Name: 양적 휘트니스 분석 워크플로우 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 배우세요 양적 휘트니스 분석(QFA)을 활용한 미생물 적응도 측정 및 유전적 상호작용 연구 방법입니다. 이 계산 워크플로우는 고처리량 스크리닝을 통해 정확한 적응도 추정과 암 약물 개발에 활용됩니다.

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우리는 기꺼이 우리의 연구실과 기술 지원 및 도움 토론 고령화와 영양 (CISBAN)의 통합 시스템 생물학을위한 센터의 모든 구성원을 인정합니다. 이 연구는 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회 (BBSRC) (BB/C008200/1)와 Wellcome 트러스트 (075,294, 093,088)에 의해 지원되었다.

<ol><li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362(2011).</li>
<li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li>
<li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonyzer%3A+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li>
<li>Colonyzer - Image analysis software [Internet]. , Newcastle University. Newcastle, UK. Available from:
 <a target="_blank" href="http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/">http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/</a> (2012).</li>
<li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>qfa - An R Package for Quantiative Fitness Analysis [Internet]. , University of Vienna. Vienna, Austria. Available from:
 <a target="_blank" href="http://qfa.r-forge.r-project.org/">http://qfa.r-forge.r-project.org/</a> (2012).</li>
<li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li>
<li>Maringele, L., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EXO1-dependent+single-stranded+DNA+at+telomeres+activates+subsets+of+DNA+damage+and+spindle+checkpoint+pathways+in+budding+yeast+yku70%CE%94mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Dev%22%5BJournal%5D)">EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70Δmutants.</a> Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).</li>
<li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li>
<li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li>
<li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864(2011).</li>
<li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li>
<li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+ecology%3A+The+social+side+of+wild+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

QFA은 여러 감각에 직접 셋 설립 벤치 규모의 미생물 기술의 후손 : 문화 희석 시리즈 스포트 테스트 9 aerated 액체 문화 9, 복제 도금 13 성장 곡선 결정. 이러한 세 가지 방법을 요약하고 QFA 및 표 2에있는 다른 높은 처리량 기법과 비교됩니다. 희석 시리즈 스폿 테스트 inoculum의 dilutions의 범위에서 성장 문화 일련의 식​​민지를 형성하는 기능으로 변형의 적합성을 정의하는 반면, 단일 문화의 반복 관측에 의한 QFA 측정 스트레인 헬스는 성장 곡선을 만들 수 있습니다. 단일 문화권에서 체력을 Quantifying 것은 더 많은 변종이 동일한 조건 하에서, 동시에 검사 할 수 있습니다. 다른 환경이나 유전적 배경에있는 문화 운동의 차이에 대해 테스트할 때 문화의 복제 배열은 대부분의 유용 스트레인 컬렉션의 반복 테스트를하실 수 있습니다. QFA 프로토콜 제공여기에, 독립적인 문화 (로봇 QFA, 표 2) 수천의 성장을 관찰 적합한 부화 및 이미지 한천 플레이트를 복제 예방하기 위해 고가의 로봇 장비를 사용합니다. QFA가 설립, 전통적인 실험실 기법을 기초로했기 때문에하지만, 그것은 또한 수동 단계 (수동 QFA, 표 2)와 로봇의 도움을 대체하여보다 싸게 많이 수행 할 수 있습니다. 수동 QFA는 수동 핀 도구 및 및 사진을위한 인큐베이터에서 접시의 수동 전송을 사용하여 한천 플레이트를 향해 문화 복제 및 접종을 포함한다. 동일한 전산 분석 워크플로우는 두 실험적인 디자인의 성장 곡선을 생성하는 데 적용할 수 있습니다. QFA 휘트니스 견적은 비교적 정확하게 될 것 같습니다. 그림 4에서 기능적으로 관련 유전자 삭제 네 가지 예제 클러스터의 평균 fitnesses가 강조 표시됩니다. 이 independ의 각 기능과 관련된 유전자 클래스의 멤버 근접엔트 유전적 배경 (ura3Δ 및 cdc13-1) QFA 휘트니스 견적의 재현성을 나타냅니다. 예를 들어, 불과 3 유전자 삭제는 (아웃 가능 4,300의) 보존 MRX 복합의 세 멤버를 구분합니다. 미생물 종자의 성장 특성을 테스트하기 위해 QFA까지 고속 처리 대안 SGA 5,6, 분광 플레이트 판독기에 광학 밀도 속도론을 캡처 경쟁 barcoded 라이브러리에서 화면 11,12와 스크린을 포함 표 2에 요약하며 더욱 완벽하게 다른 여덟 설명되어 있습니다 10 . QFA와 문화가 고체 한천 표면 (한천 기반 방법, 표 2)에서 자라는 SGA 판은 로봇에 의해 신속하고 간편하게 처리할 수 있습니다. 고체 한천 표면 문화가 잘 성장 전역 aerated하고 전지는 사교적인 미생물들이 지역 사회 14 성장할 수 있도록 고정 문화권으로 성장할 수있다. 왼쪽 그대로, 미생물 커뮤니티자신의 마이크로 환경 등 에탄올과 같은 secreting 독소, 그리고 아마도 세포 사이에 신호를 ffect. 그러나 적절한 통기를 달성하는 데 필요한 액체 문화의 혼합 지속적인 성장을 인위적으로 자신의 모드에 영향을 미칠 수있는 미생물 지역 사회와 그들의 마이크로 환경을 방해. 문화 사이의 세포를 나르는 액체 많아요을위한 더 적은 기회가 있기 때문에 교차 오염은 고체 한천 방법에 우려의 적습니다. 오염 고체 한천 assays 외국 공기 매개로 미생물에 의해 발생하는 경우, 그것은 흔히 고체 한천 플레이트의 육안 검사에 의해 감지 집결하거나 제거할 수 있습니다. QFA 처리량은 두 가지 방법으로 병렬 액체 방법에 비해 훨씬 높다. 우선, QFA (그리고 SGA) 접시에 주사 문화는 접시 당 독립적인 문화를 제공,보다 밀도가 함께 포장됩니다. QFA 년 308 문화권이 아닌 실험적인 첨단 문화 (그림 1) co.kr 사이트를 세지 않고, 일반적으로있다판 당 96 또는 100의 문화와 액체 문화를 병렬하는 앞에 서. 둘째, QFA 실험은 접시의 훨씬 더 큰 숫자에 따라 결정됩니다. 단일 QFA 실험에서 분석 번호판의 숫자에만 보육이나 따뜻한 방, 최소 허용 이미지 캡처 주파수와 최대 달성 캡처 주파수에서 사용 가능한 공간에 의해 제한되는 반면, 액체 성장 실험 접시의 수를 강력히 제한 플레이트 리더 (일반적으로 하나 또는 두 개의 접시) 또는 플레이트 리더 (일반적으로 25-50 접시)에 연결된 스태커의 용량에 의해. 우리는 최근에 37,884 동시 문화를주는 308 실험적인 문화를 가진 123 접시, 각에서 완전 자동화된 QFA 실험을 실시했습니다. 우리는 액체로 성장하고 독립적인 문화의 최대 달성 번호 96 (문화 / 플레이트)는 것을 예상하고 우리 QFA 처리량보다 열 배 가량 X 50 (플레이트 / 스태커) = 4,800. 액체 배양 화면에 대한 대안은 많은 자동 촉진제을 활용하는 것입니다병렬 wth 장치 (Blomberg 8 시까지 검토에서 표 1), 하나 또는 두 개의 접시의 용량을 가진 각. 각 장치의 온도 제어가 독립적이고, 그래서 조건이 똑같은 건 아니지만, 그들이한다고 가정하고,이 흐름은 적어도 190과 같은 장치가 QFA 처리량 (장치 당 200 액체 문화를 가정)과 일치하도록 요구한다. 요약에서는 QFA는 유용 소규모 focussed 실험 및 높은 처리량 화면에 모두 양적 성장 phenotypes를 수집하기 위해 적용할 수있는 고품질의 흐름이다. 그것은 로봇 장비에 대한 요구 사항 변화에 효과적으로 적용될 수있을만큼 유연합니다. QFA 작업 흐름의 전산 구성 요소를 자유롭게 사용할 오픈 소스 코드를 기반으로합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 복제 광택히 </td><td> 시그마 </td><td> R-2508 </td><td> 1 / 8 &quot;직경 핀으로 96 핀 설명서 pintool </td></tr><tr><td> 메이트를 혼용 </td><td> Eppendorf </td><td> 5353 000.014 </td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX </td><td> Beckman </td><td> A31842 </td><td></td></tr><tr><td> Teleshake </td><td> 써모 과학 </td><td> 50095890 </td><td> Biomek FX에 설치된 </td></tr><tr><td> BM3-SC </td><td> S &amp; P 로보틱스 INC </td><td> BM3-SC </td><td> 192 선반 회전 회전 목마 </td></tr><tr><td> spImager </td><td> S &amp; P 로보틱스 INC </td><td> spImager </td><td> 고해상도 수동 이미징 </td></tr><tr><td> Cytom있는 spImager에 </td><td> S &amp; P 로보틱스 INC </td><td> 사용자 정의 </td><td> 온도는 자동 고해상도 이미징을 제어 </td></tr><tr><td> 열 교환기와 Cytomat 6001 </td><td> 써모 과학 </td><td> 51022222 </td><td> spImager에 부착된 </td></tr><tr><td> Ecoline RE207 </td><td> Lauda </td><td> RE207 </td><td> Cytomat에 부착된 </td></tr><tr><td> 회전 목마가있는 spImager </td><td> S &amp; P 로보틱스 INC </td><td> 사용자 정의 </td><td> 자동 고해상도 이미징 </td></tr><tr><td> FP12pins위한 로봇 핀 공구 고정구 </td><td> V &amp; P 과학 </td><td> AFIX96FP12 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 X FP12 핀 </td><td> V &amp; P 과학 </td><td> FP12 </td><td> 50.4 mm 길이 17mm는 핀 길이를 노출 </td></tr><tr><td> 핀 도구에 대한 역 도킹 </td><td> V &amp; P 과학 </td><td> VP425 </td><td> 도킹 스테이션베이스 핀이 팬 건조를 허용하도록 제거 </td></tr><tr><td>브러시 청소 핀 </td><td> V &amp; P 과학 </td><td> VP425 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 복제 광택히 </td><td> 시그마 </td><td> R-2508 </td><td> 수동 핀 도구 </td></tr><tr><td> 뚜껑이있는 Nunc OmniTray </td><td> Nunc </td><td> 734-0490 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 잘 멸균 폴리스티렌 플레이트 </td><td> Greiner BioOne </td><td> 655,161 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 잘 멸균 폴리스티렌 뚜껑 </td><td> Greiner BioOne </td><td> 656,171 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> 표 3. 특정 시약 및 장비.

양적 휘트니스 분석 워크플로우

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

양적 피트니스 분석 (QFA)는 병렬 1,2,3,4 재배 미생물 문화 fitnesses을 비교하기위한 실험 및 전산 작업 흐름이다. QFA은 단일 문화 focussed 관찰에 적용하지만, 독립적인 문화 수천까지 조사 게놈 전체 유전자 상호 작용이나 약물 화면에 가장 유용합니다. 중앙 실험 방법은 incubated 정기적으로 촬영되는 고체 한천 플레이트를 향해 독립 묽은 액체 미생물 문화의 접종이다. 매번 포인트에서 사진이 양적 피트니스 조치 얻을 수 있도록, 성장 곡선을 만드는 데 사용되는 정량 셀 밀도 견적, 제작, 분석하고 있습니다. 문화 fitnesses는 계량 및 유전적 상호 작용 강점이나 약물 감성 순위를 비교할 수 있습니다. 모든 치료의 문화 적합성에 대한 효과는 기판 한천 (예 : 작은 분자, 항생제 또는 영양분)에 추가하거나 접시 외부에 적용단조 (예 : 자외선 조사, 온도)이 QFA에 의해 계량하실 수 있습니다. QFA 흐름은 성장률이 96도 또는 200도 플레이트 리더에 평행 액체 문화의 분광 측정으로 얻은 것과 유사한 추정 생산하고 있습니다. 중요한 것은, QFA 같은 방법에 비해 훨씬 높은 처리량을 가지고 있습니다. QFA 배양 고체 한천 표면에 성장하므로 잘 교반이나 흔들림없이도 성장하는 동안 aerated됩니다. QFA 처리량 일부 합성 유전자 배열 (SGA) 전형 방법 5,6의만큼 높지 않을 것입니다. QFA 문화가 많이 한천로 주사되기 전에 희석되기 때문에 그러나, QFA 3 지수와 채도 단계를 포함하여보다 완벽한 성장 곡선을 캡처할 수 있습니다. 예를 들어, 성장 곡선 관찰 이전에 한 논의로 문화 더블링 시간이, 높은 정밀도와 직접 견적을 계산할 수 있습니다. 여기 소개특정 QFA 프로토콜 S. 수천에 적용 자동 접종, 배양 및 이미징 동안 로봇에 의해 처리됩니다 cerevisiae 문화. 이러한 자동화된 단계에는 처리량의 관련 감소와 함께 이에 상응하는, 수동 프로 시저로 대체하고, 우리는 또한 낮은 처리량 매뉴얼 프로토콜을 제시 할 수 있습니다. 동일한 QFA 소프트웨어 도구 중 워크플로우에서 촬영한 이미지에 적용할 수 있습니다. 우리는 광범위한 경험 신진 효모의 문화 QFA를 적용했습니다 S. 하지만 우리는 QFA는 분열 효모의 문화를 조사에 동일하게 유용 것으로 cerevisiae를 기대 S. pombe와 세균성 문화.

양적 피트니스 분석 (QFA)는 미생물 문화 fitnesses을 계산하는 실험 및 전산 방법을 보완 시리즈입니다. QFA는 유전자 변이, 약물이나 미생물의 성장에있는 다른 적용 트리 트먼트의 효과를 추정하고있다. 단일 문화권의 focussed 분석에서 병렬 문화 수천 실험 스케일링을 설계할 수 있습니다.

정량적 적응도 분석(Quantitative Fitness Analysis, QFA)은 병렬로 배양된 미생물 배양물 간의 적응도를 비교하기 위한 실험 및 계산 워크플로입니다1,2,3,4. ...

본 절차의 목적은 게놈 전체 규모의 정량적 미생물 배양 적합성을 정밀하고 고효율적인 방식으로 병렬 캡처하는 것입니다. 이는 먼저 96웰 플레이트에 미생물 군집의 어레이 라이브러리를 구축하고 배양이 포화 상태에 도달할 때까지 배양함으로써 이루어집니다. 다음으로, 포화된 배양액을 물로 희석한 후 고체 아가 플레이트에 스팟팅합니다.그다음 고체 agar 플레이트를 미생물 군집의 성장이 포화될 때까지 주기적으로 촬영합니다. 마지막으로, 각 배양액 성장의 시계열 사진을 세포 밀도의 정량적 측정값으로 변환하고, 성장 모델 및 미생물 적응도(fitness)의 정량적 측정값과 함께 관찰된 성장 곡선을 요약합니다. 궁극적으로, 미생물 균주가 서로 다른 돌연변이와 결합하거나 서로 다른 조건에서 배양될 때 서로 다른 적응도를 가짐을 입증함으로써 유전적 상호작용의 증거를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.SGA 또는 바코드 경쟁 실험과 같은 고밀도 핀닝 방식의 기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 적응도 측정이 더 정확하다는 점입니다. 이 방법은 DNA 손상 및 세포 주기 조절 반응에 어떤 유전자와 과정이 중요한지, 그리고 이러한 기초 미생물 연구를 어떻게 이해하고 인간 암 세포의 잠재적 약물 표적 형태로 전환할 것인지와 같은 암 치료제 개발 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 또한, 이 방법은 텔로미어 기능과 시각적 분석에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.또한 이는 효모 생물학의 다른 분야나 미생물 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있는 적응도 표현형(fitness phenotypes)이 활용되는 모든 분야에 적용될 수 있습니다. 우리는 어레이 라이브러리가 존재하는 다른 많은 미생물 유기체에도 QFA가 적용될 수 있기를 바랍니다. 예를 들어, povi e coli, orilla surplus 등이 있습니다. 포화된 overnight 배양물로부터 시작하여 200 µL 부피의 풍부한 액체 배지에서 96개의 독립적인 효모 균주를 배양하였습니다.96웰 배양 접시에서, 먼저 100% 에탄올에 담근 후 화염 멸균하여 식힌 직경 1/8인치의 96핀 수동 레플리카 플레이터를 멸균합니다. 96웰 플레이트의 웰에 200 µL의 멸균수를 넣고, 멸균된 핀 툴을 포화된 효모 배양액에 세 번 담가 희석합니다. 그다음 멸균수를 포함한 플레이트에 한 번 담급니다. 다시 핀 툴을 멸균하고 충분히 식힌 후, 희석된 배양액에 세 번 담급니다. 마지막으로 핀틀을 고체 한천 배지에 전이합니다.한천 배지를 배양한 후, 자동 배양을 위해 s and p robotics SP imager를 사용하여 수동으로 이미지를 획득합니다. 고체 한천 배지에서 배양된 독립적인 효모 균주들의 직사각형 배열부터 시작합니다. 본 예제에서 시작 균주들은 온도 민감성 쿼리 돌연변이와 효모 결손 컬렉션을 교배시킨 결과물입니다.384개의 독립적인 효모 균주에 대해 4회 반복 측정하여 총 1,536개의 배양물을 SGA 플레이트에서 배양합니다. 96핀, 핀 직경 1mm의 멸균 핀 툴을 장착한 로봇을 사용하여 1,536개 균주 중 384개를 200 µL의 선택 배지가 담긴 4개의 96-well 배양 플레이트로 옮깁니다. 배양물을 20 °C에서 포화 상태가 될 때까지 배양합니다. 포화된 효모 배양물을 스팟하기 위해, 먼저 액체 핸들링 로봇으로 옮겨 마그네틱 쉐이커에서 재현탁합니다. 멸균 96핀 로봇 핀 툴을 사용하여 200 µL의 멸균수에 핀닝함으로써 배양물을 약 1:70으로 희석합니다.핀 툴을 세척 및 멸균한 후, 희석된 배양액을 아가 플레이트에 접종합니다. 384-웰 형식의 플레이트를 자동 캐러셀과 액세스 해치가 장착된 온도 및 습도 조절 인큐베이터로 옮깁니다. 배양액을 이미지화하려면 로봇 자동 이미지 분석기를 사용하며, 이 장치는 인큐베이터에서 플레이트를 반복적으로 꺼내 덮개를 제거한 후, 35mm 카메라 아래의 균일한 조명 공간으로 이동시켜 5,184 x 3,456 해상도로 이미지를 캡처합니다.Pixel resolution은 덮개를 교체한 후, 플레이트상의 배양 위치와 적용된 처리 조건을 추적하기 위해 이를 인큐베이터 캐러셀로 되돌립니다. 플레이트에는 인큐베이터 이름, 온도, 고유 순차 배치 번호 및 인큐베이터 내 위치에 따라 자동으로 바코드가 부여됩니다. 이미지 이름은 플레이트 이름과 타임스탬프의 조합으로 구성되며, 이미지 캡처 시 자동으로 생성됩니다.로봇 캐러셀 간의 이동 시 순서가 유지되도록 플레이트에 수동으로 라벨을 부착하는 경우가 많습니다. 메타데이터 파일은 수동으로 생성된 탭 구분 텍스트 파일입니다. 실험 설명 파일 FT two.표 1은 각 실험마다 고유하지만, 라이브러리 설명 FT 3, 표 1은 광범위하게 재사용될 수 있습니다. 실험이 구성되면, 바코드 또는 자동으로 생성된 플레이트 이름, 실험 시작 타임스탬프, 플레이트 처리, 고체 한천 배지 성분, 스크린 이름, 여러 플레이트로 구성된 라이브러리의 경우 라이브러리 플레이트 번호, 그리고 1,536-웰 포맷에서 384-웰 포맷으로 규모를 축소하기 위한 반복 사분면 번호 열이 포함된 실험 설명 파일 FT 2, 표 1에 실험 내용이 기술됩니다. e strain 라이브러리는 각 배양 위치에서 배양된 유전자형이 명시된 라이브러리 설명 파일 FT 3, 표 1로 기술됩니다.라이브러리의 각 플레이트에는 라이브러리 이름, ORF, 플레이트 번호, 플레이트 행 및 열, 그리고 선택 사항인 노트 열의 총 4개 열이 포함됩니다. 스크리닝 대상 균주를 식별하기 위해 각 체계적 ORF 번호와 연관된 표준 유전자 이름을 설명하는 선택 사항인 표준 유전자 이름 파일(FT 4, 표 1)을 제공할 수 있습니다. 이 파일은 데이터 분석을 위한 ORF와 유전자 이름의 두 가지 열로 구성됩니다.QFA 계산 워크플로우를 수행하려면 적절한 성능의 멀티코어 컴퓨터 워크스테이션이 필요합니다. 온라인으로 문서화되어 있으며 다양한 운영 체제에서 실행 가능한 Colonizer 이미지 분석 소프트웨어 도구와 QFAR 패키지는 모두 무료로 제공됩니다. 캡처한 각 플레이트 이미지를 입력값으로 하여 Colonizer를 실행하면, 캡처된 이미지당 하나의 Colonizer 출력 파일(.ft5, 표 1)이 생성됩니다. Colonizer 출력 파일에는 배양 밀도 추정치, 배양 영역, 모양 및 색상이 명시됩니다.이미지 플레이트의 384개 각 위치에 대해, 출력 파일 이름이 소스 이미지 파일 이름으로부터 자동으로 복사됩니다. QFAR 패키지에는 각 배양물에 대한 시간 경과 데이터를 선택하여 관찰 값에 일반화 로지스틱 인구 모델을 적합시키고 이를 도식화하는 기능이 포함되어 있습니다. 예시는 그림 2와 3을 참조하십시오.적합된 매개변수 값은 QFA 로지스틱 매개변수 파일에 기록됩니다. QFAR 패키지에는 품질 관리를 위한 함수들도 포함되어 있습니다. 플레이트 가장자리에서는 영양분 공급이 더 원활하고 이미지 분석에 어려움이 있으므로, 가장자리에 형성된 콜로니는 폐기합니다.플레이트 벽면 근처 및 SGA를 통과하지 못한 배양물, 그리고 스크리닝 특정 마커 유전자와 연관성을 보이는 유전자형은 분석에서 제외됩니다. 각 배양물에 대해 로지스틱 개체군 모델 파라미터로부터 여러 정량적 적응도 측정값이 도출됩니다. 여기에는 각 반복 배양 세트 및 각 적응도 정의에 대한 최대 개체군 배가 속도와 접종부터 포화 상태까지의 분열 횟수가 포함됩니다.평균 및 중앙값 적합도, 적합도 표준 편차 및 관찰된 반복 횟수 등 적합도 추정치의 여러 요약 통계량을 산출합니다. 요약 통계량은 추가 분석을 위해 QFA 적합도 요약 파일 FT eight, table one으로 출력됩니다. 예를 들어, 유전적 상호작용 점수 FT nine table one의 계산과 같은 작업이 이에 해당합니다.이 그림은 384 QFA에서의 로그 스케일 기준 전형적인 성장 곡선 하나를 보여줍니다. 고체 한천 배지에서 20 °C로 배양된 배양물을 colonizer로 정량화한 결과, 세포 밀도의 증가가 약 2일 후에 처음으로 감지되었습니다. 이러한 지연은 고체 배지로 접종한 후의 배양 지체기(lag phase)와 세포 밀도 측정의 검출 하한값이 복합적으로 작용한 결과로 보입니다.여기서는 단일 플레이트에서 308개의 유사한 성장 곡선을 캡처하였습니다. 평평한 선을 나타내는 균주는 상태가 매우 좋지 않았거나 사멸했음을 유의하십시오. 이 그림은 유전적 상호작용 강도를 추론하기 위해 두 가지 전유전체 QFA 스크리닝을 비교한 결과를 보여줍니다.QFAR 패키지에는 앞서 살펴본 성장 곡선 수치를 생성하고, 분석된 유전자형의 순위 목록과 유전적 상호작용 강도 추정치를 출력하는 기능이 포함되어 있습니다. 관찰된 GIS의 유의성에 대한 Q 값과 함께, 전체 게놈 범위의 4회 반복 QF.A 실험을 완전히 숙달하면 3주 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 플레이트와 이미지의 추적 및 명명 관리를 체계적으로 하는 것이 중요합니다.모든 플레이트는 올바른 방향과 순서로 접종 및 스폿(spot)되어야 합니다. 데이터 분석은 실험 과학자가 작성한 보조 텍스트 파일의 정확성에 의존합니다. 이 영상을 시청한 후에는 수천 개의 독립적인 미생물 배양액의 적응도를 추정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.고체 한천 배지에서 배양 중인 반점 배양물을 반복적으로 촬영하고, 캡처된 이미지를 세포 밀도 추정치로 변환하여 성장 곡선을 생성함으로써 적응도를 추정합니다. 성장 곡선의 수학적 모델링을 통해 정량적인 적응도 추정치를 얻을 수 있으며, 이를 통해 게놈 전체 규모에서 유전자 산물 간의 기능적 관계를 도출할 수 있습니다.

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 높은 처리량 시퀀싱을 이용하여 단백질의 종합적인 단일 사이트 포화 돌연변이 라이브러리의 기능 평가를위한 프로토콜을 제시한다. 중요한 것은,이 방법은 라이브러리 구축 및 시퀀싱을 다중화하는 직교 프라이머 쌍을 사용한다. 암피실린의 임상 적 투여 량에서 선택 TEM-1 β-lactamase를를 사용하는 대표적인 결과가 제공된다.

높은 처리량 시퀀싱을 활용하여 전체 - 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관의 기능 평가를위한 프로토콜

액체의 선충 유영의 컴퓨터 기반 분석을위한 효과적이고 간단한 방법을 설명한다. 이 방법은 C. elegans의 실험실에 대한 더 투자에 조금 필요합니다. 사용되는 하드웨어는 표준 및 행동 분석 (CeleST)을위한 컴퓨터 소프트웨어는 오픈 소스이다.

의 자동 분석<em&gt; C. 엘레</emCeleST 소프트웨어를 사용&gt; 수영 동작

세균 적합성을 결정하기 위한 이 분자 기반 접근법은 디지털 PCR을 통해 정량화되는 독특한 게놈 DNA 바코드를 사용하여 미생물을 정확하고 정확하게 검출할 수 있도록 합니다. 프로토콜은 살모넬라 균주에 대한 경쟁 지수를 계산하는 것을 설명합니다. 그러나 이 기술은 유전적으로 가단성 유기체의 절대 정량화를 요구하는 프로토콜에 쉽게 적응할 수 있습니다.

살모넬라에서 피트니스의 높은 처리량 분석을 위한 디지털 PCR 기반 경쟁 지수

이 더에이 버 프레임 워크는 실험적 파라미터에 대 한 높은 분해능과 동적 제어를 통해 고 처리량의 지속적인 미생물 배양을 가능 하 게 합니다. 이 프로토콜은 복잡 한 피트 니스 실험을 수행 하기 위해 시스템을 적용 하는 방법을 보여 주며, 사용자가 여러 개별 문화권에 대 한 자동화 된 제어를 프로그래밍 하 고, 측정 하 고, 수집 하 고, 실시간으로 실험 데이터와 상호 작용 하는 방법을 안내 합니다.

에 버 버를 사용 하 여 자동화 된 고 처리량, 지속적인 세포 성장 실험 설계

이 프로토콜은 일일 이동 및 주기적인 동결을 수행하여 대장균 LTEE(Long-Term Evolution Experiment)를 유지하는 방법과 진화된 박테리아의 적합성 향상을 측정하기 위해 경쟁 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 이러한 절차는 연구자가 자신의 미생물 진화 실험을 시작하기 위한 템플릿 역할을 할 수 있습니다.

Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli (대장균을 사용한 장기 진화 실험에서의 일일 이동, 인구 보관 및 적합성 측정)

여기에서는 전사체 데이터를 mqTrans 보기로 변환하여 다크 바이오마커를 식별할 수 있는 프로토콜을 소개합니다. 기존의 전사체 분석에서는 차등적으로 발현되지 않지만, 이러한 바이오마커는 mqTrans 보기에서 차등 발현을 나타냅니다. 이 접근법은 전통적인 방법을 보완하는 기술 역할을 하며, 이전에 간과되었던 바이오마커를 밝혀냅니다.

작은 데이터 세트에서 예측 작업 및 다크 바이오마커 검출을 위한 전사체 특징의 전사체 조절 보기 생성

다양한 전처리 단계, 다중 오믹스 요인 분석 모델 추정 및 여러 다운스트림 분석을 결합한 복잡한 다중 오믹스 데이터 세트의 비감독 분석을 위한 유연하고 확장 가능한 Jupyter-lab 기반 워크플로를 제공합니다.

심혈관 질환과 관련된 변동 패턴 및 분자 과정을 밝히기 위한 비지도 다중 오믹 요인 분석의 적용

웨어러블 기술은 비용이 저렴하고 생리학적 데이터를 편리하게 모니터링할 수 있습니다. 그러나 이러한 장치의 정확성과 신뢰성은 사용자에 대한 효율성과 안전성을 보장하기 위해 신중한 평가가 필요합니다. 이 보고서는 생리학적 데이터 및 신체 활동을 모니터링하는 상업용 스마트워치의 검증 프로세스를 설명합니다.

심혈관 및 신체 활동 모니터링을 위한 피트니스 스마트워치 데이터의 정확성 평가: 디지털 건강의 검증 연구

Xenopus 배아 상피 조직은 상피 morphogenesis 동안 극성 개발 및 형태의 변화와 같은 세포 행위를 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 고정 샘플 전통 조직학 점점 라이브 셀 이미징 공촛점에 의해 보완되고있다. 여기 개구리 조직을 분리 및 라이브 세포 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 상피 세포 및 cytoskeleton을 시각화하는 방법을 보여줍니다.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

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