Name: 의미 심장한 복잡한 두뇌 지형에 대한 Wholemount Immunohistochemistry (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 배우세요 뇌 지형 연구를 위한 전체 장면 면역조직화학법을 통해 소뇌에서 3차원 유전자 발현 패턴을 시각화하는 방법을. 이 기술은 재구성 없이 복잡한 신경 회로 구조를 관찰할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

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RVS는 예시바 대학 의과 알버트 아인슈타인 대학에서 창업 자금을 새로운 조사에 의해 지원됩니다.

1. 동물 재관류와 소뇌의 해부 <ol><li> 단백질에 따라 관류는 성공적인 염색법의 1,2에 필수적인 것입니다. Transcardiac 재관류는 anesthetics의 적절한 사용을 필요로 침입이 아닌 생존 절차입니다. 올바른 교육 기관 승인 및 IACUC 승인 모든 절차를 시도하기 전에 필요합니다. 항상 실험적인 요구 사항을 식별하고 올바른 교육을 습득에 도움을받을 기관의 수의사와 상담하는 것이 좋습니다. 절차 전에 동물 깊이 anesthetized 등 도보 또는 꼬리 핀치와 같은 자극에 반응하지 있어야합니다. 이용 가위는 복부 피부와 근육 벽에 상처를 만들고 다음 각 측면에 흉골에 단지 인접 절단하여 흉곽을 열 것을 계속한다. 또한, 실험자들은 다이어프램을 둘러싼 근막을 절단하여 큰 내부 작업 공간을 만들 수 있습니다. 복부 및 흉부 벽 superio 운동으로rly, 심장이 지금 노출됩니다. 밖으로 흘러 즉시 좌심실로 관류 바늘을 삽입하기 위해 혈액을 허용하도록 오른쪽 중앙홀에 작은 절개를합니다. 기본 정압 펌프는 (자세한 내용은 표 1 참조) 재관류 솔루션을 제공하는 것을 추천한다. 첫째, 0.1M 인산과 혈액을 끌어낼 유체 분명히 실행까지 (PBS, 표 3 참조) 염분 버퍼. 그런 다음, 정압 펌프를 끌 신속 PBS에 희석 4 % paraformaldehyde의 용기 (PFA, 표 3 참조) 솔루션 납품 관을 전환할 후 정착액을 전달하기 위해 다시 펌프를 켜십시오. 펌프의 사용은 필요하지 않습니다 : 연습을 가진 두 개의 주사기는 PBS로 가득한 및 4퍼센트 PFA는 천천히 솔루션을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 그것은 신중하게 조직에 어떠한 병변을 소개하지 않고 두개골의 두뇌를 해부하는 데 매우 중요합니다. 해부 동안 뇌로 비록 작은 상처가 서서히 눈에 띄는 구석으로 확대할 것이다트랩 항체가 및 조직 (그림 2의 예를 들어 빨간색 별표)을 처리하는 동안 artifactual 염색법의 원인이됩니다. 소뇌 절개의 경우는 머리의 중간에서 내려 피부를 자르고 나서 부드럽게 두개골을 노출 펄럭를 분리 괴롭혀 일반적입니다. 지느러미 중간선을 따라 사후 위해 앞부분에서 두개골을 잘라, 또한 laterally 두개골의 양쪽을 따라. 이 소뇌를 nicking의 위​​험을 실행으로 bregma 넘어 끄지 마. 집게를 사용하면 부드럽게 meninges에 첨부되어 뇌 조직을 떠날하지 않도록 조심하는 두뇌에서 떨어져 두개골 전면 리프트. 두뇌의 복부 측면에 두개골 신경을 끊다. </li><li> 두뇌의 나머지 부분에서 소뇌의 분리는 두 가지 이유로 중요하다. 첫째, 그것은 원래의 장소에 colliculi으로보기에서 숨겨진 앞쪽에 lobules에 표현 패턴의 탐험을 허용합니다. 두 번째는 작고 고립된 지역에 조직을 분리하는 것은 m을 허용한다는일부 단백질 염색법을 용이하게 수 광석 완전 고정. 이 최종 해부 단계 동안주의가 포셉의 조언과 소뇌를 만지지로 연결됩니다. 우수와 열등 colliculi의 중간에 포셉 한 켤레의 끝을를 삽입합니다. 집게의 두 번째 집합이 천천히 소뇌에서 열등 colliculi 멀리 애타게 함께. 그 앞쪽에 면이 아래로 향하게되고 brainstem가 위쪽으로 가리키는 있도록 다음, 소뇌 서봐. brainstem 및 lobules IX / 소뇌의 X 사이에 네 번째 뇌실로 포셉를 넣습니다. 양쪽에 집게로 곤란하여 peduncles 잘라 후 부드럽게 brainstem에서 떨어져 소뇌 리프트. 소뇌가 격리되면 24-48시간의 최소 ° C ~ 4에 4퍼센트 PFA에 침수하여 게시 - 수리. 소뇌는 오랜 기간 동안 4퍼센트 PFA에 저장할 수 있습니다. meninges는 앞이나 표현 패턴 나은 가시성을 위해 더럽히는 것 전이나 후에 제거해야합니다.실험자들은 소뇌는 과정에서 다친 것이라고 강한 가능성이있다 염색법 전에 meninges를 제​​거하도록 선택하면. 그들이 약한 배경 염색법을 습득하고 후처리 연약한을 받고 나면 위치를 쉽게되기 때문에 염색법 절차의 끝에 meninges 멀리 필링 것이 훨씬 쉽습니다. </li></ol> 2. Wholemount 염색법을위한 조직 처리 wholemount 염색법 접근 방식은 더 이상 조직 섹션의 immunohistochemical 염색법 이상 소요되기 때문에 그것은 (표 2) 제공된 예제 달력 그림과 같이 실험을 각각의 타임 라인을 계획하는 데 도움이됩니다. 시작하기 전에 염두에 두어야 할 몇 가지 중요한 것들이 있습니다. 1) 조직을 포함하는 microtubes은 동결 / 해동 과정을 제외하고 항상 nutator에서 회전한다. 2) 여러 솔루션 (솔루션 조리법에 대한 표 3 참조) 각 실험에 대한 신선한하셔야합니다. 3)프로토콜을 통해 솔루션을 변경할 때, 부드럽게 소뇌에 닿지 않도록, 오히려 포셉와 소뇌를 제거하는 것보다 지출 솔루션을 쏟다. 그런 다음 다른 용기에 새로운 솔루션을 혼합 후, 부드럽게 튜브에 새로운 솔루션을 추가하는 피펫을 사용합니다. 2.1 일 1 : <ol class="lalpha"><li> 6~8시간가 nutator에 부드럽게 출렁 이는 동안 실온에서 덴트의 픽스 3 소뇌를 고정한다. 메탄올 당신의 항원에 대한 파괴적인 경우 항원 검색 방식을 통해 2.3a 2.1a 단계를 교체하는 것을 고려하십시오. 항원 검색에 사용되는 열 및 버퍼는 항체 침투를 위해 조직을 준비하는 데 도움이됩니다. </li><li> 4에 하룻밤 덴트의 블리치 3 블리치 소뇌 ° C. </li></ol> 2.2 일 2 : <ol class="lalpha"><li> 30 분 각각 실온에서 100 % MeOH의 두 라운드에서 소뇌를 탈수. </li><li> 그런 다음, 주제, 솔루션의 침투를 강화하는동결 / 해동 사이클의 연속으로 조직. 30 분 용 드라이 아이스와 동결과 함께 용기에 튜브를 조심스럽게 넣으십시오. 그런 다음 튜브를 제거하고 15 잠시 벤치에 상온에서 둡니다. 동결 / 해동 단계는 네 번 (최소)을 수행하여야한다. </li><li> 조직 해동 지난 후 하룻밤 -80 ° C 냉동실에 튜브를 넣습니다. </li><li> 조직은 -80에서 시간 연장 기간 동안 저장할 수 ° C 즉시 이전 또는 동결 / 해동 단계 이후 중. 그렇지 않으면, 프로토콜은 계속되어야합니다. </li></ol> 2.3 일 3 : <ol class="lalpha"><li> 50 %를 세척하여 소뇌를 Rehydrate MeOH/50 % PBS 15 % MeOH/85 % PBS, 그리고 60-90분 실온에서 각각 100 % PBS. </li><li> 다음으로, 성인 마우스 cerebella, 주제 2-3분위한 PBS에서 10μg/ml Proteinase K로 효소 소화에 대한 조직입니다. 어떤 소화 단계는 젊은 동물 cerebella (마우스의 P5 세 이하)에 대한 필요가 없습니다. 긴 digestioN은 더 큰 두뇌를 위해 추천됩니다. 예를 들어, 소화는 영장류 두뇌 4 5-6분만큼 높은가 될 수 있습니다. </li><li> 소화 후 즉시 Proteinase K &#39;를 제거하기 위해 상온 10 분마다 PBS 세 번에서 소뇌를 씻어 </li><li> 4에서 하룻밤 (표 3 참조) PMT에서 조직을 차단 ° C. 그것이 저렴하기 때문에 분유 종종 단백질 일에 차단 에이전트를 선택하는 첫 번째 선택, 효과적으로 배경 염색법을 절감하고, 일반적으로 항체 바인딩이나 항원에 대한 액세스를 방해하지 않습니다. 실험자들이 추가 비용을 알고 있어야하고 처음 교차 반응 면역 글로불린 및 노이즈 비율로 최적의 신호를 생산할 수있는 능력에 대한 혈청 품질을 테스트해야합니다 비록 동물 serums 또한, 사용하실 수 있습니다. </li></ol> 2.4 일 4-5 : <ol class="lalpha"><li> 4 ° C (larg에서 48 시간 동안 5 % DMSO와 보충 PMT에 희석 일차 항체의 조직을 품어어 cerebella)은 증가 부화 시간을 요구합니다. </li></ol> 2.5 일 6 : <ol class="lalpha"><li> 언바운드 일차 항체를 제거하려면 4 ° C에서 2~3시간 PMT의 각 소뇌에게 3 배 더 씻으십시오. </li><li> 그런 다음, 4에서 5 % DMSO와 PMT를 포함하는 용액에 이차 항체의 조직을 품어 ° C에서 하룻밤 (큰 cerebella가 필요할 수 있습니다 증가 부화 시간). </li></ol> 2.6 일 7 : <ol class="lalpha"><li> 4 ° C.에 2-3시간 PMT의 각 소뇌에게 3 배 더 씻으십시오 </li><li> 조직에게 1~2시간위한 PBT (표 3 참조)와 최종 세차주세요. 이 단계는 과잉 우유를 제거하고 염색법의 선명도를 향상시킵니다. </li><li> 최적의 염색법 강도에 도달할 때까지 마지막으로, DAB (3,3 &#39;-diaminobenzidine) 용액에 조직을 품어. 갈색 반응 생성물은 ~ 10 분 이내에 명확하게 표시합니다. 빛이 precipita에 chromogen의 원인으로 그것은 어둠 속에서 DAB를 사용하는 것이 가장 좋습니다배경 염색법을 높일 수 있습니다 테. </li></ol> 2.7 최적의 염색법 강도에 도달하면 0.04 %의 나트륨 azide와 PBS에서 소뇌를 배치하여 반응을 중지합니다. 조직은이 솔루션에 장기간 저장할 수 있습니다. 나트륨 azide은 세균 성장​​의 강력한 억제제이다뿐만 아니라 양고추냉이 퍼옥시데이즈을 억제으로이 단계까지 피해야한다. 2.8 선택적 증폭 절차 : 정상적인 프로토콜을 따르지만,이 단계는 단계 위의 2.5b-2.7을 대신하여 수행되어야한다. <ol class="lalpha"><li> 4에서 하룻밤 조직을 품어 ° 5 % DMSO와 PBST에서 비오틴 - 복합 이차 항체 (표 3 참조)에서 C #. </li><li> 2~3시간 상온에서 PBST 중 3-4 변화의 각 조직을 씻어. </li><li> 4에서 하룻밤 소뇌를 품어 ° C를 PBST에서 ABC의 복잡한 솔루션. </li><li> 에서 2-3시간 각 조직을 씻어PBS의 3-4 변경 상온. </li><li> 위에서 설명한 갓 준비한 DAB 솔루션의 조직을, 알을 품다. </li><li> 염색법 최적의 경우 0.04 %의 나트륨 azide와 PBS에서 소뇌를 세척하여 반응을 중지합니다. </li></ol> 3. 이미징 얼룩진 조직 <ol><li> Wholemount 이미지 예를 들어, 사용하여 캡처할 수, Leica DFC3000 FX 카메라는 Leica 애플 리케이션 스위트 FX 소프트웨어를 실행 Leica MZ16 FA의 stereomicroscope에 장착된. 원하는 경우 deconvolution 현미경은 각 이미지가 선명하고 초점에서 단 하나의 lobule을 먹고, 서로 다른 초점 비행기에서 여러 개의 연속적인 이미지를 확보하는 데 사용할 수 있습니다. 다음 이미지는 하나의 스택과 왜곡을 제거하는 렌더링 소프트웨어로 압축 할 수 있습니다. 최종 합성 이미지는 분명 초점의 모든 보이는 patterning과 소뇌 표면 표현 패턴을 설명합니다. </li><li> PBS에 열중하면서 Wholemount 스테인드 조직 (또는를 줄 것이다 다른 미디어 군데해야최적의 굴절률). 쉽게 이미지에 대한 wholemount을 배치하기 위해서는 플라스틱 배양 접시에 1 %의 한천 젤합니다. 겔에 작은 구멍을 잘라 버릴거야. 구멍은 소뇌가 원하는 방향으로 끼여 수 있도록합니다. </li><li> 원시 데이터는 어도비 포토샵 CS4로 가져올 및 대비 및 밝기 수준으로 조정됩니다. </li></ol> 동물 모든 동물의 연구는 의학의 알버트 아인슈타인 대학에서 제도적 지침에 따라 승인된 IACUC 동물 프로토콜 하에서 수행되었다. 남성과 여성 outbred 스위스 웹스터 (Taconic, 알바니, 뉴욕) 생쥐는 우리 식민지 유지 및 모든 연구를 위해 사용되었습니다. Euthanized 성인 쥐가 친절 박사 Bryen 요르단 (의학 알버트 아인슈타인 대학)에 의해 제공되었다. 모든 동물은 한 달쯤 있었다. 4. 대표 결과 소뇌은 네 가로 구역으로 분자 표현으로하게 구분됩니다 :앞부분 영역 (AZ : ~ lobules IV), 중앙 영역 (CZ : ~ lobules VI-VII), 후부 영역 (PZ : ~ lobules VIII-IX 지느러미)와 마디가있는 영역 (NZ : ~ lobules IX 복부와 X ) 5. 각 영역 parasagittal 줄무늬 1,2,5,6 (그림 1)의 독특한 배열을 포함하고 있습니다. Purkinje 세포의 ZebrinII 표현은 AZ와 PZ (그림 2)와 CZ와 뉴질랜드 (그림 2) 유니폼을 표현의 줄무늬를 나타내고있다. Purkinje 세포의 parasagittal 조직은 수입 성의 섬유의 터미널 현장 지형 피지만. 코카인과 암페타민 - 규제 성적 증명서 (카트)이 펩타이드는 등산 섬유 (그림 3A)의 하위 집합으로 표현되는 소뇌 피질 7 (그림 3B)의 분자 층의 Purkinje 세포 dendrites의 줄무늬로 프로젝트. 같은 증폭 7 등 적절한 수정, 함께 wholemount 프로토콜은 옛 성은없이 olivocerebellar 패턴 시각화을 허용더럽히는 것 티슈 섹션 (그림 3B)에서 힘드는 시간이 소요 reconstructions위한 D. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig1.jpg" /> 그림 1. A. ZebrinII / aldolaseC 표현은 소뇌의 가로 섹션에 화살 밴드를 보여준다. 크기 조정 막대 = 500 μm의가. B. ZebrinII / aldolaseC은 Purkinje 세포 somata과 dendrites에만 표시됩니다. 스케일 바 = 150μm (GL = 세분화된 계층; PCL = Purkinje 세포 계층, ML = 분자 층). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig2.jpg" /> 그림 2. ZebrinII / aldolaseC는 앞부분 (AZ), 중앙 (CZ), 그리고 소뇌의 후부 (PZ) 영역의 이미지에서 Purkinje 세포 줄무늬를 보여주는 동안 물들일 wholemount 소뇌. 여기에서 우리는 또한 소뇌를 nicking의 부정적인 결과의 예를 보여줍니다. 결과 artifactual 염색법이 표시됩니다빨간색 별표가있는. 스케일 바 = 1mm (LS = lobulus의 심플, PML = paramedian lobule; COP = 연결사 pyramidis). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig3.jpg" /> 그림 3. A. 카트는 분자 층으로 섬유 터미널을 등산에 표시됩니다. 스케일 막대 = 100 μm의. (ML = 분자 층; PCL = Purkinje 세포 계층, GL = 세분화된 계층) 뉴질랜드에서 카트를 표현 B. Wholemount의 immunohistochemistry. 스케일 바 = 2mm (COP = 연결사 pyramidis; PML = paramedian lobule; PFL = paraflocculus; FL = 괴​​상).

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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

우리는 개발과 성인 두뇌의 의미 심장한 단백질 발현을위한 다목적 immunohistochemical 접근법을 사용해서 성공 wholemount의 염색법에 필요한 기술적인 세부 사항을 설명했습니다. 이 접근법을 사용하여 복잡한 분자 발현 패턴 분석 수 있으며 뇌 지형이 힘드는 시간이 소요되는 조직 sectioning 절차없이 평가. 이 프로토콜은 성인 1,2,8,9 및 조기 출생 후의 마우스 소뇌 10,11,12 모두에서 여러 Purkinje 세포 단백질의 패턴 표현식을 나타내기 위해 사용되었습니다. 우리의 원래의 연구는 또한 세분화된 레이어 pial 지표면 아래 ~ 250 μm의를 상주 과립 세포 항원 표현 1과 anterogradely 추적 이끼 낀 섬유 2, 검사를위한 wholemount 접근 방식의 유틸리티를 보여주었다. 또한, 여러 연구는 단백질의 성공적인 염색법을 위해 원래의 프로토콜에 수...

<table border="1"><tbody><tr><td> 자료 </td><td> 프로토콜의 기능 </td></tr><tr><td> 관류 펌프 (피셔 Scientific/13-876-2) </td><td> 일관성 있고 느린 재관류을 허용합니다. </td></tr><tr><td> 샤프 - 팁 가위 (FST/14081-08) </td><td> 관류 및 해부의 일반 사용합니다. </td></tr><tr><td> 무딘 물체 팁 포셉 (FST/91100-12) </td><td> 재관류 바늘의 삽입에 대한 마음을 안정합니다. </td></tr><tr><td> 집게 (뒤몽 AA/11210-10 의한 FST) </td><td> 두개골에서 뇌의 해부 중에 사용과 두뇌의 나머지 부분에서 소뇌를 분리. 그들은 해부 동안 소뇌의 손상을 최소화하는 데 도움이 약간 둥근 팁을 가지고 있기 때문에 이들은 필수적입니다. </td></tr><tr><td> Nutator (피셔 과학) </td><td> 인큐베이션 기간 동안 운동에 조직을 유지하는 데 사용됩니다. </td></tr><tr><td> 1.5 ML 튜브 (Sarstedt / 스크류 캡 마이크로 튜브) </td><td> 자신의 모든 단계tochemistry 프로토콜이 microtubes에서 열립니다. 둥근 바닥은 소뇌는 운동으로 유지한다는 보장합니다. </td></tr><tr><td> 다공 스푼 (FST/10370-17) </td><td> 부드럽게 보냈다 솔루션을 decanting 동안 microtubes에 wholemounts을 유지하는 데 사용됩니다. </td></tr><tr><td> Leica MZ16 FA 현미경 </td><td> wholemount 염색법을 검사하는 데 사용됩니다. </td></tr><tr><td> Leica DFC3000 FX 카메라 </td><td> wholemount 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다. </td></tr></tbody></table> 표 1. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="9"> 전형 wholemount 실험에 대한 예제 달력 </td></tr><tr><td> 1 일 </td><td colspan="4"> 덴트의 수정, 실온 8 시간 </td><td colspan="4"> 덴트의 표백제, 4 ° C, 하룻밤 </td></tr><tr><td> 날 2 </td><td colspan="3"> 백퍼센트 MeOH, 실내 온도, 배, 30 분 각각 </td><td colspan="3"> 100 % MeOH, 프리즈 / 해동, 4X, 30 min/15 분 </td><td colspa<html> N = &quot;2&quot;&gt; 100 % MeOH, -80 ° C, 하룻밤 </td></tr><tr><td> 3 일 </td><td> 50% MeOH/50 % PBS, 실온, 60-90 분 </td><td colspan="2"> 15% MeOH / 85% PBS, 실온, 60-90 분 </td><td colspan="2"> 백퍼센트 PBS, 실온, 60-90 분 </td><td> PBS의 10μg/mL Proteinase K, 실내 온도, 2-3 분 </td><td> 배 백퍼센트 PBS, 실온, 10 분 각각 </td><td> 하룻밤 PMT, 4 ° C, </td></tr><tr><td> 일 4-5 </td><td colspan="8"> PMT + 1 ° 항체 + 5퍼센트 DMSO, 4 ° C, 48 시간 </td></tr><tr><td> 6 일 </td><td colspan="3"> PMT, 4 ° C, 2 - 3 배, 2-3 시간마다 </td><td colspan="5"> PMT + 2 ° 항체 + 5퍼센트 DMSO, 4 ° C, 24 시간 (또는 ABC 복잡한와 증폭 단계를 시작합니다) </td></tr><tr><td> 7 일 </td><td colspan="2"> PMT, 4 ° C, 2 - 3 배, 2-3 시간마다 </td><td colspan="3"> PBT, 실온, 2 시간 </td><td colspan="3"> 최적의 염색법이 시각까지 PBS에서 신선한 DAB에 품어 </td></tr></tbody></table>_content &quot;&gt; 표 2. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> 조리법은 (* = 매번 신선한 준비) </td></tr><tr><td> PBS (인산염은 염분 버퍼) </td><td> 0.1M 인산염은 탈이온수에 염분 버퍼. 산도 7.2 (시그마 정제, P4417) </td></tr><tr><td> PFA (Paraformaldehyde) </td><td> 제작 및 저장 작업 솔루션을 PBS 4 %로 희석 후 20 %의 솔루션으로 동결하고 (; T353 피셔 과학) </td></tr><tr><td> 덴트의 정착액 3 * </td><td> 4 개로 메탄올 한 부분 dimethylsulfoxide (DMSO, 피셔 과학, D159-4) </td></tr><tr><td> 덴트의 블리치 3 * </td><td> 4 개로 메탄올 한 부분 dimethylsulfoxide (DMSO, 피셔 과학, D159-4) 한 부분은 30 % 과산화수소 </td></tr><tr><td> 효소 소화 </td><td> 10 μg / Proteinase K (로슈 진단, 03,115,828,001)의 ML PBS 인치 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> PBS 포함 : 0.1 % 십대 초반-20 (FisheR 과학, BP337, 트리톤은 모든 인스턴스에서 십대 초반-20 대신에도 사용할 수 있습니다.) </td></tr><tr><td> PMT는 25 * </td><td> PBS 포함 : 2퍼센트 무지방 탈지 우유 분말 (카네이션은 우대) 0.1 % 십대 초반-20 (피셔 과학, BP337) </td></tr><tr><td> PBT 25 * </td><td> PBS 포함 : 0.2 % 소 혈청 알부민 (시그마; B9001S) 0.1 % 십대 초반-20 (피셔 과학, BP337) </td></tr><tr><td> DAB * </td><td> PBS의 40 ML에서, 3,3-diaminobenzidine 중 10 밀리그램 정제 (D5905 시그마 - 올드 리치)를 해산. ) 반응을 촉진시키기 위해서 30 % 과산화수소 10 μl를 추가합니다. </td></tr><tr><td> ABC 복합 솔루션 </td><td> Vectastain 키트 (벡터 실험실, INC, PK-4000) </td></tr></tbody></table> 표 3.

의미 심장한 복잡한 두뇌 지형에 대한 wholemount immunohistochemistry

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

소뇌의 반복이고 잘 이해 셀룰러 아키텍처는 뇌의 지형을 탐험하는 데 이상적인 모델 시스템을 확인합니다. 그것의 비교적 균일한 cytoarchitecture 밑에는 유전자 및 단백질 표현의 parasagittal 도메인의 복잡한 배열입니다. 소뇌의 분자 compartmentalization는 수입 성의 섬유의 해부 학적 및 기능적 조직 피지만. 완전히 소뇌 조직의 복잡도를 감사하기 위해 우리는 이전에 마우스 소뇌의 patterning 결함의 높은 처리량 분석을위한 wholemount 염색법 방식을 정제. 이 프로토콜은 상세히 시약, 도구 및 성공적 wholemount immunostaining를 사용하여 성인 마우스 소뇌에서 단백질 발현 패턴을 표시하는 방법으로 유용 실용적인 단계를 설명합니다. 단계는 여기에서 뇌의 미세 지형이 그 드러날 수있는 방법의 예로 zebrinII / aldolaseC의 표현을 사용하여이 방법의 유틸리티를 입증 강조네이티브 입체 형태. 또한 설명은 분자 지형의 비교 연구를위한 수입 성의 전망 및 대형 cerebella의 단백질 표현의 시각화 수 있도록 프로토콜에 adaptations 있습니다. 이러한 응용 프로그램을 설명하기 위해 쥐의 소뇌의 수입 성의 염색법의 데이터가 포함되어 있습니다.

신경 회로는 topographically 특정 분자 프로필과 기능적 구획으로 구성되어 있습니다. 여기서는 다양한 wholemount immunohistochemical 염색법 접근 방식을 사용하여 글로벌 뇌의 지형을 드러내는을위한 실용적이고 기술적인 단계를 제공합니다. 우리는 잘 이해 cytoarchitecture과 소뇌의 회로를 사용하는 방법의 유틸리티를 보여줍니다.

의미 심장한 복잡한 두뇌 지형에 대한 Wholemount Immunohistochemistry

반복적이고 잘 알려진 소뇌의 세포 구조는 뇌 지형도를 탐구하기 위한 이상적인 모델 시스템이 됩니다. 소뇌의 ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 온전한 뇌 구조 전체에서 유전자 발현의 복잡한 패턴을 밝히는 것입니다. 이를 위해 먼저 동물에게 관류를 시행하여 뇌를 적출합니다. 그 다음 소뇌를 박리하여 홀 마운트 염색 프로토콜을 사용하여 처리합니다.마지막 단계는 조직화학적 발색 반응을 이용하여 유전자 발현을 시각화하는 것입니다. 최종적으로, 명시야 현미경을 사용하여 표면 유전자 발현 패턴을 이미지화합니다. 조직 절편 면역조직화학염색과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 재구성 과정 없이도 3차원적으로 복잡한 패턴을 시각화할 수 있다는 점입니다.실험 절차의 시연은 제 연구실의 대학원생인 Joshua White가 진행합니다. 동물을 희생시킨 후 두개골에서 뇌를 적출하고, 먼저 핀셋 끝을 상부 및 하부 뇌량의 중앙에 삽입하여 소뇌를 나머지 뇌 조직으로부터 분리합니다. 그런 다음 두 번째 핀셋을 사용하여 뇌량과 피질을 소뇌로부터 천천히 떼어냅니다.소뇌의 전면이 아래를 향하고 뇌줄기가 위쪽을 향하도록 방향을 잡습니다. 이제 뇌줄기와 소뇌의 labials 9 및 10 사이의 제4뇌실로 포셉을 삽입합니다. 양측을 포셉으로 집어 뇌교각을 절단한 다음, 뇌줄기로부터 소뇌를 조심스럽게 들어 올립니다.소뇌를 4% paraldehyde에 담가 4°C에서 최소 24시간에서 48시간 동안 후고정합니다. 흄 후드 내에서 작업하는 경우, 소뇌를 4% paraldehyde에 장기간 보관할 수 있습니다. paraldehyde 용액을 조심스럽게 따라내고 dense fix로 교체합니다.소뇌와 고정액이 담긴 튜브를 셰이커(mutator)에 올리고 6~8시간 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 배양 시간이 지나면 고농도 고정액을 따라내고 고농도 표백제로 교체합니다. 소뇌를 이 용액에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하며, 다음 날까지 흔들어 줍니다.튜브 내의 용액을 100% methanol로 교체합니다. 튜브를 mutator 위에 놓고 실온에서 30분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 배양 시간이 경과하면, 용액을 신선한 100% methanol로 교체하고 배양 과정을 반복하여 소뇌의 탈수를 확실히 합니다.이제 튜브를 드라이아이스가 담긴 용기에 넣어 100% methanol에서 조직을 30분 동안 동결시킵니다. 시간이 지나면 핀셋을 사용하여 튜브를 드라이아이스에서 꺼낸 후, 실험대 위에 두고 15분 동안 해동시킵니다. 염색액의 침투를 높이기 위해 이 동결-해동 과정을 최소 4회 반복합니다.마지막 해동 후, 튜브를 -80 °C 냉동고에 넣고 하룻밤 동안 보관하십시오. 조직은 동결-해동 단계의 직전 또는 직후에 -80 °C에서 장기간 보관할 수 있습니다. 그렇지 않은 경우, 프로토콜을 계속 진행하십시오.다음 날, 소뇌를 50% methanol 50% PBS, 15% methanol 85% PBS, 그리고 100% PBS 순으로 각각 실온에서 60~90분 동안 흔들어주며 침지시켜 재수화합니다. 다음으로, 성체 마우스 소뇌의 경우, PBS에 용해된 10 µg/mL proteinase K를 사용하여 실온에서 2~3분 동안 흔들어주며 조직을 효소 처리합니다.이 소화 단계는 5주령 이하 생쥐의 소뇌에는 필요하지 않습니다. 소화 후, 과도한 소화를 방지하기 위해 즉시 proteinase K를 따라내고 소뇌를 PB S로 10분씩 3회 세척하십시오. 마지막 세척 후, 용액을 P-B-S-M-T와 ROCK으로 교체하여 4°C에서 하룻밤 동안 반응시켜 다음 날 조직 블로킹을 수행하십시오.P-B-S-M-T 블로킹 용액을 따라 버리고, P-B-S-M-T에 희석된 1차 항체에 조직을 넣고 배양합니다. 이때 5% DMSO를 첨가하여 4°C에서 48시간 동안 로킹하며 배양합니다. 배양 시간이 경과하면, 결합되지 않은 1차 항체를 제거하기 위해 4°C에서 P-B-S-M-T로 소뇌를 2~3시간씩 2~3회 로킹하며 세척합니다.그런 다음, 5% DMSO가 포함된 PBSMT 용액 내의 2차 항체에서 조직을 4°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 이전과 동일하게 소뇌를 PBSMT로 세척하며 이때 셰이커로 흔들어 줍니다. 마지막으로 4°C에서 1~2시간 동안 PBT로 세척하며 셰이커로 흔들어 줍니다.이 단계에서는 과도한 밀크를 제거하여 염색의 선명도를 높입니다. 마지막으로, 조직을 DAB 용액에 배양합니다. 최적의 염색 강도에 도달할 때까지 DAB를 암실에서 사용하는 것이 가장 좋습니다.빛은 발색제를 침전시켜 배경 염색을 증가시킬 수 있습니다. 최적의 염색 강도에 도달하면 10분 이내에 갈색 반응 생성물이 명확하게 보여야 합니다. 소뇌를 0.4% sodium azide가 포함된 PBS에 넣어 반응을 중단시키십시오.조직은 이 용액 내에서 장기간 보관할 수 있습니다. 전체 마운트 염색 조직은 PBS 또는 최적의 굴절률을 제공하는 다른 매질에 담긴 상태에서 이미징해야 합니다. 이미징을 위해 전체 마운트의 위치를 쉽게 잡으려면, 플라스틱 페트리 접시에 1% agar 겔을 만드십시오.다음으로, 겔에 작은 구멍들을 낸 뒤 소뇌 조직을 이미징에 원하는 방향으로 구멍에 끼우고 소뇌 조직을 PBS로 덮어줍니다. 이제 염색된 조직을 광학 현미경으로 이미징할 준비가 되었습니다. ZEIN two Adelaide c.면역조직화학 염색을 통해 소뇌의 횡단면에서 시상 밴드(sagittal bands)를 확인할 수 있습니다. 도식에는 입술 4, 5, 3(Labials four, five, and three)이 표시되어 있습니다. 방향 참조를 위해, 스케일 바는 500 microns를 나타냅니다.ZEIN 2. Adelaide's C는 kinji 세포체와 수지상돌기의 일부 하위 집합에서만 선택적으로 발현됩니다. 이 이미지에서 스케일 바는 150 microns를 나타냅니다.이 이미지는 zein two로 염색된 소뇌 전체 마운트를 보여주며, Adela C는 소뇌의 전방, 중앙 및 후방 구역 이미지에서 bikini 세포 줄무늬를 보여줍니다. 로마 숫자는 소뇌엽을 나타냅니다. LS는 loist simplex입니다.PML은 paramedian labial의 약어입니다. COP는 copular 파라미터와 레이블을 나타냅니다. Crust one과 crust two는 두 개의 hemisphere LOE 명칭을 나타내며, P one과 P three 표기는 특정 BR two 스트라이프를 나타내는 데 사용되는 표준 명명법에 기초합니다.자세한 내용은 Sillitoe and Hawks 2002를 참조하십시오. 스케일 바는 1 mm를 나타냅니다. 여기에서 소뇌는 cocaine 및 amphetamine regulated transcript peptide에 대한 항체로 면역 염색되었습니다.확인할 수 있습니다. 해당 카트는 PCL로 표시된 푸르키네 세포층을 통과하여 ml로 표시된 분자층에서 끝나는 climbing fiber의 하위 집합에서 발현됩니다. 여기서 스케일 바는 100 microns를 나타냅니다.이 이미지에서 cart 양성 섬유가 PFL 및 fl로 표시된 Oculus와 같은 영역을 포함하여 소뇌 피질의 분자층에 있는 bikini 세포 수지상 돌기의 줄무늬로 투사되는 것을 볼 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 소뇌에 흠집이 나지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 외부 손상이 발생하면 복잡한 염색 패턴의 가시성이 떨어질 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면, 온전한 뇌 내의 뉴런과 그에 접촉하는 섬유에서 유전자 발현의 복잡하고 흥미로운 패턴을 밝혀내는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

전체 영장류 두뇌를 통해 대상 단백질의 대규모 면역이 포함 소설 조직을 고용하고 주어진 시간에 여러 자유 부동 섹션의 배치 얼룩을위한 창조적인 장치를 이용하여 결합 방법을 sectioning에서 가능합니다.

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이 기사에서는 두 개의 공간 척도를 연결하는 3D 스캐닝 기술을 사용하여 실험 프로토콜을 소개합니다: MRI에 의해 이미지된 전체 뇌 해부학의 거시적 공간 척도 &gt;100 μm 및 이를 사용하는 뉴런 분포의 현미경 공간 스케일 면역히스토화학 염색 및 다중전극 어레이 시스템 및 기타 방법(~10 μm).

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연속 이광자 단층촬영(STPT) 이미징은 이광자 이미징과 자동 스테이지 제어 및 마이크로톰 슬라이싱을 결합하여 조직 덩어리를 3차원 형태로 이미징하는 기술입니다. 여기에서는 마모셋 뇌가 구조적 특징을 더 잘 이해할 수 있도록 이를 구현하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

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