양적 휘트니스 분석 워크플로우

이 절차의 목적은 정확하고 높은 처리량 방식으로 게놈 전체 규모에서 병렬로 정량적 미생물 배양 적합성을 캡처하는 것입니다. 이것은 96개의 웰 플레이트에서 미생물 콜로니의 첫 번째 튜링 및 어레이 라이브러리와 배양물을 포화 상태로 성장시킴으로써 달성됩니다. 다음으로, 포화 배양물을 물에 희석한 다음 단단한 한천 플레이트에 점토화합니다.

그런 다음 고체 garf 플레이트를 주기적으로 촬영하고 미생물 군집의 성장이 포화 될 때까지 촬영합니다. 마지막으로, 각 배양물의 성장에 대한 시간 경과 사진을 세포 밀도의 정량적 측정으로 변환하고 성장 모델 및 미생물 적합성의 정량적 측정으로 관찰된 성장 곡선을 요약합니다. 궁극적으로, 미생물 균주가 다른 돌연변이와 결합하거나 다른 조건에서 성장할 때 다른 적합성을 갖는다는 것을 입증함으로써 유전적 상호 작용에 대한 증거를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

SGA 또는 바코드 경쟁 실험과 같은 고밀도 고정 방법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 적합성 측정이 더 정확하다는 것입니다. 이 방법은 DNA 손상 및 세포주기 조절에 대한 반응에 어떤 유전자와 과정이 중요한지, 이러한 연구 및 기초 미생물을 이해하고 번역하는 것과 같은 암 약물 개발 분야의 주요 질문에 답하고, 인간 암세포에서 잠재적인 약물 표적 형태로 이러한 연구 및 기본 미생물을 이해하고 번역하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 텔로미어 기능과 시력에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

또한 효모 생물학의 다른 분야 또는 실제로 적합성 표현형이 미생물 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있는 모든 영역에 적용할 수 있습니다. QFA가 array library가 존재하는 다른 많은 미생물 유기체에 적용될 수 있기를 바랍니다. 예를 들어, povi e coli, orilla surplus는 포화 된 하룻밤 배양에서 시작하여 200 마이크로 리터 용량의 풍부한 액체 배지에서 최대 96 개의 독립적 인 효모 균주를 재생했습니다.

96 잘 배양 된 접시에서 96 핀, 1/8 인치 직경의 수동 복제 플래터를 먼저 100 % 에탄올에 담근 다음 불을 붙이고 냉각 어레이에 남겨 두어 살균하고, 96 웰 플레이트 와류의 우물에있는 200 마이크로 리터의 멸균수는 효모 배양을 포화시키고 멸균 된 핀 도구를 균주에 세 번 담궈 희석합니다. 그런 다음 물이 들어있는 플레이트에 한 번 넣고 핀 도구를 살균하고 식힌 후 희석된 배양물에 세 번 담그십시오. 그런 다음 핀틀을 단단한 한천 플레이트로 옮깁니다.

한천 플레이트를 배양한 후 s 및 p robotics SP 이미저를 사용하여 자동 배양을 위해 수동으로 이미징합니다. 고체 한천에서 자란 독립적인 효모 균주의 직사각형 배열로 시작합니다. 이 예제에서 시작 균주는 온도에 민감한 쿼리 변형과 효모 삭제 컬렉션을 교차한 결과입니다.

384 개의 독립적 인 효모 균주의 4 개의 반복을 나타내는 1, 536 배양액은 96 핀, 1 밀리미터 핀 직경의 멸균 핀 공구를 가진 로봇을 사용하여 SGA 플레이트에서 성장합니다 1, 536 균주 중 384를 4 96으로 옮깁니다. 200 마이크로 리터의 선택적 배지를 포함하는 우물 배양 플레이트는 섭씨 20도에서 배양물을 포화 상태로 성장시킵니다. 포화된 효모 배양물을 찾아내려면 먼저 이를 액체 처리 로봇으로 옮기고 Resus를 마그네틱 셰이커에 매달아 멸균 96핀 로봇 핀 도구를 사용하여 200마이크로리터의 멸균수에 고정하여 배양액을 약 1에서 70까지 희석합니다.

핀 도구를 세척하고 살균한 후 희석된 배양물을 한천 플레이트에 묻힙니다. 384에서 웰 형식은 플레이트를 자동 캐러셀과 접근 해치가 있는 온도 제어 가습 인큐베이터로 옮깁니다. 배양을 이미지화하기 위해 인큐베이터에서 플레이트를 반복적으로 제거하고, 뚜껑을 제거하고, 35mm 카메라 아래의 균일한 조명 공간으로 전송하고, 5, 184 x 3, 456에서 이미지를 캡처하는 로봇 자동화 이미저를 사용합니다.

픽셀 해상도는 뚜껑을 대체한 다음 인큐베이터 캐러셀로 되돌려 플레이트와 적용된 처리제의 배양 위치를 추적합니다. 플레이트는 인큐베이터 이름, 온도, 고유한 순차 배치 번호 및 인큐베이터 내 위치에 따라 자동으로 바코드가 부착됩니다. 이미지 이름은 플레이트 이름과 타임스탬프를 연결한 것으로, 이미지 캡처 시 자동으로 생성됩니다.

플레이트는 종종 로봇 캐러셀 간에 이동할 때 동일한 순서로 유지되도록 수동으로 레이블을 지정합니다. 메타데이터 파일은 탭으로 구분된 텍스트 파일로, 수동으로 생성됩니다. 실험 설명 파일 FT 2.

표 1은 각 실험마다 고유하지만 라이브러리 설명 FT 3, 표 1은 광범위하게 재사용할 수 있습니다. 일단 구성되면, 실험은 실험 설명 파일 FT 2 표 1에 바코드 또는 자동으로 생성된 플레이트 이름 실험을 위한 열을 포함하는 표 1, 타임스탬프 플레이트 처리 시작 솔리드 한천 매체 스크린 이름, 여러 플레이트가 있는 라이브러리에 대한 라이브러리 플레이트 번호, 1, 536, 웰 형식에서 384로 축소하기 위한 반복 사분면 번호. 웰 포맷 e 균주 라이브러리는 라이브러리 설명 파일 FT 3으로 설명되며, 표 1은 각 배양 위치에서 성장한 유전자형을 나타냅니다.

라이브러리의 각 플레이트에는 열 4, 라이브러리 이름, ORF, 플레이트 번호판, 행 플레이트 열 및 선택적 메모 열이 포함됩니다. 선택적인 표준 유전자 이름 파일은 FT 4를 제공할 수 있으며, 표 1은 각 체계적인 ORFY 번호와 관련된 표준 유전자 이름을 설명하여 스크리닝 중인 균주를 식별합니다. 이 파일에는 데이터 분석을 위한 ORF와 유전자 이름의 두 개의 열이 포함되어 있습니다.

QFA 계산 워크플로우를 사용하려면 상당히 강력한 멀티 코어 컴퓨터 워크스테이션이 설치되어 있어야 합니다. 온라인에 문서화된 Colonizer 이미지 분석 소프트웨어 도구와 QFAR 패키지는 무료로 사용할 수 있으며 다양한 운영 체제에서 실행됩니다. 캡처된 각 플레이트 이미지를 입력으로 사용하여 콜로나이저를 실행하여 하나의 콜로니저 출력 파일 FT 5를 생성하고, 캡처된 각 이미지에 대해 표 1을 생성하고, 콜로나이저 출력 파일을 캡처하고, 문화 밀도 추정치, 문화, 면적, 모양 및 색상을 지정합니다.

이미지 플레이트의 384개 위치 각각에 대해 출력 파일 이름이 소스 이미지 파일 이름에서 자동으로 복사됩니다. QFAR 패키지에는 일반화된 로지스틱 모집단 모델을 관찰 및 플롯에 맞추기 위해 각 문화에 대한 시간 경과를 계산하는 함수가 포함되어 있습니다. 둘 다 예를 들어 그림 2와 3을 참조하십시오.

피팅된 매개변수 값은 QFA 로지스틱 매개변수 파일에 기록됩니다. QFAR 패키지에는 품질 관리를 위한 기능도 포함되어 있습니다. 가장자리 군집은 플레이트 가장자리에서 영양분의 가용성이 더 높고 이미지 분석이 어렵기 때문에 버려집니다.

SGA에 실패한 판벽 및 배양 부근 및 스크리닝 특정 마커 유전자와의 연관성을 나타내는 유전자형은 분석에서 제거됩니다. 몇 가지 정량적 적합성 측정은 각 문화에 대한 로지스틱 모집단 모델 매개변수에서 파생됩니다. 여기에는 최대 개체군 배가율과 각 복제 배양 세트 및 각 적합성 정의에 대한 접종에서 포화까지의 구분 수가 포함됩니다.

적합성 추정치에 대한 여러 요약 통계는 평균 및 중간 적합성, 적합성 표준 편차 및 관찰된 반복 횟수로 계산됩니다. 요약 통계는 추가 분석을 위해 QFA 피트니스 요약 파일 FT 8, 표 1로 출력됩니다. 예를 들어, 유전적 상호작용 점수의 계산은 FT 9 표 1을 매깁니다.

이 그림은 로그 척도 OUTTA 384 QFA의 일반적인 성장 곡선 하나를 보여줍니다. 섭씨 20도에서 고형 한천에서 자라는 배양물은 콜로니저(colonizer)에 의해 정량화되었으며 세포 밀도가 증가하여 약 2일 후에 처음 검출될 수 있습니다. 이러한 지연은 고체 배지에 접종한 후 배양 지연 단계와 세포 밀도에 대한 검출 하한의 결합된 효과일 수 있습니다.

여기서, 308개의 유사한 성장 곡선이 단일 플레이트에서 캡처되었습니다. 평평한 선을 만든 균주는 매우 아프거나 죽었다는 점에 유의하십시오. 이 그림은 유전적 상호작용 강도를 추론하기 위해 두 개의 게놈 와이드 QFA 스크리닝을 비교한 것을 보여줍니다.

QFAR 패키지에는 이전 성장 곡선 그림을 생성하고 검사된 유전자형의 순위 목록과 유전적 상호 작용 강도 추정치를 출력하는 기능도 포함되어 있습니다. 관찰된 GIS의 중요성에 대한 Q 값과 함께 완전한 게놈 전체 4 복제 QF를 마스터했습니다. 실험은 3주 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 플레이트와 이미지의 추적 및 이름 지정을 체계적으로 기억하는 것이 중요합니다.

모든 플레이트는 접종을 해야 하며 올바른 방향과 순서로 배치해야 합니다. 데이터 분석은 실험 과학자가 구축한 보조 텍스트 파일의 정확성에 의존합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 수천 개의 독립적인 미생물 배양의 적합성을 추정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

적합성은 점박이 배양물을 반복적으로 촬영하고, 단단한 한천 플레이트에서 성장하고, 캡처된 이미지를 세포 밀도 추정치로 변환하고, 성장 곡선을 생성하여 추정됩니다. 성장 곡선의 수학적 모델링은 정량적 적합성 추정치를 제공하며, 이는 게놈 전체 규모에서 유전자 산물 간의 기능적 관계를 추론하는 데 사용할 수 있습니다.