Intraluminal MCAO의 마우스 모델 : Cresyl 보라 착색에 의한 뇌 경색 평가

이 실험 절차의 전반적인 목표는 마우스에서 허혈성 뇌졸중을 모사하는 것입니다. 먼저, 총경동맥을 일시적으로 결찰하고, 외경동맥은 가능한 한 원위부에서 영구적으로 결찰합니다. 그 다음, 분지점 위쪽의 외경동맥에 약간 조이는 형태로 또 다른 일시적 봉합사를 배치합니다.

두 번째 단계는 출혈을 방지하기 위해 리버스 액션 핀셋(reverse action tweezers)을 사용하여 내경동맥을 클램핑하는 것입니다. 그다음 영구 결찰사와 임시 결찰사 사이의 외경동맥(ECA)을 절단합니다. 이어서 실리콘 코팅 모노필라멘트를 외경동맥(ECA) 내로 삽입합니다.

그런 다음 ECA를 반전시켜 ICA로 모노필라멘트를 삽입하며, 중대뇌동맥의 기저부까지 포함되도록 합니다. 1시간 후, 인간의 혈전색전성 폐쇄 용해 후 혈류 복원을 모사하기 위해 모노필라멘트를 제거하여 혈류를 재개합니다. 최종적으로 T-M-C-A-O의 성공 여부와 경색의 중증도를 반영하는 신경학적 결손을 재관류 직후 및 재관류 후 서로 다른 시점에서 평가할 수 있습니다.

NIH의 Cyan 이미지 소프트웨어를 사용하여 크레실 바이올렛(cresyl Violet)으로 염색된 대표적인 뇌 절편의 경색 부피를 계산합니다. 관강 내 필라멘트 기법을 이용한 일시적 중대뇌동맥 폐쇄의 주요 장점 중 하나는 혈류 복원과 함께 환자의 허혈성 뇌졸중을 모사한다는 것이며, 마우스에서 이 절차를 발전시키면 표적 단백질의 역할을 확인하기 위해 유전자 표지 도구를 사용할 수 있는 가능성을 제공합니다. 뇌졸중 모델링을 위해, 체중 22~28g 사이의 2~3개월령 수컷 C57BL/6 마우스를 대상으로 일시적 중대뇌동맥 폐쇄를 수행합니다.

본 프로토콜은 경색 부피의 재현성을 높이기 위해 IRCM 생명윤리 심의위원회의 승인을 받았습니다. 당사는 Doco Corporation의 12 mm 길이, 6-0 실리콘 코팅 모노필라멘트를 재사용하여 사용하고 있습니다. 수술 2시간 전.

마우스의 복강 내에 buprenorphine을 0.03 milligrams per kilogram의 용량으로 주입합니다. 절차를 시작하려면 5% isof fluorine으로 마우스를 마취하고 2.5% ISO fluorine으로 마취 상태를 유지하며, 수술 중 마우스의 체온을 일정하게 유지하기 위해 가열 패드를 사용하고, 70% ethanol 또는 Betadine으로 마우스의 피부를 소독합니다. 그 다음, 목 부위에 정중선 절개를 가하고 실체 현미경 하에서 연조직을 벌려줍니다.

기관을 노출시키기 위해 마우스의 목 부위를 둔탁하게 절개합니다. 다음으로, 근육을 견인하여 경동맥의 위치를 찾습니다. 주변 조직으로부터 왼쪽 총경동맥을 조심스럽게 박리합니다.

동맥 주변에 20 mm 길이로 자른 5-0 실크 봉합사를 임시로 배치합니다. 이때 미주신경이 손상되지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 왼쪽 내경동맥(ICA)과 외경동맥(ECA)의 분지점을 분리하고, 외경동맥의 가능한 원위부에 영구 봉합사를 배치합니다.

그 다음 분지점 위의 ECA에 또 다른 임시 봉합사를 배치합니다. 그런 다음 출혈을 방지하기 위해 리버스 액션 핀셋을 사용하여 왼쪽 ICA를 클립으로 집습니다. 이때 미주신경이 손상되지 않도록 각별히 주의하십시오.

ECA와 ICA로 갈라지는 분지점 이전이자 앞서 배치한 영구 및 임시 봉합사 사이의 ECA에 작은 구멍을 냅니다. 다음으로, 12 mm 6-0 실리콘 코팅 모노필라멘트 봉합사를 ECA에 삽입하여 ECA를 완전히 절단하고 모노필라멘트를 ICA 쪽으로 반전시켜 넣습니다. 출혈을 방지하기 위해 봉합사를 단단히 묶고 역방향 핀셋을 제거합니다.

그런 다음 모노필라멘트를 윌리스 서클(circle of Willis) 내부로 삽입하여 모노필라멘트가 MCA 기저부를 폐쇄할 때까지 밀어 넣습니다. 삽입 깊이는 ECA와 CCA 분지점으로부터 약 9~10 mm 너머까지입니다. 일반적으로 모노필라멘트가 막히게 되어 더 이상 이동할 수 없게 됩니다.

입천장동맥(tego palatine artery)을 천자하지 않도록 주의하십시오. 필라멘트를 제자리에 고정하기 위해 외경동맥(ECA)의 봉합사를 단단히 묶습니다. 이제 자동 클립 상처 폐쇄 시스템으로 피부를 봉합합니다.

생리식염수 1 mL를 피하 주사하고, 60분 동안의 재관류 기간 동안 마우스를 적외선 가열 램프 아래에 둡니다. 이전과 동일하게 마우스를 마취한 후 오토 클립을 제거하고, 외부 경동맥(ECA)의 봉합사를 약간 열어 모노필라멘트가 빠져나오고 혈류가 다시 흐르도록 합니다. 그 후, 혈액 손실을 방지하기 위해 외부 경동맥(ECA)의 임시 봉합사를 영구적으로 묶습니다.

뇌졸중 유도 1시간 후, 모노필라멘트를 제거하여 재사용을 위해 보관합니다. 다음으로, 혈류가 다시 순환할 수 있도록 CCA의 임시 봉합사를 제거합니다. 상처 부위와 피하 조직을 봉합합니다.

마우스에 생리식염수 1 mL를 추가로 주입합니다. 동물이 운동 능력을 회복했는지 확인한 후, 케이지로 다시 옮기고 케이지의 절반을 가열 패드 위에 배치하여 마우스가 스스로 환경을 선택할 수 있도록 합니다. 수술 12시간 후, 모든 가짜 수술(sham operation)군 마우스에 buprenorphine을 추가로 투여합니다.

단일 필라멘트를 수술 후 삽입하지 않는다는 점을 제외한 모든 절차는 동일합니다. T-M-C-A-O의 성공 여부를 확인하고 효율성 점수를 결정하기 위해 신경학적 결손을 평가하며, 관류 후 1, 24, 48, 72시간에 다음과 같은 6점 척도로 마우스의 신경학적 결손을 측정합니다. 0점은 정상, 1점은 꼬리를 들어 올렸을 때 불규칙한 말림 유무와 상관없이 가벼운 회전, 50% 이상의 시도에서 반대측으로 말리려는 경향을 보임을 의미합니다.

2점은 50% 이상의 시도에서 반대측으로 말리려는 가볍고 일관된 컬링(curling) 상태를 의미합니다. 3점은 일관되고 강하며 즉각적인 컬링 상태를 의미합니다. 마우스가 1~2초 이상 말린 자세를 유지하는 경우입니다.

코가 거의 꼬리에 닿는 상태입니다. 4점은 심한 말림(curling)을 의미합니다. 배럴형(barreling)으로 진행되어 보행 또는 직립 반사가 소실된 상태는 5점이며, 이는 혼수상태 또는 뭉침(mound)을 의미합니다.

PBS 용액으로 관류한 후, 뇌를 isopentane에서 빠르게 냉각시키고 -80 °C에서 보관합니다. 계획된 면역조직화학 연구에 따라 마우스 뇌를 4% paraformaldehyde로 관류할 수도 있음에 유의하십시오. 다음으로, cryostat을 사용하여 30장의 슬라이드에 17 µm 두께의 뇌 관상 단면을 절단합니다.

매 30번째 절편마다 하나씩 동일한 슬라이드에 배치합니다. 그다음 첫 번째 슬라이드와 15번째 슬라이드를 크레스틸 바이올렛(crystal violet)으로 염색합니다. 더 정확한 손상 부피 추정을 위해 NIH의 Scion image와 같은 이미지 분석 시스템을 사용하여 좌우 뇌 반구에서 하얗게 나타나는 경색 부위인 병변 크기를 평가합니다.

모든 뇌 절편에 대해 동일한 D 제한 과정을 반복합니다. 임의 단위로 경색 부피를 계산하고, 각 절편에 대해 반대측 비손상 영역의 백분율로 표시합니다. 나머지 슬라이드는 면역조직화학 연구를 위해 -80 °C에서 보관하십시오.

신경 점수 평가는 내강 내 시술을 받은 실험 대상의 T-M-C-A-O 성공 여부를 확인해 줍니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 일관되고 강하며 중간 정도의 말림 현상이 관찰되며, 생쥐는 코가 거의 꼬리에 닿을 정도로 몸을 말아 1~2초 이상 그 자세를 유지합니다. 본 실험에서는 모든 생쥐가 최소한 경미하고 일관된 말림 현상을 보였으며, 이는 테스트 기간 내내 신경 점수 2점에 해당합니다.

뇌경색의 범위를 평가하기 위해 Kressel violet 염색을 수행하였습니다. 여기에 제시된 T-M-C-A-O 이후, 재관류 72시간 후에 crest violet으로 염색한 생쥐 뇌의 대표적인 관상 단면입니다. 표시된 경색 부위는 주로 선조체와 피질 및 인접 뇌 영역이며, crest에 의해 염색되지 않아 흰색으로 나타납니다.

여기에 보라색으로 표시된 것은 손상 부피이며, 이는 우반구의 흰색 부분이 좌반구의 대조측 비손상 영역에서 차지하는 비율(%)로 표현된 것입니다. 허혈성 뇌졸중 이후 C 57 black six 수컷 생쥐의 경색 부피는 비손상 반구의 약 70%에 해당합니다. 이 절차는 강력한 병변 재현성을 제공합니다.

이 영상을 시청하신 후, 마우스에서 일시적 뇌허혈 뇌졸중을 유발하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 또한, 뇌경색 부피를 측정하기 위한 quiz viol 방식은 면역화학법을 통해 관련 마커를 테스트할 수 있는 많은 양의 시료를 확보할 수 있다는 큰 장점이 있습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.