의미 심장한 복잡한 두뇌 지형에 대한 Wholemount Immunohistochemistry

본 실험 절차의 전반적인 목적은 온전한 뇌 구조 전체에서 유전자 발현의 복잡한 패턴을 밝히는 것입니다. 이를 위해 먼저 동물에게 관류를 시행하여 뇌를 적출합니다. 그 다음 소뇌를 박리하여 홀 마운트 염색 프로토콜을 사용하여 처리합니다.

마지막 단계는 조직화학적 발색 반응을 이용하여 유전자 발현을 시각화하는 것입니다. 최종적으로, 명시야 현미경을 사용하여 표면 유전자 발현 패턴을 이미지화합니다. 조직 절편 면역조직화학염색과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 재구성 과정 없이도 3차원적으로 복잡한 패턴을 시각화할 수 있다는 점입니다.

실험 절차의 시연은 제 연구실의 대학원생인 Joshua White가 진행합니다. 동물을 희생시킨 후 두개골에서 뇌를 적출하고, 먼저 핀셋 끝을 상부 및 하부 뇌량의 중앙에 삽입하여 소뇌를 나머지 뇌 조직으로부터 분리합니다. 그런 다음 두 번째 핀셋을 사용하여 뇌량과 피질을 소뇌로부터 천천히 떼어냅니다.

소뇌의 전면이 아래를 향하고 뇌줄기가 위쪽을 향하도록 방향을 잡습니다. 이제 뇌줄기와 소뇌의 labials 9 및 10 사이의 제4뇌실로 포셉을 삽입합니다. 양측을 포셉으로 집어 뇌교각을 절단한 다음, 뇌줄기로부터 소뇌를 조심스럽게 들어 올립니다.

소뇌를 4% paraldehyde에 담가 4°C에서 최소 24시간에서 48시간 동안 후고정합니다. 흄 후드 내에서 작업하는 경우, 소뇌를 4% paraldehyde에 장기간 보관할 수 있습니다. paraldehyde 용액을 조심스럽게 따라내고 dense fix로 교체합니다.

소뇌와 고정액이 담긴 튜브를 셰이커(mutator)에 올리고 6~8시간 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 배양 시간이 지나면 고농도 고정액을 따라내고 고농도 표백제로 교체합니다. 소뇌를 이 용액에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하며, 다음 날까지 흔들어 줍니다.

튜브 내의 용액을 100% methanol로 교체합니다. 튜브를 mutator 위에 놓고 실온에서 30분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 배양 시간이 경과하면, 용액을 신선한 100% methanol로 교체하고 배양 과정을 반복하여 소뇌의 탈수를 확실히 합니다.

이제 튜브를 드라이아이스가 담긴 용기에 넣어 100% methanol에서 조직을 30분 동안 동결시킵니다. 시간이 지나면 핀셋을 사용하여 튜브를 드라이아이스에서 꺼낸 후, 실험대 위에 두고 15분 동안 해동시킵니다. 염색액의 침투를 높이기 위해 이 동결-해동 과정을 최소 4회 반복합니다.

마지막 해동 후, 튜브를 -80 °C 냉동고에 넣고 하룻밤 동안 보관하십시오. 조직은 동결-해동 단계의 직전 또는 직후에 -80 °C에서 장기간 보관할 수 있습니다. 그렇지 않은 경우, 프로토콜을 계속 진행하십시오.

다음 날, 소뇌를 50% methanol 50% PBS, 15% methanol 85% PBS, 그리고 100% PBS 순으로 각각 실온에서 60~90분 동안 흔들어주며 침지시켜 재수화합니다. 다음으로, 성체 마우스 소뇌의 경우, PBS에 용해된 10 µg/mL proteinase K를 사용하여 실온에서 2~3분 동안 흔들어주며 조직을 효소 처리합니다.

이 소화 단계는 5주령 이하 생쥐의 소뇌에는 필요하지 않습니다. 소화 후, 과도한 소화를 방지하기 위해 즉시 proteinase K를 따라내고 소뇌를 PB S로 10분씩 3회 세척하십시오. 마지막 세척 후, 용액을 P-B-S-M-T와 ROCK으로 교체하여 4°C에서 하룻밤 동안 반응시켜 다음 날 조직 블로킹을 수행하십시오.

P-B-S-M-T 블로킹 용액을 따라 버리고, P-B-S-M-T에 희석된 1차 항체에 조직을 넣고 배양합니다. 이때 5% DMSO를 첨가하여 4°C에서 48시간 동안 로킹하며 배양합니다. 배양 시간이 경과하면, 결합되지 않은 1차 항체를 제거하기 위해 4°C에서 P-B-S-M-T로 소뇌를 2~3시간씩 2~3회 로킹하며 세척합니다.

그런 다음, 5% DMSO가 포함된 PBSMT 용액 내의 2차 항체에서 조직을 4°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 이전과 동일하게 소뇌를 PBSMT로 세척하며 이때 셰이커로 흔들어 줍니다. 마지막으로 4°C에서 1~2시간 동안 PBT로 세척하며 셰이커로 흔들어 줍니다.

이 단계에서는 과도한 밀크를 제거하여 염색의 선명도를 높입니다. 마지막으로, 조직을 DAB 용액에 배양합니다. 최적의 염색 강도에 도달할 때까지 DAB를 암실에서 사용하는 것이 가장 좋습니다.

빛은 발색제를 침전시켜 배경 염색을 증가시킬 수 있습니다. 최적의 염색 강도에 도달하면 10분 이내에 갈색 반응 생성물이 명확하게 보여야 합니다. 소뇌를 0.4% sodium azide가 포함된 PBS에 넣어 반응을 중단시키십시오.

조직은 이 용액 내에서 장기간 보관할 수 있습니다. 전체 마운트 염색 조직은 PBS 또는 최적의 굴절률을 제공하는 다른 매질에 담긴 상태에서 이미징해야 합니다. 이미징을 위해 전체 마운트의 위치를 쉽게 잡으려면, 플라스틱 페트리 접시에 1% agar 겔을 만드십시오.

다음으로, 겔에 작은 구멍들을 낸 뒤 소뇌 조직을 이미징에 원하는 방향으로 구멍에 끼우고 소뇌 조직을 PBS로 덮어줍니다. 이제 염색된 조직을 광학 현미경으로 이미징할 준비가 되었습니다. ZEIN two Adelaide c.

면역조직화학 염색을 통해 소뇌의 횡단면에서 시상 밴드(sagittal bands)를 확인할 수 있습니다. 도식에는 입술 4, 5, 3(Labials four, five, and three)이 표시되어 있습니다. 방향 참조를 위해, 스케일 바는 500 microns를 나타냅니다.

ZEIN 2. Adelaide's C는 kinji 세포체와 수지상돌기의 일부 하위 집합에서만 선택적으로 발현됩니다. 이 이미지에서 스케일 바는 150 microns를 나타냅니다.

이 이미지는 zein two로 염색된 소뇌 전체 마운트를 보여주며, Adela C는 소뇌의 전방, 중앙 및 후방 구역 이미지에서 bikini 세포 줄무늬를 보여줍니다. 로마 숫자는 소뇌엽을 나타냅니다. LS는 loist simplex입니다.

PML은 paramedian labial의 약어입니다. COP는 copular 파라미터와 레이블을 나타냅니다. Crust one과 crust two는 두 개의 hemisphere LOE 명칭을 나타내며, P one과 P three 표기는 특정 BR two 스트라이프를 나타내는 데 사용되는 표준 명명법에 기초합니다.

자세한 내용은 Sillitoe and Hawks 2002를 참조하십시오. 스케일 바는 1 mm를 나타냅니다. 여기에서 소뇌는 cocaine 및 amphetamine regulated transcript peptide에 대한 항체로 면역 염색되었습니다.

확인할 수 있습니다. 해당 카트는 PCL로 표시된 푸르키네 세포층을 통과하여 ml로 표시된 분자층에서 끝나는 climbing fiber의 하위 집합에서 발현됩니다. 여기서 스케일 바는 100 microns를 나타냅니다.

이 이미지에서 cart 양성 섬유가 PFL 및 fl로 표시된 Oculus와 같은 영역을 포함하여 소뇌 피질의 분자층에 있는 bikini 세포 수지상 돌기의 줄무늬로 투사되는 것을 볼 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 소뇌에 흠집이 나지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 외부 손상이 발생하면 복잡한 염색 패턴의 가시성이 떨어질 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 온전한 뇌 내의 뉴런과 그에 접촉하는 섬유에서 유전자 발현의 복잡하고 흥미로운 패턴을 밝혀내는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.