주름 식민지 개발을 사용하여 Biofilm 형성을 평가하기 위해 세미 양적 접근

이 절차의 전반적인 목표는 시간 경과에 따른 주름진 집락 형성의 발달을 평가하여 생물막 형성의 변화를 식별하고 측정하는 것입니다. 이는 액체 배양에서 관심 있는 박테리아 균주를 먼저 성장시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 영양 한천에서 배양물을 발견하는 것입니다.

다음으로, 주름진 군체 형성의 시작을 나타내는 3차원 구조가 발달하기 시작하는 시간을 식별하기 위해 시간이 지남에 따라 반점을 모니터링합니다. 더 이상의 변화가 시각화되지 않을 때까지 군체 형태학의 발달을 모니터링합니다. 궁극적으로, 반점의 현미경 검사는 특정 균주에 의해 또는 특정 조건 하에서 시간이 지남에 따라 반정량적인 방식으로 생물막 발달의 차이를 보여주는 데 사용됩니다.

기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 주름진 집락 형태학의 개발을 사용하여 박테리아 생물막 형성에 대한 반정량 분석이 가능하다는 것입니다. 이 방법은 Vireo 어업의 생물막 형성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 basc, slus, pseudomonas osa 및 vial cholera와 같은 다른 박테리아 시스템에서 생물막 표현형의 특성화에도 적용할 수 있습니다. 우리는 주름진 군체 형성의 발달을 지연시키는 박테리아 돌연변이를 확인했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다.

생물막 형성은 일반적으로 세포 밀도와 성장 속도의 영향을 받습니다. 따라서 주름진 집락 형태를 평가하기 전에 관심 균주의 성장률과 수율을 결정하여 성장률을 결정해야 합니다. 시간 경과에 따른 각 균주의 광학 밀도 또는 OD 증가를 측정하고 성장 곡선을 그려 수율 또는 최종 세포 수를 결정합니다.

세포 도금 분석을 사용할 수 있습니다. 관심 박테리아 균주는 액체 배양에서 성장한 다음 배양물의 희석액을 한천 플레이트에 도금합니다. 배양 후, 생존 가능한 세포의 수가 계산되어 여기에 표시된 것처럼 그래픽으로 표시됩니다.

또한 관심 있는 대조군과 돌연변이 사이에 가장 뚜렷한 차이를 드러내는 조건을 발견하기 위한 최상의 조건을 식별하는 것도 중요합니다. 이를 달성하기 위해 다양한 배지 또는 온도와 같은 다양한 조건, 지수 또는 고정상과 같은 다양한 성장 단계에서 액체 배양에서 성장 균주를 발견하기 전에 다양한 세포 밀도의 배양액 10마이크로리터를 적절한 배지에 스위팅하고 콜로니 형태가 분명해질 때까지 원하는 온도를 배양합니다. 이러한 방식으로, 주어진 변형률 또는 조건 세트에 대한 최적의 시작 OD를 결정하여 이 절차를 시작할 수 있습니다.

한천 플레이트에서 5 밀리리터의 LB 염 또는 필요한 항생제를 함유 한 LBS 배지에 v Fisher 안구 세포를 접종하고, 다음 날 아침 섭씨 28도에서 밤새 흔들면서 배양하고, 5 밀리리터의 신선한 LBS 배지에 1-100 희석으로 세포를 계량 배양하고, 세포가 600 나노 미터에서 원하는 OD에 도달 할 때까지 동일한 조건에서 배양합니다. Vibrio fii의 경우 OD가 약 0.2인 배양물에서 반점이 생성될 때 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 다음으로 각 배양액 1ml를 마이크로 퍼지 튜브와 원심분리기에 최대 속도로

1분 동안 흡인에 의해 supinate를 제거하고 펠릿을 1ml의 멸균 70% 인공 해수 또는 SW 원심분리기에 재현탁시킵니다. 세포는 다시 말하지만, 이 세척 단계는 잔류 배지와 세포 외 구성 요소를 제거합니다. 원심분리 후, supinate를 제거하고 세척된 펠릿을 1ml의 70%A SW에 재현탁시켜 각 샘플에 OD.At 600나노미터로 추정된 세포 수가 포함되도록 합니다.

더 농축된 샘플을 추가 70%A SW 스폿, 각 배양액 10마이크로리터로 희석하여 필요한 항생제가 포함된 LBS 플레이트에 필요한 조정을 수행합니다. 한천 표면 바로 위에 있는 손가락으로 피펫을 연구하고 비스듬하지 않고 수직으로 찾으십시오. 스폿의 균일한 분포를 위해 액체를 천천히 배출하고 동일한 플레이트에 적절한 양극 및 음성 대조군을 포함합니다.

주름진 콜로니 형성을 마이너 플레이트로 평가할 때 AFL 변이는 생물막 발달에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 절차의 가장 어려운 측면은 주름진 군체 형성의 시작을 식별하는 것입니다. 때로는 개발이 진행된 후에야 명백합니다.

주름 군집 발달의 시작을 포착하기 위해 우리는 특정 기간 내에서 시간별 시점을 취합니다. 이것은 또한 개발이 시작된 후에 돌아가서 비교할 수 있도록 합니다. 점박이 배양액이 고르게 분포되도록 하려면 플레이트를 인큐베이터로 옮기기 전에 스팟을 건조시키고 플레이트를 뒤집어 섭씨 28도에서 배양합니다.

점박이 배양물의 형태를 평가하는 한 가지 방법은 주름진 집락 형성과 점유 후 미리 결정된 시점에 대한 평가를 포함하는 종말점 분석을 사용하는 것입니다. 이는 주름진 콜로니 형성을 평가한 종말점 분석의 대표적인 결과입니다. 발견 후 40시간이 지난 후, Vibrio FII의 비생물막 형성 균주가 왼쪽에 표시되고 생물막 형성 균주가 오른쪽에 표시됩니다.

종말점 분석은 생물막 형성에서 심각한 결함을 나타내거나 제안된 균주에 유용합니다. 군집 형태학을 평가하기 위한 또 다른 분석법은 발견 후 시간을 쉽게 추적하기 위해 발견 후 일정 기간 동안 주름진 집락 형성을 평가하는 시간 경과 분석입니다. 카운트업할 타이머를 설정합니다.

이 시연에서는 성장 지점의 형태를 12시간에서 15시간 후부터 매시간 모니터링하여 카메라가 부착된 해부 스코프를 발견하고 이미지 획득 및 이미지 분석을 수행합니다. 소프트웨어 프로그램은 군체 형태를 관찰 및 문서화하고 주름진 군체 형성의 시작과 진행을 평가하는 데 사용됩니다. 점박이 배양물을 이미징하기 전에 일반적으로 가장 선명한 이미지를 제공하기 위해 페트리 플레이트의 뚜껑을 제거합니다.

여기에서 스팟은 차가운 광원이 있는 투명한 유리 스테이지를 통해 아래에서 조명되고 이미지는 위에서 캡처됩니다. 이 설정은 비브리오 피셔 눈 군집이 반투명하기 때문에 주름진 군집 발달을 이미징하는 데 최적입니다. 주름진 군집 발달을 가장 잘 시각화하려면 발달 중인 생물막의 3차원 형태를 식별할 수 있도록 박테리아 군집 아래의 조명 강도와 반사 각도를 모두 조정하십시오.

점박이 군체와 주변 한천 배경 사이에 가장 강한 대비를 제공하는 최적의 조명 조건을 결정합니다. 카메라 뒷면에 있는 레버를 사용하여 실험 전반에 걸쳐 이미지를 수집할 때 동일한 배율을 사용하고, 현미경의 접안렌즈에서 컴퓨터 화면으로 보기를 전환하고, 보기를 조정하고, 그에 따라 초점을 맞춘 다음 이미지를 캡처하고, 주름진 군체 형성의 시작과 발달을 문서화하기 위해 적절한 이미지를 캡처하는 것이 중요합니다. 실험의 끝은 생물막의 더 이상의 발달이 없을 때 발생합니다.

획득한 실험이 끝나면 이미지가 그림으로 통합되어 각 변형주 또는 조건에 대한 시간 경과에 따른 패턴 발달을 시각화합니다. 접종 시점부터 주름진 집락 형성이 시작되는 시간까지 얼마나 많은 시간이 경과하는지, 주름진 집락 형성의 시작은 패터닝 및 3D 구조의 형성이 처음으로 명백한 시점에서 정의됩니다. 이 예시에서, 생물막 형성의 시작은 상단 패널에 묘사된 Vibrio FII의 생물막 유능 제어 균주에 대해 12시간에 분명합니다.

하단 패널에서는 Vibrio FII의 돌연변이 균주의 대표 이미지로, 시간이 지남에 따라 주름진 집락 형성이 시작되는 데 4시간 지연을 보이며 접종 후 16시간이 지나면 생물막 형성이 시작됩니다. 이러한 균주 간의 미묘한 차이는 40시간의 초기 시점에서 관찰되지만, 주름진 콜로니 형성이 시작된 후 각 시점에서 균주가 생물막 형성의 강도와 패턴화에서 유사하게 보입니다. 주름진 군체 발달 패턴에 주목해야 합니다.

아키텍처는 패널 A에 예시된 바와 같이 외부에서 내부로 발달할 수 있거나, 패널 B에 예시된 바와 같이 내부로부터 외부로 발전할 수 있습니다. 이 평가는 상이한 균주 또는 상이한 조건 하에서 형성된 생물막을 구별하는 메커니즘을 제공합니다. 생물막 형성에 대한 두 번째 반(半)정량적 측정은 시간이 지남에 따라 발달 중인 군체의 변화하는 군체 직경을 사용합니다. 상단 패널에서 볼 수 있듯이 대표적인 생물막 역량 균주가 형성되며, 이는 복잡성과 직경이 증가하는 콜로니입니다.

대조적으로, 하단 패널에 표시된 다른 균주는 생물막을 형성하지 않습니다. 마지막으로, 이 그림은 시간이 지남에 따라 군체 직경의 증가를 그래픽으로 표현한 것입니다. 동일한 두 균주에 의해 생물막 역량 균주는 흰색 원으로 표시됩니다.

생물막을 형성하지 않는 균주는 검은 색 사각형으로 표시됩니다. 이 분석은 생물막 유능 콜로니의 크기가 바이오필름 음성 콜로니보다 더 큰 비율로 증가한다는 것을 밝혔으며, 종료 시점에서는 둘이 거의 2배 차이를 보였습니다. 이 절차를 수행하는 동안 각 균주를 주의 깊게 발견하고 각 균주에 대한 스타터 주름진 집락 형성을 문서화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 프로토콜에 따라 iCal 분석 또는 결정 와이드 염색과 같은 다른 방법을 수행하여 공정 및 관련 및 생물막 형성에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.