인간의 췌장을위한 컬렉션 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 해부학적 방향을 유지하는 방식으로 인간 췌장을 절개하는 것입니다. 이것은 췌장에서 십이지장과 비장을 제거한 다음 췌장에서 과도한 지방과 혈관을 제거함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 앞쪽 표면을 파란색 잉크로 칠하고 뒤쪽 표면을 검은색 잉크로 칠하는 것입니다.

다음으로 췌장은 세 부분으로 나뉩니다. 그런 다음 각 영역을 십자형으로 균일한 슬래브로 자르고 파라핀 카세트, OCT 몰드에 배치하거나 더 다져서 바이알에 넣습니다. 궁극적으로 췌장의 세 영역 모두에서 샘플을 수집하며, 향후 분석을 위해 올바른 해부학적 방향을 유지합니다.

이 방법은 베타 세포 질량 또는 기능 손실의 기저에 있는 메커니즘 및 면역 세포 공격의 특성과 같은 제1형 당뇨병 연구의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 췌장 처리 방법의 시각적 시연은 췌장의 생체 내 방향을 유지하려면 세부 사항에 주의를 기울여야 하기 때문에 매우 중요합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 그의 기술자인 린다 스나이더(Linda Snyder)와 제 연구실의 생물학자인 에밀리 몽고메리(Emily Montgomery

절차에 필요한 모든 자료를 준비하는 것으로 시작하십시오. 먼저, 파라핀 블록을 담을 카세트에 donor identifier, sample type, aliquot number 및 추가 정보를 표시하십시오. 그런 다음 같은 방식으로 OCT 금형에 레이블을 지정합니다.

각 OCT 블록을 감쌀 수 있을 만큼 알루미늄 호일 조각을 충분히 자르고 나중에 사용하기 위해 따로 보관합니다. 신선 및 냉동 샘플을 보관하는 데 필요한 모든 바이알을 준비합니다. 나중에 RNA를 추가하고 적절한 경우 RPMI 배지를 추가합니다.

다음으로, 작업 영역을 준비하고 해부 보드, 멸균 된 기기 및 절차에 필요한 기타 모든 소모품을 생물 안전 후드와 조리대에 놓습니다. 모든 카세트와 OCT 몰드를 사용 순서대로 정렬하십시오. 가까이에. 스티로폼 상자 바닥의 드라이아이스를 덮을 수 있을 만큼 충분한 isop pentane을 추가하여 냉동 수조를 만듭니다.

해부를 시작하려면 십이지장과 비장을 제거하십시오. 십이지장과 췌장의 한쪽 끝을 분리하기 시작하고 완전히 분리될 때까지 계속합니다. 비장은 느슨하게 붙어 있으며 지방과 췌장에서 쉽게 제거됩니다.

다음으로, 뭉툭한 해부와 날카로운 해부를 사용하여 외부 지방 혈관과 신경의 췌장을 청소합니다. 지방과 림프절은 나중에 처리할 수 있도록 따로 보관하십시오. 청소가 끝나면 종이 타월로 덮인 해부 보드에 췌장을 놓습니다.

췌장의 올바른 방향을 유지하는 것은 이 절차에서 가장 어려운 부분입니다. 성공을 보장하기 위해 전방 및 후방 표면은 서로 다른 색상의 잉크로 칠해집니다. 솜 끝이 있는 어플리케이터에 파란색 잉크를 묻혀 췌장 앞쪽 표면에 잉크를 펴 바르고 초과분을 닦아냅니다.

다음으로, 새 어플리케이터를 검정 잉크에 담그고 췌장 뒤쪽 표면에 펴 바릅니다. 췌장을 정상 방향으로 되돌립니다. 앞쪽 표면이 위를 향하게 하면 이제 췌장을 세 부분으로 절단할 준비가 되었습니다.

먼저 머리와 몸통 사이의 접합부를 자릅니다. 다음으로 나머지 부분을 거의 같은 부분으로 나누어 몸통과 꼬리를 분리하고 췌장의 각 영역의 무게를 기록합니다. 머리 부분부터 시작합니다.

빵 한 덩어리를 자르는 것과 유사하게 가로로 잘라 각 영역을 약 0.5cm 섹션으로 나눕니다. 췌장의 각 부위를 절단한 후 머리 부위의 마지막 부분인 머리 몸체 접합 부분을 제거하고 별도의 해부 보드에 놓습니다. 이 부분을 작은 조각으로 자르고 RNA가 있는 것과 없는 것으로 표시된 극저온 바이알 사이에 조각을 균등하게 나눕니다.

나중에, 바이알은 그런 다음 얼립니다. 표준 절차를 따릅니다. 본체 테일 접합 단면에 대해 이 절차를 반복합니다.

다진 샘플이 수집되면 모든 가로 부분을 오른쪽으로 기울입니다. 각 지역의 교대 섹션이 제거됩니다. 파라핀 및 OCT 블록의 경우 파라핀 차단에 대한 첫 번째 섹션을 제거합니다.

섹션이 너무 크면 반으로 자릅니다. 카세트에 A와 B로 레이블을 지정합니다.조각이 여전히 너무 크면 각 섹션을 이전 컷에 수직으로 자른 다음 카세트 A에서 D까지 시계 방향으로 레이블을 지정합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 레이블이 왼쪽에 오도록 카세트를 배치합니다.

그런 다음 티슈를 카세트에 넣고 뚜껑을 닫습니다. 카세트를 중성 완충 포르민이 들어 있는 용기로 옮깁니다. 각 영역 내에서 OCT 블록의 가장 중간 섹션부터 시작하여 순차적으로 블록에 번호를 매깁니다.

사전 라벨링된 주형에 OCT 매체의 얇은 층을 붓습니다.조직을 도입하기 전에 조직을 OCT 매체로 덮고 나중에 사용할 수 있도록 샘플을 빠르게 동결하여 이전에 보관된 조직으로 되돌립니다. 췌장 림프낭을 둘러싼 지방과 결합 조직을 잘라내어 췌장 림프절을 분리합니다. DMEF가 들어 있는 멸균 접시에 마디를 넣고 큰 마디를 0.5cm 이하의 조각으로 다집니다.

췌장 림프절이 분리되면 추가 처리를 위해 준비된 바이알과 카세트 사이에 조직을 나눕니다. 림프절을 완성한 후 비장을 다져 비슷한 방식으로 보관합니다. 십이지장을 처리하려면 적신 거즈 패드를 사용하여 점막에서 점액을 깨끗이 닦아내고 점막을 잘라낸 다음 부분으로 자릅니다.

앞에서 보여준 것처럼 점막 샘플을 나눕니다. 이 절차를 사용하여 여기에서 볼 수 있듯이 췌장의 각 영역의 대표 샘플을 수집합니다. 머리, 몸통, 꼬리 부분의 무게는 거의 같았다.

이 비디오를 시청한 후에는 인간 췌장을 다양한 샘플 유형으로 처리하는 방법, 특히 방향을 유지하는 능력과 췌장 주위 지방에서 림프절을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.