Name: 주름 식민지 개발을 사용하여 Biofilm 형성을 평가하기 위해 세미 양적 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 배우세요 주름 식민지 형태를 활용한 세미정량적 바이오필름 형성 평가 방법입니다. 현미경 관찰로 세균의 3차원 구조 발달을 시간 경과에 따라 모니터링하여 다양한 균주 간 생물막 표현형을 비교 분석할 수 있습니다.

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1. 초기 특성화 및 고려 사항 <ol><li> Biofilm 형성은 일반적으로 세포 밀도와 성장 속도에 의해 영향을받습니다. 따라서 성장 속도 (시간에 따른 광학 밀도 (OD)의 증가) 및 단순 성장 곡선과 세포 도금 assays를 수행하여 관심의 변형 (들)의 수율 (최종 휴대폰 번호)를 확인하는 데 필요합니다. 실험을 야생에서 결과를 해석하면 성장, 혹은 OD 및 휴대폰 번호 사이의 상관 관계의 부족 결함은 고려되어야한다. </li><li> 마이너 판 - 투 - 플레이트 편차가 biofilm 개발에 영향을 수 있으므로 주름 콜로니 형성을 평가했을 때 같은 접시 적절한 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 포함합니다. </li><li> 스포팅위한 최상의 조건​​, 즉 제어 및 관심있는 돌연변이 (들) 사이의 가장 뚜렷한 차이를 밝혀 이들을 식별합니다. 같은 다른 미디어 또는 온도 등 다양한 조건 하에서 액체 문화의 변종을 재배하고, 다양한 무대에이전에 야생의 성장 (지수 혹은 고정 상)의의. 스팟 10 적절한 미디어를 향해 다양한 세포 밀도의 문화의 μl, 그리고 식민지의 morphologies은 명백한 될 때까지 원하는 온도에 부화. </li><li> 엔드 포인트 분석 (예, 48 시간) 야생 후 미리 정해진 시점에 주름이 식민지 형성의 평가를 포함한다. 이 평가는 종자 유용 biofilm 형성에 전시 (또는 전시 제안하고 있습니다) 심각한 결함니다. </li><li> 시간 코스 분석은 일정 기간 (예, 매 시간) 이후의 야생을 통해 주름 식민지 형성을 평가합니다. 이 분석은 일정 기간 동안 주름이 식민지 형성 및 패턴 개발의 시작의 결정을 허용하여 biofilm 형성 세미 양적 평가를 허용합니다. 주어진 시간 코스에 대한 컬렉션 포인트의 실험과 숫자의 기간은 예비 실험에서 결정되어야한다. </li><li> 쉽게에 설정 후 야생 시간을 추적하려면최대 계산하기 imer. </li></ol> 2. V.에 주름 콜로니의 형태론의 현미경 평가 fischeri <ol><li> 접종 V. LB-소금 (LBS) 중형 13 (1 % [W / V] tryptone, 0.5 % [W / V] 효모 추출물 2 % [W / V] 나트륨 염화물, 50 MM 트리스-HCL [5 ML에 fischeri 세포 산도 7.5]) 28시 야간, 흔들림과 함께 필요한 경우 항생제와 부화를 포함한 ° C. 세포가 원하는 OD 600에 도달하기 전까지 아침에, 동일한 조건 하에서 신선한 LBS 매체와 부화 5 ML에 1:100 희석과 세포를 subculture (예 : OD 600 = 0.2 또는 0.5). </li><li> microfuge 튜브와 하나 잠깐 최대 속도 microfuge 세트의 원심 분리기로 문화의 피펫 1 ML. 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. 멸균 70% 인공 해수 중 1 ML (ASW) (35 MM MgSO 4 7H 2 O, 7 MM CaCl에 펠렛을 resuspending하여 잔류 미디어 및 세포외 구성 요소를 제거하는 세포를 씻으2 - 2 시간 2 O, 210 MM NaCl, 7 MM KCl)과 원심 분리를 반복. 70% ASW 1 ML에서 한물간 펠렛을 Resuspend. </li><li> 각 예제와 같은 600 nm의에서 OD가 추정 세포의 동일한 숫자를 포함하고 있는지 확인합니다. 추가 70% ASW보다 집중적으로 샘플을 diluting하여 필요한 조정을합니다. 예비 실험에서 다양한 초기 OD 값의 현장 문화는 변종이나 조건의 주어진 집합에 대한 최적의 시작 OD를 확인하십시오. 최상의 결과 V. 위해 얻을 수있다 반점은 약 0.2의 OD와 문화에서 생성됩니다 fischeri. </li><li> 필요한 경우 항생제를 포함한 LBS 플레이트쪽으로 한물간 세포의 10 μl를 정확 해요. 접시에 문화를 안보 때, 한천 표면 위에서 꾸준한 피펫 (손가락 포함)에 있는지 확인하십시오. 아니 각도로, 수직으로 정확하고, 현장의 균일한 분포를 위해 천천히 액체를 추출. 일반적으로 각 변형이 (접시 당 최대 6 곳) 접시에 한 번씩 목격되고 위트실험마다 H 여러 접시 (2-3). </li><li> 점박이 문화가 고르게 분산 상태를 유지하기 위해 자리가 인큐베이터에 플레이트를 이동하기 전에 건조하실 수 있습니다. 번호판을 반전 28에서 그들을 품어 ° C. </li><li> 접종에 따라 12~15시간에서 성장하고 자리 시간별 시작의 형태를 모니터링합니다. 우리는 카메라 첨부 (ProgRES C10 플러스)와 ProgRes CapturePro하고 관찰하고 문서화 식민지의 형태를하고 주름 식민지 형성의 시작과 진행을 평가하기 위해 ImageJ 소프트웨어 프로그램과 함께 해부 범위 (자이스 혈구 stemi 2000-C)을 사용합니다. </li><li> 이미지 위에서 캡처하는 동안 단계 2.5에 나열된 특정 설치의 경우 반점은 CL 1,500 EC 차가운 광원과 투명한 유리 단계를 통해 수렁에서 조명하고 있습니다. 이 설정은 영상 주름 식민지 개발을위한 이유 V. 최적입니다 fischeri 식민지는 (명소) 반투명입니다. </li><li> 세인트에 나열된 특정 장비의 부재에EP 2.5, 완전한 식민지 시청 가능하며 조절 광원과, 이상적으로, 연결된 카메라를 가지고있는 해부 현미경을 사용하여 모니터 주름 식민지의 형태. 필요한 경우, 디지털 카메라도 첨부된 카메라의 부재로 활용하지만 이것은 최적되지 않습니다 수 있습니다. </li><li> 최고의 주름 식민지 개발을 시각화하기 위해서는 개발 biofilms의 입체 형태가 분별이 될 수 있도록 세균성 식민지 밑에 반사의 조명 강도와 각도를 모두 조정할 필요가 있습니다. 발견 식민지와 식민지의 아키텍처 (주름) 명확히 구별할 수 있는지 등 주변의 한천 배경 사이의 강한 대비를 제공하는 최적의 조명 조건을 확인합니다. </li><li> 식민지 색상의 변경이 biofilm 형성하는 동안 발생할 수있는 경우에 반점이 식민지의 색상 또한 고려되어야한다. 표시하는 방법으로 조명 소스의 강도와 각도를 조정착색에 이러한 미묘한 변화. 적절한 설정이 달성되면, 실험 기간 동안 그들을 유지합니다. </li><li> 얼마나 시간이 경과 접종시기부터 주름이 군락 형성이 각 변형이나 컨디션에 시작되는 시간이 있습니다. patterning 및 3D 구조의 형성 (즉, 강선은 바깥쪽 가장자리에 형성 또는 &#39;파문&#39;는 중앙에 발생)가 없었던 이유는 첫째되는 시점으로 주름 식민지 형성의 시작을 정의합니다. 돌연변이 세포는 주름 식민지 형성의 시작 (예를 들어, 그림 2.)로 시간을 감소 또는 증가 발생할 수 있습니다. </li><li> 적절한 디지털 이미지를 캡처하여 주름 식민지 형성의 시작과 발전을 문서. 그것은 실험을하는 동안 이미지를 수집하는 경우 동일한 배율을 사용하는 것이 중요합니다. 현미경의 접안 렌즈에서 카메라의 후면에 위치한 레버를 사용하여 컴퓨터 화면으로보기를 전환합니다. 접안 렌즈 사이를 전환할 때그리고 컴퓨터 화면 시청은 전망을 조정하고 이에 따라 초점을 맞춥니다. </li><li> 이미징 점박이 배양하기 전에, 페트리 접시의 뚜껑은 일반적으로 가장 선명한 이미지를 제공하기 위해 제거됩니다. 점박이 문화가 단계 2.5 및 2.6에서 설명한 설정을 사용하여 뚜껑을 통해 몇 군데 수 있습니다 그러나, 이것이 단계는 선택 사항입니다. </li><li> 주름 식민지 형성의 시작에 따라 각각의 시점에서, 주름 식민지 개발의 패턴을 확인합니다. 아키텍처는 내부 밖에서 개발할 수도 있고,이 평가 인치 외부는 다른 변종이나 다른 조건 하에서 형성 biofilms를 구별하기위한 메커니즘을 제공합니다. </li><li> 각 시점에서 개발 식민지의 직경을 측정합니다. 이것은 수동으로 수행하거나, 디지털 관련 소프트웨어 프로그램을 사용하실 수 있습니다. 디지털로 할 경우, ProgRes CapturePro 소프트웨어 프로그램을 사용하여 먼저 실험에 사용된 특정 배율로 눈금 막대를 보정. 캡처된 각각의 이미지의 스케일 막대를 포함합니다. </li><li> ImageJ 소프트웨어 프로그램을 사용하여 식민지 직경을 계산하려면 각 이미지 파일을 엽니다. 다음과 같이 규모가 막대를 표준화 : 도구 모음에서 &#39;스트레이트 라인 옵션 &quot;을 선택하십시오. 동일한 길이와 너비 직선으로 임베디드 규모 표시줄을 입혀라. 레이블 탭에서 &quot;설정 규모&quot;를 선택 &quot;분석을.&quot; 그리고 &quot;확인&quot;을 선택, &quot;알려진 거리&quot;상자에서 (즉, 2mm로서 원래의 규모 표시줄에서 결정) 해당 길이를 넣습니다. </li><li> 현장을 가로질러 수평선을 삽입하려면 &#39;스트레이트 라인&#39;옵션을 사용하십시오. 분석 탭에서 &quot;법안&quot;을 선택합니다. 새로운 결과 창에서 계산된 길이가 제공됩니다. 현장 전반에 걸쳐 수직 라인을 삽입하여 두 번째 측정을 구합니다. 직경을 다시 계산합니다. 두 측정의 평균을 기록합니다. 그래프와 같은 엑셀과 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 각 시점에서 각 지점의 평균 직경. </li><li> 실험의 끝이 어느 특정 시점에서 때 또는 더 이상 없습니다 발생biofilm을 개발. 끝에 도달하면, 같은 파워 포인트와 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 시간이 지남에 따라 패턴 개발을 시각화하기 위해 그림 (들)에 이미지를 통합. </li></ol> 3. 대표 결과 이러한 실험에서는 사용 V. 고체 한천 표면에 주름이 식민지의 발전을 평가하여 biofilm 형성을 연구하는 모델 생물로서 fischeri. V.의 Biofilm 생산 종자 40 H 내에서 광범위한 3D 아키텍처 fischeri 양식 식민지 (그림 1) 8,9,14. 시간에 걸쳐 검사하면 컨트롤 변형에 의한 주름 식민지 형성이 12만큼 일찍 시작하는 것이 명백한된다 H 포스트 접종 (특정 조건에 따라 다름) (그림 2) 9. 반대로, 대표적인 돌연변이에 의한 biofilm 형성은 약 16 H 포스트 접종 9까지 시작하지, 약 4 H에 의해 지연될 수 있습니다. 반복 하오이러한 실험 TS는 9이 평가는 세미 양적 만드는시기가 비교적 일관성 것을 제안했습니다. biofilm 형성의 두 번째 세미 양적 측정은 시간이 지남에 개발 식민지의 직경의 변화 이용한다. 다른 이름으로 그림. 3A는 대표 biofilm - 관할 발표했던 식민지를 형성하는 그 복잡 성과 biofilms을 구성하지 못하는 대표적인 변형에 상대적으로 직경이 증가. 이 두 가지 변종에 의해 형성된 콜로니 직경의 시간의 경과에 조심스럽게 측정은 biofilm-관할 콜로니의 크기가 biofilm - 부정적인 식민지보다 더 큰 비율로 증가 것으로 나타났다 및 종료 시점에 두 사람은 거의 2 일까지 다릅니다 - 배 (그림 3B). 대표 늦은 시간 또는 &quot;엔드 포인트&quot;식민지의 형태의 이미지가 자주 문학에 표시된 있지만 따라서, 추가, 세미 양적 데이터는 biofilm 결함에 대한 이해를 허용할 것이다 수령하실 수 있습니다.<img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig1.jpg" /> 그림 1. 엔드 포인트 분석. 이 수치는 V. 대표 (오른쪽) 이외의 biofilm - 성형 (왼쪽)와 biofilm - 성형 변종을 사용하여 엔드 포인트 분석의 예입니다 fischeri. 이러한 이미지는 40 H는 이후 야생에서 수집되었다. 이러한 이미지는 야생 형 V.으로 생성되었습니다 fischeri는 벡터 제어 (비 biofilm - 성형) 또는 설정 모리스 외., 2011에 대해 수집된 데이터의 rscS overexpressing 플라스미드 (biofilm - 성형) 및있었습니다 일부를 포함하는. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig2.jpg" /> 그림 2. 시간 코스 분석. 상단 패널의 biofilm - 유능한 제어의 흐름은 biofilm 형성을 대표하는 이미지가 포함되어 있습니다 V. 선택한 시간 코스 이상 fischeri. biofilm 형성의 개시는 12 H에 분명하다. 하단 패널은 대표 전을 포함V.의 돌연변이 변종의 mages biofilm 형성 16 H 이후의 접종시 시작으로 시간이 지남에 주름이 식민지 형성의 시작의 지연 (4 H), 전시 fischeri. 이러한 변종 사이의 미묘한 차이가 오직 이전 시간 지점에서 관찰하는 동안 40시간에서 변종이 biofilm 형성의 강도 및 patterning에서 비슷합니다. 이러한 이미지는 rscS overexpressing 야생 - 타입과 sypE 돌연변이로 생성된 V. fischeri 세포와 데이터의 줄 부분은 모리스 외 대해 수집된 집합., 2011. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig3.jpg" /> biofilm 형성의 반 정량 분석 그림 3. 콜로니 직경. V. 대표 biofilm - 성형 (위쪽 패널) 및 비 biofilm - 성형 (하단 패널) 변종에 의한 biofilm 형성 () 시간 코스 fischeri. biofilm - 성형 변형률이 큰 증가를 전시하고주의비 biofilm 형성 변형에 상대적으로 시간이 지남에 직경 인치 이러한 이미지는 야생 형 V.으로 생성되었습니다 데이터 rscS overexpressing 플라스미드 (biofilm - 성형) 또는 벡터 제어 (비 biofilm - 성형) 및있었습니다 부분을 포함 fischeri 모리스 외., 2011에 대한 수집 설정합니다. (B) 프로토콜에 명시된 바와 같이 이러한 데이터가 ImageJ와 엑셀 소프트웨어를 사용하여 생성된 패널 A에서 두 변종에 의해 시간의 경과에 식민지 직경의 증가의 그래픽 표현.

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</ol>

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이 작품에서 우리는 biofilm 형성을 사용하여 평가하는 세미 양적 방법을 설명 V. 모델 생물로서 fischeri. 특히, 우리는 고체 한천 표면에 시간이 지남에 주름이 식민지 형성 등 biofilm 형성과 발전을 모니터하는 카메라 첨부 파일이있는 해부 현미경을 활용. 이 프로토콜에서는, 우리는 일반적으로 주름 식민지 형성을 평가하기 위해 사용하는 방법 두 가지 구체적인 유형을 설명합니다. 첫 번째는 우리가 선택한 &quot;최종&quot;시점에 최종적으로 전체적인 3D 아키텍처, patterning, 그리고 더럽혀진 문화의 직경을 관찰 수있는 엔드 포인트 분석이다. 이러한 접근 방식은 biofilm 형성을 극적으로 결함을 초래할 돌연변이 변종 또는 조건을 평가하기위한 가장 유용합니다. 그러나, 이러한 방식은 선택된 엔드 포인트 전에 시간 지점에서 발생하는 많은 미묘한 차이를 구분하지 않습니다. 보다 긴밀하게 주름 식민지 형성을 모니터링하기 위해, 우리는 우리 w의 시작을 식별할 수있는 시간 코스 분석을 사용시간의 경과에 식민지 형성과 발전을 지켜을 rinkled. 이 접근법의 결과로 주름 콜로니 형성, 3D 건축 및 patterning의시기에 더 미묘한 차이는 확인할 수 있습니다. 우리는 biofilm 형성의 두 세미 양적 assays을 생성하기 위해이 시간 코스 분석를 사용했습니다. 첫째, 긴장이 3D 아키텍처를 개발하기 위해 시작되는 시간을 제어 계통의 비교할 수 있습니다. 우리는 동일한 조건 하에서 특정 돌연변이의 biofilm 형성의 지연 9 상당히 일관성있는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 그림 데이터 인치 2 돌연변이가 지속 biofilm 형성을 시작에서 4 H 지연에 대해 전시. biofilm 형성의 두 번째 세미 양적 법안은 주름 식민지 (장소)의 직경의 크기의 변화입니다. 우리는 (그림 3 주름 콜로니 직경이 점차적으로 종료 시점에서 2 배 차이에 대해 접근이 아닌 biofilm 식민지의와는 다른 것으로 나타났습니다 </strong&gt;)을 (모리스와 Visick, 게시되지 않은 데이터). 그것이 어떤 뮤턴트 다르게 동작합니다 가능한 남아 있지만 현재까지, 우리는 (되지 않은 데이터) (즉, 식민지 직경의 증가없이 biofilm 형성) 다른없이 한 표현형을 관찰하지 않았습니다. 실제로, 그것은 V. 대해보고되었습니다 식민지 직경에있는 상당한 증가에 약간 주름이 식민지 결과가 다른 15 없지만 것을 cholerae. 그럼에도 불구하고 시간이 지남에 따라 직경의 변화를 평가하는 것은 잠재적인 biofilm의 돌연변이 및 / 특성화에 투입하거나 개발 지연과 뮤턴트의 추가적인 양적 척도를 제공할 수 있습니다. biofilm 형성의 두 가지 대책 (시간 및 직경)의, 주름 식민지 형성의 시작을 결정하는 것은 현장의 직경을 결정하는 것보다, 더 많은 주관적 더 민감하지만. 그럼에도 불구하고 두 조치는 biofilm 연구에 매우 유용하지만, quantificatio으로 즉시 의무가 없습니다 표현형의 세미 양적 평가를 제공N. 발견 교양 assays를 수행하면 발견 변종이 배양해되는 환경 조건을 고려하는 것이 중요합니다. 주름 식민지 형성은 주로 양분 가용성, 온도 및 습도 등 다양한 환​​경 조건에 의해 영향을받습니다. 실험 사이의 다양성을 줄이기 위해서는 가능한 (즉 설정된 볼륨 한천 플레이트를 표준화하고 통제된 온도에서 culturing 발견 변종)가 이러한 조건을 표준화하는 데 유용합니다. 야생 실험 사이의 다양성에 대한 제어, 실험의 각 집합 내에서 해당 컨트롤 변종을 포함하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 이러한 assays에서 데이터를 해석하면, 그것은 주름 식민지 형성의 미묘한 차이 (예를 들어, biofilm 형성 또는 patterning 차이가 지연될)을 평가 특히 어느 한 실험에 여러 번 (3 +)을 수행할 필요가 있습니다. 이 프로토콜 중 일부 제한 사항은 다음과 같습니다 1) determin세포 성장에 결함을 가지고 있는지 ING가 어려울 수 있습니다 : 액체 문화에 세포의 성장은 정확하게 성장 고체 미디어 요금 및 불가 능할 수 있습니다 뭉쳐 있습니다 biofilm - 형성 세포의 성장의 정확한 결정을 반영하지 않을 수 있습니다; 2) 성장 결함있는 종자는 분석이 문제가 될 것이다; 3) 그것은 미묘한 biofilm의 phenotypes와 변종 사이의 직경 차이를 구별하지 못할 수도 있습니다 4) 동심 반지 성장하지 변종 위해 정확하게 측정할 수 없을 수도 있습니다 직경의 변화,이 실험적인 설정과 biofilm의 Z-치수를 측정 할 수 없어도), 6, 5) patterning이 biofilm 형성 동안 관찰할 수 있지만 거기에 결과 biofilm의 patterning을 수량 수있는 방법은 없다 . 이러한 제한에도 불구하고,이 프로토콜은 그럼에도 불구하고 주름 식민지 형성을 평가에 투입하는 수치 데이터를 얻을 수있는 수단을 제공합니다. 이 프로토콜에서는 특정 이미지를 활용시스템은 주름 식민지 형성을 관찰하고 평가하는 (즉, 자이스 혈구 해부 현미경과 ProgRes CapturePro 이미징 소프트웨어). , 주름 식민지 형성의 시작을 감지하고, 따라서 시간 코스 방식으로 개발을 평가할 수있는 능력이 크게 해부 현미경의 사용을 통해 향상됩니다 여기서 설명 이미징 시스템은 강력하다. 이 기술을 사용할 수없는 경우에는 프로토콜은 줌 초점 간단한 디지털 카메라 등 다른 장비와 함께 사용을 위해 적응 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 주름 식민지 개발의 평가에 초점을 맞추고 있지만, 또한 박막 형성, 세포가 액체 문화에 정적으로 성장하는 때 개발 biofilm의 형태를 평가하기 위해 수정이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 biofilm 개발 중 점박이의 식민지로 특정 염료의 결합을 포함하여 biofilm 형성의 다른 지표를 평가에 유용합니다. 이들은 포함하지만, 그러한 콩고 레드와 calcoflu 같은 염료에 국한되지 않습니다또는 이것은 셀룰로오스, 16 세균성 biofilms의 일반적인 구성 요소에 바인딩할 수 있습니다. 또한이 프로토콜을 사용하기 위해 개발된 비록 V. fischeri는이 유기체에 한정되지 않고 있지만 이러한 바실러스 subtilis 4, 비브리오 cholerae 5, 장염의 비브리오균 6 및 녹농균 7, 모두 전시 주름 식민지 형성 등 여러 가지 생물에서 biofilm 형성을 연구에 일반화 될 수 있습니다. 마지막으로, 그것은 또한 녹농균 18의 Myxococcus xanthus 17 성장과 항공 구조를 개발 중에 발생 patterning, 잠재적 등의 발달 패턴을 가지고 다른 식민지의 morphologies 공부를 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 미생물학과 biofilm 연구자에 대한 일반적인 사용하므로입니다.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 자이스 혈구 stemi 2000-C는 현미경 분석 해 봅시다 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> 45,505,300,000,000,000 </td><td> (루카스 현미경을 통해 얻은) </td></tr><tr><td> ProgRes C10 플러스 </td><td> JENOPTIK 광학 시스템 게엠베하 </td><td> 017953-602-26 </td><td> 카메라 부착 (루카스 현미경을 통해 얻은) </td></tr><tr><td> CL 1,500 EC 콜드 라이트 소스 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> 4355400000000000 </td><td> (루카스 현미경을 통해 얻은) </td></tr><tr><td> ProgRes CapturePro </td><td> JENOPTIK 광학 시스템 게엠베하 </td><td> 등록 카메라와 자유 소프트웨어 </td><td> 이미지 캡처를위한 컴퓨터 프로그램 </td></tr><tr><td> 이미지 J </td><td> NIH </td><td> 에서 무료 소프트웨어 :엘제이 / download.html &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html </td><td> 직경 측정을위한 컴퓨터 프로그램 </td></tr></tbody></table>

주름 식민지 개발을 사용하여 biofilm 형성을 평가하기 위해 세미 양적 접근

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms이나 세포외 기질에 캡슐 세포의 표면 부착 사회는 많은 박테리아에 대한 일반적인 라이프 스타일을 나타냅니다. biofilm 내에서 세균 세포는 종종 항생제 및 기타 환경 스트레스 1 ~ 향상된 저항을 포함하여 생리를 변경냅니다. 또한 biofilms는 호스트 - 미생물 상호 작용에서 중요한 역할을 재생할 수 있습니다. Biofilms 개인의 경우 세균 전환을 개발, planktonic 전지는 복잡한 다세포 공동체에게 2를 형성합니다. 실험실에서 biofilms는 특정 biofilm의 phenotypes의 발전을 평가하여 공부하고 있습니다. 일반 biofilm의 표현형은 단단한 한천 매체 3의 주름이나 주름이 많은 세균 콜로니 형성을 포함한다. 주름 식민지 형성 식별하고 특성 변경된 biofilm의 phenotypes을 전시 박테리아 변종을, 그리고 충격 biofilm 형성 그 환경 조건을 조사하기 위해 특히 간단하고 유용한 방법을 제공합니다. Wrinkled 식민지 형성은 이러한 비브리오 cholerae 5, 장염의 비브리오균 6, 녹농균 7과 바실러스 subtilis 4 및 그람 음성 세균과 같은 그람 양성 세균, 모두 포함한 박테리아의 다양한에서 biofilm 형성의 지표 역할을하고, 장염 fischeri 8. 해양 세균 V. fischeri는 호스트 식민지 동안 biofilms의 중요한 역할에 의한 biofilm 형성을위한 모델이되었다 : 제작한 biofilms V. fischeri는 하와이 꼬리 자른 오징어 Euprymna scolopes의 8-10 자사의 식민지를 추진. 중요한 것은, 체외에서 관찰 biofilm의 phenotypes는 V.의 능력과 상관 관계 fischeri 세포는 효과적으로 호스트 동물을 식민지 방법 : 종자가 증가 할 전시하면서 체외의 biofilm 형성을 위해 장애인 변종은 식민지 결함 9,11을 가지고biofilm의 phenotypes는 식민지 8,12위한 개선됩니다. V. fischeri 따라서 박테리아가 biofilm 형성 방법과 biofilms 영향을 미치는 호스트 식민지를 조절하는 메커니즘을 평가하는 간단한 모델 시스템을 제공합니다. 이 보고서에서 우리는 biofilm 형성을 사용하여 평가하는 세미 양적 방법을 설명 V. 모델 시스템으로 fischeri. 이 방법은 고체 한천 매체를 향해 정의의 농도와 볼륨에서 세균성 문화의 야생 신중을 포함, 더럽혀진 문화는 하나의 세균성 식민지에 대한 동의어입니다. 이 &#39;점박이 문화&#39;기술은 하나의 지정된 시간 포인트 (엔드 포인트 assays)에서 총 biofilm의 phenotypes을 비교하거나 식민지 직경의 biofilm 개발과 측정 시간 코스 assays를 통해 미묘한 biofilm의 phenotypes를 식별하고 특성을 위해 활용할 수 어느가 biofilm 형성에 의해 영향을받습니다. 따라서이 기법은 당, biofilm 형성 세미 양적 분석을 제공합니다주름 식민지 개발과 개발 구조를 간단하게 전체적인 형태 넘어 확장 특성의 상대적 크기의 타이밍과 patterning의 평가를 mitting.

우리는 biofilm 형성을 조사하기위한 간단한 세미 양적 방법을 제공<em&gt; 체외에서</em&gt;. 이 방법은-C 2000 타이밍 및 biofilm 형성의 패턴을 모두 모니터링하는 (카메라 부착 포함) 현미경 분석 해 봅시다, 등 주름 콜로니의 개발에 의해 평가 자이스 혈구 stemi 활용합니다.

주름 식민지 개발을 사용하여 Biofilm 형성을 평가하기 위해 세미 양적 접근

바이오필름(Biofilms), 즉 세포외 기질에 둘러싸여 표면에 부착된 세포 군집은 많은 박테리아에게 일반적인 생존 방식입니다. ... 내에서

이 실험 절차의 전반적인 목표는 시간에 따른 주름진 콜로니 형성 과정을 평가함으로써 바이오필름 형성의 변화를 식별하고 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 관심 있는 박테리아 균주를 액체 배양액에서 배양합니다. 그 다음 단계로 배양액을 영양 한천 배지에 점적합니다.다음으로, 반점들이 주름진 콜로니 형성의 시작을 나타내는 3차원 구조를 발달시키기 시작하는 시점을 확인하기 위해 시간에 따라 모니터링합니다. 콜로니 형태의 발달은 더 이상 변화가 보이지 않을 때까지 모니터링합니다. 최종적으로, 반점의 현미경 관찰을 통해 특정 균주 또는 특정 조건 하에서 시간에 따른 바이오필름 발달의 차이를 반정량적인 방식으로 보여줍니다.기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 주름진 콜로니 형태의 발현을 통해 세균 바이오필름 형성의 반정량적 분석이 가능하다는 점입니다. 이 방법은 Vireo fishery의 바이오필름 형성에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, basc, slus, pseudomonas osa 및 vial cholera와 같은 다른 세균 시스템의 바이오필름 표현형 특성 분석에도 적용될 수 있습니다. 저희는 주름진 콜로니 형성 발현이 지연되는 세균 돌연변이체를 확인했을 때 처음으로 이 방법 아이디어를 얻었습니다.바이오필름 형성은 일반적으로 세포 밀도와 성장 속도의 영향을 받습니다. 따라서 주름진 콜로니 형태를 평가하기 전에, 관심 균주의 성장 속도와 수율을 확인하여 성장 속도를 결정해야 합니다. 시간 경과에 따른 각 균주의 광학 밀도(OD) 증가량을 측정하고 성장 곡선을 그려 수율 또는 최종 세포 수를 결정하십시오.세포 도말 분석법(cell plating assay)을 사용할 수 있습니다. 분석 대상인 박테리아 균주를 액체 배양한 후, 배양액을 희석하여 한천 배지에 도말합니다. 배양 후 생존 세포 수를 계산하여 여기에서 보는 것과 같이 그래프로 나타냅니다.대조군과 관심 돌연변이체 사이의 가장 뚜렷한 차이를 나타낼 수 있는 최적의 스포팅(spotting) 조건을 확인하는 것 또한 중요합니다. 이를 위해 다양한 배지나 온도와 같은 여러 조건 및 지수 성장기 또는 정지기 등 서로 다른 성장 단계에서 액체 배양된 성장 균주를 스포팅하기 전에, 다양한 세포 밀도의 배양액 10 µL를 적절한 배지에 스포팅하고 콜로니 형태가 뚜렷해질 때까지 원하는 온도에서 배양하십시오. 이러한 방식으로 주어진 균주 세트 또는 조건에 대해 이 절차를 시작하기 위한 최적의 시작 OD를 결정할 수 있습니다.한천 배지 플레이트의 v Fisher 안구 세포를 필요한 항생제가 포함된 5 mL의 LB 염 또는 LBS 배지에 접종하고, 28 °C에서 흔들어 밤새 배양합니다. 다음 날 아침, 세포를 1:100으로 희석하여 5 mL의 신선한 LBS 배지에 계대 배양하고, 세포가 600 nm에서 원하는 OD 값에 도달할 때까지 동일한 조건에서 배양합니다. Vibrio fii의 경우, OD가 약 0.2인 배양액에서 스팟을 생성할 때 최상의 결과가 얻어집니다. 그다음, 각 배양액 1 mL를 마이크로 원심분리관에 취해 최대 속도로 원심분리합니다.1분 동안 흡입을 통해 상층액을 제거하고, 펠렛을 1mL의 멸균된 70% 인공 해수 또는 SW 원심분리관에 재현탁합니다. 이 세척 단계는 잔류 배지와 세포 외 성분을 제거하기 위한 것입니다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고 세척된 펠렛을 1mL의 70% ASW에 재현탁하여, 각 샘플이 600nm에서의 OD 값으로 추정된 세포 수를 포함하도록 합니다.더욱 농축된 샘플을 70%A SW spot으로 추가 희석하여 필요한 조정을 수행하고, 각 배양액 10 µL를 필요한 항생제가 포함된 LBS 플레이트에 점적합니다. 피펫을 아가 표면 바로 위에 두고 손가락으로 잘 고정하여, 기울이지 않고 수직으로 점적하시기 바랍니다. 점적 부위가 균일하게 분포될 수 있도록 액체를 천천히 분사하며, 동일한 플레이트에 적절한 양성 및 음성 대조군을 함께 포함시키십시오.마이너 플레이트에서 주름진 콜로니 형성을 평가할 때, AFL 변이가 바이오필름 발달에 영향을 줄 수 있습니다. 이 절차에서 가장 어려운 점은 주름진 콜로니 형성의 시작 시점을 식별하는 것입니다. 때로는 발달이 상당히 진행된 후에야 비로소 뚜렷하게 나타나기도 합니다.주름진 콜로니(wrinkle colony) 발달의 시작 시점을 포착하기 위해, 특정 시간 범위 내에서 매시간 측정 지점을 설정합니다. 이는 발달이 시작된 후 이전 상태와 비교 분석하는 것을 가능하게 합니다. 점적 배양액이 고르게 분포된 상태를 유지하려면, 플레이트를 인큐베이터로 옮기기 전에 점적 부위를 완전히 건조시킨 후, 플레이트를 뒤집어 28 °C에서 배양하십시오.스폿 배양의 형태학적 특성을 평가하는 한 가지 방법은 엔드포인트 분석(endpoint assay)으로, 이는 스폿팅 후 미리 정해진 시점에 주름진 콜로니 형성 여부를 평가하는 과정을 포함합니다. 이는 주름진 콜로니 형성을 평가한 엔드포인트 분석의 대표적인 결과입니다. 스폿팅 40시간 후, 왼쪽에는 바이오필름을 형성하지 않는 Vibrio FII 균주가, 오른쪽에는 바이오필름을 형성하는 균주가 나타나 있습니다.종점 분석(endpoint assay)은 바이오필름 형성 능력이 심하게 결여되었거나 그럴 것으로 추정되는 균주에 유용합니다. 군락 형태를 평가하는 또 다른 분석법으로 시계열 분석(time course assay)이 있으며, 이는 점적 후 일정 기간 동안 주름진 군락 형성 여부를 평가하여 점적 후 경과 시간을 쉽게 추적할 수 있게 합니다. 타이머를 설정하여 시간을 측정하십시오.본 시연에서는 스폿팅 후 12~15시간부터 시작하여 성장하는 스폿의 형태를 매시간 모니터링하며, 이때 카메라가 장착된 해부 현미경과 이미지 획득 및 분석 소프트웨어를 사용합니다. 소프트웨어 프로그램을 통해 콜로니 형태를 관찰 및 기록하고, 주름진 콜로니 형성의 시작과 진행 과정을 평가합니다. 스폿팅된 배양물을 촬영하기 전에는 일반적으로 가장 선명한 이미지를 얻기 위해 페트리 접시의 뚜껑을 제거합니다.여기서는 투명한 유리 스테이지를 통해 아래쪽에서 냉광원을 사용하여 스폿을 조명하고, 위쪽에서 이미지를 캡처합니다. Vibrio fischeri 콜로니는 반투명하기 때문에 이러한 설정이 주름진 콜로니 발달을 이미징하는 데 최적입니다. 주름진 콜로니 발달을 가장 잘 시각화하려면, 발달 중인 바이오필름의 3차원 형태를 식별할 수 있도록 박테리아 콜로니 하단의 조명 강도와 반사 각도를 모두 조정하십시오.반점 모양의 콜로니와 주변 한천 배경 사이의 대비가 가장 뚜렷하게 나타나는 최적의 조명 조건을 결정하십시오. 카메라 뒷면에 있는 레버를 사용하여 실험 전 과정 동안 동일한 배율로 이미지를 수집하는 것이 중요합니다. 현미경의 접안렌즈에서 컴퓨터 화면으로 뷰를 전환하고, 화면을 조정하고, 적절하게 초점을 맞춘 다음 이미지를 캡처하십시오. 주름진 콜로니 형성의 시작과 발달 과정을 기록하기 위해 적절한 이미지를 캡처하십시오. 바이오필름의 발달이 더 이상 진행되지 않을 때 실험이 종료됩니다.획득한 실험이 종료되면, 각 균주 또는 조건에 따른 시간 경과별 패턴 발달을 시각화하기 위해 이미지들을 하나의 도표로 통합합니다. 접종 시점부터 주름진 군락(wrinkled colony) 형성의 시작까지 얼마만큼의 시간이 경과하는지 확인하십시오. 주름진 군락 형성의 시작은 패턴 및 3D 구조의 형성이 처음으로 뚜렷하게 나타나는 시점으로 정의합니다. 본 예시에서는 상단 패널에 표시된 바이오필름 형성 능력이 있는 Vibrio FII 대조군 균주의 경우, 12시간째에 바이오필름 형성의 시작이 뚜렷하게 나타납니다.하단 패널은 Vibrio FII 변이 균주의 대표 이미지로, 시간이 경과함에 따라 주름진 콜로니 형성 시작이 4시간 지연되어 접종 후 16시간에 바이오필름 형성이 시작됨을 보여줍니다. 40시간의 초기 시점에서는 균주 간의 미세한 차이가 관찰되지만, 주름진 콜로니 형성이 시작된 이후의 각 시점에서는 바이오필름 형성의 강도와 패턴이 서로 유사하게 보인다는 점에 유의하십시오. 주름진 콜로니의 발달 패턴을 확인하시기 바랍니다.구조는 패널 A에 표시된 것처럼 외부에서 내부로 발달하거나, 패널 B에 표시된 것처럼 내부에서 외부로 발달할 수 있습니다. 이러한 평가는 서로 다른 균주 또는 서로 다른 조건에서 형성된 바이오필름을 구별하는 메커니즘을 제공합니다. 바이오필름 형성의 두 번째 반정량적 측정법은 시간이 경과함에 따라 발달하는 콜로니의 직경 변화를 이용합니다. 상단 패널에 표시된 바와 같이, 대표적인 바이오필름 형성 능력 균주는 복잡성과 직경이 증가하는 콜로니를 형성합니다.반면, 하단 패널에 표시된 다른 균주는 바이오필름을 형성하지 않습니다. 마지막으로, 이 그림은 시간에 따른 콜로니 직경의 증가를 그래프로 나타낸 것입니다. 동일한 두 균주 중에서 바이오필름 형성 능력이 있는 균주는 흰색 원으로 표시되었습니다.바이오필름을 형성하지 않는 균주는 검은색 사각형으로 표시되었습니다. 이 분석 결과, 바이오필름 형성 능력이 있는 콜로니의 크기가 바이오필름 음성 콜로니보다 더 빠르게 증가했으며, 최종 시점에서는 두 그룹 간의 크기가 거의 두 배 정도 차이 났음을 확인했습니다. 이 절차를 수행할 때는 각 균주를 주의 깊게 스폿팅하고, 각 균주의 초기 주름진 콜로니 형성 과정을 기록하는 것이 중요합니다.본 프로토콜을 마친 후, 관여하는 과정과 바이오필름 형성에 관한 추가적인 의문을 해결하기 위해 iCal 분석이나 결정 전체 염색과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

분석은 박테리아와 곰팡이의 초기 biofilm 형성을 측정하는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 미생물의 biofilm 형성에 대한 하층으로 microtiter 접시를 사용하고, biofilm은 크리스탈 바이올렛 스트레인을 사용하여 시각입니다. 분석도 초기 biofilm 형성에 대한 질적 양적 분석 또는를 제공합니다.

Microtiter 디시 Biofilm 형성 분석

이 문서는 8 자 챔버 슬라이드 내에서 성장 세균 biofilm의 형성과 시각화를위한 절차를...

8 잘 회의소 슬라이드에서 체외의 Biofilm 형성에

출처: Bucher, T. 외, 『B. subtilis 바이오필름 연구를 위한 소분자 바이오필름 억제제 특성화 모델로서의 방법론』. J. Vis. 경험(2016)이 영상은 고해상도 이미징을 위해 성숙한 박테리아 바이오필름 집락을 준비하는 과정을 보여줍니다. 고정, 탈수, 장착, 금속 코팅 단계를 다루어 바이오필름 형태를 보존하고 시각화합니다.

형태학적 분석을 위한 박테리아 바이오필름 군락 준비

이 비디오는 생물막 형성을 평가하기 위한 고체상 부착 분석을 보여줍니다. 멀티웰 플레이트에서 담즙염이 보충된 매체의 박테리아는 고체 표면에 부착되어 생물막을 형성하며, 이는 결정 바이올렛 염색 및 에탄올 처리를 통한 비색법으로 확인됩니다.

생물막 형성을 평가하기 위한 고체상 부착 분석

생물막 내 3개의 세포 및 세포 외 구성 요소를 동시에 정량화하고 비교하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법론에는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경, 생물막 구조 분석 및 시각화 소프트웨어, 통계 분석 소프트웨어의 사용이 포함됩니다.

생물막의 세포 및 세포 외 성분의 동시 정량화

본 연구는 생물막 억제제와 Bacillus subtilis 다세포성에 미치는 영향을 연구하기 위한 재현 가능한 방법론의 개발을 제시합니다.

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이 프로토콜은 접종물의 준비, 크리스탈 바이올렛 염료를 사용한 마이크로타이터 플레이트의 생물막 정량화, 생물막의 생존 가능한 수 및 아시네토박터의 생물막 시각화에 대해 설명합니다.

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이 프로토콜은 결정-바이올렛 바이오매스 분석, 타임랩스 위상 차비 역학, 공초점 3D/매트릭스 매핑, SEM 초구조, 생체 내 햄스터 감염 모듈을 결합한 모듈형 BSL-2 워크플로우를 제공하여 렙토스피라 바이오필름의 기능적 역할을 배양, 정량, 특성화, 조사하여 실험실 간 돌연변이 및 반바이오필름 개입의 표준화된 평가를 가능하게 합니다.

렙토스피라 바이오필름의 정량적, 구조적, 기능적 분석을 위한 모듈식 워크플로우

배우세요 주름 식민지 형태를 활용한 세미정량적 바이오필름 형성 평가 방법입니다. 현미경 관찰로 세균의 3차원 구조 발달을 시간 경과에 따라 모니터링하여 다양한 균주 간 생물막 표현형을 비교 분석할 수 있습니다.

주름 식민지 개발을 사용하여 Biofilm 형성을 평가하기 위해 세미 양적 접근

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