Intraluminal MCAO의 마우스 모델 : Cresyl 보라 착색에 의한 뇌 경색 평가

이 절차의 전반적인 목표는 마우스의 허혈성 뇌졸중을 모방하는 것입니다. 첫째, 총경동맥은 임시로 결찰되는 반면, 외부 경동맥은 가능한 한 원위부로 영구적으로 결찰됩니다. 약간 팽팽한 또 다른 임시 봉합사가 분기점 위의 ECA에 배치됩니다.

두 번째 단계는 출혈을 방지하기 위해 역동작 핀셋을 사용하여 내부 경동맥을 고정하는 것입니다. 그런 다음 영구 합자와 임시 합자 사이의 ECA를 자릅니다. 다음으로, 실리콘 코팅된 모노필라멘트가 ECA에 도입됩니다.

그런 다음 ECA를 반전시켜 중대뇌동맥의 기저부를 포함할 때까지 모노필라멘트를 ICA에 도입합니다. 1시간 후, 인간의 혈전색전증 발톱을 용해한 후 혈류가 회복되는 것을 모방하기 위해 모노필라멘트를 제거하여 혈류가 회복됩니다. 궁극적으로, T-M-C-A-O의 성공과 경색의 중증도를 반영하는 신경학적 결손은 재관류 직후와 재관류 후 다른 시기를 평가할 수 있습니다.

NIH의 시안 이미지 소프트웨어는 크레탈 바이올렛으로 염색된 대표적인 뇌 절편의 경색 부피를 계산하는 데 사용됩니다. 인트라루미날 필라멘트 기법을 사용한 일시적인 중대뇌동맥 폐색의 주요 장점 중 하나는 혈류가 회복된 환자의 허혈성 뇌졸중을 모방한다는 점이며, 마우스에서 이 절차의 개발은 라벨 유전학 도구를 사용하여 표적 단백질의 역할을 식별할 수 있는 가능성을 제공합니다. 뇌졸중의 경우, 일과성 중대뇌동맥 폐색은 생후 2-3개월 된 수컷 C, 57세, 검은색 6마리, 체중 22-28g의 생쥐에게 시행됩니다.

이 프로토콜은 경색 부피의 재현성을 높이기 위해 IRCM 생명윤리 관리 위원회(IRCM Bioethics Care Committee)의 승인을 받았습니다. 우리는 Doco Corporation의 재사용 가능한 12mm 길이, 6oh 실리콘 코팅 모노필라멘트를 사용하고 있습니다. 수술 2시간 전.

마우스에 복강내 부프레노르핀을 킬로그램당 0.03mg의 용량으로 주입합니다. 절차를 시작하려면 5%의 불소로 마우스를 마취하고 2.5%ISO 불소로 마취를 유지하고 가열 패드를 사용하여 수술 중 마우스 체온을 일정하게 유지하고 70% 에탄올 또는 베타딘으로 마우스의 고사리 피부를 소독합니다. 그런 다음 목의 정중선을 절개하고 실체 현미경으로 연조직을 분리하십시오.

기관을 노출시키기 위해 쥐의 목을 퉁명스럽게 절개합니다. 다음으로 근육을 수축시켜 경동맥을 찾습니다. 주변 조직에서 왼쪽 총경동맥을 조심스럽게 절개합니다.

동맥 주위에 20mm 세그먼트로 자른 임시 5 oh 실크 봉합사를 놓습니다. 미주신경이 손상되지 않도록 주의한다. 다음으로, 좌측 내부 총경동맥(ICA)과 외부 총경동맥(ECA)의 분기점을 분리하고 ECA 또는 ECA를 통해 ECA 주위에 가능한 한 원위부로 영구 봉합사를 배치합니다.

그리고 분기점 위의 ECA에 대한 또 다른 임시 봉합사. 그런 다음 출혈을 방지하기 위해 리버스 액션 핀셋을 사용하여 왼쪽 ICA를 클립합니다. 다시 말하지만, 미주신경에 해를 끼치지 않도록 매우 주의해야 한다.

ECA와 ICA로 분기하기 전에, 그리고 이전에 배치된 영구 봉합사와 임시 봉합사 사이에 ECA에 작은 구멍을 자릅니다. 다음으로, 12mm 6 oh 실리콘 코팅 모노필라멘트 봉합사를 ECA에 도입하고 ECA를 완전히 절단한 다음 모노필라멘트를 ICA로 반전시킵니다. 출혈을 방지하기 위해 봉합사를 단단히 묶고 리버스 액션 핀셋을 제거합니다.

그런 다음 모노필라멘트가 MCA 스톱의 바닥을 막을 때까지 모노필라멘트를 Willis의 원에 삽입합니다. ECA와 CCA의 분기점을 약 9-10mm 넘어 삽입됩니다. 일반적으로 모노필라멘트가 막혀 더 이상 움직일 수 없습니다.

테고 구개 동맥을 관통하지 않도록 주의하십시오. 필라멘트를 제자리에 고정하기 위해 ECA의 봉합사를 단단히 묶습니다. 이제 자동 클립 상처 닫힘 시스템으로 피부를 닫으십시오.

1ml의 식염수를 피하로 주입하고 생쥐를 적외선 가열 램프 아래에 놓고 폐색 후 기간(60분) 동안 진행합니다. 이전과 같이 마우스를 마취하고 자동 클립을 제거하고 ECA의 봉합사를 약간 열어 모노필라멘트가 빠져나가고 혈액이 재관류할 수 있도록 합니다. 그런 다음 출혈을 방지하기 위해 ECA의 임시 봉합사를 영구적으로 묶습니다.

스트로크 후 1시간 후에 모노필라멘트를 빼내고 재사용을 위해 보관하십시오. 다음으로, 혈액이 재순환할 수 있도록 CCA의 임시 봉합사를 제거합니다. 상처를 봉합하고 피하로 합니다.

생쥐에 1ml의 식염수를 더 주입합니다. 동물이 이동성을 되찾았는지 확인한 후 동물을 다시 우리에 넣고 케이지의 절반을 가열 패드에 올려 놓아 쥐가 환경을 선택할 수 있도록 합니다. 수술 후 12시간 후, 생쥐는 모든 가짜 수술에 대해 부프레노르핀을 한 번 더 투여합니다.

수술 후 모노필라멘트를 삽입하지 않는다는 점을 제외하고는 모든 절차가 동일합니다. 신경학적 결손은 T-M-C-A-O의 성공을 확인하고 효율성을 결정하기 위해 평가됩니다.1, 24, 48 및 72시간에 마우스의 신경학적 결손을 다음과 같이 6점 척도로 관류 후 0은 정상, 1은 경증과 같으며 꼬리로 집었을 때 일관되지 않은 말림이 있거나 없이 회전합니다. 50% 이상이 반대쪽 쪽으로 컬을 시도합니다.

2개는 50% 이상의 경미하고 일관된 컬링이 반대쪽 쪽으로 컬링을 시도합니다. 3은 일관되고 강하며 즉각적인 컬링과 같습니다. 마우스가 1-2초 이상 말린 자세를 유지합니다.

코가 꼬리에 거의 닿을 정도로. 4는 심한 컬링과 같습니다. 배럴로 진행, 걷기 또는 쓰기의 상실 반사 5는 혼수 상태 또는 마운드와 같습니다.

PBS 용액으로 관류한 후 isop pentane에서 뇌를 빠르게 바람을 쐬고 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 쥐의 뇌에는 계획된 면역조직화학 연구에 따라 4%파라폼 알데히드가 관류될 수도 있습니다. 다음으로, 저온 유지 장치를 사용하여 30개의 슬라이드를 사용하여 17개의 미크론 코로나 뇌 절편을 절단합니다.

같은 슬라이드에 30개마다 한 섹션을 배치합니다. 그런 다음 첫 번째와 15번째 슬라이드를 크레탈 바이올렛으로 염색합니다. 보다 정확한 부상 부피 추정을 위해 NIH의 Scion 이미지와 같은 이미지 분석 시스템을 사용하여 좌뇌 및 우뇌 반구에서 흰색으로 보이는 경색 영역인 병변 델리를 평가합니다.

모든 뇌 절편에 대해 이 D 제한을 반복합니다. 경색 부피를 임의의 단위로 계산하고 각 섹션에 대한 반대쪽 비병변 영역의 백분율로 표현합니다. 다른 슬라이드는 면역조직화학 연구를 위해 섭씨 영하 80도로 유지합니다.

신경 점수 평가는 내강 내 시술을 받은 저에서 T-M-C-A-O의 성공을 확인합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 일관되고 강하며 중간 정도의 말림이 관찰되며 마우스는 코가 꼬리에 거의 닿는 상태에서 1-2초 이상 웅크리고 있는 자세를 유지합니다. 우리의 실험에서, 모든 쥐는 적어도 경미하고 일관된 컬링을 보였는데, 이는 테스트 기간 동안 2의 신경 점수에 해당합니다.

Kressel 바이올렛 염색은 뇌 경색의 정도를 평가하기 위해 수행되었습니다. 여기에 표시된 T-M-C-A-O에 따라 재관류 후 72시간 후에 능률 보라색으로 염색된 쥐 뇌의 대표적인 관상 절편. 경색 영역, 주로 선조체와 피질 및 인접한 뇌 영역은 표시되어 있으며, 볏에 의해 염색되지 않았기 때문에 흰색으로 나타납니다.

여기에 표시된 보라색은 부상 부피(injury volume)로, 좌반구의 반대쪽 비병변 부위(contralateral non lesioned area)의 백분율로 표현된 우반구의 흰색 부분입니다. 허혈성 뇌졸중 후 C 57 흑인 6 마리의 수컷 마우스의 경색 부피는 목줄이 없는 반구의 약 70%를 나타냅니다. 이 절차는 강력한 병변 재현성을 제공합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 마우스에서 일과성 허혈성 뇌졸중을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한, 뇌의 부피를 측정하는 퀴즈 바이올 접근 방식은 면역 화학으로 관련 마커를 테스트 할 수있는 많은 자료를 보유하는 큰 이점을 제공합니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.