중선의 K. 부위로 약 3mm 길이의 절개를 가합니다. 다음으로 0.5mm 마이크로 큐렛을 삽입하고 절개창의 양쪽 가장자리 아래를 조심스럽게 긁어 knut을 파괴합니다. 열 응고 장치의 직선형 미세 루프를 사용하여 지혈을 위해 절개 부위를 소작합니다.마우스가 완전히 의식을 회복할 때까지 가온 지지대 위에서 회복하도록 둡니다. 이후 3일 동안, 탈수를 방지하기 위해 마우스에 생리식염수 1 mL를 주사합니다.수분 상태를 평가하려면 피부 텐트 테스트(skin tent test)를 수행하여 피부 긴장도(skin turgor)를 확인하십시오. 필요한 경우 하루에 최대 세 번까지 수행합니다. 마찬가지로, 경구용 진통제를 하루에 한 번 투여하십시오.모든 실험 절차를 수행하기 최소 3일 전부터 습식 사료를 제공해야 합니다. 체중 증가량을 추적하여 8~10일 동안 마우스를 관찰하십시오. 체중 회복이 불충분한 경우는 대개 구개 치유가 불완전함을 나타내며, 이러한 마우스는 이후 연구 대상에서 제외해야 합니다.수술의 성공 여부는 조직학적으로 확인해야 합니다. 모든 실험이 끝난 후, 앞서 설명한 방식대로 마우스를 안락사시키고 경추 탈구로 과정을 마무리합니다. 이제 가위로 과상돌기를 잘라내어 하악골을 두개골의 나머지 부분에서 분리합니다.양쪽 모두 동일하게 수행합니다. 목덜미 부분부터 시작하여, 두개골의 복측 방향으로 천천히 벗겨내고 절개하여 피부와 털을 제거합니다. 비강 주변의 피부를 조심스럽게 제거합니다.그런 다음 주둥이 끝부분의 피부를 잘라내어 완전히 제거합니다. 이제 가위를 사용하여 두개골을 척추에서 분리합니다. 가위를 두개골의 대후두공(foramen magnum)에 삽입하고 두개골 정중선을 따라 중간 지점까지 절개합니다.이를 통해 고정 과정 동안 포르말린이 연조직으로 침투할 수 있게 됩니다. 두개골을 10% 중성 완충 포르말린에 24시간 동안 고정하십시오. 다음 날 상온에서, 샘플을 카세트에 넣고 카세트를 거즈로 감싼 뒤 포름산 혼합액이 든 병에 넣어 탈회시키십시오.시료를 12시간 동안 처리한 후, 다시 실온에서 12시간 동안 배양합니다. 시료를 세척하고 수돗물 아래에서 20분간 헹굽니다. 면도날을 사용하여 시료를 중격(septum)까지 다듬고 안와(eye orbits)를 통과시킵니다. 단기 보관의 경우, 시료와 카세트를 10% NBF에 보관할 수 있습니다.포매 시 ssam 끝부분이 파라핀 속으로 충분히 들어가게 하고, 카세트 끝부분이 안와 끝부분 위로 오도록 배치하십시오. 그 다음 카세트 상단까지 파라핀을 계속 채운 후, 마이크로톰에 올리기 전에 냉각시키십시오. 준비가 되면 표준 조직학적 검사를 수행하십시오.주둥이 부위를 5 µm 두께의 횡단면으로 절편하고 h 및 d 염색을 수행하십시오. 조직학적 검사를 통해 신경 절제(node ablation)를 확인하는 것은 결과 해석에 필수적이며, 모든 실험을 성공적으로 마친 후에 반드시 이루어져야 합니다. alt 측면에 단핵 세포 군집이 없는 것이 절제가 성공적으로 이루어졌음을 나타내는 지표입니다.KNT 주변 비강 영역의 H&amp;E 횡단면은 일반적으로 각질성 상피 세포층으로 둘러싸인 핵 세포 군집으로 나타납니다. 수술 후에는 상악구개뿐만 아니라 NAT의 무결성에도 뚜렷한 손상이 있어야 합니다. 수술 후 회복되면 절개 부위가 닫혀야 하며 비강 내에 NAT가 없어야 합니다. 마우스에 Toll-like receptor 4를 활성화하는 면역증강제가 포함된 STX 백신을 투여합니다.경로 대조군에는 식염수만 투여하거나 보조제가 포함되지 않은 백신을 배양하였습니다. 실험군에서 얻은 NALT는 ELISA로 측정 가능한 항원 특이적 면역글로불린을 배지로 분비하였습니다. 두 가지 백신 투여 경로를 비교한 결과, 서브유닛 백신을 비강 내로 접종한 마우스에서 얻은 NALT가 가장 많은 양의 IgA를 방출하는 것으로 나타났습니다.대조군 또는 MALT가 없는 생쥐로부터 얻은 보조 생물학적 시료와 결합하여, 비강 항원에 대한 in vivo 면역 반응의 프로파일을 작성하는 데 생쥐를 사용할 수 있습니다. 조직 배양 결과와 비교했을 때, 비강 내 백신 접종에 대한 IgA 및 IgG 반응은 기능적 MALT 수준이 없을 때 유의하게 감소했습니다. 백신 접종 생쥐의 점막 분비물에서는 항원 특이적 IgA 수준이 일반적으로 IgG보다 높았습니다. 숙련되면, 1회 수집 및 24시간 시점 수집 1회를 포함하여 하나의 조직 수집 및 배양을 약 30분 내에 완료할 수 있습니다.숙련된 작업자가 적절히 수행한다면 하루에 여러 마리의 nat를 수집하고 배양할 수 있습니다. 입천장 아래를 긁어내는 과정은 nat를 절제하기에 충분해야 합니다. 이 절차를 시도할 때는 혈액 손실을 방지하기 위해 신속하게 작업하는 것이 중요합니다.이를 통해 절개 부위를 명확하게 시각화하고 동물의 건강 상태를 유지할 수 있습니다. 본 영상을 시청하고 나면, 비강 내 백신 접종 후 국소 및 전신 면역 반응에 대한 마우스 MALT의 기여도를 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

examining-role-nasopharyngeal-associated-lymphoreticular-tissue-nalt

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기, 우리는 폐에 타고난 면역 세포를 거주하고 polyanhydride의 nanoparticles와 공동으로 문화에 대한 응답으로 자신의 활성화를 검토하고 있습니다 murine 폐포 macrophages를 수확을위한 프로토콜을 설명합니다.

Polyanhydride의 Nanoparticles에 의해 유도된 Murine Macrophages 폐포 수확 및 평가 세포 활성화

마우스 성기 기관에서 림프구를 분리 할 수​​있는 효과적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 효율적으로 분리 할 수​​ 있도록 효소 분해와 Percoll 기울기 분리에 활용합니다. 이 기술은 다른 종에 사용하기 위해도에 적용 할 수...

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

예방 및 치료 백신은 종종 노드와 면역 세포의 결과로 가난한 참여 림프로 인해 백신의 주 배수에 강한 면역 반응을 자극하는 데 실패합니다. 림프절 백신의 직접 주사에 의해, 소위 intralymphatic 주입은 백신 효능 강하게 개선 될 수 있으며, 백신의 투여 량을 저감 할 수있다.

마우스의 Intralymphatic 면역 및 예방 접종

쥐 백신 접종 모델에서 나노 입자를 사용한 면역에 대한 반응으로 항원 특이적 CD8+ T 세포의 확장을 모니터링하기 위한 전체 동물 이미징 및 유세포 분석 기반 기술에 대해 설명합니다.

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

백신이 어떻게 작용하는지에 대한 전반적인 지식이 부족합니다. 여기에서는 수지상 세포와 T 세포 면역에 특히 중점을 두고 백신에 대한 초기 숙주 면역 반응에 대한 통찰력을 얻기 위해 역유전학과 골수 키메라 마우스를 함께 사용할 것을 제안합니다.

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

본 문서에서는 마우스 모델에서 BCG를 사용하여 비강 내 및 피하 면역에 의해 유도된 보호 효능 및 폐 면역 반응을 비교하기 위해 따랐던 방법론을 자세히 설명합니다. 본 연구의 결과는 폐 백신 접종의 이점을 보여주며, 백신 유도 보호에서 IL17 매개 반응의 역할을 시사한다.

보호 효능 및 폐 면역 반응은 마우스에 피하 및 비강 BCG 관리에 따라

선물이 여기 표준 면역학 기술에 대 한 응용 프로그램 (CFSE 스테인드 OT-내가 확산) 빠르게 보조 중재 된 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 세대를 모니터링 하기 위한 vivo에서. 이 빠른 CTL 용량 추정 세포내 병원 체에 대 한 예방 백신으로 치료 암 백신의 개발에 대 한 유용합니다.

급속 한 비보에 평가 보조의 세포 독성 T 림프 톨 생성 기능의 백신 개발에 대 한

Immunostimulating 접한의 치료 후 림프 조직의 림프 수지상 세포 활성화 테스트 후속 추출에 대 한 실험 절차를 설명 합니다.

Immunostimulatory 에이전트 평가: 림프 조직 추출 및 주입 경로-종속 수지상 세포 활성화

여기 선물이 vivo에서 백신의 평가 위한 우아한 프로토콜 효과 호스트 면역 반응. 이 프로토콜은 바이러스 성, 세균성, 백신 모델 또는 기생 병원 균에 대 한 적응 될 수 있다.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

제2형 염증과 관련된 그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2s)는 주로 기생충 감염, 알레르기 질환, 대사 항상성 및 조직 복구에 대한 반응에 참여합니다. 이 연구에서는 쥐의 코 점막에서 ILC2를 분리하고 CD226의 발현을 감지하는 절차를 입증합니다.

CD226의 발현을 검출하기 위해 마우스 비강 점막에서 그룹 2 선천성 림프 세포 분리

본 프로토콜은 쥐 비강 세척액(NLF)의 혈액 오염을 방지하기 위한 새로운 방법을 설명합니다. 이 방법은 혈액 오염 없이 NLF 수집을 보장하기 때문에 면역학적 성분과 다양한 호흡기 병원체를 보다 정확하게 검출할 수 있습니다.

혈액 오염이 없는 Murine Nasal Lavage Fluid Collection

배우세요 마우스 NALT의 역할을 연구하는 외배양 및 수술적 절제 방법을 통해 비강 내 백신에 대한 면역 반응을 분석하는 기술입니다. 이 모델은 백신 효능 연구에 활용됩니다.

백신에 마우스 응답 Nasopharyngeal - 관련 Lymphoreticular 조직 (NALT)의 역할을 검토

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