탄소 고정 가능성 화학 층상 남극 호수 및 평가에서 미생물 진핵 농축 문화의 확립

이 실험 절차의 전반적인 목표는 남극 보니 호수(Lake Bonnie)에서 원생생물 농축 배양물을 제작하고, 대사 다양성의 초기 지표로서 탄소 고정량을 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 보니 호수에서 원생생물과 식물성 플랑크톤의 정점이 확인된 수심의 호수물을 채취합니다. 그 다음, 채취한 호수물 시료를 다양한 성장 배지에 접종하고 온도 조절기와 조명이 설치된 성장 챔버에서 4~6주 동안 배양합니다.

배양물은 필요에 따라 4°C에서 운송할 수 있습니다. 다음 단계는 농축 배양물에서 조세포 용해물을 추출하는 것입니다. 이 절차의 마지막 단계는 ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase 또는 RubisCO 활성에 대한 방사성 동위원소 분석법을 사용하여 세포 용해물의 탄소 고정 능력을 평가하는 것입니다.

궁극적으로, 원생생물 농축 배양물은 자연 원생생물 군집의 탄소 고정 잠재력의 다양성을 보여줍니다. 이 방법은 호수 미생물 생태학에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 층상 구조를 가진 남극 호수의 다양한 단계에서 탄소 순환에 미생물 진핵생물이 수행하는 역할 등이 이에 해당합니다.

후속 세대의 농축 배양을 위한 수층 샘플링은 자주 사용되는 기술이지만, 본 방법은 예기치 못한 합병증이 발생할 수 있는 극한의 저온 환경에서 작동하도록 수정되었습니다. 저는 천연 호수 샘플에서 Redisco 어세이를 테스트할 방법을 고민하던 중 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 샘플링 지점이 많은 연구자에게 생소한 환경에 위치해 있어 샘플링 단계를 상상하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

남극 McMurdo 건조 계곡에 위치한 수많은 영구 결빙 호수 중 하나인 Bonnie 호수에서 시료를 채취합니다. 수층 샘플링 하루 전에 샘플링 지점을 선정하고 준비합니다. 이는 드릴링 및 얼음 구멍 융해로 인한 교란 이후 수층의 층상 구조가 다시 형성될 수 있도록 하기 위함입니다. GPS를 이용하여 수층에 접근하기 위한 드릴 지점의 위치를 확인합니다.

4인치 Jiffy 플라이트 연장대와 커팅 비트가 장착된 Jiffy Ice 오거를 사용하여 얼음에 구멍을 뚫는 것으로 시작하며, 이는 구멍 내에서 드릴이 어는 것을 방지하기 위함입니다. 수면 위 약 4~6인치 지점에서 드릴 작업을 중단하여 액체 상태의 물까지 뚫지 않도록 주의하십시오. 샘플 채취를 위해 드릴 구멍의 직경을 6인치에서 2피트로 넓혀야 합니다.

이는 가열된 폴리에틸렌 글리콜을 구리 파이프 구멍을 통해 순환시키는 고온 해수 모델 구멍 멜터를 사용하여 수행됩니다. 멜팅 작업은 일반적으로 수층 시료 채취 전날까지 최대 18시간이 소요됩니다. 필요한 모든 장비와 시료 보관 용기가 채취 현장에 준비되어 있는지 확인하십시오.

시료 채취 재료에는 5~10리터 용량의 NICU 병, 수심 측정 케이블이 장착된 윈치, 각 채취 수심별로 충분한 양의 시료 병, 메신저 및 시료 운반용 냉장고가 포함됩니다. 호수 물 여과 작업이 채취 당일에 완료되어야 하므로, 오전 5시경 이른 아침부터 채취를 시작하십시오. 보정된 핸드 윈치에 부착된 kin 샘플러를 사용하여 채취를 진행합니다.

본 연구를 위해 원하는 깊이에서 1~5L의 수중 샘플을 채취하십시오. 샘플링 깊이는 아이스 홀의 PI 대칭 수위로부터 측정하여 6m, 15m 및 18m로 설정합니다. 채취한 호수 샘플은 쿨러에 보관하여 샘플 채취 지점에서 현장 실험실로 운송하십시오.

ATV에 부착된 썰매를 사용하여 현장 실험실에서 시료를 처리하거나 안정화해야 합니다. 시료 채취 후, 시료가 현장 실험실로 운송되면 즉시 증식 배양을 시작해야 합니다. 0.5에서 1L의 호수물을 47mm 0.45µm 공극 크기의 필터로 농축하십시오.

부드러운 여과 방식을 사용하여 폴리에테르설폰(POLYETHERS sulfone) 필터로 여과합니다. 자연 군집의 다양성을 확인하고자 하는 경우, 두 번째 샘플을 47 mm, 0.45 µm 공극 크기의 필터로 여과하십시오.

폴리에테르설폰(Polyethers sulfone) 필터를 액체 질소에 넣어 급속 냉동합니다. 각 필터를 필터링된 호숫물이 약 20 milliliters 들어 있는 50 milliliter 멸균 팔콘 튜브(falcon tube)로 옮깁니다. 이때 호숫물은 필터를 채취한 것과 동일한 채집 깊이에서 수집한 것이어야 합니다.

서로 다른 배양 배지에서 농축하기 위해 세포 현탁액을 25 centimeter square 멸균 세포 배양 플라스크로 옮깁니다. 각 샘플링 깊이별로 여러 개의 반복구를 설정합니다. 각 배양 플라스크에 bold basil, medium, BG 11 및 F two의 멸균 배지 용액을 각각 50 x씩 첨가합니다.

혼합 영양불균형 생물(mix atrophic organisms)의 배양이 필요한 경우, 보충제가 첨가된 F two 용기 두 개를 준비하고, 그중 한 배양 플라스크에 멸균된 쌀알 2~3알을 넣습니다. 미국 연구소로 운송하기 전, 온도 조절 성장 인큐베이터에서 저온 및 낮은 방사도 조건으로 최소 4주 동안 배양하십시오. 농축 배양물을 멸균된 50 milliliter Falcon 튜브로 옮깁니다. 운송 요청서에 '냉동 금지 및 냉장 보관'이라는 운송 요구 사항을 기재하십시오. 미국 도착 후, 각 농축 배양물 5 milliliters를 125 milliliter 플라스크에 담긴 적절한 성장 배지 45 milliliters에 옮깁니다.

멸균된 스펀지로 뚜껑을 막은 멸균 Erlenmeyer 플라스크를 사용합니다. 4°C의 온도 조절 환경 성장 챔버에서 농축 배양액을 정지 배양 상태로 유지하며, 30일마다 새로운 배지로 계대 배양합니다. 세포 용해물 추출 절차를 시작하려면, 완만한 진공 상태에서 5L의 농축 배양액을 25mm Whatman GF/F 필터에 여과합니다.

다음으로, 멸균된 강철 가위로 필터를 4~5개 구역으로 자릅니다. 그런 다음 멸균된 핀셋을 사용하여 조각들을 0.1 millimeter 직경의 2 milliliter 스크류 캡 튜브에 옮깁니다. 튜브의 5분의 1 정도가 채워지도록 합니다.

지르코니아 실리카 비드. 튜브에 필터 추출 버퍼 1.25 milliliters를 넣고, 미니 비드 비더를 사용하여 속도 설정 48에서 30초 동안 세포를 파쇄한 후 1분간 얼음에 보관합니다. 시료의 가열을 방지하기 위해 비드 파쇄와 1분간의 얼음 배양을 두 번 더 반복한 후 원심분리합니다.

4°C에서 3000 ×g로 2분 동안 여과 슬러리를 원심분리합니다. GFF 필터 섬유와 세포벽 잔해로 구성된 느슨한 펠릿을 형성합니다. 상층액 200 µL를 취하여 얼음처럼 차가운 90% 아세톤 800 µL에 담급니다.

남은 상층액을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 분광광도계를 사용하여 664 nm 및 647 nm 파장에서 추출 가능한 클로로필 A를 측정합니다. 남은 상층액을 4 °C에서 15,000 ×g로 2분 동안 원심분리합니다.

불용성 세포막 펠렛과 남아있는 GFF 필터 섬유가 섞이지 않도록 주의하면서 S를 깨끗한 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이 가용성 세포 용해물은 다음에 시연할 루비스 카복실라아제 활성 분석에 사용할 수 있습니다. 이 분석을 시작하려면, 각 가용성 용해물 125 microliters를 얼음 위에서 냉각시킨 1.5 스크류 캡 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

음성 대조군 샘플의 경우, 1.5 milliliter 스크류 캡 마이크로 원심분리 튜브에 가용성 용해물을 125 microliters 첨가하되, 기질은 첨가하지 않습니다. 이후 모든 샘플과 음성 대조군에 대해 이중 반응을 수행합니다. assay buffer 10 milliliters를 새로 조제하여 얼음 위에 올려 냉각시킵니다.

모든 시료와 음성 대조군에 충분한 양의 분석 완충액을 5 mL 튜브에 분주합니다. 이후의 모든 단계는 흄 후드 내에서 수행해야 합니다. 정해진 양의 완충액에 C 14 표지 소듐 바이카보네이트를 첨가하고 완충액을 얼음에 보관합니다.

C 14이 포함된 어세이 버퍼 10 µL를 취해 어세이 버퍼 1 mL에 희석한 후 뒤집어 섞습니다. 희석된 혼합물 100 µL를 신틸레이션 바이알에 담긴 Bios Safe 2 신틸레이션 카운팅 칵테일 3 mL에 첨가하고 뒤집어 혼합합니다. Beckman LS 6,500 카운터로 C 14 카운트를 측정하며, 어세이를 계속 진행하기 전 신틸레이션 카운트가 18,000 cpm 이상이어야 합니다.

어세이 버퍼에 C 14 표지 중탄산나트륨을 충분히 첨가한 후, 반응 튜브를 25 °C로 미리 설정된 드라이 배스로 옮겨 3~5분 동안 인큐베이션합니다. 다음으로, 용해물에 어세이 버퍼 100 µL를 첨가하고 25 °C에서 5분 동안 인큐베이션합니다. 5분 후, 각 시료에 ribulose bisphosphate를 첨가하고 25 °C에서 5~10분 동안 반응시킵니다.

반응을 중단시키기 위해 100% 프로바이오틱 산 100 µL를 첨가하고, 결합되지 않은 C 14를 제거하기 위해 2000 ×g에서 1시간 동안 원심분리합니다. 마지막으로, 샘플의 전체 부피를 3 mL의 bios. Safe two 신틸레이션 계수 칵테일이 들어 있는 신틸레이션 바이알로 옮겨 산 안정성 cpm(분당 계수)을 측정합니다.

신틸레이션 카운팅을 통한 최종 생성물 측정. 남극 보니 호수(Lake Bonnie)의 세 가지 깊이에서 새로운 저온 적응형 광영양 및 혼합영양 원생동물을 분리하기 위해 농축 배양을 실시하였습니다. 더 다양한 유기체를 선택하기 위해 bolds, basil medium 또는 BBMF two si, 해양 배지 및 BG 11 배지 등 다양한 종류의 성장 배지를 사용하였습니다.

이 표에 제시된 영양분 농도와 광합성 유효 방사선(PAR)은 시료 수집 당시의 조건을 나타냅니다. 광학 현미경을 이용한 배양액의 육안 검사 결과, 대부분의 세포에서 엽록소 색소가 관찰됨에 따라 광영양 원생생물이 우점하고 있음이 확인되었습니다. 또한 배양액은 접종원을 채취한 시료 채취 깊이와 배양에 사용된 배지의 종류에 따라 다양한 세포 형태를 나타냈습니다.

탄소 고정의 대리 지표로서 rubis 효소에 의해 촉매되는 카르복실화 효소 활성의 최대 속도를 농축 배양액에서 측정하였습니다. 또한, 여기에 표시된 바와 같이 광영양 원생생물 바이오매스의 추정치로서 잠재적 chlorophyll a 함량을 모니터링하였습니다.

모든 배양물을 동일한 온도와 광조건에서 배양했음에도 불구하고, 탄소 고정 잠재력과 광영양 생물량은 농축 배양물 간에 매우 크게 달랐다. 최대 rubis O 활성은 BBM 배지에서 성장한 농축 배양물 4 및 6과 BG 11 배지에서 성장한 농축 배양물 13 및 14에서 관찰되었다. 반면, F two 성장 배지에서 농축된 배양물 1921 및 23은 최대 카르복실화 효소 활성이 4배에서 34배 더 낮게 나타났다.

카복실화효소(carboxylase) 활성이 엽록소 a 기준으로 표기되었으므로, 이러한 차이는 F two 배양액의 낮은 바이오매스 수준 때문이 아니었습니다. 또한, 피어슨 상관분석 결과 rubis co 활성은 엽록소 a 농도와 상관관계가 없는 것으로 나타났습니다. 6m와 15m 깊이의 호수 물을 접종한 BBM 배양액.

Enrichment의 forum five에서 가장 높은 chlorophyll A 수치가 나타난 반면, 다른 모든 배양액에서는 rubis 효소 활성도와 관계없이 상대적으로 낮은 chlorophyll a 수치가 나타났습니다. 숙달되면 호수 샘플링 기술을 수행하는 데 약 2시간이 소요됩니다. 채취하는 샘플 수에 따라 다르지만, carboxylase 분석 또한 적절하게 수행될 경우 2시간이 소요됩니다. 이 절차 이후에 heterotrophic 효소 활성 분석과 같은 다른 방법을 사용하여 종속영양생물이 어느 깊이에서 발생하는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 좋습니다. 이 영상을 시청한 후에는 호수 샘플을 수집하고, 이를 농축하며, rubis carboxylase 활성을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.