주름 식민지 개발을 사용하여 Biofilm 형성을 평가하기 위해 세미 양적 접근

이 실험 절차의 전반적인 목표는 시간에 따른 주름진 콜로니 형성 과정을 평가함으로써 바이오필름 형성의 변화를 식별하고 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 관심 있는 박테리아 균주를 액체 배양액에서 배양합니다. 그 다음 단계로 배양액을 영양 한천 배지에 점적합니다.

다음으로, 반점들이 주름진 콜로니 형성의 시작을 나타내는 3차원 구조를 발달시키기 시작하는 시점을 확인하기 위해 시간에 따라 모니터링합니다. 콜로니 형태의 발달은 더 이상 변화가 보이지 않을 때까지 모니터링합니다. 최종적으로, 반점의 현미경 관찰을 통해 특정 균주 또는 특정 조건 하에서 시간에 따른 바이오필름 발달의 차이를 반정량적인 방식으로 보여줍니다.

기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 주름진 콜로니 형태의 발현을 통해 세균 바이오필름 형성의 반정량적 분석이 가능하다는 점입니다. 이 방법은 Vireo fishery의 바이오필름 형성에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, basc, slus, pseudomonas osa 및 vial cholera와 같은 다른 세균 시스템의 바이오필름 표현형 특성 분석에도 적용될 수 있습니다. 저희는 주름진 콜로니 형성 발현이 지연되는 세균 돌연변이체를 확인했을 때 처음으로 이 방법 아이디어를 얻었습니다.

바이오필름 형성은 일반적으로 세포 밀도와 성장 속도의 영향을 받습니다. 따라서 주름진 콜로니 형태를 평가하기 전에, 관심 균주의 성장 속도와 수율을 확인하여 성장 속도를 결정해야 합니다. 시간 경과에 따른 각 균주의 광학 밀도(OD) 증가량을 측정하고 성장 곡선을 그려 수율 또는 최종 세포 수를 결정하십시오.

세포 도말 분석법(cell plating assay)을 사용할 수 있습니다. 분석 대상인 박테리아 균주를 액체 배양한 후, 배양액을 희석하여 한천 배지에 도말합니다. 배양 후 생존 세포 수를 계산하여 여기에서 보는 것과 같이 그래프로 나타냅니다.

대조군과 관심 돌연변이체 사이의 가장 뚜렷한 차이를 나타낼 수 있는 최적의 스포팅(spotting) 조건을 확인하는 것 또한 중요합니다. 이를 위해 다양한 배지나 온도와 같은 여러 조건 및 지수 성장기 또는 정지기 등 서로 다른 성장 단계에서 액체 배양된 성장 균주를 스포팅하기 전에, 다양한 세포 밀도의 배양액 10 µL를 적절한 배지에 스포팅하고 콜로니 형태가 뚜렷해질 때까지 원하는 온도에서 배양하십시오. 이러한 방식으로 주어진 균주 세트 또는 조건에 대해 이 절차를 시작하기 위한 최적의 시작 OD를 결정할 수 있습니다.

한천 배지 플레이트의 v Fisher 안구 세포를 필요한 항생제가 포함된 5 mL의 LB 염 또는 LBS 배지에 접종하고, 28 °C에서 흔들어 밤새 배양합니다. 다음 날 아침, 세포를 1:100으로 희석하여 5 mL의 신선한 LBS 배지에 계대 배양하고, 세포가 600 nm에서 원하는 OD 값에 도달할 때까지 동일한 조건에서 배양합니다. Vibrio fii의 경우, OD가 약 0.2인 배양액에서 스팟을 생성할 때 최상의 결과가 얻어집니다. 그다음, 각 배양액 1 mL를 마이크로 원심분리관에 취해 최대 속도로 원심분리합니다.

1분 동안 흡입을 통해 상층액을 제거하고, 펠렛을 1mL의 멸균된 70% 인공 해수 또는 SW 원심분리관에 재현탁합니다. 이 세척 단계는 잔류 배지와 세포 외 성분을 제거하기 위한 것입니다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고 세척된 펠렛을 1mL의 70% ASW에 재현탁하여, 각 샘플이 600nm에서의 OD 값으로 추정된 세포 수를 포함하도록 합니다.

더욱 농축된 샘플을 70%A SW spot으로 추가 희석하여 필요한 조정을 수행하고, 각 배양액 10 µL를 필요한 항생제가 포함된 LBS 플레이트에 점적합니다. 피펫을 아가 표면 바로 위에 두고 손가락으로 잘 고정하여, 기울이지 않고 수직으로 점적하시기 바랍니다. 점적 부위가 균일하게 분포될 수 있도록 액체를 천천히 분사하며, 동일한 플레이트에 적절한 양성 및 음성 대조군을 함께 포함시키십시오.

마이너 플레이트에서 주름진 콜로니 형성을 평가할 때, AFL 변이가 바이오필름 발달에 영향을 줄 수 있습니다. 이 절차에서 가장 어려운 점은 주름진 콜로니 형성의 시작 시점을 식별하는 것입니다. 때로는 발달이 상당히 진행된 후에야 비로소 뚜렷하게 나타나기도 합니다.

주름진 콜로니(wrinkle colony) 발달의 시작 시점을 포착하기 위해, 특정 시간 범위 내에서 매시간 측정 지점을 설정합니다. 이는 발달이 시작된 후 이전 상태와 비교 분석하는 것을 가능하게 합니다. 점적 배양액이 고르게 분포된 상태를 유지하려면, 플레이트를 인큐베이터로 옮기기 전에 점적 부위를 완전히 건조시킨 후, 플레이트를 뒤집어 28 °C에서 배양하십시오.

스폿 배양의 형태학적 특성을 평가하는 한 가지 방법은 엔드포인트 분석(endpoint assay)으로, 이는 스폿팅 후 미리 정해진 시점에 주름진 콜로니 형성 여부를 평가하는 과정을 포함합니다. 이는 주름진 콜로니 형성을 평가한 엔드포인트 분석의 대표적인 결과입니다. 스폿팅 40시간 후, 왼쪽에는 바이오필름을 형성하지 않는 Vibrio FII 균주가, 오른쪽에는 바이오필름을 형성하는 균주가 나타나 있습니다.

종점 분석(endpoint assay)은 바이오필름 형성 능력이 심하게 결여되었거나 그럴 것으로 추정되는 균주에 유용합니다. 군락 형태를 평가하는 또 다른 분석법으로 시계열 분석(time course assay)이 있으며, 이는 점적 후 일정 기간 동안 주름진 군락 형성 여부를 평가하여 점적 후 경과 시간을 쉽게 추적할 수 있게 합니다. 타이머를 설정하여 시간을 측정하십시오.

본 시연에서는 스폿팅 후 12~15시간부터 시작하여 성장하는 스폿의 형태를 매시간 모니터링하며, 이때 카메라가 장착된 해부 현미경과 이미지 획득 및 분석 소프트웨어를 사용합니다. 소프트웨어 프로그램을 통해 콜로니 형태를 관찰 및 기록하고, 주름진 콜로니 형성의 시작과 진행 과정을 평가합니다. 스폿팅된 배양물을 촬영하기 전에는 일반적으로 가장 선명한 이미지를 얻기 위해 페트리 접시의 뚜껑을 제거합니다.

여기서는 투명한 유리 스테이지를 통해 아래쪽에서 냉광원을 사용하여 스폿을 조명하고, 위쪽에서 이미지를 캡처합니다. Vibrio fischeri 콜로니는 반투명하기 때문에 이러한 설정이 주름진 콜로니 발달을 이미징하는 데 최적입니다. 주름진 콜로니 발달을 가장 잘 시각화하려면, 발달 중인 바이오필름의 3차원 형태를 식별할 수 있도록 박테리아 콜로니 하단의 조명 강도와 반사 각도를 모두 조정하십시오.

반점 모양의 콜로니와 주변 한천 배경 사이의 대비가 가장 뚜렷하게 나타나는 최적의 조명 조건을 결정하십시오. 카메라 뒷면에 있는 레버를 사용하여 실험 전 과정 동안 동일한 배율로 이미지를 수집하는 것이 중요합니다. 현미경의 접안렌즈에서 컴퓨터 화면으로 뷰를 전환하고, 화면을 조정하고, 적절하게 초점을 맞춘 다음 이미지를 캡처하십시오. 주름진 콜로니 형성의 시작과 발달 과정을 기록하기 위해 적절한 이미지를 캡처하십시오. 바이오필름의 발달이 더 이상 진행되지 않을 때 실험이 종료됩니다.

획득한 실험이 종료되면, 각 균주 또는 조건에 따른 시간 경과별 패턴 발달을 시각화하기 위해 이미지들을 하나의 도표로 통합합니다. 접종 시점부터 주름진 군락(wrinkled colony) 형성의 시작까지 얼마만큼의 시간이 경과하는지 확인하십시오. 주름진 군락 형성의 시작은 패턴 및 3D 구조의 형성이 처음으로 뚜렷하게 나타나는 시점으로 정의합니다. 본 예시에서는 상단 패널에 표시된 바이오필름 형성 능력이 있는 Vibrio FII 대조군 균주의 경우, 12시간째에 바이오필름 형성의 시작이 뚜렷하게 나타납니다.

하단 패널은 Vibrio FII 변이 균주의 대표 이미지로, 시간이 경과함에 따라 주름진 콜로니 형성 시작이 4시간 지연되어 접종 후 16시간에 바이오필름 형성이 시작됨을 보여줍니다. 40시간의 초기 시점에서는 균주 간의 미세한 차이가 관찰되지만, 주름진 콜로니 형성이 시작된 이후의 각 시점에서는 바이오필름 형성의 강도와 패턴이 서로 유사하게 보인다는 점에 유의하십시오. 주름진 콜로니의 발달 패턴을 확인하시기 바랍니다.

구조는 패널 A에 표시된 것처럼 외부에서 내부로 발달하거나, 패널 B에 표시된 것처럼 내부에서 외부로 발달할 수 있습니다. 이러한 평가는 서로 다른 균주 또는 서로 다른 조건에서 형성된 바이오필름을 구별하는 메커니즘을 제공합니다. 바이오필름 형성의 두 번째 반정량적 측정법은 시간이 경과함에 따라 발달하는 콜로니의 직경 변화를 이용합니다. 상단 패널에 표시된 바와 같이, 대표적인 바이오필름 형성 능력 균주는 복잡성과 직경이 증가하는 콜로니를 형성합니다.

반면, 하단 패널에 표시된 다른 균주는 바이오필름을 형성하지 않습니다. 마지막으로, 이 그림은 시간에 따른 콜로니 직경의 증가를 그래프로 나타낸 것입니다. 동일한 두 균주 중에서 바이오필름 형성 능력이 있는 균주는 흰색 원으로 표시되었습니다.

바이오필름을 형성하지 않는 균주는 검은색 사각형으로 표시되었습니다. 이 분석 결과, 바이오필름 형성 능력이 있는 콜로니의 크기가 바이오필름 음성 콜로니보다 더 빠르게 증가했으며, 최종 시점에서는 두 그룹 간의 크기가 거의 두 배 정도 차이 났음을 확인했습니다. 이 절차를 수행할 때는 각 균주를 주의 깊게 스폿팅하고, 각 균주의 초기 주름진 콜로니 형성 과정을 기록하는 것이 중요합니다.

본 프로토콜을 마친 후, 관여하는 과정과 바이오필름 형성에 관한 추가적인 의문을 해결하기 위해 iCal 분석이나 결정 전체 염색과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.