Name: 중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 배우세요 중추 신경계 세포에 유전자 전달을 위한 렌티바이러스 벡터 생산 및 정제 방법. 293T 세포 공동전환, 초원심분리 농축, 유세포 분석 및 실시간 정량 PCR을 활용한 역가 측정, 그리고 신경세포와 성상세포에서의 효율적인 유전자 전달 기술을 익힐 수 있습니다.

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이 작품은 워싱턴 대학, 프로그램 프로젝트 그랜트 NS032636 (BJS)에 NIH 신경 과학 청사진 코어 교부금 (P30 NS057105, BJS)와 신경계 장애에 대한 희망 센터에 의해 지원되었다.

1. Lentiviral 벡터의 포장 Lentiviral 벡터는 lentiviral 전송 벡터 및 칼슘 인산염 transfection 방법에 의한 293T 세포에 포장에 필요한 다른 plasmids의 cotransfection에 의해 생산됩니다. 우리는이 프로토콜의 10 100-mm 조직 배양 접시를 사용합니다. 그것은 최대 크기를 조정 또는 아래로 응용에 따라 수 있습니다. 293T 세포 라인 10% 태아 소 혈청 (FBS), 100 단위 / ML 페니실린, 37 ° C ~ 100 μg / ML 스트렙토 마이신과 보완, 높은 혈당 (4500 MG / L)로 Dulbecco의 수정된 이글스 매체 (DMEM)에서 관리되고 있습니다 5% CO 2 배양기. <ol><li> 배지에서 10 100-mm 조직 배양 요리 (3 X 10 6 세포 / 접시)에 30-40%의 합류점에서 종자 293T 세포. 배양기에 세포를 반환합니다. </li><li> 20-24 H 문화 후 세포 밀도를 확인하십시오. 세포는 transfection시 약 80 %의 합류해야합니다. </li><li> 50 ML 튜브를 준비합니다. 4.4 ML TE79/10 (1 MM TrisHCl, 0.1 MM 추가EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 다음 플라스미드 DNA의 마이너스 총 볼륨 산도 7.9). 100 μg lentiviral 전송 플라스미드 (그림 1), 58 μg pMDLg / pRRE, 31 μg pCMV-G, 25 μg pRSV - 레브 600 μl 2M CaCl 2. 추가 부드럽게 믹스. </li><li> 또 다른 50-ML 튜브를 준비합니다. 5 ML 2X HBS를 (0.05 M의 HEPES, 0.28 M NaCl, 1.5 MM이 나 HPO 4, 산도 7.12) 추가합니다. </li><li> 10-ML 피펫으로 DNA-CaCl 2 혼합물을 가지고 튜브를 vortexing하면서 dropwise이 X HBS를 포함하는 튜브에 추가합니다. </li><li> 30 분 동안 실온 (RT)에서 석출 반응을 유지. </li><li> 배양기에서 배양 접시를 제거합니다. vortexing하여 잘 석출 반응을 섞는다. 각 100 mm 접시 함유 세포로 정지 1 ML을 추가합니다. 서스펜션은 부드럽게 접시에있는 매체를 소용돌이 치는 동안 천천히, dropwise 추가해야합니다. 보육 이러한 요리를 반환 5 H로 떠나. </li><li> 문화 매체를 제거합니다. 6 MM 나트륨 BU를 포함하는 6 ML 신선한 배지 추가각 요리에 tyrate. 인큐베이터에 문화를 반환합니다. 구조의 형광 기자이있다면 하룻밤 문화 후, 형광 현미경으로 리포터 유전자 발현을 확인합니다. 그것이 유비 쿼터스 발기인 (예 : CMV 프로 모터)에 의해 구동하는 경우 일반적으로, 세포의 80 % 이상은 리포터 유전자를 표현. </li><li> 이틀 (40-44 H) transfection 후, 2 개의 50-ML 튜브 (약 30 ML 각 튜브)에 10 요리에서 뜨는 수집합니다. -80 ° C의 냉장고에 뜨는 고정하거나 다음 단계로 이동합니다. </li></ol> 2. 벡터의 농도 및 정화 <ol><li> 원심 갓 표면에 뜨는에서 모든 세포 파편을 제거하는 10 분 동안 900g (2000 RPM 정도)에서 수집된이나 뜨는 해동. </li><li> 0.2-μm의 SFCA 주사기 필터로 60 ML 주사기를 부착합니다. 주사기로 50 ML 튜브에서 뜨는을 전송합니다. polyallomer의 원심 관에 뜨는을 필터링합니다. </li><li> 5 ML 피펫의 최대 5 ML 20 % 자당을 (PBS에서 준비) 가져가라. 삽입뜨는을 포함하는 원심 분리기 튜브의 바닥에 피펫. 천천히 벡터 뜨는 아래 자당 솔루션을 추가합니다. 다른 튜브의 표면에 뜨는 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> ° C 4 H에 대한 Beckman SW28 스윙 로터와 11,000 RPM과 4에서 뜨는을 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 제거합니다. 각각의 원심 분리기 튜브 150 μl 4 % 유당을 (PBS에서 준비) 추가합니다. 알약을 Resuspend. </li><li> 모든 원심 분리기 튜브에서 1.5 ML 관에 집중 벡터를 전송합니다. 15 분 동안 얼음 튜브를 남겨주세요. </li><li> pipetting하여 벡터 정지를 섞습니다. 1 분 동안 최대 속도 (16,000 천달러 정도)에 microcentrifuge 같이 해요. </li><li> 새로운 1.5-ML 관에 뜨는 전송합니다. 20 μl aliquots에 최종 샘플을 나누어 -80 ° C의 냉동고에 그들을 저장. </li></ol> 3. 벡터의 적정 <ol><li> 종자 5 × 10 4 / 잘 10% FBS로 보완 한 ML DMEM 배지에서 12 잘 플레이트의 HT1080 세포의. </li><li> overnig 후HT 문화는 잘 하나에서 세포를 세고 휴대폰 번호를 득점. </li><li> 문화 매체로 집중 벡터의 5 배 희석 직렬 (및 1:625; 1:125 25 1시 5분, 1) 확인합니다. 별도의 우물 각 희석 벡터의 전 μl 추가합니다. 샘플 정확도를 높이기 위해 중복될 수 있습니다. </li><li> 각도 포함하는 벡터와 벡터없이 잘 개를 1 μl 4 밀리그램 / ML Polybrene (Hexadimethrine 브로마이드)를 추가합니다. 부드럽게 판을 흔들어하여 섞는다. 48 H을위한 인큐베이터로 돌아가기. </li><li> 세포 배양 우물에서 매체를 제거합니다. PBS로 각 잘 씻으십시오. 세포를 250 μl 1X trypsine-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가합니다. 전지은 (3-5 분) 분리되면, 1 ML 문화 매체를 추가하십시오. pipetting하여 세포를 Resuspend. 1.5 ML의 원심 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 6 분 동안 900g에서 원심 분리기. 형광 리포터 유전자 (예 : GFP)와 벡터의 경우 FACS 분석을 위해 3.7 단계로 이동합니다. 기자없이 벡터의 경우 실시간 qPCR을 위해 3.8 단계로 이동합니다. </li><li> fluo를 포함하는 벡터에 대한rescent 리포터 유전자가 뜨는을 제거하고 PBS에 3.7 %의 포름 알데히드 300 μl로 펠렛을 resuspend. FACS 분석하여 기자 양성 세포의 비율을 결정합니다. titer는 밀리리터 집중 벡터 (TU / ML) 당 형질 도입 단위로 표시됩니다. </li></ol><img alt="등식 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq1.jpg" /> 예를 들어, 1 X 10 5 세포 25분의 1 μl (0.04 μl) 벡터와 30 %의 세포로 transduced되었다이 기자 긍정적이며, titer가 될 것입니다 : <img alt="등식이" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq2.jpg" /> 오직 dilutions 양성 세포의 비율과 titer를 계산하기 위해 추가 벡터의 양을 간의 선형 관계에 빠지지 사용합니다. 최종 titer는 벡터의 적어도 2 개의 다른 양의 transductions에서 얻은 titers의 평균이어야합니다. <ol start="8"><li> 없이 벡터에 대한형광 리포터 유전자는 제조 업체의 프로토콜에 따라 QIAamp DNA와 미니 키트 (Qiagen)를 사용 HT1080 세포의 게놈 DNA를 추출합니다. primers (HIV-1 PBS / PSI 지역 17) 5&#39;-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 &#39;와 5&#39;-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3&#39;로 ABI 프리즘 7000 시퀀스 탐지 시스템 (응용 Biosystems)를 사용하여 게놈 DNA의 벡터 시퀀스를 확대하고, TaqMan 탐침 5 &#39;-식구들-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3&#39;이다. 게놈의 단일 사본 유전자 (2 부 / 셀)입니다 알부민 유전자는 또한 primers 5&#39;-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 &#39;와 5&#39;-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3&#39;로 증폭하고, 프로브 5&#39;-우리 식구들-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-TAMRA-3습니다 &#39;내부 통제 등. 다음의 프로그램 제작의 지시에 따라 96 - 웰 플레이트에 복사 벡터의 번호와 PCR에 의한 알부민을 결정 : 15 초, 50 ° C에서 2 분, 95 ° 10 분, 95의 35주기위한 C ° C와 60 ° C 2 분입니다. 알려진 농도 plasmids의 10 배로 시리얼 dilutions (부로 표현번호) 템플릿 시퀀스도 알려지지 않은 샘플 부량위한 표준 곡선을 작성 증폭되어야 포함하는. titer는 밀리리터 집중 벡터 (IU / ML) 당 통합 단위로 표시됩니다. </li></ol><img alt="등식 3" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq3.jpg" /> 4. Neocortical 문화의 형질 도입 뉴런과 glia를 모두 포함하는 Neocortical 문화는 이전 18 설명된대로 두 단계 도금 절차를 사용하여 마우스 cortices에서 준비가되어 있습니다. 14~16일의 태동부터 태아 생쥐에서 얻은 Neocortices는 10% FBS, 24 음 조직 배양 플레이트 20 밀리미터 포도당과 2 밀리미터 글루타민과 함께 보충 MEM에서 이전에 설립 glial 단일층에 도금하고 있습니다. <ol><li> 시험 관내에 5 일 후에 neoc 10 μm의 사이 토신 arabinoside (ARA-C)을 추가ortical 문화 이외의 연결을 세포 분열을 억제합니다. 문화에게 2 일간 세포를 계속합니다. </li><li> 5-10 분 37의 따뜻한 문화 매체 ° C의 물 목욕. 신선한 배지 (물론 500 μl /)로 매체를 포함하는 아라-C를 교체합니다. </li><li> 문화, 원하는 방어 (대상 세포의 개수에 벡터 입자의 개수의 비율 감염 다수)를 벡터에 추가합니다. 24 H에 대한 문화를 계속합니다. 우리는 일차 피질 문화에 (대개 5) 1-10의 방어를 사용합니다. </li><li> 신선한 매체와 문화 매체를 교체합니다. 문화를 계속합니다. 벡터 구조에서 리포터 유전자가있다면 2 일 형질 도입 후 형광 현미경으로 세포를 확인합니다. 리포터 유전자 발현은 벡터 디자인과 사용 복용량에 따라 형질 도입 후 뉴런 2-7에 표시됩니다. </li></ol> 5. 대표 결과 이 프로토콜 범위 생산된 lentiviral 벡터의 titers 10 8 -10 10 IU / ML, whicH는 시험 관내 및 생체내의 두 CNS의 세포 유형의 다양한 형질 도입에 적합합니다. 표 1과 그림 2는이 프로토콜이 제작한 벡터를 사용하는 대표적인 결과를 보여줍니다. 우리는 transduced 표현 lentiviral 벡터와 murine neocortical 문화를 녹색 형광 단백질 (GFP) synapsin (SYN) 발기인 또는 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 프로 모터에 의해 제어. 이레 형질 도입 후, 우리는 각각 안티 NeuN 및 안티 GFAP 항체와 라벨 뉴런과 astrocytes에 immunostaining 수행했습니다. 으로 표 1과 그림. 2A는 뉴런의 90 % (NeuN + 세포)를 통해, synapsin 발기인을 나르는 벡터로 형질 도입 후 특급 GFP없이 astrocytes는 (GFAP + 세포)이 리포터 유전자를 표현. GFAP 발기인은 astrocytes의 약 80 % (GFAP + 세포) expres, 벡터 구조 (그림 2B)에서 사용되는 경우의 GFP, 모든 GFP + 세포 GFAP와 colocalization와 NeuN-라벨 세포의 GFP 표현의 부재에 의해 확인된대로 astrocytes 있습니다. 이러한 결과는 lentiviral 벡터 CNS와 세포에 특정한 유전자 발현에서 세포로 transgenes를 전달하는 매우 효율적인 적절한 발기인이 사용될 때 달성될 수 있도록 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig1.jpg" /> 1 그림. HIV 기반 lentiviral 벡터와 포장 plasmids의 도식 표현은. HIV-1 provirus는 상단에 표시됩니다. 벡터 생산을위한 요소는 네 가지 plasmids으로 구분됩니다. 플라스미드 lentiviral 양도 U3 영역이 사이토 메갈로 바이러스 프로 (CMV) 발기인, 포장 신호 (ψ), RRE 순서, 중앙 polypurine 기관을 (cPPT), 관심있는 유전자 (예로 대체되는 하이브리드 5 &#39;LTR이 포함되어 있습니다 형광등 선택의 발기인과 함께 기자)와 3 &#39;LTR하는CIS 규제 시퀀스는 완전히 U3 영역에서 제거됩니다. pMDLg / pRRE은 CMV 프로 모터의 조절하에 HIV-1의 개그와 폴포트 유전자 및 RRE 시퀀스가​​ 포함되어 있습니다. pRSV - 레브 RSV 프로 모터에 의해 구동 레브의 코딩 순서가 포함되어 있습니다. pCMV-G는 CMV 프로 모터의 조절하에 VSV-G 단백질 유전자가 포함되어 있습니다. PA는 인간 β-globin 유전자의 polyadenylation 신호를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig2.jpg" /> 그림 2. 마우스 neocortical 혼합 문화의 리포터 유전자의 표현이 세포 유형의 특정 발기인을 나르는 lentiviral 벡터와 transduced. 문화는 LV-SYN-GFP (A) 또는 (b) 방어 5시 LV-GFAP-GFP 벡터와 transduced되었다. 이레 형질 도입 후, 세포가 백신 NeuN 또는 방지 GFAP 항체와 immunostained되었다. 어퍼 패널 GFP 형광을 보여, 중앙 패널은 immunostaining을 표시하고 낮은 패널은 (GFP : 녹색, NeuN 또는 GFAP : 적색) 이미​​지를 병합됩니다. </P&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> 벡터 </td><td> 뉴런의 GFP + 세포 </td><td> astrocytes에 GFP +는 </td></tr><tr><td> LV-SYN-GFP </td><td> 92.2 ± 7.3 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> LV-GFAP-GFP </td><td> 0 </td><td> 78.3 ± 11.5 </td></tr></tbody></table> 표 1. murine neocortical 문화의 GFP 표현의 비교는 다른 발기인을 나르는 lentiviral 벡터와 transduced. Murine neocortical 문화는 (5 × 10 5 / 잘 24 - 웰 플레이트) 입니다만 5 시에 LV-SYN-GFP 또는 LV-GFAP-GFP와 transduced되었다. 형질 도입 후 이레가, 문화가 수정 및 NeuN 또는 GFAP에 대한 immunostained되었다. GFP와 NeuN / GFAP 표현하는 세포의 숫자는 실험 조건 지당 10 분야의 이미지에 포함되었다. 값은 또는 뉴런의 비율 (NeuN + 세포)를 나타내는또한 GFP의 리포터 유전자를 표현 astrocytes (GFAP + 세포). 표시된 값은 수단 ± SD 세 독립적인 실험에서입니다.

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이 프로토콜에서는 neocortical 문화권에서 이러한 벡터의 lentiviral 벡터와 응용 프로그램의 제작을 보여주었다. 우리는이 방법으로 생산되는 벡터로 효율적이고 셀 유형 - 특정 형질 도입을 보여주었다. synapsin 모터를 사용하는 경우, GFP 표현은 엄격히 신경 세포에만 적용됩니다. GFAP 모터를 사용하는 경우, GFP 표현은 astrocytes에 독점적이다. 어떤 세포 유형에 특정한 표현이 필요하지 않은 경우 유비 쿼터스 발기인을 사용할 수 있습니다. 우리가 추구하는 neocortical 문화 6에서 높은 수준의 유전자 발현을 운전할 수 ubiqutin 및 phosphoglycerate의 키나제 (PGK)을 찾았습니다. lentiviral 벡터에 의한 유전자 발현은 발기인의 선택 (예 : 유비 쿼터스 또는 형식 고유의 셀)에 의해 또는 특정 조직이나 응용 프로그램을 대상으로 서로 다른 봉투 단백질이나 벡터 pseudotypes를 사용하여 표현하거나 셀 유형의 특정 수준에 맞게 할 수 있...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Hyclone </td><td> SV3001403 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CM </td></tr><tr><td> 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T3924 </td></tr><tr><td> 나트륨 butyrate </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> B5887 </td></tr><tr><td> Hexadimethrine 브로마이드 (Polybrene) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H9268 </td></tr><tr><td> 293T 세포 </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td></tr><tr><td> HT1080 세포 </td><td> ATCC </td><td> CCL-121 </td></tr><tr><td> 팔콘 100 X 20mm 조직 cultur전자 요리 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353,003 </td></tr><tr><td> × 3 ½ polyallomoer의 원심 분리기 튜브 1 </td><td> Beckman - 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 326,823 </td></tr><tr><td> 0.2 마이크론 주사기 필터 </td><td> 코닝 </td><td> 431,219 </td></tr><tr><td> QIAamp DNA 미니 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 51,304 </td></tr></tbody></table>

중추 신경계에서 transducing 전지 lentiviral 벡터 제작

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

중추 신경계 (CNS)에서 효율적인 유전자 전달 신경학적인 질병 모델링 및 치료 접근법을 개발, 유전자 기능 연구에 중요하다. Lentiviral 벡터들은 모두 분리 및 비 나누어 세포, transgenes 지원하는 지속적인 표현을 transduce으로 CNS의 뉴런과 다른 세포 유형의 형질 도입에 매력적인 도구이며, 비교적 큰 포장 용량과 낮은 독성 1-3 있습니다. Lentiviral 벡터가 성공적으로 체외 4-6에서 많은 신경 세포 유형을 transducing과 7-10 동물에 사용되었습니다. 그레이트 노력 향상된 biosafety 및 유전자 전달을위한 효율 lentiviral 벡터를 개발되었습니다. 현재 3 세대 복제 - 결함과 자기 운영을 중지시키지 (SIN) lentiviral 벡터는 그림 1에 표시됩니다. 벡터 포장을위한 필수 요소 네 가지 plasmids 나뉘어있​​다. lentiviral 트랜스에서플라스미드 하기까지, 5 &#39;긴 터미널 반복 (LTR)의 U3 영역은 다른 바이러스의 강력한 모터로 대체됩니다. 이 수정은 일반적으로 HIV 유전자 발현 11가 필요합니다 HIV-1 두드리는 단백질의 벡터 시퀀스의 전사 독립 있습니다. 포장 신호 (Ψ)가 encapsidation와 레브 - 반응 요소 (RRE)에 필수적인 높은 titer 벡터를 제작할 필요합니다. 중앙 polypurine 요로 (cPPT)는 벡터 DNA의 핵 수입이 아닌 분열하는 세포에게 12 transducing에 필요한 기능을 위해 중요하다. 3 &#39;LTR에서 CIS-규제 시퀀스는 완전히 U3 영역에서 제거됩니다. 이 삭제는 두 LTRs의 transcriptional 불활 성화 결과, 리버스 녹음 후 5 &#39;LTR에 복사됩니다. 플라스미드 pMDLg / pRRE은 구조 단백질 및 역방향 transcriptase를 제공​​ HIV-1 개그 / POL 유전자를 포함합니다. pRSV - 레브 핵의 효율적인 RNA의 수출 RRE에 바인딩 레브 인코딩합니다. pCMV-G는 인코딩HIV-1 유럽 표준안을 대체 소낭성의 구염 바이러스 당단백질 (VSV-G). VSV-G는 벡터의 tropism을 확대하고 ultracentrifugation 13을 통해 집중력이 가능합니다. Vif, Vpr, VPU 및 NEF 포함한 액세서리 단백질을 인코딩 모든 유전자는 패키징 시스템에서 제외됩니다. lentiviral 벡터의 생산과 조작은 재조합 DNA (참여 연구를위한 NIH 가이드라인에 따라 실시되어야 <a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf을</a> ). 개별 기관 생물 및 화학 안전위원회의 승인을 lentiviral 벡터를 사용하기 전에 필요할 수 있습니다. Lentiviral 벡터는 일반적으로 lentiviral 전송 플라스미드 및 벡터 포장에 필요한 단백질을 인코딩 도우미 plasmids 함께 293T 세포의 cotransfection에 의해 생산됩니다. 많은 lentiviral 전송 plasmids와 헬퍼 plasmids은 Addgene, 비에서 구할 수 있습니다비영리 플라스미드 보관함 ( <a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/~~V</a> ). 일부 안정적인 포장 세포 라인 개발하지만, 이러한 시스템은 시간이 14여 덜 유연성과 그들의 포장 효율은 일반적으로 거부, 15을 제공하고 있습니다. 상용 transfection 키트는 transfection 16 높은 효율성을 지원할 수 있지만 대규모 벡터 준비를 위해 매우 비쌉니다. 칼슘 인산염 석출 방법 293T 세포의 효율적인 transfection을 제공하기 때문에 lentiviral 벡터 생산을위한 안정적이고 비용 효과적인 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜에서는 20 %의 자당 쿠션을 통해 정화 및 ultracentrifugation와 농도이어서 칼슘 인산염 석출 원리에 기반으로 최대 4 plasmids 함께 293T 세포의 cotransfection로 lentiviral 벡터를 생성합니다. 벡터 titers는 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS) 항문에 의해 결정됩니다ysis 또는 실시간 qPCR에 의한. 이 프로토콜의 lentiviral 벡터의 생산과 적정가 구일이 완료됩니다. 우리는 뉴런과 astrocytes를 모두 포함하는 murine neocortical 문화로 이러한 벡터를 transducing의 예를 제공합니다. 우리는 lentiviral 벡터 형질 도입과 CNS의 기본 교양 세포의 세포 유형의 특정 유전자 발현의 높은 효율을 지원하는 것을 보여줍니다.

이 프로토콜에서는 생산, 정제 및 lentiviral 벡터의 적정을 설명합니다. 우리는 기본 교양 뉴런과 astrocytes의 lentiviral 벡터 매개 유전자 전달의 예제를 제공합니다. 우리의 방법은 다른 세포 유형에도 적용될 수<em&gt; 체외에서</em&gt;과<em&gt; 생체내에서</em&gt;.

중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작

중추신경계(CNS) 내의 효율적인 유전자 전달은 유전자 기능을 연구하고, 신경계 질환 모델을 구축하며, ...를 개발하는 데 있어 중요합니다.

이 프로시저의 전체적인 목표는 중추신경계 세포로 트랜스진을 전달하기 위한 렌티바이러스 벡터를 제작하는 것입니다. 이는 먼저 인산칼슘 침전 원리를 이용하여 2 93 T 세포에 렌티바이러스 전달 플라스미드와 헬퍼 플라스미드를 공동 형질전환함으로써 달성됩니다. 프로시저의 두 번째 단계는 20% sucrose 쿠션을 이용한 초원심분리를 통해 벡터 상층액을 정제하고 농축하는 것입니다.세 번째 단계는 fax 분석 또는 실시간 정량 PCR을 통해 벡터의 역가(titer)를 결정하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 대상 세포에 벡터를 형질전환(transduce)시키는 것입니다. 최종적으로, 외래유전자를 발현하는 대상 세포의 면역 염색을 통해 세포 유형 특이성에 따른 형질전환 효율을 확인할 수 있습니다.상용 키트를 사용하는 등의 기존의 다른 방법들과 비교했을 때 본 기술의 주요 장점은 렌티바이러스 벡터 생산을 위해 비용 효율적이고 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공한다는 점입니다. 따라서 이 방법은 중추신경계(CNS) 세포 내로의 트랜스진 전달에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 이는 생체 내(in vivo) 및 생체 외(in vitro)의 다른 세포 유형에도 적용 가능합니다. 렌티바이러스 벡터는 293T 세포에 플라스미드를 공동 형질전환(cotransfection)하여 생산합니다.본 실험에서는 2 9 3 T 세포주를 변형된 DMEM에서 배양해야 합니다. 10개의 100 mm 배양 접시에 2 9 3 T 세포를 30~40% 합류도로 접종합니다. 20~24시간 동안 배양하면 세포가 약 80% 합류도에 도달하여 형질전환이 가능한 상태가 됩니다.형질전환을 위해, 필요한 모든 플라스미드를 50 mL 튜브에 넣고 TE 7 9 10을 사용하여 4.4 mL까지 채웁니다. 그런 다음 2 M 염화칼슘 0.6 mL를 넣고 튜브를 부드럽게 섞습니다. 다른 50 mL 튜브에 2 XHBS 5 mL를 준비합니다. 혼합액을 볼텍싱하면서 플라스미드와 염화칼슘 혼합물을 HBS에 한 방울씩 첨가합니다.이제 다음 30분 동안 실온에서 침전물이 형성되도록 둡니다. 배양 접시를 인큐베이터에서 꺼내고 침전물이 형성되어 현탁액 상태가 되면, 볼텍스 믹서를 사용하여 각 접시에 현탁액 1 mL를 한 방울씩 첨가합니다.디시 내의 배지를 부드럽게 흔들어 섞어줍니다. 현탁액을 다음 디시로 옮기기 전에 튜브를 짧게 흔들어 줍니다. 로딩이 완료된 플레이트를 인큐베이터로 다시 넣습니다.플라스미드가 세포로 형질전환되도록 5시간 동안 둡니다. 5시간 후, 배지를 6 mM Sodium butyrate가 포함된 배지 6 mL로 교체합니다.그 후 다음 날 배양물을 인큐베이터로 되돌립니다. 보편적으로 발현되는 형광 리포터가 사용된 경우, 형광 현미경으로 그 발현 여부를 확인하십시오. 일반적으로 세포의 80% 이상에서 리포터 유전자가 발현됩니다.형질전환 2일 후, 배양 접시에서 SANE를 두 개의 50 milliliter 튜브에 수집하며, 튜브당 약 30 milliliters가 되어야 합니다. 이 시점에서 상층액을 보관한 후 나중에 진행하려면 minus 80 degrees Celsius에서 저장할 수 있습니다. 우선, 형질전환 접시에서 수집한 상층액을 원심분리하여 세포 잔해를 제거합니다.그동안 60 mL 주사기를 0.2 µm SFCA 주사기 필터에 연결합니다. 다음으로, 상층액을 주사기에 붓습니다. 그런 다음 플런저를 밀어 상층액을 스윙 로터용 38 mL 폴리머 원심분리 튜브에 필터링하여 옮깁니다.이제 5mL 피펫으로 PBS에 포함된 20% sucrose 5mL를 흡입합니다. 상층액이 들어 있는 원심분리 튜브 바닥까지 피펫을 삽입하고, 벡터 상층액 아래로 sucrose 용액을 천천히 첨가합니다. 그다음 Beckman SW 28에서 SNAT를 4시간 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝난 직후 상층액을 따라내어 버리고, 벡터가 포함된 펠릿을 PBS에 포함된 4% lactose 150µL로 재현탁합니다. 모든 현탁액을 하나의 1.5mL 튜브에 모아 얼음 위에서 15분 동안 냉각시킵니다.다음으로, 피펫팅을 통해 현탁액을 혼합한 후, 마이크로 원심분리기를 이용하여 최대 속도로 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고, 농축된 벡터를 20 µL씩 분주하여 -80 °C에서 보관합니다. 벡터의 역가를 측정하기 위해, 먼저 HT 1080 세포를 12-웰 플레이트에 분주하며, 각 웰에 보충제가 첨가된 DMEM 1 mL씩을 넣습니다. 하룻밤 동안 배양한 후, 한 개의 웰에서 세포 수를 측정하여 기록합니다.이제 농축된 벡터를 배양 배지에 넣고 5배 단계 희석 시리즈를 만듭니다. 그다음, 희석된 각 벡터 1 µL를 각각의 웰에 첨가합니다. 샘플은 중복으로 준비할 수 있으나, 음성 대조군으로 벡터가 없는 웰을 최소 하나 이상 남겨둡니다. 다음으로, 모든 웰에 poly brain 1 µL를 첨가하고 플레이트를 가볍게 흔들어 혼합합니다.플레이트를 인큐베이터로 옮겨 48시간 동안 배양합니다. 2일 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 PPS로 세포를 세척합니다. 그다음 세포를 트립신 처리하고 파이펫팅을 통해 1 mL의 배양액에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 1.5 mL 튜브로 옮긴 후 원심분리하여 세포 펠릿을 수집합니다.벡터에 형광 리포터 유전자가 포함되어 있다면, 펠릿을 3.7% formaldehyde가 포함된 PBS 300 µL에 다시 현탁한 후, FACS 분석을 통해 양성 세포의 비율을 측정하여 타이터를 계산하십시오. 형광 리포터 유전자를 사용하지 않은 경우에는 시판되는 키트를 사용하여 세포에서 게놈 DNA를 추출하십시오. 그 다음, 실시간 PCR을 이용하여 벡터 서열을 증폭하십시오.알려진 카피 수를 가진 플라스미드의 템플릿 서열을 10배 희석 시리즈로 증폭하여 표준 곡선을 작성하십시오. 그런 다음 밀리리터당 통합 단위로 타이터를 계산하십시오. 이전에 설명된 2단계 절차에 따라 보충된 MEM이 담긴 24웰 조직 배양 플레이트에서 5일 후, 마우스 피질 유래의 뉴런과 글리아를 포함하는 신피질 배양물을 준비하십시오.In vitro에서, 비신경 세포의 분열을 억제하기 위해 10 µM RSC를 첨가합니다. 이후 배지 교체 중에 세포가 건조해지지 않도록 주의하며 이틀 동안 배양을 계속합니다. 이틀 후, RSC가 포함된 배지를 0.5 mL의 따뜻한 신선 제조 배지로 교체합니다.그 다음, 원하는 MOI의 벡터를 배양액에 첨가하고 24시간 동안 세포를 계속 배양합니다. 24시간 후 배지를 교체하며, 48시간 후에 리포터 유전자가 있는 경우 형광 현미경으로 세포를 관찰합니다. 리포터 발현은 형질전환 후 2~7일 사이에 뉴런에서 확인되어야 합니다. 벡터 설계에 따라 다르나, 본 프로토콜로 제작된 렌티바이러스 벡터의 역가 범위는 10⁸에서 10¹⁰ 사이입니다.밀리리터당 통합 단위(Integration units per milliliter)는 많은 CNS 세포의 in vitro 또는 in vivo 형질전환에 적합합니다. 따라서, 생쥐 신피질 배양물에 synapsin 프로모터 또는 GFAP 프로모터에 의해 조절되는 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 형질전환시켰습니다. 형질전환 7일 후, synapsin 프로모터를 포함하는 벡터에 대해 면역조직화학 염색을 수행하였습니다.NeuN 양성 세포로 확인된 뉴런의 90% 이상이 GFP를 발현한 반면, GFAP 양성 세포로 확인된 별아교세포는 발현하지 않았습니다. GFAP 프로모터를 포함하는 벡터로 형질도입된 세포의 리포터 유전자의 경우, 별아교세포의 약 80%가 GFP를 발현했으나 NeuN으로 라벨링된 뉴런 중 GFP를 발현한 세포는 없었습니다.이러한 결과는 렌티바이러스 벡터가 중추신경계(CNS) 세포에 트랜스진을 전달하는 데 매우 효율적임을 보여줍니다. 또한, 적절한 프로모터를 사용하면 세포 특이적 유전자 발현을 달성할 수 있습니다. 렌티바이러스 벡터는 중추신경계에서 표적 유전자의 과발현 및 녹다운을 위해 널리 사용되어 왔습니다.본 프로토콜은 자신의 실험실에서 이러한 방법들을 활용하고자 하는 다른 연구자들에게 유용할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

lentiviruses을 만들려면, DNA 벡터는 인간의 293 세포에 transfected 수 있습니다. 수확 후 뜨는을 집중, 바이러스 titer는 흐름 cytometer로 형광 표현식에 의해 결정됩니다.

Lentivirus 제작

Lentiviral 표현 벡터가 안정적으로 포유 동물 세포와 전체 생명체를 나누어와 비 나누어에서 다른 이펙터 분자 또는 리포터 구조를 표현하는 가장 효과적인 수단입니다. 여기 pseudoviral 입자에 lentivector 표현 구조를 패키지하고 pseudoviral 입자를 사용하여 대상 세포를 transduce하는 방법에 프로토콜을 제공합니다.

포장 HIV 또는 FIV 기반 Lentivector 식 구조 및 VSV-G Pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입

여기, 우리는 레트로 바이러스 전달 및 테트라 사이클린의 부재 렌티 바이러스 벡터 (LV)의 구성 요소를 표현할 수있는 세포 라인을 만들 수 concatemeric 형질을 사용합니다. 이 LV는 GFP를 인코딩 및 수지상 세포 수용체 특정 당 단백질, SVGmu로 pseudotyped 있습니다.

항생 물질 규제 세포주 특히 수지상 세포를 대상으로 높은 titer의 렌티 바이러스 벡터를 생성

여기에서는 중추신경계 수초화의 시험관 모델을 통해 희소돌기아교세포에서 희소돌기아교세포의 역할을 구체적으로 조사하기 위해 희소돌기아교세포 전구세포를 바이러스로 조작하여 관심 단백질을 과발현할 수 있는 유연하고 전략적인 기반을 제공하는 프로토콜을 제시합니다.

생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한 체외 수초 분석

여기에서는 Tfap2c, Gata3, Eomes 및 Ets2의 10일 과발현을 통해 쥐 배아 섬유아세포를 완전한 기능을 갖춘 안정적인 영양막아세포 줄기세포로 직접 전환하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

이 프로토콜 transcriptionally 규제 잠자는 미녀 시스템에 의해 인간 게놈에 관심사의 유전자의 안정적인 통합을 달성 하는 방법을 설명 합니다. 결함이 lentiviral 벡터, 인간의 세포, 생체 외에서 변환 및 불리고 세포에 분자 분석 결과의 통합의 준비 보고 됩니다.

효율적인 체 외에서 이항 메서드인 Transcriptionally 규제 자 아름다움 시스템 통합 결함이 Lentiviral 벡터에 포장 하 여

여기, 선물이 수정된 oocyte의 perivitelline 공간에서 lentiviral 벡터의 간단한 주입에 의해 transgene 통합 및 높은 효능과 설립자 유전자 변형 생쥐의 생산을 촉진 하는 프로토콜.

유전자 변형 마우스 생산을 중재 하는 lentiviral: 창시자의 직접적인 연구를 위한 간단 하 고 매우 효율적인 방법

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

저가의 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 H9 인간 배아줄기세포(hESCs)에서 shRNA의 안정적인 발현을 위한 렌티바이러스 입자를 생산하고 H9 유래 신경전구세포(NPC)를 고효율로 일시적으로 형질도입했습니다.

저비용 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 hESC 및 NPC에 대한 shRNA의 렌티바이러스 매개 전달

우리는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 생체 내에서 복막 조직 상주 대식세포의 유전자 기능을 조사하기 위한 단계별 프로토콜을 보여줍니다.

생쥐의 In Vivo 에서 복막강 조직 거주 대식세포의 효율적인 유전자 및 MicroRNA 조절을 위한 렌티바이러스 벡터 준비

배우세요 중추 신경계 세포에 유전자 전달을 위한 렌티바이러스 벡터 생산 및 정제 방법. 293T 세포 공동전환, 초원심분리 농축, 유세포 분석 및 실시간 정량 PCR을 활용한 역가 측정, 그리고 신경세포와 성상세포에서의 효율적인 유전자 전달 기술을 익힐 수 있습니다.

중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작

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