Name: Intraluminal MCAO의 마우스 모델 : Cresyl 보라 착색에 의한 뇌 경색 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 학습하세요 마우스 뇌경색 모델 수술법과 Cresyl violet 염색을 통한 경색 평가 방법을. 이 기법은 허혈성 뇌졸중 연구와 유전자 기능 분석에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 연구는 CIHR TEAM 부여 # CTP 82946, CIHR 부여 # 걸레 102,741뿐만 아니라 캐나다 의자 # 216684와 스트라우스 재단에 의해 지원되었다. ER은 캐나다 심장 질환 및 뇌졸중 재단의 화목에 의해 지원되었다.

과도 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 1. 수술 절차 (그림 1) 과도 중간 대뇌 동맥 폐색 (tMCAO)는 2 일에 수행됩니다 - 3 개월 된 남자 C57Bl / 6 마​​우스 (22~28g)에. 이 프로토콜은 IRCM 생명 윤리위원회 동물 관리에 의해 승인되었습니다. 수술 도구 autoclaving (60 분 15 PSI에서 121 ° C)의 소독을했다. 각 동물 사이, 그들은 뜨거운 비드 살균기를 (15 초)를 사용하여 소독되었습니다. 수술 테이블 및 기타 장비는 70 % 에탄올을 사용하여 살균합니다. 수술 전에 2 시간, 마우스는 buprenorphine (0.03 밀리그램 / kg bwip)로 analgesized되었습니다. 그림 1A. <ol><li> 깊이 isoflurane 5퍼센트과 쥐를 마취시키다 후 2.5 % isoflurane에서 마취를 유지합니다. 마우스 본체 온도는 가열 패드와 수술 중 지속적으로 유지됩니다. </li><li> 모피와 SK를 소독70 % 에탄올 또는 Betadine으로 인치 면도는 뇌졸중 pathophysiology에 영향을 미칠 수 있습니다 머리카락 자료, microabrasions과 염증을 생산하고 있기 때문에, 우리는 마우스 털을 면도하지 않습니다. </li><li> 중간 선에 목을 절개하고 부드럽게 부드러운 조직을 분열. </li><li> 스테레오 현미경 (Stemi 2000, Zeiss)에서 무딘 절개는 경동맥을 찾습니다 기관을 표시하고 근육을 철회 수행됩니다. </li><li> 왼쪽 온목 동맥 (CCA)는주의 깊게 조직을 주변에서 해부되고 CCA가 일시적으로 20mm 세그먼트에 5-0 실크 봉합 컷을 사용하여 임시 봉합 (1)에 의해 occluded 있습니다. 좋은 치료는 vagal 신경을 손상하지 행사해야합니다. </li><li> 왼쪽 내부 온목 동맥 (ICA)와 외부 온목 동맥 (ECA)의 분기를 분리합니다. 영구 봉합 (2)와 같은 distally 가능한, ECA 주위에 배치하고 있으며, 약간 빡빡 다른 임시 봉합 (3)에 말초 ECA에 위치분기. </li><li> 피를 피하기 위해 리버스 액션 핀셋을 사용하여 왼쪽 ICA (4) 클립. 좋은 치료는 vagal 신경을 손상하지 행사해야합니다. </li><li> 영구 (2) 및 임시 (3) 봉합 사이의 ECA (5)에 작은 구멍을 잘라 버릴거야. </li></ol> 1B 그림. <ol start="9"><li> , 12mm 길이 6-0 실리콘 코팅 (9~10mm에 대한 코팅 실리콘입니다) ECA (6)에 모노 필라멘트의 봉합 (Doccol 공사)를 소개 완전히 영구적 봉합에 말초 ECA을 잘라 ICA에 occluder로 바꾸 . 봉합은 단단히 출혈을 방지 할 수있는 모노 필라멘트 주위에 연결되어 있으며 리버스 액션 핀셋이 제거됩니다. </li><li> occluder는 윌리스의 원에있는 MCA의 출처를 막다하기 위해 도입된다. ECA와 CCA의 분기 이후 9~10밀리미터 주변의 삽입을 중지합니다. occluder가 차단되어 더 이상 이동할 수 없습니다. 주의 pterygopalatine 동맥을 통과하지 행사해야합니다. ECA에서 봉합 (3) 싸움이다htly 위치에서 모노 필라멘트를 해결하기 위해 묶어. </li><li> autoclip의 상처 폐쇄 시스템과 피부를 닫습니다. </li><li> 피하 생리 식염수 1 ML를 삽입하고 모든 포스트 가림 기간 (60 분) 동안 적외선 가열 램프에서 마우스를 놓습니다. </li></ol> 2. 중간 뇌 동맥 혈액 흐름의 복원 reanesthesia 전에 neuroscore은 수술의 성공 여부를 평가하기 위해 확인하실 수 있습니다. <ol><li> 로 이전에 설명 된 생쥐를 마취하고 autoclips를 제거합니다. </li><li> 약간 모노 필라멘트 탈퇴 및 혈액 reperfusion을 허용하도록 ECA에 봉합 (3) 엽니 다. </li><li> 영구적으로 혈액 손실을 방지하기 위해 ECA에서 임시 봉합을 묶어. 모노 필라멘트는 재사용을 위해 보관됩니다. </li><li> 혈액 재순환을 허용 할 수있는 CCA로 임시 봉합 (1)를 제거합니다. </li><li> 상처를 닫습니다. 마우스 피하에 또 다른 하나 ML 생리 식염수을 받아야합니다. </li><li> 1 시간에 대한 적외선 가열 램프 아래에 마우스를 놓습니다. 동물이 이동성을 회복 여부를 확인 후, 마우스의 케이지에 반환되고 가열 패드, 72 시간 용 수건에서 떠났다. 케이지의 절반 만이 쥐가 자신의 환경을 선택할 수 있도록 가열 패드에 배치되어 있습니다. 후 수술 체중 감소는 일반적으로 관찰되기 때문에, 다진 식품을 섭취 권장 할 수있는 배양 접시에 배치됩니다. 열두 시간 수술, 쥐 buprenorphine (0.03 밀리그램 / kg bwip)의 또 다른 복용량을 받았습니다. </li></ol> 3. 위장 운영 체하다 작업의 모든 절차가 occluder가 삽입되어 있지 제외하고 동일합니다. 4. Neuroscore 신경 결손은 reperfusion 이후 부상의 심각성의 정도의 이후 평가 tMCAO의 성공의 평가를 할 수 있습니다. 이전 5에 설명 된대로 신경 결손이 채점 &lt;/ 저녁을 먹다&gt;, 1, 24, 48, 72 시간의 포스트 reperfusion에서 수행. 확장 여섯 점 척도가 사용됩니다 : <ul><li> 0 : 정상. </li><li> 1 : 부드러운 꼬리가 감지 할 때 사용하거나 일관성없이 회전 동작을 돌고, contralateral 측면으로 회전 할 &lt;50 % 시도합니다. </li><li> 2 : 가벼운 돌고 일관 contralateral 측면으로 회전 할&gt; 50 % 시도. </li><li> 3 : 강한 일관성과 돌고 즉시, 마우스는 코가 거의 꼬리를 도달과 함께, 이상 1-2 초 동안 회전 위치를 보유하고 있습니다. </li><li> 4 : barreling으로 진행 심한 회전, 반사를 산책하거나 righting의 손실. </li><li> 5 : 혼수 상태 나 죽어가는. </li></ul> 5. Cresyl 보라 착색 (그림 2) PBS 솔루션 재관류 후, 머리는 빠르게 이소 펜탄에 고정되어 있으며 -80에 저장 °C. 마우스 뇌는 계획 immunohistochemistry 연구에 따라 4 % paraformaldehyde (PFA)와 perfused 될 수 있습니다. 코로나 뇌 섹션 (17 μm)의 그라 이오 스탯 - 상처가 수행됩니다. 매 30에서 한 섹션은 대표 뇌성 부상을 가지고 동일한 슬라이드에 수집됩니다. 볼륨 정량화를 들어, 2 슬라이드 (귀공자 공사, 프레데릭, MD)이 병변을 평가하는 데 사용 된 cresyl 보라색의 착색 및 이미지 분석 시스템으로 얼룩 져 있습니다. 부상의 볼륨은 임의의 단위 (픽셀)으로 계산하고, 각 섹션에 대한 contralateral 비 lesioned 지역의 백분율로 표시되었습니다. 다른 슬라이드 immunohistochemistry 연구를 위해 -80 ° C에 보관됩니다. 또한, PFA-고정 뇌는 vibratome 등 한 외. (2009) 6에서 권장하는 측정 경색 볼륨을 사용하여 30-50 μm에서 절단 할 수 있습니다.

<ol><li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema%2C+I%3A+a+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jpn. J. Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
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</ol>

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다른 뇌졸중 모델은 환자 뇌졸중 결과를 모방하기 위해 개발되었습니다. 스트로크 모델의 선택은 생물학적 질문에 따라 달라집니다. intraluminal MCAO 모델은 환자의 허혈성 뇌졸중의 가장 일반적인 유형 중 하나를 모방하고 타무라 모델 4,7보다 침습적 더 일치합니다. 이 neuroprotection, neurorepair 및 세포 죽음에 분석을위한 정말 흥미로운 모델입니다. intraluminal 모델의 성공은 제어​​해야하는 등 동물의 성별, 나이, 무게, 온도, 마취 및 수술 시간 등 여러 요인에 따라 달라집니다. occluder (팁 직경, 길이, 모양, fexibility)의 물리적 예절은 MCAO (4)의 일관성 중요하다. 여기, 우리는 Doccol 공사 9~10밀리미터에 실리콘으로 코팅 12mm 길이의 6-0 모노 필라멘트를 사용합니다. 의 길이는 모든 ICA를 적용하기 때문에이 모노 필라멘트의 가장 큰 장점은 subarachnoid의 출혈을 줄일 수 있으며,윌리스와 PPA의 마법사 협회의 앞쪽과 뒤쪽 통신 동맥에서 나오는 길이, 잔류 혈액의 흐름은, 예방 및 경색 볼륨 감소의 다양성 (우리의 손에 다양성의 15 %)은 8입니다. CCA의 봉합은 또한 경색 볼륨 9 다양성을 낮 춥니 다. 뇌 손상 다음 tMCAO의 범위는 여러 가지 방법에 의해 평가 될 수있다. 앞서 언급 한 바와 같이 신경 결손을 측정 할 수 있습니다. 그러나이 방법으로 효율적인 측정을하기가 어렵습니다. 경색의 범위는 일반적으로 TTC의 착색에 의해 수행됩니다. 최근 자기 공명 기술은 또한 neuroprotective 트리트먼트 특히 흥미로운 기술을 사용합니다. 이러한 neurorepair, 세포 사망 또는 세포 증식 등의 행정에 관여 기본 세포 메커니즘을 이해하려면, immunohistochemistry에 의해 서로 다른 마커의 연구는 중요하고 매우 유익한 것입니다. 따라서, 우리 protoc뇌 섹션 준비의 충실한이 분석을 허용하는 큰 이점을 가지고 있으며, 사용 마우스의 수를 최소화합니다. 또한, Tureyen 외 10. cresyl 보라색의 착색 및 TTC 사이 좋은 상관 관계가있는 것으로보고있다.

<table border="1"&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; 설명</strong</td&gt;<td<strong&gt; 회사 소개</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 번호</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 스테레오 현미경</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt; Stemi 2000</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 섬유 - 가벼운 고강도 조명기</td&gt;<td&gt; Dolan - 제너 산업 주식회사</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdisoflurane을위한&gt; 마취 시스템</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isoflurane</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 108737</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 난방 담요</td&gt;<td&gt; Gaymar Medsearch</td&gt;<td&gt; TP22G</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 적외선 가열 램프</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 울트라 고급 핀셋, 스타일 5</td&gt;<td&gt; 전자 현미경 과학</td&gt;<td&gt; 78,320 - 5TI</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vannas 가위 3mm 커팅 에지, 직선</td&gt;<td&gt; 전자 현미경 과학</td&gt;<td&gt; 72932-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 스타일 LA-1과 MPF-1 모든 부드러운 블레이드</td&gt;<td&gt; 전자 현미경 과학</td&gt;<td&gt; 77926-5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 부정적 행동 핀셋, 스타일 KOPINC 5</td&gt;<td&gt; 전자 현미경 과학</td&gt;<td&gt; 72850-F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 가위, 5 1 / 2 &quot;직선을 해부</td&gt;<td&gt; Cedarlane</td&gt;<td&gt; 72,960</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Autoclip 스타터 세트</td&gt;<td&gt; 하버드 장치</td&gt;<td&gt; 34-0557</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BD Autoclip은 휴관일 Syst을 나갔습니다., 9mm 길이 100/pk</td&gt;<td&gt; 피셔</td&gt;<td&gt; 01-804-5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 5-0 봉합</td&gt;<td&gt; 하버드 장치</td&gt;<td&gt; 517763</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 봉합 재료 PDS II 모노 필라멘트 바이올렛, 5-0, RB-1, Z303H</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 6167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12mm 길이 6-0 실리콘 코팅 모노 필라멘트의 봉합</td&gt;<td&gt; Doccol 기업</td&gt;<td&gt; 60SPRePK5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 1ml를 Seringes</td&gt;<td&gt; 피셔</td&gt;<td&gt; 14-823 - 2F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 바늘 26G1 / 2</td&gt;<td&gt; 피셔</td&gt;<td&gt; BD-305111</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; C57BL / 6</em&gt; 마우스</td&gt;<td&gt; IRCM</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</table

intraluminal mcao의 마우스 모델 : cresyl 보라 착색에 의한 뇌 경색 평가

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

행정 사망률 세계에서 장애의 주요 원인의 세 번째 원인입니다. 모든 스트로크의 약 80 % 허혈성 뇌졸중 차지한다. 그러나, thrombolytic 조직 plasminogen 활성 (TPA)는 존재 급성 허혈성 뇌졸중의 유일한 치료입니다. 이 LED 연구자들은 종의 다양한 여러 허혈성 뇌졸중 모델을 개발할 수 있습니다. 쥐 모델의 두 가지 주요 유형이 개발되었습니다 : 글로벌 뇌성 국소 빈혈 또는 초점 뇌성 국소 빈혈의 모델. 누구에 약 80 %가 thrombotic 또는 embolic 스트로크는 중간 대뇌 동맥 (MCA), 모델은 뇌졸중 연구 상당히 관련이 intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO)의 영역에서 발생, 환자의 허혈성 뇌졸중을 모방합니다. 이 모델이 처음 고이즈미 외로 쥐 개발되었습니다. 1,986 1인치 때문에 쥐 유전자 조작의 용이성 때문에,이 모델은 또한이 종 2-3으로 개발되었습니다. 내용은 &quot;&gt; 여기, 우리는 C57/Bl6 마우스에 과도 MCA 폐색 절차를 제시한다. 이전 연구 등 팁의 직경, 길이, 모양, 및 유연성 등의 occluder의 물리적 속성 경색 볼륨 (4)의 재현성에 중요하다고보고했습니다. 여기, 상용 실리콘 코팅 monofilaments (Doccol 공사)가 사용되었습니다. 또 다른 큰 이점이 모노 필라멘트가 subarachnoid의 출혈을 유발 할 수있는 위험을 줄일 수 있다는 것입니다. Zeiss 스테레오 - 현미경 Stemi 2000을 사용하여 실리콘 코팅 된 모노 필라멘트는 속목 동맥에 소개되었습니다 (ICA) 모노 필라멘트 때까지 외부 경동맥 동맥 (ECA)의 컷을 통해이 MCA의 기반을 occludes. 혈액 흐름이 thromboembolic 응고의 용해에 후 혈액 흐름의 복원을 모방 할 수있는 모노 필라멘트의 제거로 1 시간 이상 복원되었습니다 인간. 대뇌 경색의 범위가 neurologic 점수 의해 경색 볼륨의 측정에 의해 먼저 평가 될 수 있습니다.허혈성 마우스 따라서 다른 포스트 - reperfusion 시간에 자신의 neurologic 점수에 대해 분석 하였다. 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화 (TTC)와 얼룩, 경색 볼륨을 평가하기 위해 일반적으로 수행되었다. 이 immunohistochemistry하여 많은 중요한 마커를 테스트 할 수있는 기회를 제공하기 때문에 여기에서, 우리는 cresyl 보라색의 착색를 사용했습니다. 이 동영상에서는, 우리는 MCAO 절차를보고, 신경 점수 및 cresyl 보라색의 착색에 의한 경색 볼륨의 평가.

neuroscore 평가는 tMCAO 후 스트로크의 성공을 확인하고 tMCAO 후 reperfusion의 효율성을 결정합니다. 우리 손에, 모든 마우스는 적어도 온화한 일관성 컬링 (neuroscore 2) 신경 적자가 72 시간에 일반적으로 안정 제시 intraluminal 절차를 받게. 대부분의 마우스는 가벼운 일관성 컬링 (neuroscore 2) 나타냅니다. 컬링의 부재를 보여주는 마우스는 연구에서 제외됩니다. 그러나, neuroscore 평가는 우리가 부상당한 해마와 그대로 해마있는 사람과 쥐를 구별 할 수 없습니다. 어떤 사망률은 subarachnoid의 출혈이 발생하지 않은 제안, 수술 일 동안 관찰되지 않았습니다. subarachnoid의 출혈이 마우스에서 확인되는 경우,이 하나는 체계적으로 분석에서 제외됩니다. 집에서 준비 monofilaments보다 부드럽고입니다 Doccol 공사,에서 실리콘 코팅 모노 필라멘트의 사용은의 성공을 증가tMCAO하고 subarachnoid의 출혈을 줄일 수 있습니다. 24 시간과 72 시간 사이의 사망률이 모델에 14 %이며, 같은 일반적으로 폐색의 60 분에보고했다. 관찰 사망률은 아마도이 마우스 변형에 큰 경색 볼륨 때문입니다. 강한 병변 재현성이 또한 효과 (들)이 모델의 다양성에 의해 숨겨 질 수 neuroprotection 분자를 연구하기가 매우 흥미로운입니다 (표준 편차는 15 %입니다) 관찰되었습니다. tMCAO에 따라 뇌 손상의 정도를 평가하기 위해, 우리는 재료의 많은 관련 마커에게 6 테스트해야하기 위해 오히려 TTC보다 cresyl 보라색의 착색 (그림 2)를 사용하도록 선택. 병변의 정도는 비교적 일치합니다. 그러나, 우리는 마우스에 해마가 (쥐 30 %) 부상하고있는 것으로 나타났습니다. 그렇게 cresyl 보라색의 착색이 나중에 일주까지 적용 할 수있는 참고 할 수 흥미 롭습니다. 문학에서 뇌 경색의 비율이 다양 하나에서다른 공부합니다. 이 마우스 긴장, 마취, 뇌 섹션의 두께, 사용 된 모노 필라멘트, 또는 6, 7을 사용 착색의 선택에 따라 달라집니다. <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1highres.jpg" /> 1 그림. 실리콘 코팅 intraluminal 모노 필라멘트를 사용하여 중간 대뇌 동맥의 폐색의 제도. 마우스 뇌와 실리콘 코팅 모노 필라멘트의 도입을 준비하는 연속 봉합 및 클립을 보여 뇌성 동맥의. (간체) 제도. B.는 윌리스의 원을 통해 모노 필라멘트의 위치가 표시됩니다. . 모노 필라멘트는 MCA ACA, 앞 뇌동맥의 기반을 막다하기 위해 ECA를 통해 ICA에 도입, BA, 뇌 바닥 동맥, CCA, 온목 동맥, C. 윌리스, 윌리스의 장 (场), ECA, 외부 경동맥 아르테는보시지, ICA, 내부 경동맥, MCA, 중, 뇌동맥, PCA, 뒤 교통 동맥, PPA, pterygopalatine 동맥. <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 72 시간 후 reperfusion. 경색 지역 (주로 striatum, 피질과 인접 뇌 영역) 이후 cresyl 보라색으로 물들 마우스 뇌의 대표 코로나 섹션은 흰색 (cresyl 보라색으로 흠없는)에 나타납니다. 부상 볼륨 (흰 부분, 오른쪽 뇌)가 구분이고 contralateral 비 lesioned 지역 (왼쪽 반구)의 백분율로 표시.

쥐 intraluminal 중간 뇌성 가림 모델은 여기서 제공됩니다. 대뇌 경색의 범위는 neurologic 점수와 cresyl 보라색의 착색, TTC의 대안 얼룩, 병렬 많은 관심 마커에서 테스트 큰 이점을 제공함으로써 평가됩니다.

Intraluminal MCAO의 마우스 모델 : Cresyl 보라 착색에 의한 뇌 경색 평가

뇌졸중은 전 세계적으로 세 번째로 높은 사망 원인이자 장애의 주요 원인입니다. 뇌졸중 전체의 약 80%는 허혈성 뇌졸중이 차지합니다. ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 마우스에서 허혈성 뇌졸중을 모사하는 것입니다. 먼저, 총경동맥을 일시적으로 결찰하고, 외경동맥은 가능한 한 원위부에서 영구적으로 결찰합니다. 그 다음, 분지점 위쪽의 외경동맥에 약간 조이는 형태로 또 다른 일시적 봉합사를 배치합니다.두 번째 단계는 출혈을 방지하기 위해 리버스 액션 핀셋(reverse action tweezers)을 사용하여 내경동맥을 클램핑하는 것입니다. 그다음 영구 결찰사와 임시 결찰사 사이의 외경동맥(ECA)을 절단합니다. 이어서 실리콘 코팅 모노필라멘트를 외경동맥(ECA) 내로 삽입합니다.그런 다음 ECA를 반전시켜 ICA로 모노필라멘트를 삽입하며, 중대뇌동맥의 기저부까지 포함되도록 합니다. 1시간 후, 인간의 혈전색전성 폐쇄 용해 후 혈류 복원을 모사하기 위해 모노필라멘트를 제거하여 혈류를 재개합니다. 최종적으로 T-M-C-A-O의 성공 여부와 경색의 중증도를 반영하는 신경학적 결손을 재관류 직후 및 재관류 후 서로 다른 시점에서 평가할 수 있습니다.NIH의 Cyan 이미지 소프트웨어를 사용하여 크레실 바이올렛(cresyl Violet)으로 염색된 대표적인 뇌 절편의 경색 부피를 계산합니다. 관강 내 필라멘트 기법을 이용한 일시적 중대뇌동맥 폐쇄의 주요 장점 중 하나는 혈류 복원과 함께 환자의 허혈성 뇌졸중을 모사한다는 것이며, 마우스에서 이 절차를 발전시키면 표적 단백질의 역할을 확인하기 위해 유전자 표지 도구를 사용할 수 있는 가능성을 제공합니다. 뇌졸중 모델링을 위해, 체중 22~28g 사이의 2~3개월령 수컷 C57BL/6 마우스를 대상으로 일시적 중대뇌동맥 폐쇄를 수행합니다.본 프로토콜은 경색 부피의 재현성을 높이기 위해 IRCM 생명윤리 심의위원회의 승인을 받았습니다. 당사는 Doco Corporation의 12 mm 길이, 6-0 실리콘 코팅 모노필라멘트를 재사용하여 사용하고 있습니다. 수술 2시간 전.마우스의 복강 내에 buprenorphine을 0.03 milligrams per kilogram의 용량으로 주입합니다. 절차를 시작하려면 5% isof fluorine으로 마우스를 마취하고 2.5% ISO fluorine으로 마취 상태를 유지하며, 수술 중 마우스의 체온을 일정하게 유지하기 위해 가열 패드를 사용하고, 70% ethanol 또는 Betadine으로 마우스의 피부를 소독합니다. 그 다음, 목 부위에 정중선 절개를 가하고 실체 현미경 하에서 연조직을 벌려줍니다.기관을 노출시키기 위해 마우스의 목 부위를 둔탁하게 절개합니다. 다음으로, 근육을 견인하여 경동맥의 위치를 찾습니다. 주변 조직으로부터 왼쪽 총경동맥을 조심스럽게 박리합니다.동맥 주변에 20 mm 길이로 자른 5-0 실크 봉합사를 임시로 배치합니다. 이때 미주신경이 손상되지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 왼쪽 내경동맥(ICA)과 외경동맥(ECA)의 분지점을 분리하고, 외경동맥의 가능한 원위부에 영구 봉합사를 배치합니다.그 다음 분지점 위의 ECA에 또 다른 임시 봉합사를 배치합니다. 그런 다음 출혈을 방지하기 위해 리버스 액션 핀셋을 사용하여 왼쪽 ICA를 클립으로 집습니다. 이때 미주신경이 손상되지 않도록 각별히 주의하십시오.ECA와 ICA로 갈라지는 분지점 이전이자 앞서 배치한 영구 및 임시 봉합사 사이의 ECA에 작은 구멍을 냅니다. 다음으로, 12 mm 6-0 실리콘 코팅 모노필라멘트 봉합사를 ECA에 삽입하여 ECA를 완전히 절단하고 모노필라멘트를 ICA 쪽으로 반전시켜 넣습니다. 출혈을 방지하기 위해 봉합사를 단단히 묶고 역방향 핀셋을 제거합니다.그런 다음 모노필라멘트를 윌리스 서클(circle of Willis) 내부로 삽입하여 모노필라멘트가 MCA 기저부를 폐쇄할 때까지 밀어 넣습니다. 삽입 깊이는 ECA와 CCA 분지점으로부터 약 9~10 mm 너머까지입니다. 일반적으로 모노필라멘트가 막히게 되어 더 이상 이동할 수 없게 됩니다.입천장동맥(tego palatine artery)을 천자하지 않도록 주의하십시오. 필라멘트를 제자리에 고정하기 위해 외경동맥(ECA)의 봉합사를 단단히 묶습니다. 이제 자동 클립 상처 폐쇄 시스템으로 피부를 봉합합니다.생리식염수 1 mL를 피하 주사하고, 60분 동안의 재관류 기간 동안 마우스를 적외선 가열 램프 아래에 둡니다. 이전과 동일하게 마우스를 마취한 후 오토 클립을 제거하고, 외부 경동맥(ECA)의 봉합사를 약간 열어 모노필라멘트가 빠져나오고 혈류가 다시 흐르도록 합니다. 그 후, 혈액 손실을 방지하기 위해 외부 경동맥(ECA)의 임시 봉합사를 영구적으로 묶습니다.뇌졸중 유도 1시간 후, 모노필라멘트를 제거하여 재사용을 위해 보관합니다. 다음으로, 혈류가 다시 순환할 수 있도록 CCA의 임시 봉합사를 제거합니다. 상처 부위와 피하 조직을 봉합합니다.마우스에 생리식염수 1 mL를 추가로 주입합니다. 동물이 운동 능력을 회복했는지 확인한 후, 케이지로 다시 옮기고 케이지의 절반을 가열 패드 위에 배치하여 마우스가 스스로 환경을 선택할 수 있도록 합니다. 수술 12시간 후, 모든 가짜 수술(sham operation)군 마우스에 buprenorphine을 추가로 투여합니다.단일 필라멘트를 수술 후 삽입하지 않는다는 점을 제외한 모든 절차는 동일합니다. T-M-C-A-O의 성공 여부를 확인하고 효율성 점수를 결정하기 위해 신경학적 결손을 평가하며, 관류 후 1, 24, 48, 72시간에 다음과 같은 6점 척도로 마우스의 신경학적 결손을 측정합니다. 0점은 정상, 1점은 꼬리를 들어 올렸을 때 불규칙한 말림 유무와 상관없이 가벼운 회전, 50% 이상의 시도에서 반대측으로 말리려는 경향을 보임을 의미합니다.2점은 50% 이상의 시도에서 반대측으로 말리려는 가볍고 일관된 컬링(curling) 상태를 의미합니다. 3점은 일관되고 강하며 즉각적인 컬링 상태를 의미합니다. 마우스가 1~2초 이상 말린 자세를 유지하는 경우입니다.코가 거의 꼬리에 닿는 상태입니다. 4점은 심한 말림(curling)을 의미합니다. 배럴형(barreling)으로 진행되어 보행 또는 직립 반사가 소실된 상태는 5점이며, 이는 혼수상태 또는 뭉침(mound)을 의미합니다.PBS 용액으로 관류한 후, 뇌를 isopentane에서 빠르게 냉각시키고 -80 °C에서 보관합니다. 계획된 면역조직화학 연구에 따라 마우스 뇌를 4% paraformaldehyde로 관류할 수도 있음에 유의하십시오. 다음으로, cryostat을 사용하여 30장의 슬라이드에 17 µm 두께의 뇌 관상 단면을 절단합니다.매 30번째 절편마다 하나씩 동일한 슬라이드에 배치합니다. 그다음 첫 번째 슬라이드와 15번째 슬라이드를 크레스틸 바이올렛(crystal violet)으로 염색합니다. 더 정확한 손상 부피 추정을 위해 NIH의 Scion image와 같은 이미지 분석 시스템을 사용하여 좌우 뇌 반구에서 하얗게 나타나는 경색 부위인 병변 크기를 평가합니다.모든 뇌 절편에 대해 동일한 D 제한 과정을 반복합니다. 임의 단위로 경색 부피를 계산하고, 각 절편에 대해 반대측 비손상 영역의 백분율로 표시합니다. 나머지 슬라이드는 면역조직화학 연구를 위해 -80 °C에서 보관하십시오.신경 점수 평가는 내강 내 시술을 받은 실험 대상의 T-M-C-A-O 성공 여부를 확인해 줍니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 일관되고 강하며 중간 정도의 말림 현상이 관찰되며, 생쥐는 코가 거의 꼬리에 닿을 정도로 몸을 말아 1~2초 이상 그 자세를 유지합니다. 본 실험에서는 모든 생쥐가 최소한 경미하고 일관된 말림 현상을 보였으며, 이는 테스트 기간 내내 신경 점수 2점에 해당합니다.뇌경색의 범위를 평가하기 위해 Kressel violet 염색을 수행하였습니다. 여기에 제시된 T-M-C-A-O 이후, 재관류 72시간 후에 crest violet으로 염색한 생쥐 뇌의 대표적인 관상 단면입니다. 표시된 경색 부위는 주로 선조체와 피질 및 인접 뇌 영역이며, crest에 의해 염색되지 않아 흰색으로 나타납니다.여기에 보라색으로 표시된 것은 손상 부피이며, 이는 우반구의 흰색 부분이 좌반구의 대조측 비손상 영역에서 차지하는 비율(%)로 표현된 것입니다. 허혈성 뇌졸중 이후 C 57 black six 수컷 생쥐의 경색 부피는 비손상 반구의 약 70%에 해당합니다. 이 절차는 강력한 병변 재현성을 제공합니다.이 영상을 시청하신 후, 마우스에서 일시적 뇌허혈 뇌졸중을 유발하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 또한, 뇌경색 부피를 측정하기 위한 quiz viol 방식은 면역화학법을 통해 관련 마커를 테스트할 수 있는 많은 양의 시료를 확보할 수 있다는 큰 장점이 있습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 비디오 intraluminal monofilament를 사용하여 성인 마우스의 중간 대뇌 동맥 폐색을 생산하는 방법을 보여줍니다. 또한 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화물 (TTC) 염색법에 의해 대뇌 경색의 범위를 평가하는 방법을 보여줍니다.

중간 대뇌 동맥 폐색의 마우스 모델

intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 모델은 실험 허혈성 뇌졸중 모델 중 가장 자주 사용되는 모델입니다. 여기서 우리는 전체 레이저 도플러 flowmetry의 가이드와 함께 상세하게 모델 및 대표 결과를 보여줄 것입니다.

마우스의 레이저 도플러 Flowmetry 안내와 허혈성 뇌졸중에 대한 중간 대뇌 동맥 Intraluminal 폐색 (MCAO) 모델

뇌 관류 모니터링은 허혈성 뇌졸중 모델의 정확성을 향상시키기 위해 입증되었습니다. 기술적 인 문제는 종종 뇌 혈관 연구에 대해이 필수적 도구의 사용을 제한 할 수 있습니다. 이 비디오에서는 최적화 된 시스템은 쥐의 intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색 동안 단일 또는 다중 사이트 hemodynamic 모니터링을 얻기 위해 표시됩니다.

Intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색의 쥐 뇌졸중 모델에서 뇌 관류 모니터링에 최적화 된 시스템

Photothrombosis 매우 재현성 방식으로 관심 분야의 작은 잘 구분 경색을 유도하기위한 빠르고, 최소 침습 기술입니다. 그것은 형질 전환 생쥐에서 뇌의 가소성을 기본 세포 및 분자 반응 연구를 위해 특히 적당하다.

Photothrombotic 국소 빈혈 : 마우스 스트로크 연구를위한 최소 침습 및 재현성 광화학 대뇌 피질의 병변 모델

중대 뇌동맥 폐색 (MCAO)의 다양한 쥐 모델은 널리 실험 뇌 연구에 사용됩니다. 여기서 우리는 인간의 허혈성 뇌졸중의 대다수에 의해 부과 된 손상에 해당하는 크기의 일관성있는 대뇌 피질의 경색을 생산 두개 영구 원심 MCAO의 모델을 보여줍니다.

마우스의 모델링 스트로크 : 말초 중간 대뇌 동맥의 영구 응고

다음 스트로크 뇌 골수 세포 특성화 광학 분별 법을 이용하여 수행 Stereology를, 뇌의 유세포 분석에 의해 현탁액 백혈구 수있다. 둘 허혈성 뇌에서 발견되는 주된 서브 세트 골수 세포 표현형의 정확한 구별을 수행하는 유용한 기술이다.

일시적 또는 영구적 인 뇌허혈 모델에서 백혈구 부분 집단의 Stereological 및 유동 세포 계측법 특성

이 연구에서 우리는 결과 얻기 위해 더 많은 재현, 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 마우스 모델을 구축 하 여 기존 실험 방법 수정. Glycyrrhizae 기 수의 구강 관리 외 뿌리 줄기 (GR) 메탄올 추출 물 (GRex), 선 유도 따라 크게 감소 치료 제어 그룹을 기준으로 총 경색 볼륨.

Glycyrrhizae 기 수의 신경 보호 효과 평가 외 Rhizoma 과도 중간 대뇌 동맥 폐색 마우스 모델을 사용 하 여 추출

중간 대뇌 동맥 폐색의 다른 모델 (MCAo) 실험 적인 뇌졸중 연구에 사용 됩니다. 여기서, 외부 경동맥(ECA)을 통한 과도 MCAo의 실험적인 뇌졸중 모델이 기술되며, 이는 자발적인 혈전 용해 또는 치료로 인해 뇌혈관 혈전이 제거되는 인간의 뇌졸중을 모방하는 것을 목표로 한다.

마우스에서 뇌졸중 모델링: 외부 경동맥을 통한 일시적인 중간 뇌동맥 폐색

이 프로토콜은 중간 크기의 경색과 우수한 생존율을 가진 독특한 마우스 스트로크 모델을 보여줍니다. 이 모델을 통해 전임상 뇌졸중 연구자는 허혈 기간을 연장하고, 노령 마우스를 사용하고, 장기적인 기능적 결과를 평가할 수 있습니다.

늙은 쥐의 뇌졸중 결과를 연구하기 위해 수정된 경두개 중뇌동맥 폐색 모델

여기에서는 C57BL/6J 마우스에서 경두개 전기응고를 통해 원위 중뇌동맥 폐색(dMCAO) 모델을 확립하고 후속 신경학적 행동 및 조직병리학적 특징을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

원위 중동맥 폐색 기법을 사용한 마우스의 급성 허혈성 뇌졸중 유도

쥐 생체 내 모델은 허혈성 뇌졸중의 병리학적 메커니즘과 치료 표적을 조사하는 데 필수적인 도구입니다. 이 연구는 쥐의 중대뇌동맥 폐색(MCAO) 후 경색된 뇌 절편에서 면역형광 염색을 수행하는 방법을 설명합니다.

허혈성 뇌졸중의 쥐 모델에서 면역형광에 의한 세포 사멸 신호 평가

학습하세요 마우스 뇌경색 모델 수술법과 Cresyl violet 염색을 통한 경색 평가 방법을. 이 기법은 허혈성 뇌졸중 연구와 유전자 기능 분석에 필수적인 도구를 제공합니다.

Intraluminal MCAO의 마우스 모델 : Cresyl 보라 착색에 의한 뇌 경색 평가

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