Name: 인간의 췌장을위한 컬렉션 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 배우세요 인간 췌장 해부법으로 해부학적 방향성을 유지하며 샘플을 수집하는 방법을. 색칠 표식과 다중 보관 형식을 활용해 췌도 구성과 밀도 분석을 위한 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 기증자의 가족과 전문가의 도움이 연구와 마리아 마티노와 이리나 Kusmartseva에 관련된 장기 조달 기관 감사드립니다. 이 작품은 당뇨병과 췌장 장기 기증자를위한 네트워크를 지원 소아 당뇨병 연구 재단 (MC-T., MA)에 의해 재정 지원되었다.

1. 설정 <ol><li> 연필로, 또는 자동으로 카세트 프린터 수동으로 파라핀 블록에 대한 라벨 카세트. 기증자 식별자 (CaseID), 샘플 종류, 나누어지는 번호 및 추가 고유 식별합니다 (사례 워크시트 등이 <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">부록 1</a> ). </li><li> 영구 마커와 카세트뿐 아니라 라벨 10월 금형. 알루미늄 호일의 5~10센티미터의 직사각형을 잘라 버릴거야. </li><li> 영구 마커 모든 튜브와 튜브와 라벨을 인쇄하거나 수동으로. 신선한 배송의 RPMI 매체와 다진 스냅 냉동 샘플 튜브에 대한 충분한 튜브를 포함합니다. RNAlater과 스냅 냉동 튜브은 각 cryovial 1 ML의 RNAlater를 추가합니다. </li><li> 멸균 절개 악기 (포셉, scalpels, 블레이드, 거즈 패드 (4x4))뿐만 아니라 카세트와 10월 금형과 biosafety 후드 및 카운터 상판의 설정 해부 보드 사용의 순서로 배열. </li><li> 넣어 냉동 목욕 준비건조 적어도 3cm의 깊이로 중간 크기 스티로폼 상자 (10x10 ㎝)에 얼음과 드라이 아이스가 완전히 덮여 때까지 이소펜탄를 추가합니다. </li><li> 옵션 : 액체 질소로 작은 Dewar 컨테이너를 채웁니다. </li><li> 췌장은 전자 현미경 (EM)을 위해 필요한 경우, 1.25 ML 16 % paraformaldehyde, 1.25 ML 8 % 글루 타 알데히드, 그리고 7.5 ML 0.1M PBS를 추가하여 TAAB의 정착액을 준비합니다. 7.5 ML 0.1M PBS에 2.5 ML 16 % paraformaldehyde를 추가하여 Lowicryl 정착액을 준비합니다. </li><li> 세포를 분리에 사용되는 솔루션을 준비합니다. 다음 사항을 추가하는 동안 DMEF 500 ML 병 (글루타민과)에, 무균 기술을 따르십시오 <ol><li> 태아 소 혈청 (FBS) : 추가 50mL, 최종 10 %. </li><li> 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / Strep, 10,000 U / ML / 10,000 UG / ML 주식) - 100 U / ML / 100ug/mL의 최종 농도를 위해 RPMI에 5 ML 펜 / Strep 주식을 추가합니다. 또한 림프절이나 비장 샘플을 들고 사용 DPBS의 500 ML 병에 5 ML을 추가합니다. </li></ol></li></ol> 2. 인원 <oL&gt; <li> 절차는 최적의 세 직원 그러나 절차가 하나의 잘 훈련 개별적으로 수행할 수로 수행됩니다. 두 개인은 일반적으로 90 분 이내에 절차를 완료할 수 있습니다. 실제 기간은받은 조직의 숫자에 의존하고 췌장 림프절을 찾는 용이성. 셀 isolations에 대한 샘플이 4 시에 개최됩니다 ° C까지 조직 해부 완료 혈청 샘플을 병렬로 처리하는 동안. </li><li> 병리학자, 병리 조교, 또는 이와 동등한-숙련된 직원들이 조직 취급을 선도하고 췌장의 머리 부문 (들)을 포함하고 췌장 림프절을 수확 주요 절개를 수행합니다. 초기 노력은 임파선에 대한 사망 시에 췌장의 지방 시험이어서 췌장쪽으로 이동합니다. </li><li> 실험실 기술자 또는 동급 - 직원 누구의 일차 책임 고정 및 냉동 블록과 스냅 냉동 V를위한 췌장과 지역 및 트림 조직의 무게를하는 것입니다 트리밍 조직 훈련ials. 병리학 조교에서 십이지장과 비장을 받고 병리의 비서가 췌장을 처리하는 동안 이러한 장기를 처리합니다. </li><li> 블록 및 유리병의 라벨, cryovials위한 닦지 샘플 및 혈청 처리를 포함하여 다른 사람을 도와 실험실 조교 - 직원. </li></ol> 3. 췌장의 해부 <ol><li> 십이지장과 비장을 제거하고 무딘와 날카로운 절개를 사용하는 관계없는 지방, 혈관, 그리고 신경의 췌장을 청소 </li><li> 종이 수건으로 덮여 해부 보드 청소 췌장 놓으십시오. 췌장의 앞부분은 표면에 파란색 잉크 및 확산에 솜 스쳐지나 작은 주걱을 찍어. 초과를 가릴. </li><li> 옵션 : 췌장의 후부 표면에 검정 잉크와 확산에 새로운 작은 주걱을 찍어. 앞부분은 표면이 시체 해부자 직면와 함께 정상적인 방향으로 췌장을 반환합니다. </li><li> 머리, 몸 및 꼬리 (그림 1) : 3 지역으로 췌장을 잘라요. hea의 경계인를 잘라d와 신체 그러면 몸과 꼬리를위한 ~ 동등한 부분으로 남아있는 부분을 나눕니다. </li><li> 췌장 및 기록 중량 (케이스 검사 결과 시트 (각 지역 체중 <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">부록 1</a> )). </li><li> 섹션 (~ 0.5 ㎝) 가로 &quot;빵 고기 &#39;방식 (그림 1)에서 췌장의 각 지역. </li><li> 다진 시료를위한 지역 간의 두 분기점에서 섹션을 사용합니다. 췌장의 크기에 따라 체형이 꼬리 접합 지역에서 샘플 파라핀 블록의 수를 얻을 수 췌장 머리 - 몸 지역에서 다진 시료 또는 유일한 샘플을 얻기 위해 감소시킬 수있는 경우에 얻기 어려울 수 있습니다. 머리 또는 교차점에서 근위 지역을 상징하는 신체로 따라 라벨 cryovials. <ol><li> 조각을 말하다 및 cryovials (유리병 당 ≥ 1g) 사이에 균등하게 나눕니다. 신속하게 액체 질소 또는 드라이 아이스의 RNALater없이 튜브를 고정 - 이소펜탄 슬러리 그러면 T를 전송OA -80 ° C의 냉동고. </li><li> 평균 수 있도록 30 분간 실온에서 RNALater와 튜브를 계속 빠르게 리믹스하고 나서 -80 ° C의 냉동고로 전송 액체 질소 또는 드라이 아이스 이소펜탄 슬러리의 동결. </li></ol></li><li> 파라핀과 파라핀 (그림 1)로 시작하는 10월 블록에 대한 교체 섹션을 제거합니다. </li><li> 오른쪽으로 가로 섹션을 기댈. </li><li> 장소 ~ 1.5 X 1.5 카세트에서 X 0.5 cm 섹션. 가로 부분이 너무 큰 경우, 반은 (그림 2B)로 잘라. &quot;B&quot;로 &quot;&quot;와 후부 반으로 푸른 앞부분 절반 라벨 카세트. </li><li> 조각 아직도 너무 큰 경우, 이전 컷 (그림 2C)로 각 섹션에 수직으로 잘라. 시계 방향 방식으로 라벨 카세트는 광고입니다. 이상과 같은 카세트 이내에 맞게 필요한 부분을 트림. </li><li> 대부분의 중간 섹션으로 시작하는 지역 내에서 순차적으로 번호 블록. </li><li> 파라핀 블록 위치에있다 c라벨이 너무 assettes는 방향을 유지, 카세트로 왼쪽과 장소 조직하는 것입니다. 닫기 카세트 뚜껑과 ~ 500 ML 10% 중립과 컨테이너로 전송 (NBF) 포르말린 버퍼. 마지막으로 카세트가 정착액에 배치되는 타이밍 고정을 시작합니다. </li><li> 10월 블록의 경우 prelabeled 금형에 10월 미디어의 얇은 레이어를 부어 후 오리 엔테이션을 유지하고 10월과 조직을 충당해야되는 금형의 조직을 바칩니다. ~ 1 분 이소펜탄 슬러리 - 급속 드라이 아이스에 10월 금형 젖어. 임시 저장을위한 드라이 아이스 또는 -80에서 슬러리 및 장소에서 제거 장기 저장을위한 ° C 냉동고. </li><li> 전자 현미경 (EM)의 헤드 바디 접합부에서 ~ 0.5 X 0.5 cm의 슬라이스를 구합니다. TAAB의 정착액 및 Lowicryl 정착액의 다른 슬라이스에서 개최 한 조각. 최소 48 시간 및 / 또는 무기한 EM에 대한 처리까지. 대해 4 ° C에서 샘플 고정력있는 두 가지 유형을 저장 </li></ol> 4. 비장, 림프 노드 Dissections 및 십이지장 점막 절개 <ol><li> 지방에서 췌장 림프절 (PLN)를 격리하고 노드 캡슐에 대한 모든 결합 조직을 잘라. DMEF를 포함하는 무균 세포 배양 접시에있는 장소. 격리 총 숫자에 따라, 신선한 출하량, cryopreserved 세포 isolations, 파라핀 및 / 또는 10월 블록 및 튜브에 대한 aliquots으로 PLN을 나눕니다. 0.5 cm보다 큰 조각으로 큰 노드를 말하다. </li><li> 소형 (~ 0.5 ㎝) 큐브에 비 췌장 림프절과 비장을 말하다. 시작하는 재료의 양을에 따라 신선한 샘플 출하 또는 cryopreserved 셀 isolations위한 정착액, 10 월 미디어, 혹은 DMEM의 장소. </li><li> 십이지장을 열고 부드럽게 moistened 거즈 패드와 점액의 십이지장 점막 깨끗하게 닦아냅니다. 와 함께 RNAlater없이 파라핀 및 / 또는 유리병을위한 냉동 10월 블록과 다진 샘플 점막 부분을 잘라 버릴거야. 다른 샘플로 정지해. </li></ol> 5. 사전 분류 알루미늄 호일과 장소 10월 블록과에서 랩 10월 블록<html> -80에서 장기간 저장 상자에 튜브 ° C. 6. 파라핀 처리에 고정 샘플 제출 <ol><li> 자동 파라핀 프로세서를 사용하거나 수동으로 타이밍을 사용 16시간을위한 조직 (범위 : 20 ± 4 시간) 이후의 수정 프로그램입니다. 자동 프로세서 (사용하는 파라핀 블록을 처리 <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix2.doc" target="_blank">부록 2</a> ). </li><li> 왼쪽으로 카세트 레이블 시체 해부자에 의해 배치로 정확한 방향으로 섹션을 포함시킵니다. submucosa에 점막 직각의 심사를 허용하도록 절단 표면과 십이지장 점막을 포함시킵니다. </li></ol> 7. 해부 영역을 청소하고 소독. 절개 악기를 씻고 다시 소독. 생명 의학 폐기물 등의 저장을 위해 포르말린 정착액에 남은 인간의 조직을 놓습니다. 1 개월 이내 현지 규정에 따라 생물 의학 폐기물을 폐기하십시오. 8. 샘플 인벤토리 시스템 업데이트 ve_title &quot;&gt; 9. 대표 결과 이 절차는 3 대 즉 지역, 머리, 몸, 2 시간 이내에 꼬리 경계를 포함하여 장기에 걸쳐 대표적인 샘플링과 함께 그대로 인간의 췌장을 처리합니다. 후부 머리 지역에서 발견 uncinate 지역은, 머리를 절개에 포함되어 있습니다. 당뇨병없이 장기 기증자의 평균 췌장 무게는 82.4 g (- 139.0 g 52.7)였다. 췌장 지역 가중치는 (그림 3)은 약 있었 읍니다. 이 절차는 또한 순차적인 파라핀과 10월 블록에서 스테인드 슬라이드를 사용하여 전체 췌장의 재건을 위해 허용할 수 있습니다. 복합 형식은 현재와 미래 기술의 최대 활용을 위해 허용 가능한 있습니다. 현재 nPOD 사례 워크시트가 (제공되는 <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">부록 1</a> 회복 샘플 및 후속 PROC을 문서화하는 데 사용됩니다)나누어지는 종류와 수량에 의해 essing. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig1.jpg" /> 1 그림. 해부 학적 방향을 유지하면서 절차의 전반적인 계획은. 전체 췌장이 처리됩니다. 머리 지방은 uncinate 지역을 포함 후부 지역의 복부 췌장 엽의 존재로 인해 우수한-열등 축에 더 깁니다. 분기점에서 부화 면적은 cryovials에 다진 샘플에 사용되는 영역을 나타냅니다. P, 파라핀, O, 10월 <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig2.jpg" /> 그림 2. 췌장 섹션을위한 문자 체계. 가로 췌장의 조각은 더욱 반쪽 또는 분기로 나누어 시계 방향 방식으로 글자 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig3.jpg" /> 그림 3. 당뇨병없이 장기 기증자의 췌장의 무게.성인 기증자 (&gt; 17 세)에서 그대로 췌장을 얻어 지역 및 지역의 중량으로 나눈 후 무게되었다. 데이터는 의미가 ± SEM (N = 15).

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<li>In't Veld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+insulitis+in+adult+autoantibody-positive+organ+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors.</a> Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).</li>
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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이 절차의 목적은 여러 컬렉션 사이트 전반에 걸쳐 조화가 될 수있는 표준 췌장 처리를 정의하고 있으므로 다른 그룹에 의해 얻은 결과의 비교를 허용하는 것입니다. 절개 방법은 내부 - 지역 제트 연료의 파이프 뒤에 주요 췌장 영역의 주석에 대한 추가 단계와 일반 외과 병리학 관행에 따라 달라집니다. biospecimen 처리 방법의 표준화와 같은 국립 암 연구소 6 등 국가 biobanking 기관 biospecimen 수집에 대한 모범 사례의 출판물에 의해 exemplified 고품질의 샘플 수집을 용이하게하는 데 필요합니다. 당뇨병과 적절한 통제 집단의 다양한 단계를 나타내는 기증자로부터 인간의 췌장 샘플 biobanking는 7-9를보고되었습니다. 그러나, 췌장 머리 지역에서 수집한 이들 시료에 대한 정확한 내용은 부족했습니다. 상당한 간 개별 섬의 이질은 잘 알려져 WI입니다최대 섬 크기 분포의 5 배 유사 번째 고유 heterogenity 10을 분석하면 췌장 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 22 블레이드와 scalpels 포함한 절개 악기 </td><td> 여러 </td><td> 여러 </td><td></td></tr><tr><td> 원심 분리기 튜브 (15 및 50 ML) </td><td> 피셔 과학 </td><td> 05-539-5, 430,828 </td><td> 불모의 </td></tr><tr><td> Cryotubes (1.8 ml) 쇼핑 </td><td> VWR 북미 </td><td> 89004-300 </td><td> 멸균, 바코드 선택 </td></tr><tr><td> RNAlater </td><td> Ambion </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> 외과 병리학 잉크 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 카세트 </td><td> 메르세데스 의료 </td><td> CAS ECO109 </td><td></td></tr><tr><td> 일중립 0 % 포르말린 버퍼 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 23-245-685 </td><td></td></tr><tr><td> 10월 냉동 미디어 </td><td> TissueTek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 금형 </td><td> ThermoScientific </td><td> 58,952 </td><td> 다양한 크기 </td></tr><tr><td> 이소펜탄 </td><td> 피셔 과학 </td><td> O3551-4 </td><td> 10월 추워서 목욕 </td></tr><tr><td> 드라이 아이스 </td><td></td><td></td><td> 10월 추워서 목욕 </td></tr><tr><td> Dewar 플라스크에 액체 질소 </td><td></td><td></td><td> 냉동 cryovials 낚아채 </td></tr><tr><td> 세포 배양 접시 (100mm) </td><td> 코닝 </td><td> 430,167 </td><td> 불모의 </td></tr><tr><td> Hyclone DMEF </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30023.01 </td><td> 멸균 가게에 냉장, 글루타민 포함 </td></tr><tr> &lt;TD&gt; 태아 소 혈청 </td><td> Cellgro </td><td> 35-010 - 이력서 </td><td> 멸균, 냉동 저장 aliquots </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 / Antifungal </td><td> GIBCO </td><td> 15240-062 </td><td> 멸균, 냉동 저장 aliquots </td></tr><tr><td> 9 파라핀을 입력 </td><td> 리차드 - 앨런 과학 </td><td> 8337 </td><td></td></tr><tr><td> 1X D-PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190-144 </td><td> 불모의 </td></tr><tr><td> 16 % Paraformaldehyde </td><td> EM 과학 </td><td> 15,710 </td><td> 신선 저장소가 냉장하십시오 </td></tr><tr><td> 8 % 글루 타 알데히드 </td><td> EM 과학 </td><td> 16,019 </td><td> 신선 저장소가 냉장하십시오 </td></tr><tr><td> Biosafety 레벨 2 후드 </td><td> 여러 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 초저 냉동고 </td><td> 여러 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 사쿠라 카세트 프린터 </td><td> 사쿠라 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 사쿠라 VIP300 </td><td> 사쿠라 </td><td></td><td> 자동 파라핀 프로세서 </td></tr><tr><td> 파라핀의 임베딩 역 </td><td> ThermoFisher </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 특정 시약 및 장비.

인간의 췌장을위한 컬렉션 프로토콜

Collection Protocol for Human Pancreas

이러한 해부 및 샘플링 절차는 시체 같은 장기 기증자에게서 채취한 췌장의 준비을 표준화하기 위해 당뇨병 (nPOD) 프로그램과 췌장 장기 기증자에 대한 네트워크를 위해 개발되었습니다. 췌장은 가로 축에 중간에 걸쳐 일련 가로 섹션에 다음 세 주요 영역 (머리, 몸, 꼬리)으로 나누어져 있습니다. 번갈아 섹션 고정 파라핀 및 신선한 냉동 블록 및 잔여 샘플에 사용되는가 DNA, RNA 또는 단백질 분리를 위해 함께 또는 RNAse 억제제없이도 스냅 냉동 시료 준비에 대한 다진있다. 췌장의 해부 절차의 전반적인 목표는 해부 학적 방향을 유지하면서 전체 췌장을 맛볼 것입니다. 섬 조성, 크기와 숫자의 관점에서 내분비 세포 이질은 쥐 islets 1로 비교해 인간 islets에 대해보고됩니다. 췌장의 머리에서 인간 islets의 대부분은 몸과 꼬리 영역은 인슐린 containin으로 구성되어 있습니다g의 β-세포의 낮은 비율이어서 글루카곤 함유 α-세포 및 δ-세포를 somatostatin 함유합니다. 췌장 폴리펩티드 함유 PP 전지 및 ghrelin 함유 엡실론 세포도 존재하지만, 작은 숫자입니다. 반대로, uncinate 지역은 주로 췌장 폴리펩티드 함유 PP 전지 2로 구성되어있다 islets가 포함되어 있습니다. 이러한 지역 섬 변형은 발달의 차이에서 발생합니다. 췌장 foregut과 위장과 십이지장, 지느러미 3 복부 엽 이동 및 퓨즈의 회전 후 복부와 지느러미 췌장 꽃봉오리에서 개발하고 있습니다. 복부 기억 상실증이 지느러미 엽은 장기 나머지 상승을 제공하면서 uncinate 과정을 포함한 머리의 후부 부분을 형성하고 있습니다. 지역 췌장 편차도 꼬리 지역은 1 형 당뇨병에서 선택적 위축을받은 다른 지역과 지느러미 엽 - 파생 부품에 비해 더 높은 섬 밀도를 갖는으로보고됩니다 <s최대&gt; 4,5. 추가 장기와 조직은 종종 장기 기증자로부터 복구 및 췌장 림프절, 비장 및 비 췌장 림프절을 포함합니다. 이러한 샘플은 cryopreserved 세포 분리의 추가와 췌장에 대한 이와 유사한 형식으로 회복됩니다. 근위 십이지장은 췌장에 포함된 경우, 십이지장 점막은 파라핀 및 냉동 블록과 다진 스냅 냉동 준비를 위해 수집됩니다.

이 비디오는 여러 스토리지 형식으로 인간의 췌장을 처리를위한 해부 절차를 보여줍니다. 해부 학적 방향이 지역의 섬 조성 및 밀도의 정의를 허용하도록 췌장 영역에 걸쳐 유지됩니다.

본 박리 및 샘플링 절차는 준비 과정을 표준화하기 위해 당뇨병 췌장 장기 기증자 네트워크(Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes, nPOD) 프로그램을 위해 개발되었습니다...

이 절차의 전체적인 목적은 해부학적 방향성을 유지하는 방식으로 인간의 췌장을 박리하는 것입니다. 이는 췌장에서 십이지장과 비장을 제거한 후, 췌장의 과도한 지방과 혈관을 정리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 췌장의 전면을 파란색 잉크로, 후면을 검은색 잉크로 칠하는 것입니다.다음으로, 췌장을 세 영역으로 나눕니다. 그런 다음 각 영역을 가로 방향으로 균등한 두께의 조각으로 절단하여 파라핀 카세트나 OCT 몰드에 넣거나, 더 잘게 다져 바이알에 넣습니다. 최종적으로 췌장의 세 영역 모두에서 샘플을 수집하며, 이때 향후 분석을 위해 정확한 해부학적 방향을 유지합니다.이 방법은 베타 세포 질량 또는 기능의 손실 기전, 그리고 면역 세포 공격의 특성과 같이 제1형 당뇨병 연구의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 췌장의 생체 내 방향을 유지하려면 세부 사항에 주의를 기울여야 하므로, 췌장 처리 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 본 절차의 시연은 저희 실험실의 조직 기술자인 Linda Snyder와 생물학자인 Emily Montgomery가 진행하겠습니다.절차에 필요한 모든 재료를 준비하는 것으로 시작하십시오. 먼저, 파라핀 블록을 담을 카세트에 공여자 식별자, 시료 유형, 분주 번호 및 기타 추가 정보를 기입하십시오. 다음으로, OCT 몰드에도 동일한 방식으로 라벨을 붙이십시오.각 OCT 블록을 감쌀 수 있는 충분한 양의 알루미늄 호일을 잘라 나중에 사용할 수 있도록 준비해 둡니다. 신선한 샘플과 냉동 샘플을 보관하는 데 필요한 모든 바이알을 준비합니다. 적절한 시점에 RNA later와 RPMI 배지를 첨가합니다.다음으로, 생물안전 작업대(biosafety hood)와 실험대 위에 해부판, 멸균된 기구 및 절차에 필요한 모든 기타 소모품을 배치하여 작업 영역을 준비합니다. 모든 카세트와 OCT 몰드를 사용 순서대로 근처에 정렬해 둡니다. 스티로폼 박스 바닥의 드라이아이스가 충분히 덮일 정도로 이소펜탄(isopentane)을 추가하여 냉동조(freezing bath)를 만듭니다.해부를 시작하려면 십이지장과 비장을 제거하십시오. 한쪽 끝에서부터 십이지장과 췌장을 분리하기 시작하여 완전히 떨어질 때까지 계속합니다. 비장은 느슨하게 부착되어 있어 지방과 췌장에서 쉽게 제거할 수 있습니다.다음으로, 둔성 및 예리한 박리법을 병행하여 췌장에서 불필요한 지방, 혈관 및 신경을 제거합니다. 제거한 지방과 림프절은 나중에 처리할 수 있도록 따로 보관합니다. 세척이 완료되면, 종이 타월이 깔린 박리판 위에 췌장을 놓습니다.췌장의 올바른 방향을 유지하는 것이 이 실험 절차에서 가장 어려운 부분입니다. 성공적인 수행을 위해 췌장의 전면과 후면을 서로 다른 색상의 잉크로 표시합니다. 면봉을 파란색 잉크에 담가 췌장의 전면에 펴 바른 후, 과도한 잉크는 닦아냅니다.다음으로, 새로운 어플리케이터를 검은색 잉크에 담근 후 췌장의 후면에 펴 바릅니다. 췌장을 원래 방향으로 되돌립니다. 전면이 위를 향하게 하여 췌장을 세 부분으로 절단할 준비를 마칩니다.먼저, 머리와 몸통 사이의 접합부를 절단합니다. 다음으로, 남은 부분을 거의 동일한 크기로 나누어 몸통과 꼬리를 분리한 후, 췌장 각 부위의 무게를 기록합니다. 머리 부분부터 시작하십시오.식빵을 자르는 것과 유사하게 횡단면으로 절단하여 각 부위를 약 0.5 centimeter 간격의 섹션으로 나눕니다. 췌장의 각 부위를 슬라이스한 후, 머리 부위의 마지막 섹션인 머리-몸통 접합부 섹션을 제거하여 별도의 해부판에 놓습니다. 이 섹션을 작은 조각으로 잘게 다진 후, RNA 포함 여부가 표시된 크라이오 바이알에 조각들을 균등하게 나누어 넣습니다.그 후, 바이알을 동결합니다. 표준 절차를 따르십시오. 몸통-꼬리 접합부 섹션에 대해 이 과정을 반복합니다.다져진 샘플 수집이 완료되면, 모든 횡단면을 오른쪽으로 기울입니다. 각 영역의 단면을 하나씩 건너뛰며 제거합니다. 파라핀 및 OCT 블록의 경우, 파라핀 블로킹을 위해 첫 번째 단면을 제거합니다.섹션이 너무 크면 절반으로 자릅니다. 카세트에 A와 B라고 표시합니다. 조각이 여전히 너무 크다면, 각 섹션을 이전 절단면과 수직이 되게 자른 다음 카세트에 시계 방향으로 A부터 D까지 표시합니다. 여기에서 보는 것처럼, 라벨이 왼쪽에 오도록 카세트를 배치하십시오.다음으로, 조직을 카세트에 넣고 뚜껑을 닫습니다. 카세트를 중성 완충 포르말린이 담긴 용기로 옮깁니다. OCT 블록의 경우 가장 내측 섹션부터 시작하여 각 영역 내에서 블록에 순차적으로 번호를 매깁니다.미리 라벨을 붙인 몰드에 OCT 매질을 얇게 붓습니다. 조직을 넣기 전에 조직을 OCT 매질로 덮고, 나중에 사용하기 위해 샘플을 빠르게 동결시킨 후 이전에 따로 떼어 놓은 조직으로 돌아갑니다. 림프절 캡슐 주변의 지방과 결합 조직을 다듬어 제거하여 췌장 림프절을 분리합니다. 림프절을 DMEF가 담긴 멸균 접시에 넣고, 큰 림프절은 0.5 cm 이하의 크기로 잘게 다집니다.췌장 림프절을 분리한 후, 추가 처리를 위해 준비된 바이알과 카세트에 조직을 나누어 담습니다. 림프절 처리를 마친 후, 비장을 잘게 다져 비슷한 방식으로 보관합니다. 십이지장을 처리하려면, 젖은 거즈 패드로 점막의 점액을 닦아내고 점막을 잘라낸 다음, 이를 여러 구역으로 절단합니다.앞서 설명한 대로 점막 샘플을 나눕니다. 이 절차를 통해 여기에서 보는 것과 같이 췌장 각 부위의 대표 샘플을 수집합니다. 머리, 몸통 및 꼬리 부위의 무게는 거의 동일했습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 인체 췌장을 다양한 샘플 유형으로 처리하는 방법, 특히 방향성을 유지하는 방법과 췌장 주변 지방에서 림프절을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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