라만 분광학을 사용하여 세포와 세포외 기질의 비 접촉, 레이블이없는 모니터링

라만 분광법은 비 접촉에 적합한 기술, 살아있는 세포, 조직 - 엔지니어링 구조와 기본 조직의 라벨이없는 분석입니다. 소스 고유의 스펙트럼 지문가 생성 및 복수 변수 분석을 사용하여 분석할 수 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 비접촉 및 마커가 없는 방법을 통해 세포와 조직을 모니터링하는 것입니다. 이는 단색광의 비탄성 산란을 감지하는 레이저 기반 기술인 Ramen spectroscopy를 통해 달성되며, 라면 분광계에 결합된 표준 형광 현미경을 사용하여 고유한 생화학적 구성을 기반으로 각 생물학적 샘플에 대한 일반적인 스펙트럼 패턴을 생성합니다. 명시야 및 형광 이미지를 ramen Spectra와 직접 비교하여 수많은 생물학적 샘플을 모니터링하는 데 사용됩니다.

각 화학적 진동은 특정 라만 대역에 할당되며, 피크 강도는 현재 분자 결합의 양과 상관관계가 있습니다. 스펙트럼 데이터 세트의 유사점과 차이점이 감지됩니다. 다변량 분석을 사용함으로써 결과 스펙트럼을 사용하여 생검 수확 후 조직의 무결성을 확인하거나 분리된 세포의 무균 상태를 증명할 수 있습니다.

또한 이 기술을 사용하면 in vitro에서 다양한 세포 유형을 특성화하고 식별할 수 있습니다. 궁극적으로, 라면 분광법은 조직 공학 및 임상 응용 분야를 위한 유망한 레이저 기반 기술입니다.비접촉 라벨 프리 분석을 통해 시연하는 사람은 기술자인 Daniel Cabal Barrio와 제 연구실의 박사 과정 학생인 Miriam Tala가 맡을 것입니다. 조직학 및 면역형광 이미징과 같은 기존의 일상적인 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 샘플 처리가 필요하지 않다는 것입니다.

이 방법은 단일 세포 상태 및 기질 구성 요소에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다세포 조직 및 장기에도 적용할 수 있습니다. 맞춤형 라면 스펙트럼을 준비하기 위해 표준 형광 현미경을 라면 분광계에 연결하여 형광 이미지와 라면 스펙트럼을 직접 비교할 수 있습니다. 기본 설정은 784나노미터 다이오드 레이저, 라면, 여기광에서 산란광을 분리하기 위한 노치 필터, 현미경 및 스펙트럼 정보 감지에 최적화된 전하 결합 장치가 있는 분광기로 구성됩니다.

레이저 기능을 제어하려면 소프트웨어 및/또는 위안을 시작하고 CCD 카메라의 온도를 섭씨 영하 60도로 설정하여 카메라의 열 유도 전류로 인한 노이즈를 최소화하십시오. 보정 절차를 위해 현미경 스테이지에 실리콘 웨이퍼를 놓습니다. 레이저를 켜고 전력을 85밀리와트로 설정합니다.

소프트웨어 셀 B를 사용하여 XY가 나타날 때까지 웨이퍼에 레이저의 초점을 맞춥니다. 1초의 단일 적분 시간으로 실리콘 웨이퍼를 측정합니다. 60X 에어 대물렌즈를 사용하여 X축의 단위를 픽셀 번호에서 라면으로 변경합니다.

and 또는 Soli 소프트웨어의 이동은 수집된 스펙트럼에서 파동 수 520에서 Silicon Peak의 레이저 초점을 변경합니다. 이 라면 밴드에 대해 가능한 최대 강도를 찾으려면 스펙트럼 측정 전에 성공적인 보정을 위해 최소 카운트 양이 11, 000 이상이어야 하며, 서면 프로토콜의 지시에 따라 생물학적 샘플을 준비합니다. 이 비디오와 함께 모든 측정은 실온에서 수행됩니다.

개구수가 1.2인 60배 침수 대물렌즈를 사용하여 10초당 10회 적분하여 측정당 총 100초 동안 스펙트럼을 수집해야 합니다. 부착 세포를 측정하려면 세포를 고정하는 유리 바닥 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다. 더 나은 신호를 얻고 재현성을 보장하려면 레이저를 세포핵에 집중시키고 현미경 조명을 끈 다음 스펙트럼 수집을 시작합니다.

10 스펙트럼마다 레이저 초점을 세포 옆으로 이동하여 배경의 참조 스펙트럼을 측정합니다. 초점을 변경할 때 각 초점 깊이에 대해 새 배경을 수집해야 한다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 또는 세포와 현탁액을 측정하기 위해 100마이크로리터의 세포 현탁액을 유리 바닥 접시에 옮깁니다.

현미경 스테이지에 놓은 후 세포 중앙에 레이저의 초점을 맞추고 현미경 조명을 끈 다음 스펙트럼 수집을 다시 시작합니다. 레이저 초점을 세포 옆으로 이동하여 10개의 스펙트럼마다 배경의 참조 스펙트럼을 측정합니다. 천연 조직의 스펙트럼을 측정하려면 샘플을 유리 바닥 접시에 넣습니다.

관심 영역은 접시 바닥을 향해야 합니다. 샘플을 덮을 수 있을 만큼 충분한 PBS로 접시를 채웁니다. 샘플의 움직임을 피하기 위해 샘플 위에 커버 유리를 놓습니다.

측정하는 동안 레이저 초점을 관심 구조로 설정하고 스펙트럼 수집을 시작합니다. 레이저 초점을 전체 조직 영역 밖으로 이동하여 10개 스펙트럼마다 배경의 참조 스펙트럼을 수집하고, 면역형광 표지된 극저온 절편의 스펙트럼 측정을 위해 각 초점 깊이에 대해 항상 새로운 배경을 수집합니다. 단면도 신선한 스냅 냉동 조직 샘플.

표준 극저온 오메를 사용하여 실리카 코팅된 커버 유리에 장착합니다. 면역형광을 위한 일상적인 프로토콜에 따라 cryo section을 염색하고, 짧은 고정 단계만 사용하며, 수행된 관심 단백질의 검출을 위해 적절한 항체를 사용합니다. 형광이 발생하는 영역에 초점을 맞춘 라면 측정.

엘라스틴 분해 실험을 입증하기 위해 절개된 돼지 대동맥 판막 첨판의 심실은 유리 바닥을 향하도록 배치됩니다. 바닥 접시. 전체 조직 표면에 걸쳐 30개의 무작위 지점에서 네이티브 조직을 비배양 대조군으로 측정합니다.

섬유소 구조에 초점을 맞추면 샘플을 두 부분으로 나누고 2ml의 엘라스타제 용액으로 채워진 별도의 2.5ml eend tube에 넣었습니다. 섭씨 37도에서 15분 또는 30분 동안 조직을 배양합니다. 배양 후 einor 튜브에서 조직을 제거하고 PBS로 조심스럽게 세척하여 효소 반응을 완전히 중단시킵니다.

섬유소 구조에 초점을 맞춘 30개의 무작위 점에서 각 샘플을 측정합니다. Raman Spectra 처리는 Opus 소프트웨어를 사용하여 생성된 스펙트럼을 전처리하는 것으로 시작됩니다. 먼저, 수집된 스펙트럼에서 해당 배경 스펙트럼을 빼서 유리와 매체의 간섭 신호를 줄이고 초점 변경으로 인한 변동을 방지합니다.

측정하는 동안 필요한 경우 가장 많은 정보를 제공하는 401, 800 사이의 파수 영역으로 스펙트럼을 줄입니다. 스펙트럼을 최대 피크 정규화로 정규화하고, 시스템 고장의 강도 변동을 고려하여 샘플 스펙트럼의 구조적 변화 감지를 단순화합니다. 기준선 보정을 수행하여 서로 다른 실험 간의 비교성을 높입니다.

언스크램블러 소프트웨어와 함께 주성분 분석 또는 PCA를 사용하여 라만 스펙트럼을 분석합니다. 이 다변량 분석은 스펙트럼 데이터 세트 내의 차이점과 유사점을 감지합니다. 모든 스펙트럼은 모든 라멘 이동에 대해 수집된 개수를 기반으로 다차원 공간의 단일 점으로 표시됩니다.

각 주요 구성 요소, 약칭 PC는 원본 데이터에 포함된 전체 정보의 일정량을 설명합니다. 첫 번째 PC는 가장 높은 변동 소스를 포함하는 PC입니다. 다음 각 PC에는 이전 PC보다 적은 정보가 순서대로 포함되어 있습니다.

모든 변수에는 PC를 플로팅하는 각 PC.By 에 점수와 부하가 있으며 중요한 샘플 상관 관계가 노출될 수 있습니다. 적재는 분석된 각 변수가 PCA에 기여하는 정도를 설명합니다. 모든 샘플 그룹에 대한 행 범위를 생성하여 각 측정 그룹에 레이블을 지정하고 PCA 교차 검증, Nip Al 알고리즘, 회전 없음에 대해 다음 기본 설정을 사용하고 분석을 시작합니다.

이러한 설정은 스펙트럼에 따라 다릅니다. 마지막으로, 부착 세포에서 생성된 PCA 원시 라면 스펙트럼을 수행하면 종종 낮은 신호 대 잡음비와 낮은 전체 신호 강도를 나타낼 수 있습니다. 레이저 초점은 실제 샘플 신호를 마스킹하는 유리 바닥 근처에 설정해야 합니다.

결과적으로, 샘플 신호는 후속 배경 빼기 중에 최소화되거나 제거될 수도 있습니다. 반대로, 셀과 현탁액을 사용하면 보다 자세한 스펙트럼 정보를 검출할 수 있습니다. 그러나, 부착 세포와 현탁 세포의 스펙트럼은 현탁액 내에서 서로 다른 세포 유형의 특성화를 위해 강도 개체에서만 다른 동일한 주요 피크를 나타내며, 전처리가 필요하지 않습니다.

현탁액에서 측정된 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기세포, 연골세포 및 각질세포의 평균 라만 스펙트럼 및 표준 편차가 여기에 설명되어 있습니다. 모든 라멘 스펙트럼은 단백질, 핵산 및 지질과 같은 일반적인 생체 분자에서 유래한 피크로 유사하게 구성되어 있습니다. 이러한 세포 유형의 경우, 파동 번호 601, 800 사이의 스펙트럼 영역에는 서로 다른 세포 유형 간에 명확한 차이를 감지할 수 있는 가장 관련성이 높은 스펙트럼 정보가 포함되어 있습니다.

예시적인 하나의 스펙트럼 영역은 콜라겐과 지질의 분자 진동에 할당될 수 있는 명확한 구조적 차이를 나타냅니다. 대조적으로, 형태학적 분석은 대부분의 세포를 식별하고 구별하는 데 적합하지 않습니다. 연골세포와 피부 세포의 차이는 관찰할 수 있지만, 섬유아세포와 중간엽 줄기세포는 분리하기 어렵습니다.

특정 지문 스펙트럼에 천연 조직을 할당하기 위해 명시야 현미경만을 사용하여 Raman Spectra는 상업적으로 이용 가능한 순수 단백질과 면역 조직학적으로 염색된 극저온 절편을 생성했습니다. 여기서, 탄성 섬유의 지문 스펙트럼은 엘라스틴에 대한 항체를 사용하여 표지된 동결건조, 엘라스틴 및 면역 형광 염색 극저온 절편과 비교하여 천연 조직 내에서 확인되었습니다. 그러나 엘라스틴은 라만 스펙트럼에 반영된 높은 자가형광을 특징으로 하기 때문에 자가형광과 같은 시료 특이적 특성으로 인한 체계적 불량을 줄이기 위해 데이터 분석이 어려우며 데이터 세트의 적절한 처리가 중요합니다.

데이터 분석에서. 정규화는 순수 엘라스틴 단백질의 현저하게 더 높은 신호 강도를 제거하는 데 사용되었으며, 그 결과 유사한 라만 스펙트럼이 생성되었습니다. 엘라스틴은 신체에서 가장 안정적인 세포외 기질 단백질 중 하나이므로 분해가 매우 어렵습니다. 여기.

다변량 분석을 적용하여 효소 분해를 수행하여 건강한 돼지 대동맥 판막 첨판에서 엘라스틴 분해를 유도했으며, 효소 처리된 샘플의 라만 스펙트럼과 네이티브 대조군 간에 PCA의 유의미한 차이가 확인되었습니다. 이러한 스펙트럼 차이는 파수 861, 1003 및 1, 664의 로딩 스펙트럼에서 관찰되었으며, 엘라스타제에 대한 노출 시간 연장으로 인해 섬유를 함유하는 엘라스틴에서 예상되는 구조적 변화는 보다 뚜렷한 분리 가능한 점수에 반영되었습니다. 여기에 표시된 클러스터는 네이티브 조직 내에서 처리되지 않은 대조군과 효소로 분해된 탄성 섬유 간의 비교 점수입니다. 이러한 예상되는 구조적 변화는 30분 동안 엘라스틴 통합 효소 엘라스타제에 노출된 조직 샘플과 처리되지 않은 대조군을 비교하여 이 삽입에서 시각화된 바와 같이 심장의 염색된 돼지 대동맥 판막 첨판에서도 분명합니다.

이 기술은 세포 및 매트릭스 생물학, 재생 의학 및 조직 공학 분야의 연구자들이 실시간 세포 표현형 분석을 수행할 뿐만 아니라 네이티브 환경 내에서 Z two에서 중요한 세포 세포 및 세포 매트릭스 상호 작용을 식별할 수 있는 길을 열어줍니다.