신진 대사 레이블 및 유동세포계측법와 세포주기 진행의 동력학 측정

다음 절차의 전반적인 목표는 세포주기의 동역학과 진행을 측정하는 것입니다. 첫 번째 세포는 로모(romo), 데옥시(deoxy), 우리딘(uridine) 또는 BRDU로 표지된 펄스 추적(pulse chase)이며, 이는 티미딘(thymidine) 대신 세포의 DNA에 통합됩니다. 그런 다음 세포를 BRDU에 대한 항체로 면역 염색하고 염색 직후 유세포 분석으로 분석합니다.

S-phase의 세포만 라벨링된 세포가 세포 주기를 통해 G 2로 진행됨에 따라 라벨링됩니다. 유사분열 후 4개의 NDNA 함량이 있는 것으로 검출됩니다. 따라서 유세포 분석에 의해 생성된 형광 프로파일의 분석은 세포주기 진행의 역학을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

세포 동기화를 위해 화학 물질을 사용하는 다른 프로토콜에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포 분열 기계에 실수로 영향을 미칠 수 있는 생리학적 섭동이 없다는 것입니다. 화학적 동기화를 사용하여 세포주기 진행 속도를 연구하려는 시도가 분석을 방해하는 예기치 않은 결과를 얻었을 때 이 방법을 처음 사용했습니다. 이 방법은 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

예를 들어, 서로 다른 세포 유형 간의 성장률 차이의 근거는 무엇입니까? 이 작업을 수행하기 위해 BRDU로 셀에 레이블을 지정하는 펄스 체이스로 이 프로토콜을 시작합니다. 먼저 각 시점에 대해 10cm 플레이트에 하나씩 레이블을 지정하고 다음 컨트롤 각각에 대해 하나씩 레이블을 지정합니다.

BRDU 전용 PI 전용 BRDU 음수 PI 음수 시드 각 플레이트는 5 곱하기 10에서 5 번째입니다. 보충된 DMEM의 MCF 7개 세포는 세포가 회복하고 부착할 수 있도록 24-48시간 동안 플레이트를 배양합니다. 세포가 60%conf 유창성에 도달하면 배지를 10마이크로몰을 포함하는 새로운 DMEM으로 교체합니다.

BRDU는 BRDU가 DNA에 통합될 수 있도록 섭씨 37도, 5%CO2에서 1시간 동안 세포를 배양합니다. 한 플레이트 하나를 처리하지 않고 1시간 후에 네거티브 컨트롤 또는 제로 타임 포인트로 작동하도록 하십시오. 펄스 라벨링 배지를 제거하고 2-8시간 시점까지 PBS로 세포를 짧게 헹굽니다.

신선한 성장 배지를 추가하고 인큐베이터에 다시 넣습니다. 그런 다음 다음 섹션에 설명된 대로 0 및 1시간 시간 플레이트를 즉시 수확합니다. 세포를 수확하려면 배지를 흡인하고 플레이트를 헹굽니다.

PBS로 한 번, 트립신은 세포를 주시하여 플레이트에서 세포를 분리하고 5분 동안 90회 G로 3회 DMEM 원심분리기에 수집합니다. 상등액을 버리십시오. 그런 다음 스핀 후 5 분 동안 90 회 G로 3 회 얼음 차가운 PBS 원심 분리기 1-5 밀리리터로 세포를 헹구고 상층액을 버리고 100 마이크로 리터의 얼음에 세포를 다시 현탁시킵니다.

1%FBS를 함유한 콜드 PBS. FBS는 세포 응집을 방지하는 데 도움이 됩니다. 이 절차의 가장 중요한 측면 중 하나는 수확된 세포에서 단일 세포 현탁액이 있는지 확인하는 것입니다.

사실에 대해. 이를 위해 세포를 한 방울 한 방울 에탄올에 직접 추가할 수 있습니다. 이것은 매우 중요합니다 : 세포를 고정하기 위해 피펫을 사용하여 세포를 5 밀리리터의 얼음 코드에 적가형으로 추가합니다.

15 밀리리터 원뿔형 튜브에 70 % 에탄올. 얼음 위에서 30분 동안 세포를 배양하거나 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 보관합니다. 이는 다양한 시점의 샘플 수집을 중지하는 이상적인 단계이며, 샘플을 며칠 동안 에탄올에 방치하여 프로토콜의 나머지 부분을 동시에 처리하여 BRDU 및 프로피듐 요오드화물 염색을 수행할

섭씨 4도에서 세포를 제거하고 5분 동안 90배 G로 3회 원심분리합니다. 스핀 후 대부분의 고정액을 흡입하면 약 50 마이크로 리터가 남습니다. 그런 다음 소용돌이.

와류를 일으키고 있는 동안 DNA를 변성시키기 위하여 펠릿을 느슨하게 하기 위하여. 1ml의 일반 HCL Triton X 100을 적가한 후 실온에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 90배 G로 3회, 5분 동안 시료를 원심분리하여 세포를 펠렛화한 후 상층액을 흡인하고 폐기합니다.

그런 다음 세포 펠릿을 1ml의 0.1몰 테트라 붕산나트륨에 재현탁합니다. 원심분리 후 세포는 다시 흡인하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 세포 펠릿을 75마이크로리터의 BRDU 염색에 재현탁합니다.

배양 후 빛으로부터 보호된 실온에서 45분 동안 혼합 배양합니다. 이전과 같이 원심분리로 세포를 펠렛화하고 요오드화 perdium당 밀리리터당 5마이크로그램을 함유하는 PBS 1밀리리터에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 유세포분석기를 통해 PI 양성 샘플을 실행할 때 세포의 적절한 크기 분포를 보장하기 위해 전방 산란 대 측면 산란 플롯을 생성합니다.

이 두 매개변수는 모두 선형 스케일로 플롯되어야 합니다. FL 3 H 대 FL 2 W의 플롯을 동시에 보고 PI 염색 대 형광 펄스 폭을 확인합니다. 이 플롯은 세포주기의 정규 분포 패턴 내에 있는 것으로 생각되는 세포의 분획을 분리하기 위한 보행을 만드는 데 사용됩니다.

일반적으로, 이러한 분포 패턴은 PI 염색의 2개의 N 및 4개의 NDNA 함량으로부터 2개의 세포 클러스터로 특징지어지며, 이는 각각 세포 주기의 G 1 및 G 2 단계를 나타냅니다. 이 두 클러스터 사이에 위치한 일련의 세포는 세포주기의 S 단계에서 발생하는 지속적인 DNA 복제를 나타냅니다. 게이트 셀을 표시하는 플롯을 만들고, FL, Y축의 로그 스케일에 FITC를 사용하고, X축에 선형 스케일에 PI를 표시합니다.

이 플롯은 다양한 컨트롤을 사용하여 나머지 매개변수를 설정하고 데이터를 수집하는 데 사용됩니다. 분석을 위해 PI 전용 염색 샘플을 유세포 분석기의 로딩 포트에 놓고 게인을 조정하여 G 1을 x축에서 약 200에 배치합니다. 이것은 PI 염색의 히스토그램 플롯에서 더 쉽게 시각화할 수 있습니다.

다음으로 BRDU 전용 샘플을 로딩 포트에 넣고 실행합니다. 두 개의 셀 집단, BRDU 양성 및 BRDU 음성이 플롯에 나타나도록 이득을 조정합니다. 이상적으로 BRDU 음수 셀은 10에서 10 바로 아래에 위치합니다.

최종 제어는 BDU 슬래시 PI 음성 샘플입니다. 이 음수 컨트롤을 실행하여 셀이 위쪽 또는 오른쪽 사분면에 나타나지 않도록 합니다. 다양한 플롯의 매개변수가 설정되면 유세포 분석기가 보정되고 BRDU 및 PI를 처리할 준비가 됩니다. 염색된 세포는 각 샘플에 대해 최소 10, 000개의 PI 게이트 세포에서 데이터를 수집합니다.

그런 다음 FlowJo 또는 fax diva와 같은 소프트웨어를 사용하여 PI 대 FL 2 W 플롯에서 PI 양성으로 게이트된 셀을 사용하여 FITC 대 PI의 플롯을 만듭니다. 사이클링 인구를 구별하기 위해. 다음으로, BRDU 양성 모집단을 격리하기 위해 두 번째 게이트를 생성합니다.

그런 다음 세포주기 진행의 시간 경과를 추적하기 위해 G 1 또는 G 2 함량을 시간 함수로 사용하여 BRDU 양성 세포의 수를 플롯하여 진행의 세포주기를 비교합니다. 두 대장 세포주 HT 29와 LS 180 사이의 동역학. 세포는 A-B-R-D-U 펄스를 제거한 후 8시간 동안 매시간 수집되었습니다.

두 프로파일의 동역학을 비교하면, 이 피크가 없는 HT 29 세포주에 대한 해당 시점과 비교하여 LS 180 세포에서 BRDU 후 4시간 후의 t에서 G one 피크의 출현이 분명합니다. 이는 세포주기의 G 2기를 통해 세포주기 진행이 가속화되었음을 나타냅니다. 결장직장 세포주에서 LS 180은 유방암 세포주의 순환 프로파일을 생성한다.

MC 7개의 세포를 8시간 동안 매시간 수집했습니다. BRDU 펄스를 제거한 후. 그런 다음 면역 표지 및 DNA 대조염색 세포를 형광 신호에 따라 분류했습니다.

여기에서 볼 수 있듯이, CF 7개의 세포는 테스트된 두 개의 결장 직장 세포주 중 하나보다 상당히 느린 속도로 순환했습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 시점 수확과 함께 DNA의 대사 라벨링을 통해 세포주기 역학을 추적할 수 있는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.