Name: 병렬 공촛점 현미경을 사용하여 여러 세포의 운동 데이터를 취득 빠르고 높은 해상도, mtPA-GFP 기반 Mitochondrial 퓨전 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 학습하세요 병렬 공촛점 현미경을 이용한 mtPA-GFP 기반 미토콘드리아 융합 분석법으로, 다중 세포의 고해상도 3D 영상 데이터를 자동화하여 신속하게 수집하는 방법입니다. 이 기술은 대사성 및 퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

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우리는 신경 과학 연구를위한 Tufts 센터, P30 NS047243 (잭슨), 보스턴 대학 의과 대학, 링크 의학 공단에서 학제간 바이오 메디컬 연구 에반스 센터에서 지원 Mitochondria 동질 연구 협력 (mtARC), 그리고이 작품을 지원하기위한 자이스 혈구 감사드립니다.

1. 이미지 플레이트 준비 <ol><li> 10% 표준 태아 소 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신, 2 개의 MM L-글루타민, 50 μm의 2 - 메르 캅 토 에탄올, 5 밀리미터 NaHCO 3, 2 MM HEPES, 2 개의 MM pyruvic 산성, 11 MM 포도당을 포함하는 RPMI 미디어 문화 INS1 세포 80 % 합류합니다. </li><li> 0.05 %의 트립신 및 플레이트 그들 폴리-D-라이신 코팅 coverslip 바닥 이미징 플레이트 (30~40%의 합류점)를 향해 함께 INS1 셀 문화를 Trypsinize. </li><li> 번호판 60~80%의 합류점 (~ 2 일)에 도달하고 mitochondrial 매트릭스는 타겟 추가할 수 있도록 허용 (COXVIII)에 대한 adenoviral PA-GFP 24 시간 (방어 = 5). 교환 매체와 세포 이미징하기 전에 다른 2 일 성장할 수 있습니다. </li><li> 이미징의 날, 이미징 플레이트로 7-15 나노미터 TMRE을 추가하고 적어도 45 분 동안 평형. </li><li> 인큐베이터에서이 시간 순서 (무대 최고 인큐베이터 여기에 사용되고있다) 동안과 현미경 ° C에서 약 1 시간 동안 37 평형 수 있습니다. 5 % CO 2를 켭니다. </리&gt; </ol> 2. 자이스 혈구 LSM 710 공촛점 현미경을위한 이미징 매개 변수 <ol><li> 현미경 equilibrated 후 취득 탭 아래, &quot;쇼 설명서 도구&quot;를 클릭 이미징이 패널을 설치 열고 &quot;채널 모드&quot;를 선택하고 모든 &quot;프레임&quot;을 추적할 전환합니다. </li><li> 라이트 경로 패널에서 LSM 및 채널 모드를 선택합니다. 표본 아이콘에서 일하는 것은 상향, 690 + 및 MBS 488 &quot;리어&quot;, MBS를 선택합니다. 패널의 아래쪽에서 명시야 또는 DIC 채널의 시각화을 활성화하는 &quot;T-PMT&quot;를 선택합니다. </li><li> 490-540 nm의와 TMRE 색소를위한 580-700 nm의에 GFP의 염료에 대한 범위를 설정하여 빛의 경로 매개 변수를 조정 완료. </li><li> 획득 모드에서 × 512 픽셀 스캔 필드, 평균 4X를 512을 사용하고 줌 계수를 (당신이 교정 목적으로 일관성있게 유지하려는 수도 있음)를 선택합니다. </li></ol> 3. 이미징 매개 변수를 최적화 <ol><li> foc는 (1.4 NA) 100x 객관 렌즈를 계획 고차 색지움 사용phototoxicity에서 mitochondria 보호하는 할로겐 라이트가 아닌 형광등, 귀하의 세포에있는 우리. </li><li> PA-GFP는 maximally 오픈 핀홀을 사용하여 세포를 표현하고 밝은 녹색 세포를 찾기 위해 스캔을위한 화면. </li><li> PA-GFP를 활성화하고 신호가 감지기를 포화하지 않는다는 보장 이미징 매개 변수를 최적화하는 데 필요한 2 광자 레이저의 가장 낮은 전력을 찾습니다. PA-GFP 신호가 몇 Z-시리즈 TMRE 신호 colocalizes 확인하십시오. TMRE 신호의 손실은 mitochondrial 탈분극 또는 phototoxicity을 표시하고, 세포는 이러한 특성을 분석에 사용하지 않아야 전시. </li><li> PA-GFP 표현하는 셀을 찾아 줌 계수를 지정합니다. </li><li> 6 조각 (특정 Z-포커스가 각 위치에서 설정하지 않는 한이 범위 모두 10 세포를 충족해야합니다)를 수집하기 위해 Z-시리즈 범위를 설정합니다. </li><li> 각 셀 (셀 1, 셀 2 등)에 이미징 방법을 저장합니다. </li></ol> 4. 자동화 조정D 프로그램의 부분 그리고 당신이 1 시간 Mitochondrial 퓨전 분석을 위해 따르는 10 개의 셀을 지정 <ol><li> multitime 창의 왼쪽 패널에서 &quot;절약&quot;패널을 선택하고 파일이 저장됩니다 위치를 지정합니다. </li><li> &quot;취득&quot;패널에서 스캔 구성 세포 1 저장한 수집 방법을로드하고 Z 스택 상자를 선택합니다. 또한 &quot;Z 스택의 Z-한가운데 표시&quot;를 선택합니다. </li><li> &quot;블록&quot;패널에서 &quot;각각의 장소에서 하나의 블록&quot;를 선택합니다. 측정되는 각 구간에 대해 &quot;추가 블록&quot;을 클릭합니다. </li><li> &quot;타이밍&quot;패널에서 &quot;처음 위치로만에 차단하기 전에 대기 간격&quot;에서 &quot;간격을 기다&quot;및 유형 &quot;0&quot;를 선택합니다. 블록 2-4이 섹션에서 &quot;15 분&quot;을해야합니다. </li><li> 장소 패널에서 선택 &quot;위치 사이의 위치를​​로드하는 데 초점을 이동&quot;및 다중 &quot;을 선택 후와&quot;모두를 지우 편집 위치 목록 &quot;을 선택&quot; &quot;로드 또는 &#39;다음 LOC의&#39;클릭 &#39;은 LOC로 이동&#39;때 아래. 설정 검색&quot; 위치는 &quot;무대를 동력. </li><li> 깨물어어 &quot;블리치&quot;패널은 &quot;표백제&quot;상자를 클릭하고 &quot;설정&quot;에서 설정 파일을 지정 메뉴를 풀다운 등 주요 소프트웨어의 윈도우에 지정. 그런 다음 &quot;표백&quot;창에서 적절한 photoactivati​​on 방법을 저장합니다. 지역 패널에서이 특정 세포에 대한 투자 수익 (ROI)를 선택하고, 윈도우 &#39;투자 수익 (ROI) 목록에 추가할 현재 영역 &quot;을 선택하여 multitime이 투자 수익 (ROI)을 추가합니다. 풀다운 메뉴를 &#39;투자 수익 (ROI) &quot;에서 같은 위치를 선택하십시오. </li></ol> 타이밍이 제대로 작동하기 위해서는 각각의 세포는 15 분 간격을해야하는 두 가지 방법 저장해야합니다. 블록의 목록에서, 첫번째는 &quot;진짜&quot;photoactivati​​on 구성을 가지게 될 것이며, 나머지 두 광자 레이저를 사용하지 않는 &quot;모의&quot;구성을해야합니다. 첫 번째 블록도 (= 0 BKIntv) 지연이없는 유일한 블록 될 것입니다. 따라서 방법은 photoactivati​​on 스캔 다음에 한베이스 라인 스캔과 함께 시작됩니다. 블록의 나머지 900 초 BkIntv를 가지고 있고,각 시점에서 타이밍의 일관성을 유지하는 것처럼 시간 0 초 두 검사가 마련되어 있습니다. <ol start="7"><li> 시간이 지남에 따라되는 10 세포의 각각의 경우이 시퀀스를 수행합니다 : 표현 PAGFP 찾기 자사의 이미징 방법으로 세포를 저장 위치는 무대 위치를 패널 표시, 이미징 방법을 지정 주요 투자 수익 (ROI) 패널을 선택 구체적인 투자 수익 (ROI)을 패널 저장하고 또한 투자 수익 (ROI)을 상자에 넣어로드 photoactivated 블리치로 관심 지역 : 투자 수익 (ROI)을 지우고 1로 스캔 확대를 재설정 다음 셀을 찾아 줌으로 설정 다음 9 세포에 대한 과정을 반복 </li></ol> 각 단계의 위치와 모든 블록 관련된 적절한 이미징 방법 (스캔 구성)가 있는지 확인합니다. 또한, 나머지는 &quot;모의&quot;방법을 포함하면서 각 위치에서 첫 번째 블록은 적절한 photoactivati​​on 메서드에 해당하는지 확인하십시오. 마지막으로, &quot;실행&quot;을 선택하십시오. 5. PA-GFP 신호 강도를 분석 <ol><lI&gt; photoactivatable-GFP 신호가 빨간색 TMRE 신호로 colocalizes있는 세포의 경우 PAGFP 이미지 (여기서 우리가 metamorph을 사용)의 배경을 뺍니다. </li><li> 그런 다음 엑셀로 데이터를 내보낼하고 각 시점에서 Z-스택에 대한 평균 강도를 계산합니다. 신호가없는 광학 부분을 폐기하십시오. </li><li> 원래 photoactivated 신호의 비율을 계산하여 각 Z-스택의 신호 희석을 측정합니다. </li></ol> 각 데이터 포인트는 각 시점에 대한 중복 Z-스택 정보를 그 결과 두 번 스캔되어 기록됩니다. Z-스택 값을 동의 확인하십시오. 그렇지 않다면,이 문제 (예 : 초점, 세포 운동)을 나타내는 것입니다. 6. 대표 결과 융합 이벤트가 활성 및 비 활성 PA-GFP mitochondrion 사이에 발생하면 mitochondrial 매트릭스 내에서 PAGFP가 아닌 라벨이 매트릭스와 혼합하고 큰 지역에 희석되고, 신호를 감소강도 (그림 1A). mitochondrial 융합의 평균이 (약 1 시간)에 도달되기 전에 INS1 세포에서 신호 강도가 크게 감소는 15 분 간격으로 발생합니다. 그림 1B의 세포 PA-GFP 및 TMRE 신호의 거의 완전한 colocalization을 전시하고 있습니다. 이러한 assays에서 TMRE의 매우 낮은 농도 (15 NM) PAGFP의 photoactivati​​on을 타겟팅하기 위해, 또한 세포의 건강을 모니터링하는 데 사용됩니다. 이 중 phototoxicity, 또는 죽어가는 상태의 세포를 원하셨기에 depolarized mitochondria의 풍부한 세포는 PAGFP 및 TMRE의 불완전한 colocalization을 주어 분석해서는 안됩니다. ~ mitochondrial 볼륨의 15 %가 활성화될 때 mitochondrial 융합을위한 평균 시간은, 보통 INS1 세포에서 1 시간입니다. 때로는 작은 면적가 켜져있는 경우에도 mitochondria 대부분 인해 더욱 융합 감지하기 어려운 경우에는 높은, 네트워크받는 것에 photoactivated되기. 다른 세포 유형은 서로 다른 평균 시간을 나타내는 수 있고 mitochondrial 역학 성격 짧은 간격과 긴 기간 동안 테스트해야합니다. mitochondrial 융합을 억제하기 위해 세포 lipotoxic 환경에서 배치될 수 있습니다. 그것은 이전에 0.4 MM은 파편이 mitochondria palmitate 것을 입증하고, mitochondrial 융합 9 억제되었습니다. 이 효과는 mitochondria가 조각되어 그림 2에서 볼 수 있지만, mtPAGFP의 신호 강도가 정상 상태 (그림 1)에서만큼 변경되지 않습니다. 따라서 PA-GFP 신호의 희석 오히려 분열보다 mitochondrial 융합으로 인해가 될 가능성이 높습니다. 다른 세포 유형에서 우리는 그러한 mitochondrial 퓨전 14 필요한 OPA1 입을 등 mitochondrial 분열을 유도하기 위해 알려진 다른 방법을 사용하는 것이 좋습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3991/3991fig1.jpg" /> 1 그림. </stroNG&gt; mitochondrial 융합 분석 중에 photoactivation 후 PA-GFP 신호의 일반적인 희석. A. PA-GFP는 점차적으로 주차이 투사된 이미지에서 볼 수 있듯이 증가 면적 이상의 단백질의 희석에 이르는 mitochondrial 퓨전 이벤트로 인해됩니다 6 광학 섹션은 15 분 간격으로 계량의. PA-GFP와 B. TMRE는 mitochondria가 depolarized 활성화되어 있지 않다는 것을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3991/3991fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3991/3991fig2.jpg" /> . Mitochondrial 융합은 0.4 밀리미터 palmitate와 저해 그림 2 PA-GFP의 희석을 감소시킵니다. 시간이 지남에 변함없는 신호 강도와 짧은 mitochondria를 보여주는 6 광학 섹션 A. 추정치. TMRE와 PA-GFP의 바실러스 Colocalization 그 mitochondria가 없습니다 보여줍니다 드편광. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3991/3991fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> .

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인수 photoactivati​​on 후 15 분마다 발생하는 경우이 방법은 한 번에 약 10 세포 이미징을 허용합니다. 세포의 정확한 숫자는 하나 mtPAGFP 표현 문화 접시 내에서 세포, 그리고 얼마나 빨리 하나가 모든 소프트웨어 매개 변수를 설정할 수를 찾아 표시할 수있게하는 속도에 따라 다릅니다. 지정된 Z-스택 마진은 모든 세포를 신청하기 때문에 자동화가 원활하게 실행하기 위해서 세포의도 레이어를 사용해야합니다. 이 초기 photoactivati​​on 영역의 크기는 평균 시간을 적용합니다. mitochondrial 융합을 측정할 수있게하기 위해서는 네트워크의 나머지 부분에 대한 신호의 확산은 시간이 지남에 따라 모니터링할 수 있도록 네트워크의 유일한 10~20%를 photoactivate하는 것이 중요합니다. 네트워크의 너무 많이가 photoactivated 경우, 그것은 완전한 융합도 빠르게 발생 가능성이 있으며, 이벤트가 캡처되지 않습니다. 익스 트림주의로 이동합니다두 광자 레이저의 레이저 파워뿐만 아니라 mitochondrial 탈분극로 연결 phototoxicity을 피하기 위해 TMRE 농도를 조정합니다. mtPAGFP 신호가 TMRE 신호로 colocalizes 수 있도록하는 것은 phototoxicity과 일반 세포 건강 8,15를 평가하는 데 유용합니다. epifluoerescent 빛이있는 조명은 피해야한다. mtPAGFP을 표현 세포를 검색하는 동안 저전력 488nm의 여기로 스캔하는 동안, 핀홀이 maximally 열려 있어야합니다. PA-GFP는 1 시간 이상 신호를 측정할 수 있지만 세포 중 8 까다롭습 수 oversaturate하는 데 충분하지 photoactivate하는 두 광자 레이저 파워 조절. 일단 자동으로 프로그램이 시작되기 때문에 그러나 시간이 최적화 단계에서 지출되어야합니다 그것은 세포를 선택하여, 그것을 중지하고 재개하는 지루한이다. 품질 관리의 경우 차등 간섭 대비 (DIC)의 인수 세포에 초점을 모니터 이미지 (또는 전송 빛) 매우 될 수 있습니다도움이 또한 스캔하는 동안 침지 기름에 형성된 거품을 감지하는 좋은 방법, 이것은 때로는 무대의 움직임에서 발생합니다. 이 mtPAGFP 방법을 사용하면 분류되지 않은 사람들에게 photoactivated mitochondria에서 mitochondrial 매트릭스 단백질의 단방향 운동에서 데이터를 수집하지만, 그것은 다른 프로세스를 연구하기 위해이 기술을 활용하는 생각할 수있다. 예를 들어, 특정 fluorochromes는 ABC-날 15 가용성 매트릭스 단백질의 혼합에서 다른 시간 척도에서 발생하는의 융합에 표시되었습니다대로 퓨전 이벤트 기간 동안 자신의 구체적인 움직임을 관찰하는 멤브레인 단백질에 첨부하실 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> COXIII-adenoviral PA-GFP </td><td> 박사 리핀코트요 - 슈워츠 </td><td></td></tr><tr><td> TMRE </td><td> Invitrogen </td><td> T669 </td></tr><tr><td> 자이스 혈구 LSM 710 공촛점 </td><td> 자이스 혈구 </td><td></td></tr></tbody></table>

병렬 공촛점 현미경을 사용하여 여러 세포의 운동 데이터를 취득 빠르고 높은 해상도, mtpa-gfp 기반 mitochondrial 퓨전 분석

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

미토콘드리아 융합은 미토콘드리아 칼슘 항상성, 생체 에너지학, 자가포식 및 품질 관리에서 필수적인 역할을 합니다. 살아있는 세포에서의 융합은 미토콘드리아의 일부에서 매트릭스 표적 광활성화 GFP(mtPAGFP)를 광전환함으로써 정량화합니다. 광전환된 분자들이 전체 미토콘드리아 집단 전체로 평형을 이루는 속도가 융합 활성의 측정값으로 사용됩니다. 지금까지의 측정은 단일 세포 타임랩스 방식을 사용하여 한 세포 내에서 1시간 동안의 평형 상태를 정량화하는 방식으로 수행되었습니다. 본 연구에서는 mtPAGFP와 저농도의 TMRE(15 nm)를 사용하는 기존의 살아있는 세포 분석법을 확장하고 자동화합니다. 이 방법은 미토콘드리아 네트워크의 일부분을 광활성화하고, 1시간 동안 15분 간격으로 고해상도 공초점 단면 스택을 수집하여 신호 강도의 변화를 정량화하는 과정을 포함합니다. PAGFP 발현 세포를 찾는 용이성과 광활성화 영역의 신호 등 여러 요인에 따라, 15분 간격 내에 약 10개의 세포를 수집할 수 있습니다. 이는 고해상도 세포 내 정량화뿐만 아니라 고유한 세포 구조적 환경에서 미토콘드리아 행동의 세부 사항을 포착하는 데 필요한 동역학적 파라미터를 유지하면서, 해당 분석법의 시간 효율성을 크게 향상시킵니다.
미토콘드리아 역동성은 호흡, 칼슘 조절, 세포 사멸을 포함한 많은 세포 과정에서 역할을 합니다1,2,3,13. 미토콘드리아 네트워크의 구조는 미토콘드리아의 기능과 세포 내 다른 구성 요소와의 상호작용 방식에 영향을 미칩니다. 미토콘드리아 네트워크는 지속적인 분열과 융합을 거치며, 고도로 융합된 네트워크부터 더 분절된 형태까지 다양한 모양을 갖게 됩니다. 흥미롭게도, 알츠하이머병, 파킨슨병, 샤르코-마리-투스병 2A형, 우성 시신경 위축증은 미토콘드리아 형태의 변화, 즉 분절된 네트워크와 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌습니다4,10,13. 흔히 분절 시 미토콘드리아는 탈분극되며, 이러한 현상이 누적되면 세포 기능 손상으로 이어집니다18. 미토콘드리아 분열은 세포가 세포 사멸로 진행하도록 신호를 보내는 것으로 나타났습니다. 또한, 이는 탈분극된 비활성 미토콘드리아를 분리하여 네트워크의 대부분을 견고하게 유지하는 기전을 제공할 수 있습니다14. 반면, 미토콘드리아 융합은 매트릭스 단백질, 용질, mtDNA 및 전기화학적 구배의 공유로 이어지며, 세포 사멸로의 진행을 방지하는 것으로 보입니다9. 미토콘드리아의 분열과 융합이 세포 항상성과 궁극적으로 유기체의 기능에 어떤 영향을 미치는지에 대해서는 추가적인 이해가 필요하며, 따라서 이러한 현상에 대한 정보를 수집하는 방법의 지속적인 개발과 최적화가 필수적입니다.
기존의 미토콘드리아 융합 분석법은 각기 다른 장점을 바탕으로 미토콘드리아 생리학에 대한 다양한 통찰을 제시해 왔습니다. 하이브리드 PEG 융합 분석법7은 서로 다른 형광 표지(mtRFP 및 mtYFP)가 된 두 세포 집단을 혼합하여, 융합된 다핵 세포 내에서 형광 물질의 혼합 및 공존 정도를 분석합니다. 이 방법은 가치 있는 정보를 제공했으나, 모든 세포 유형이 융합될 수 있는 것은 아니며, 융합을 유도하는 조건에 사용되는 독성 약물이 정상적인 융합 과정에 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 보다 최근에는 분리된 미토콘드리아를 사용하여 루시퍼레이스 분석법1,5을 통해 융합 현상을 관찰하는 무세포 기술이 고안되었습니다. 두 종류의 인간 세포주를 대상으로, 혼합 시 이량체 형성을 보장하는 류신 지퍼(leucine zipper)와 함께 Renilla 루시퍼레이스의 아미노 말단 또는 카복실 말단 부위를 표적화합니다. 각 세포주에서 미토콘드리아를 분리하여 융합시킵니다. 융합 반응은 에너지, 적절한 온도 및 미토콘드리아 내막 전위가 존재하는 생리적 조건 하에서 세포질 없이도 일어날 수 있습니다. 흥미롭게도, 세포질이 융합 정도를 조절한다는 것이 밝혀졌으며, 이는 세포 신호 전달이 융합 과정을 조절함을 보여줍니다 4,5. 이 분석법은 융합 기전의 구성 요소와 미토콘드리아 동역학에 영향을 줄 수 있는 약리 화합물을 식별하기 위한 고효율 스크리닝에 매우 유용할 것입니다. 다만, 이러한 현상을 세포 환경 내에서 관찰하기 위해서는 이 in vitro 분석법을 보완할 더 상세한 전세포 미토콘드리아 분석법이 필요할 것입니다.
전세포 미토콘드리아 역학을 모니터링하는 기법이 한동안 사용되어 왔으며, 이는 미토콘드리아 표적 광활성 GFP (mtPAGFP)6,11를 기반으로 합니다. mtPAGFP가 발현되면 미토콘드리아 네트워크의 일부(10-20%)가 광활성화되고, 나머지 미토콘드리아 네트워크로 신호가 퍼지는 과정이 타임랩스 공초점 이미징을 통해 1시간 동안 15분 간격으로 기록됩니다. 각 융합 이벤트는 신호 강도의 희석을 유발하므로 융합 속도를 정량화할 수 있습니다. 세포 내에서 융합과 분열이 지속적으로 일어나지만, 분열은 PAGFP 신호의 희석을 유발하지 않으므로 이 기법은 융합만을 모니터링합니다6. 낮은 농도의 TMRE (INS1 세포에서 7-15 nM)로 공동 라벨링하면 미토콘드리아의 막 전위를 정량화할 수 있습니다. 미토콘드리아가 과분극되면 TMRE를 더 많이 흡수하고, 탈분극되면 TMRE 염료를 소실합니다. 탈분극된 미토콘드리아는 더 이상 충분한 막 전위를 가지지 못하며, 융합 효율이 떨어지거나 거의 융합되지 않는 경향이 있습니다. 따라서 이러한 낮은 농도의 TMRE를 통해 활발하게 융합하는 미토콘드리아를 추적할 수 있습니다9,15. TMRE 신호가 없는 탈분극된 미토콘드리아의 축적은 광독성 또는 세포 사멸의 징후일 수 있습니다. 고농도의 TMRE는 미토콘드리아를 레이저 빛에 매우 민감하게 만들므로, TMRE 과라벨링을 방지하기 위해 각별한 주의가 필요합니다. 미토콘드리아의 탈분극 효과가 주요 관심 주제인 경우, 약간 더 높은 농도의 TMRE와 더 강한 레이저 빛을 사용하는 기법을 통해 미토콘드리아를 제어된 방식으로 탈분극시킬 수 있습니다 (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). TMRE로 인한 독성이 문제가 되지 않도록, 로딩된 세포(3-15 nM TMRE)를 분석에 사용할 이미징 파라미터(예: 6개의 광학 섹션으로 구성된 7개의 스택을 연속 촬영)에 노출시킨 후 2시간 뒤에 세포 건강 상태를 평가할 것을 권장합니다. 만약 미토콘드리아가 너무 분절되어 보이고 세포가 사멸한다면, TMRE 대신 dsRED나 Mitotracker red와 같은 다른 미토콘드리아 마커를 사용할 수 있습니다.
mtPAGFP 방법은 다른 방법으로는 시각화할 수 없었던 미토콘드리아 네트워크 거동에 관한 세부 사항들을 밝혀냈습니다. 예를 들어, 미토콘드리아 융합은 완전하거나 일시적일 수 있으며, 이 중 일시적 융합에서는 전체적인 네트워크 형태의 변화 없이 매트릭스 내용물이 혼합될 수 있다는 점이 밝혀졌습니다. 또한, 융합 확률은 접촉 시간 및 소기관의 크기와는 무관하며, 소기관의 운동성, 막 전위 및 이전 융합 활동의 이력에 의해 영향을 받는다는 것을 알 수 있습니다8,15,16,17.
본 원고에서는 mtPAGFP와 15nM TMRE8를 사용한 기존의 프로토콜을 확장하여, 세포 내 해상도를 유지하면서 동시에 여러 세포를 관찰함으로써 데이터 수집의 시간 효율성을 높이는 방법론을 설명합니다. 이는 자동화된 현미경 스테이지와 프로그래밍 가능한 이미지 획득 소프트웨어의 사용을 통해 가능해졌습니다. Zeiss의 Zen 소프트웨어를 사용하면 사용자가 mtPAGFP를 발현하는 지정된 여러 세포를 표시하고 추적할 수 있습니다. 이러한 각 세포의 특정 관심 영역을 광활성화할 수 있으며, 지정된 간격으로 TMRE뿐만 아니라 mtPAGFP 신호에 대한 공초점 슬라이스 스택을 모니터링할 수 있습니다. 프로그래밍 가능한 자동 스테이지, CO2 인큐베이터, 그리고 PAGFP를 광활성화할 수 있는 수단(다광자 레이저 또는 405 nm 다이오드 레이저)이 갖춰져 있다면 다른 공초점 시스템에서도 이 프로토콜을 수행할 수 있습니다.

Mitochondrial 융합은 시간이 지남에 mitochondrial 네트워크 photoconverted 매트릭스 타겟 GFP의 평균 추적에 의해 측정되었다. 지금까지 하나의 세포는 한 번에 한 시간 동안 운동 분석을 받다 수 있습니다. 우리는 동시에이를 통해 데이터 수집 과정을 속도, 여러 개의 세포를 측정하는 방법을 제시한다.

병렬 공촛점 현미경을 사용하여 여러 세포의 운동 데이터를 취득 빠르고 높은 해상도, mtPA-GFP 기반 Mitochondrial 퓨전 분석

미토콘드리아 융합은 미토콘드리아 칼슘 항상성, 생체 에너지학, 자가포식 및 품질 관리에 필수적인 역할을 합니다. 융합은 ...에서 정량화됩니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 여러 세포의 고해상도 3D 이미지에서 미토콘드리아 융합을 병렬적으로 측정하는 것입니다. 이는 먼저 대상 세포에 광활성화 가능한 GFP인 미토콘드리아 photo-activatable GFP를 발현시킴으로써 달성됩니다. 그다음, 각 세포 내 미토콘드리아 집단의 작은 영역에서 GFP를 광활성화합니다.그 다음, 미토콘드리아 융합의 정도를 평가하기 위해 신호 평형에 도달할 때까지 15분마다 각 세포의 광학 절편 6개를 수집하며, 이는 결과적으로 미토콘드리아 표적 광활성화된 GFP 강도의 희석을 의미합니다. 형광 신호의 정량화를 바탕으로 미토콘드리아 융합이 일어나는 세포 내의 GFP 강도를 평가할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 자동화되어 있어 여러 세포의 고해상도 데이터를 더 빠르게 수집할 수 있다는 점입니다. 본 방법은 INS one 세포를 사용하여 시연되며 당뇨병에 대한 통찰력을 제공하지만, 노화뿐만 아니라 대사 및 신경퇴행성 질환에서의 전체적인 미토콘드리아 융합을 연구하기 위해 다른 세포 유형에도 적용될 수 있습니다.이미징 자동화 단계가 다른 곳에 설명되어 있지 않으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. INS one 세포를 80% confluence까지 배양한 후, 0.05% trypsin으로 세포를 떼어내어 poly-D-lysine이 코팅된 커버슬립 바닥 이미징 플레이트에 재현탁된 세포를 분주합니다. 2일간 배양한 후, 미토콘드리아 매트릭스 표적 adenoviral photo-activatable GFP를 플레이트에 첨가합니다.그런 다음 세포를 24시간 동안 배양한 후, 배지를 교체하고 이틀 더 세포를 성장시킵니다. 이미징 당일에 7~15 nM의 TMRE를 이미징 플레이트에 첨가하고 배양물을 최소 45분 동안 평형화합니다. 이 시간 동안 5% 이산화탄소와 인큐베이터를 켜고, 현미경이 평형 상태에 도달한 후 현미경을 켭니다.Acquisition 탭에서 show manual tools를 클릭하십시오. imaging setup 패널을 열고 channel mode와 switch를 선택하십시오. light path 패널에서 모든 프레임을 추적하십시오.LSM 및 채널 모드를 선택하십시오. 그런 다음 시료 아이콘에서 위쪽으로 이동하여 패널 하단의 rear MBS six 90 plus와 MBS 4 88을 선택하고, TPMT를 확인하여 명시야 또는 DIC 채널의 시각화를 활성화하십시오. GFP 염료의 범위를 490 to 540 nanometers로, TMRE 염료의 범위를 580 to 700 nanometers로 설정하여 광경로 파라미터 조정을 완료하십시오.마지막으로, 획득 모드(acquisition mode)를 열고 프레임 크기의 드롭다운 메뉴에서 512 by 512 픽셀 스캔 필드를 설정하고, 평균 횟수 메뉴에서 4x 평균값을 설정하십시오. 이제 대물렌즈를 사용하여 할로겐 광원으로 세포의 초점을 맞춥니다. 핀홀을 최대치로 열고 스캔하여 밝은 녹색의 photo activat GFP 발현 세포를 찾으십시오.임의의 레이저 출력 사진을 선택하여 세포를 활성화한 다음, 활성화가 충분한지 확인하기 위해 Z 시리즈 광학 절편을 촬영합니다. 그다음, 양호한 신호 대 잡음비를 유지하기 위해 검출기 게인을 완전히 최대화하지 않고 488 nanometer 이미징 레이저를 낮은 출력으로 조정합니다. 신호가 포화되지 않았음을 확인한 후, 광활성화 GFP 신호가 TMRE 신호와 공국소화되었는지 확인합니다.마지막으로, 핀홀을 열고 검출기의 게인을 높인 다음, 광활성 GFP를 발현하는 새로운 세포를 찾아 줌 배율을 지정합니다. 그런 다음 Z-시리즈 범위를 설정하여 6개의 슬라이스를 수집하도록 하고 이미징 방법을 저장합니다. 이제 왼쪽 패널에서 다중 시간 창을 엽니다.저장 패널을 선택하고 '이미지 폴더 선택'을 클릭하여 파일이 저장될 위치를 지정하십시오. 그런 다음 획득 패널의 스캔 구성 드롭다운 메뉴에서 방금 저장한 이미징 방법을 선택하십시오. 다음으로, Z 스택의 중간 지점인 'Z middle'을 선택하십시오.이제 블록 패널을 열고 각 위치에서 단일 블록을 선택하십시오. 그런 다음 측정할 각 간격에 대해 블록 추가를 클릭하고, 타이밍 패널을 열어 가중치 간격을 선택한 후, 첫 번째 위치 이전의 가중치 간격 상자에 0을 입력하십시오. 위치 패널을 선택한 후, 위치 목록 아래의 편집 위치에서 위치 간 부하 위치로 초점 이동 및 LO 또는 다음 LO 클릭 시 부하 스캔 구성 설정을 선택하십시오. 모두 지우기를 선택한 다음, 블리치 패널에서 다중 위치 전동 스테이지를 선택하십시오. 블리치 상자를 클릭하고 구성 드롭다운 메뉴에서 구성 파일을 지정하십시오.그런 다음 메인 소프트웨어의 표백 창에서 영역 패널에 적절한 광활성화 방법을 저장하십시오. 해당 세포에 대한 ROI를 선택하고 '현재 영역을 ROI 목록에 추가' 창을 선택하여 이 ROI를 다중 시간 설정에 추가하십시오. ROI 풀다운 메뉴에서 동일한 위치를 선택했는지 확인하십시오.마지막으로, 시간에 따라 추적할 10개의 세포 각각에 대해 다음 순서를 수행합니다. 먼저, 세포를 찾았을 때 위치 패널(location panel)에 스테이지 위치를 표시하고 획득 패널(acquisition panel)에 해당 세포의 특정 스캔 구성 방법을 지정합니다. 모든 블록에 대해 스캔 구성을 반드시 지정하십시오.그 후 메인 영역 패널에서 광활성화할 관심 영역을 선택합니다. 다음으로 블리치 패널에서 ROI를 저장하고 ROI 창에 불러옵니다. 그런 다음 메인 영역 창에서 ROI를 지우고 스캔을 재설정합니다.배율을 1배로 확대하여 다음 세포를 찾아 줌 설정을 합니다. 다음 9개의 세포에 대해 이 과정을 반복한 후, 각 스테이지 위치와 모든 블록에 적절한 스캔 구성이 지정되었는지, 그리고 각 위치의 첫 번째 블록이 적절한 광활성화 방법에 해당하고 나머지는 모의(mock) 방법으로 설정되었는지 확인합니다. 그런 다음 광활성화된 GFP 신호가 적색 TMRE 신호와 대부분 공국소화되는 세포들을 선택하여 실행합니다.photo activat GFP 이미지에서 배경을 제거한 다음, 영역 측정 설정을 통해 평균 강도를 보고하도록 구성합니다. 그런 다음 ZS 스택의 각 슬라이스에 대한 데이터를 Excel 파일로 내보냅니다. 신호가 없는 평면을 제외한 후, 각 시간 지점의 ZS 스택 강도를 초기 photo activated 강도로 나누어 INS 단일 세포 내 원래 신호의 백분율을 구합니다.미토콘드리아 융합의 평형 상태에 도달할 때까지 1시간 동안 15분마다 신호 강도가 현저히 감소합니다. 이는 일반적인 미토콘드리아 융합 분석 과정 중 15분 간격으로 정량화한 6개 광학 단면의 투영 이미지에서 확인할 수 있습니다. 이러한 분석에서는 photo activat GFP의 광활성화를 표적화하고 세포 건강 상태를 모니터링하기 위해 매우 낮은 농도의 TMRE를 사용합니다.녹색의 광활성화 GFP와 적색의 TMRE 신호가 세포 내에서 거의 완전히 공존(colocalization)하며, 두 염색제의 공동 염색 결과 저밀리몰(low millimolar) 농도에서 미토콘드리아가 활성 상태이며 탈분극되지 않았음을 알 수 있습니다. 팔미테이트(Palmitate)는 미토콘드리아를 단편화하고 미토콘드리아 융합을 억제합니다. 따라서 팔미테이트 처리된 세포의 이러한 광학 단면에서 볼 수 있듯이, 미토콘드리아는 단편화되어 있으며 매트릭스 표적 광활성화 GFP의 신호 강도는 이전 그림에서 보여준 정상 조건 때만큼 크게 변화하지 않았습니다.따라서 본 그림에서 관찰되는 광활성화 GFP 신호의 희석은 분열보다는 미토콘드리아 융합으로 인해 발생했을 가능성이 높습니다. 이 방법을 설정할 때, 신호를 유지할 수 있을 만큼 충분한 GFP를 광활성화하면서도 미토콘드리아 융합 사건을 놓치지 않도록 GFP와 TMRE가 공국소화된 세포를 선택해야 하며, 광학 절편 내에서 전체 미토콘드리아 부피를 수집해야 함을 유의하십시오. 특정 조절 단백질이나 신호 분자가 없는 상태에서 미토콘드리아 네트워크에 어떤 변화가 일어나는지 결정하기 위해, 유전자를 억제하거나 다양한 약제를 처리한 여러 실험군에서 이 분석을 수행할 수 있습니다. 미토콘드리아 융합을 정량화하고 파라미터를 통계적으로 분석하는 능력은 질병 상태에서의 미토콘드리아 역동성 연구를 가능하게 하며 치료법 개발을 가능하게 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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출처: Kennedy, L. H., et. al. 아데노 관련 바이러스 및 컨포칼 현미경을 사용한 유기형 뇌 절편에서 희소돌기아교세포 소기관의 시각화 및 라이브 이미징. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 유기형 마우스 뇌 절편에서 희소돌기아교세포 미토콘드리아의 이미징을 보여줍니다. 슬라이스는 지속적인 유체 순환과 온도 조절이 가능한 수조 챔버 내부에 배치됩니다. 컨포칼 현미경의 다양한 매개변수를 설정한 후 적색 형광을 가진 미토콘드리아의 타임 랩스 이미지를 캡처한 다음 녹색 형광을 가진 희소돌기아교세포의 Z 스택 이미지를 캡처합니다.

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