양적 휘트니스 분석 워크플로우

본 절차의 목적은 게놈 전체 규모의 정량적 미생물 배양 적합성을 정밀하고 고효율적인 방식으로 병렬 캡처하는 것입니다. 이는 먼저 96웰 플레이트에 미생물 군집의 어레이 라이브러리를 구축하고 배양이 포화 상태에 도달할 때까지 배양함으로써 이루어집니다. 다음으로, 포화된 배양액을 물로 희석한 후 고체 아가 플레이트에 스팟팅합니다.

그다음 고체 agar 플레이트를 미생물 군집의 성장이 포화될 때까지 주기적으로 촬영합니다. 마지막으로, 각 배양액 성장의 시계열 사진을 세포 밀도의 정량적 측정값으로 변환하고, 성장 모델 및 미생물 적응도(fitness)의 정량적 측정값과 함께 관찰된 성장 곡선을 요약합니다. 궁극적으로, 미생물 균주가 서로 다른 돌연변이와 결합하거나 서로 다른 조건에서 배양될 때 서로 다른 적응도를 가짐을 입증함으로써 유전적 상호작용의 증거를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

SGA 또는 바코드 경쟁 실험과 같은 고밀도 핀닝 방식의 기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 적응도 측정이 더 정확하다는 점입니다. 이 방법은 DNA 손상 및 세포 주기 조절 반응에 어떤 유전자와 과정이 중요한지, 그리고 이러한 기초 미생물 연구를 어떻게 이해하고 인간 암 세포의 잠재적 약물 표적 형태로 전환할 것인지와 같은 암 치료제 개발 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 또한, 이 방법은 텔로미어 기능과 시각적 분석에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

또한 이는 효모 생물학의 다른 분야나 미생물 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있는 적응도 표현형(fitness phenotypes)이 활용되는 모든 분야에 적용될 수 있습니다. 우리는 어레이 라이브러리가 존재하는 다른 많은 미생물 유기체에도 QFA가 적용될 수 있기를 바랍니다. 예를 들어, povi e coli, orilla surplus 등이 있습니다. 포화된 overnight 배양물로부터 시작하여 200 µL 부피의 풍부한 액체 배지에서 96개의 독립적인 효모 균주를 배양하였습니다.

96웰 배양 접시에서, 먼저 100% 에탄올에 담근 후 화염 멸균하여 식힌 직경 1/8인치의 96핀 수동 레플리카 플레이터를 멸균합니다. 96웰 플레이트의 웰에 200 µL의 멸균수를 넣고, 멸균된 핀 툴을 포화된 효모 배양액에 세 번 담가 희석합니다. 그다음 멸균수를 포함한 플레이트에 한 번 담급니다. 다시 핀 툴을 멸균하고 충분히 식힌 후, 희석된 배양액에 세 번 담급니다. 마지막으로 핀틀을 고체 한천 배지에 전이합니다.

한천 배지를 배양한 후, 자동 배양을 위해 s and p robotics SP imager를 사용하여 수동으로 이미지를 획득합니다. 고체 한천 배지에서 배양된 독립적인 효모 균주들의 직사각형 배열부터 시작합니다. 본 예제에서 시작 균주들은 온도 민감성 쿼리 돌연변이와 효모 결손 컬렉션을 교배시킨 결과물입니다.

384개의 독립적인 효모 균주에 대해 4회 반복 측정하여 총 1,536개의 배양물을 SGA 플레이트에서 배양합니다. 96핀, 핀 직경 1mm의 멸균 핀 툴을 장착한 로봇을 사용하여 1,536개 균주 중 384개를 200 µL의 선택 배지가 담긴 4개의 96-well 배양 플레이트로 옮깁니다. 배양물을 20 °C에서 포화 상태가 될 때까지 배양합니다. 포화된 효모 배양물을 스팟하기 위해, 먼저 액체 핸들링 로봇으로 옮겨 마그네틱 쉐이커에서 재현탁합니다. 멸균 96핀 로봇 핀 툴을 사용하여 200 µL의 멸균수에 핀닝함으로써 배양물을 약 1:70으로 희석합니다.

핀 툴을 세척 및 멸균한 후, 희석된 배양액을 아가 플레이트에 접종합니다. 384-웰 형식의 플레이트를 자동 캐러셀과 액세스 해치가 장착된 온도 및 습도 조절 인큐베이터로 옮깁니다. 배양액을 이미지화하려면 로봇 자동 이미지 분석기를 사용하며, 이 장치는 인큐베이터에서 플레이트를 반복적으로 꺼내 덮개를 제거한 후, 35mm 카메라 아래의 균일한 조명 공간으로 이동시켜 5,184 x 3,456 해상도로 이미지를 캡처합니다.

Pixel resolution은 덮개를 교체한 후, 플레이트상의 배양 위치와 적용된 처리 조건을 추적하기 위해 이를 인큐베이터 캐러셀로 되돌립니다. 플레이트에는 인큐베이터 이름, 온도, 고유 순차 배치 번호 및 인큐베이터 내 위치에 따라 자동으로 바코드가 부여됩니다. 이미지 이름은 플레이트 이름과 타임스탬프의 조합으로 구성되며, 이미지 캡처 시 자동으로 생성됩니다.

로봇 캐러셀 간의 이동 시 순서가 유지되도록 플레이트에 수동으로 라벨을 부착하는 경우가 많습니다. 메타데이터 파일은 수동으로 생성된 탭 구분 텍스트 파일입니다. 실험 설명 파일 FT two.

표 1은 각 실험마다 고유하지만, 라이브러리 설명 FT 3, 표 1은 광범위하게 재사용될 수 있습니다. 실험이 구성되면, 바코드 또는 자동으로 생성된 플레이트 이름, 실험 시작 타임스탬프, 플레이트 처리, 고체 한천 배지 성분, 스크린 이름, 여러 플레이트로 구성된 라이브러리의 경우 라이브러리 플레이트 번호, 그리고 1,536-웰 포맷에서 384-웰 포맷으로 규모를 축소하기 위한 반복 사분면 번호 열이 포함된 실험 설명 파일 FT 2, 표 1에 실험 내용이 기술됩니다. e strain 라이브러리는 각 배양 위치에서 배양된 유전자형이 명시된 라이브러리 설명 파일 FT 3, 표 1로 기술됩니다.

라이브러리의 각 플레이트에는 라이브러리 이름, ORF, 플레이트 번호, 플레이트 행 및 열, 그리고 선택 사항인 노트 열의 총 4개 열이 포함됩니다. 스크리닝 대상 균주를 식별하기 위해 각 체계적 ORF 번호와 연관된 표준 유전자 이름을 설명하는 선택 사항인 표준 유전자 이름 파일(FT 4, 표 1)을 제공할 수 있습니다. 이 파일은 데이터 분석을 위한 ORF와 유전자 이름의 두 가지 열로 구성됩니다.

QFA 계산 워크플로우를 수행하려면 적절한 성능의 멀티코어 컴퓨터 워크스테이션이 필요합니다. 온라인으로 문서화되어 있으며 다양한 운영 체제에서 실행 가능한 Colonizer 이미지 분석 소프트웨어 도구와 QFAR 패키지는 모두 무료로 제공됩니다. 캡처한 각 플레이트 이미지를 입력값으로 하여 Colonizer를 실행하면, 캡처된 이미지당 하나의 Colonizer 출력 파일(.ft5, 표 1)이 생성됩니다. Colonizer 출력 파일에는 배양 밀도 추정치, 배양 영역, 모양 및 색상이 명시됩니다.

이미지 플레이트의 384개 각 위치에 대해, 출력 파일 이름이 소스 이미지 파일 이름으로부터 자동으로 복사됩니다. QFAR 패키지에는 각 배양물에 대한 시간 경과 데이터를 선택하여 관찰 값에 일반화 로지스틱 인구 모델을 적합시키고 이를 도식화하는 기능이 포함되어 있습니다. 예시는 그림 2와 3을 참조하십시오.

적합된 매개변수 값은 QFA 로지스틱 매개변수 파일에 기록됩니다. QFAR 패키지에는 품질 관리를 위한 함수들도 포함되어 있습니다. 플레이트 가장자리에서는 영양분 공급이 더 원활하고 이미지 분석에 어려움이 있으므로, 가장자리에 형성된 콜로니는 폐기합니다.

플레이트 벽면 근처 및 SGA를 통과하지 못한 배양물, 그리고 스크리닝 특정 마커 유전자와 연관성을 보이는 유전자형은 분석에서 제외됩니다. 각 배양물에 대해 로지스틱 개체군 모델 파라미터로부터 여러 정량적 적응도 측정값이 도출됩니다. 여기에는 각 반복 배양 세트 및 각 적응도 정의에 대한 최대 개체군 배가 속도와 접종부터 포화 상태까지의 분열 횟수가 포함됩니다.

평균 및 중앙값 적합도, 적합도 표준 편차 및 관찰된 반복 횟수 등 적합도 추정치의 여러 요약 통계량을 산출합니다. 요약 통계량은 추가 분석을 위해 QFA 적합도 요약 파일 FT eight, table one으로 출력됩니다. 예를 들어, 유전적 상호작용 점수 FT nine table one의 계산과 같은 작업이 이에 해당합니다.

이 그림은 384 QFA에서의 로그 스케일 기준 전형적인 성장 곡선 하나를 보여줍니다. 고체 한천 배지에서 20 °C로 배양된 배양물을 colonizer로 정량화한 결과, 세포 밀도의 증가가 약 2일 후에 처음으로 감지되었습니다. 이러한 지연은 고체 배지로 접종한 후의 배양 지체기(lag phase)와 세포 밀도 측정의 검출 하한값이 복합적으로 작용한 결과로 보입니다.

여기서는 단일 플레이트에서 308개의 유사한 성장 곡선을 캡처하였습니다. 평평한 선을 나타내는 균주는 상태가 매우 좋지 않았거나 사멸했음을 유의하십시오. 이 그림은 유전적 상호작용 강도를 추론하기 위해 두 가지 전유전체 QFA 스크리닝을 비교한 결과를 보여줍니다.

QFAR 패키지에는 앞서 살펴본 성장 곡선 수치를 생성하고, 분석된 유전자형의 순위 목록과 유전적 상호작용 강도 추정치를 출력하는 기능이 포함되어 있습니다. 관찰된 GIS의 유의성에 대한 Q 값과 함께, 전체 게놈 범위의 4회 반복 QF.A 실험을 완전히 숙달하면 3주 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 플레이트와 이미지의 추적 및 명명 관리를 체계적으로 하는 것이 중요합니다.

모든 플레이트는 올바른 방향과 순서로 접종 및 스폿(spot)되어야 합니다. 데이터 분석은 실험 과학자가 작성한 보조 텍스트 파일의 정확성에 의존합니다. 이 영상을 시청한 후에는 수천 개의 독립적인 미생물 배양액의 적응도를 추정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

고체 한천 배지에서 배양 중인 반점 배양물을 반복적으로 촬영하고, 캡처된 이미지를 세포 밀도 추정치로 변환하여 성장 곡선을 생성함으로써 적응도를 추정합니다. 성장 곡선의 수학적 모델링을 통해 정량적인 적응도 추정치를 얻을 수 있으며, 이를 통해 게놈 전체 규모에서 유전자 산물 간의 기능적 관계를 도출할 수 있습니다.