Name: 단일 Oocyte의 Bisulfite의 돌연변이 유발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: 배우세요 단일 난자에서 비설파이트 변형을 이용한 DNA 메틸화 분석 방법을. 이 기법은 중첩 PCR 및 클로닝을 통해 조기 발생 단계의 후성유전학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 웨스턴 온타리오, 산과학 및 Gynaecology학과의 대학에 의해 지원되었다; 및 Ministryof 연구 및 혁신, 조기 연구원 상으로부터 보조금 ER06-02-188. MMD는 복제, 조기 개발 및 보건 (REDIH) 대학원 장학금에 미치는 영향에 CIHR 교육 프로그램에 의해 지원되었다.

1 일 이러한 GIBCO 물 등의 살균, 증류수로 oocyte 컬렉션 당일 신선한 다음과 같은 솔루션을 준비합니다. 유전자 오염의 가능성을 줄이기 위해 종종 장갑을 변경하고 필터 팁을 사용합니다. 언제 오픈 튜브 멀리 각도 유지하고, 사용하지 않을 때 모든 튜브를 요점을 되풀이하다. 우리는 솔루션 N +1로 만들어진 것이 좋습니다. 3퍼센트 LMP 아가로 오스 30 MG 낮은 융점 (LMP) 아가로 오스 최대 1 ML GIBCO H 2 O로 @ 70 용해 ° C 용해 용액 8 μl 용해 완충액 1 μl proteinase K 1 μl 10 % IGEPAL 사용할 준비까지 얼음 곳 2시 1분 아가로 오스 : 용해 용액은 (개인 oocyte 당 10 μl, 금액은 3 oocytes입니다) 20 μl 3퍼센트 LMP 아가로 오스 10 μl 용해 용액 @ 70 섞는다 ° C SDS의 LY시스 버퍼 (개인 oocyte 당 501 μl) <table border="0"><tbody><tr><td> 1X TE 산도 7.5 </td><td> 450 μl </td></tr><tr><td> 10% SDS </td><td> 50 μl </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td></td><td> 501 μl </td></tr></tbody></table> 1. Oocyte 컬렉션 <ol><li> M2 미디어 해부 마우스 oviducts를 삽입하고, 적운 세포 단지를 추출 ampullae 찢어. </li><li> 0.3 MG / M2 미디어 30 μl 방울의 ML hyaluronidase 용액을 사용하여 적운 전지 복잡한에서 oocytes를 분리합니다. 오직 한 긴 노출 그들을 손상시킬 수 있으므로 그것이, 적운 세포를 제거하는 데 걸리는로 솔루션 oocytes 보관하십시오. 주기적으로 적운 세포를 제거하는 M2 미디어의 30 μl 방울의 3 배 oocytes를 씻으십시오. </li><li> 산성 tyrode의 솔루션을 사용하여 조나 pellucida를 제거합니다. 또 다른 30 ​​전송할 처음엔 솔루션 중 하나를 30 μl 드롭에 oocytes를 삽입하고,μl 드롭으로 함께 수행하는 미디어는 산성을 희석하고 효율성을 감소시킵니다. 오직 한가 긴 노출 그들을 손상시킬 수 있으므로 조나을 제거하는 데 걸리는로 솔루션 oocytes 보관하십시오. 참고 : 인간 조나 pellucida가 마우스보다 산성 tyrode의 솔루션과 치료에 더 저항이기 때문에 산성 tyrode의 솔루션이나 pronase의 증가 농도는, 인간의 샘플에 사용할 수 있습니다. </li><li> 한 번 더 M2 미디어 30 μl 드롭에 oocytes 씻으십시오. </li></ol> 2. 아가로 오스의 임베딩 및 용해 <ol><li> 아가로 오스의 삽입을 수행하려면 70 ° C heatblock에 용해 용액을 넣으십시오. 용해 용액 : 2시 1분 아가로 오스를 생산 용해 용액에 preheated LMP 아가로 오스를 추가합니다. </li><li> 최소한의 M2 미디어 깨끗한 유리 슬라이드를 향해 하나의 oocyte를 놓습니다. 피펫 팁에 용해 용액, 그리고 (현미경으로) 부드럽게 그것 미님와 혼합 수 있도록 유리 슬라이드에 (~ 1 μl 이하) 소량을 추방 : 아가로 오스의 10 μl를 타고알 미디어. 부드럽게 피펫 팁에 oocyte를 데리러와 구슬이 영역을 형성하므로 300 μl 광유와 Eppendorf 튜브에 모두 10 μl 넣어. 참고 :이 프로세스는 아가로 오스로 비교적 빨리 할 수​​ 있어야합니다 단단해 온도는 빠르면 5와 ° C ~ 70 ° C. 아래로 떨어뜨리면 </li><li> 10 분 동안 얼음 튜브를 품어. 용해를 수행하려면 300 μl 미네랄 오일을 제거하고 SDS의 용해 완충액 500 μl를 추가합니다. 50 ° C의 물을 욕조에 밤새 품어. 참고 : 용해 용액 (표 1) 또한이 목적을 위해 사용될 수 있습니다. </li></ol> 제 2 일 bisulfite의 돌연변이 유발 당일 신선한 다음과 같은 솔루션을 준비합니다. 유전자 오염의 가능성을 줄이기 위해 종종 장갑을 변경하고 필터 팁을 사용합니다. 언제 오픈 튜브 멀리 각도 유지하고, 사용하지 않을 때 모든 튜브를 요점을 되풀이하다. 우리는 솔루션 N +1로 만들어진 것이 좋습니다. <table border="0"><tbody><tr><td> 3 M NaOH </td> &lt;20 ML autoclaved ddH 2 O의 TD&gt; 2.4 g NaOH </td></tr><tr><td> 0.1 M NaOH </td><td> 14.5 ML autoclaved ddH 2 O의 3M 0.5 ML </td></tr><tr><td> 0.3 M NaOH </td><td> 13.5 ML autoclaved ddH 2 O에있는 3M의 1.5 ML </td></tr></tbody></table> 2.5 M의 Bisulfite 솔루션 <ol class="lalpha"><li> 3.8 g의 나트륨 bisulfite 5.5 ML GIBCO 증류수 H 2 O 한 ML 3 M NaOH @ 실내 온도를 해산 </li><li> 110 MG의 히드로퀴논 한 ML GIBCO 증류수 H 2 O @ 90 ° C (오직 한 녹이신 수만 위해 정기적으로 믹스)를 용해 </li></ol> 완전히 용해되면 용액 ()을 섞어 및 (b) * 빛 * 저리 3. Bisulfite의 돌연변이 유발 <ol><li> 완전 500 μl SDS의 용해 버퍼를 제거하고 300 μl 광유 (~ 20 시간) 추가합니다. 나머지 모든 용해 버퍼 일을 희석합니다E 아가로 오스가 가열되고 비드가 후속 단계에서 용해에 더 민감한 메시지가 나타납니다. 즉시 bisulfite의 돌연변이 유발을 진행, 또는 최대 5 일 대한 -20 ° C에서 저장합니다. </li><li> 해당되는 경우, 냉동고에서 oocytes를 제​​거하고 (아가로 오스 비드가 상대적으로 반투명에만 때까지) 해동 봅시다. 10 분간 얼음에있는 품어 따라 90 ° C 열 구역 2.5 분 동안 품어. 참고 : 혼합이나 볶음, 이상 2.5 분 연장하거나, 온도 변동하지 마십시오. </li><li> 변성을 수행하려면 미네랄 오일을 제거하고 각 튜브, 영화 1 ML 0.1M NaOH를 추가하고 5-6 시간을 바꾸란. </li><li> 반전 37 ° C waterbath에서 15 분, 매 3-4분 동안 품어. 비드는 NaOH에 부유한다. </li><li> bisulfite 처리를 수행하려면 부드럽게 튜브를 돌려서 다음, NaOH를 제거하고 300 μl 광유와 500 μl bisulfite 솔루션을 추가합니다. 50 ° C waterbath에서 3.5 시간 동안 튜브를 품어. * 빛 * 저리 </strong&gt; 참고 : 부화 기간은 경험적으로 관심의 유전자에 대해 결정 할 수 있습니다. </li><li> desulfonation를 수행하려면 3 분 동안 얼음에 품어, 그럼, 미네랄 오일과 bisulfite 용액을 제거 부드럽게 돌려서, 1 ML 0.3 M NaOH를 추가합니다. 톡하고 5-6 시간을 바꾸란. </li><li> 반전 37 ° C waterbath에서 15 분, 매 3-4분 동안 품어. 비드는 NaOH에 부유한다. </li><li> 샘플을 씻으 먼저 부드럽게 회전하여 다음 NaOH를 제거하고 1 ML 1X TE 산도 7.5를 추가합니다. 실온 (뿌리에서)에서 5~10분 동안 흔들어. 다시 부드럽게 돌려 다음, 1X TE를 제거합니다. 두번 세탁 과정을 반복합니다. </li><li> 한 ML autoclaved ddH 2 O에 추가 실온 (뿌리에서)에서 5~10분 동안 흔들어. 부드럽게 돌려 후 H 2 O를 제거 두번 ddH 2 O 세척을 반복합니다. </li><li> 뜨는의 산도를 확인, 그것은 산도 5.0이어야합니다. 그래도 너무 기본적인면, H 2 O를하고 다시 씻어 오직 아가로 오스 될 떠나 모든 뜨는 제거광고. </li></ol> 4. 1 일 및 2 차 라운드 PCR 증폭 <ol><li> **을 씻는 동안에 1 일 왕복 PCR 믹스 ** 준비 </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 앞으로 외부 10 μm의 프라이머 </td><td> 0.5 μl </td></tr><tr><td> 외부 10 μm의 프라이머의 후진 </td><td> 0.5 μl </td></tr><tr><td> 240 NG / ML tRNA </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 13 μl </td></tr></tbody></table> Illustra 레디 - 투 - 이동 핫 스타트 PCR 비즈에 추가 조심스럽게 PCR 튜브 (~ 10 μl)로 고체 아가로 오스 비드 밀어 70 ° C와 믹스에 대한 열 25 μl 광유 추가 총 : 50 μl <ol start="2"><li> 증폭하다 참고 : 마우스 Snrpn위한 사이클링 조건 예제 94에서 2 분간 변성은 94에서 30 초 40주기에 이어 ° C, ° C, 50 ° C에서 1 분, 168시 분 ° C 및 68에서 마지막 십분 연신율 단계 ° C. 1 일 원형 마우스 H19을위한 PCR 및 Peg3 위해 온도를 어닐링하는 것은 50 ° C.이다 </li><li> 제 2 라운드 PCR 혼합물 준비 </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 앞으로 내부 10 μm의 프라이머 </td><td> 0.5 μl </td></tr><tr><td> 내부 10 μm의 프라이머의 후진 </td><td> 0.5 μl </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 19 μl </td></tr></tbody></table> Illustra 레디 - 투 - 이동 핫 스타트 PCR 비즈에 추가 템플릿으로 5 μl 제 1 라운드의 제품을 추가합니다. ° C에서 1 분 아가로 오스을 약화시키기 위해 70까지 1 일 왕복 제품을 가열. 미네랄 오일 층 아래 피펫해야합니다. 25 μl 광유 추가 총 : 50 μl 참고 : Snrpn, H19, 그리고 Peg3위한 중첩된 프라이머 시퀀스는 시장 Velker 외 10에서 찾을 수 있습니다,12. <ol start="4"><li> 증폭하다 참고 : 사이클링 조건 마우스 Snrpn위한 94에서 2 분간 변성있다 ° 94에서 30 초 40주기에 이어 C, ° C, 50 ° C에서 1 분, 그리고 68시 일분 ° C, 그리고 마지막 10 분 이격 68에서 단계 ° C에서 10. 마우스 H19과 Peg3이 필요하다 50 ° C 제 2 라운드 PCR을 위해 온도를 풀림. </li><li> 진단 테스트로 패하면서 샘플 methylation 또는 스트레인에만 제한 효소로 절단 할 수 있습니다. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 제 2의 라운드 제품 </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> 제한 효소 </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> 버퍼 </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 4 μl </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> 8 % 아크릴 아미드 겔에 소화 제품을 Electrophorese. 모든 이기종 밴드 하나 이상의 seque를 나타냅니다제정신. </li></ol> 5. TA 클로닝 및 콜로니 PCR <ol><li> 제 2 라운드 제품, 70 먼저 열을 복제 ° C에서 1 분 Promega pGEM-T 벡터 시스템 (피셔 과학 고양이 # A1360)를 사용하여 벡터로 다음 ligate 아가로 오스를 부드럽게합니다. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 제 2 라운드 PCR </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> pGEMT 쉬운 벡터 </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> Ligase </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> 2X 내고 버퍼 </td><td> 5 μl </td></tr></tbody></table> 하룻밤 @ 4 ° C에서 PCR 기계를 품어. <ol start="2"><li> 15 분 동안 얼음 유능한 E.coli 세포 (Zymo 리서치 사의 고양이 # T3009)를 녹여. 8 μl E.coli와 15 분 동안 얼음에 부화를 내고 3 μl 내고 반응을 추가합니다. </li><li> 42 ° C waterbath 40 초간 열 충격,2 분 동안 얼음에 품어. 1 시간 (뿌리)를위한 37 ° C에서 60 μl SOC 매체와 부화를 추가합니다. </li><li> 37 ° C 하룻밤에 LB / 한천 / IPTG / Xgal / 앰프 강판 및 품어 접시에 반응 혼합물을 모두 놓습니다. </li><li> 식민지 PCR 믹스를 준비 </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 20 μm의 M13 앞으로의 프라이머 </td><td> 0.7 μl </td></tr><tr><td> 20 μm의 M13 역방향 프라이머 </td><td> 0.7 μl </td></tr><tr><td> 5 배 그린 바둑 DNA 형성 촉매 버퍼 </td><td> 7.0 μl </td></tr><tr><td> 10 MM dNTP </td><td> 0.7 μl </td></tr><tr><td> DNA 형성 촉매 장치의 DNA 중합 효소 </td><td> 0.28 μl </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 25.62 μl </td></tr><tr><td></td><td> 35 μl 총 </td></tr></tbody></table> PCR 튜브에 35 μl 콜로니 PCR 마스터 믹스를 추가합니다. 피펫 팁, 그리고 PCR 반응에 소용돌이를 함께 접시에서 하얀 세균성 식민지를 선택하십시오. <ol start="6"><li> 94시 10 분 변성으로 확대 ° 94 45 초 30주기에 이어 C, ° 57에서 C 30 초 ° C, 72시 일분 ° C, 72에서 마지막 10 분 연신율 단계 ° C. 1.5 % 아가로 오스 겔에 4 μl를 Electrophorese. 시퀀싱을위한 PCR 제품의 ~ 30 μl을 보냅니다. 참고 : oocytes의 경우, 5 콜로니 PCR 제품은 순서가있다. </li><li> 시퀀싱 결과가 획득되면, methylation 패턴을 읽을 수 있습니다. CG로 남아 모든 원본 CG는 methylated했다, 이제 TG 존재하는 어떤 원래 CG가 unmethylated되었다. </li></ol> 6. 대표 결과 우리 연구에서는 분석은 개별 oocytes과 배아 (그림 1)에서 methylation을 각인. bisulfite 변환 primers를 사용하여 중첩된 PCR 증폭에 따라 그것은 아가로 오스 겔 (그림 2)에서 올바른 조각 크기를 시각화하여 성공적인 전환을 확인할 수 있습니다. 개별 oocyte가한 부모의 allele을 대표하고, 이론적으로는, 각인 methylation 패턴을 가지고 있습니다. 따라서 패하면서 PCR 제품은 무심코 오염에 대한 검사를 할 수 있습니다. 의 DNA methylation (예 : HinfI 또는 DpnII 등)에 민감한 제한 효소는 그것이 methylated 또는 unmethylated allele (그림 3)가 포함되어 있는지 여부를 평가하기 위해 두 번째 라운드 PCR 제품을 소화하는 데 사용할 수 있습니다. T로 변환된다 unmethylated C가 더 이상 효소에 의해 인식되지 않으며 포경가되는 동안 효소 인식 시퀀스 내에서 methylated C는 죽습됩니다. 그것이 적운 세포 오염 (그림 3)는 지표이기 때문에 methylated 및 unmethylated 대립 유전자 모두를 포함하는 모든 MII의 oocyte 샘플은 폐기되어야한다. 결합 및 변형에 이어 성공적인 식민지 PCR 증폭은 올바른 제품 크기 샘플 (그림 4) 시퀀싱을위한 메일이 발송되었습니다 보장하기 위해 아가로 오스 겔에 시각이 될 수 있습니다. 마지막으로, 다섯 개인 CL의 순서MII의 oocyte에서 사람 다섯 동일한 methylation 패턴과 동일한 nonCpG 전환율 (그림 5A)을 생산한다. 하나 이상의 패턴을 포함하는 모든 샘플 (그림 5B) 폐기되어야합니다. ovulated MII의 oocytes 두 염색체 사본 또는 첨부 극지 몸을 갖고 있기 때문에 두 개의 유사한 시퀀스 패턴 (그림 5c)를 취득 가능성이 있습니다. 우리는 적운 셀 오염을 배제할 수 없다 때문에 고도 ...와 비슷하지 않은 methylation 패턴을 가지고 oocytes에서 폐기 데이터를 권해드립니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig1.jpg" /> 그림 1. 단일 Oocyte의 Bisulfite의 돌연변이 유발 분석의 도식. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig2.jpg" /> 노래에서 Snrpn을위한 제 2 라운드 증폭의 그림 2. 대표 결과1.5 % 아가로 오스 겔에 르 MII의 oocyte. 레인 1-4 네 개의 싱글 MII의 oocytes이며 차선 5는 부정적인 컨트롤 (없음 oocyte)입니다. Snrpn에 대한 예상 amplicon 크기는 420 BP이다. L, 사다리. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig3.jpg" /> 8 % 아크릴 아미드 겔의 한 MII의 oocyte에서 Snrpn을위한 제 2 라운드 methylation에 특정한 제한 소화의 그림 3. 대표 결과입니다. HinfI 진단 제한 소화 (420bp, 차선 1) 제한 사이트를 abolishes T를 비호하는 unmethylated DNA를 보여줍니다 또는 (잘라내기, 262, 103, 54 BP, 차선 2) 인식 사이트 내에서 C를 포함하고 methylated DNA. methylated 및 unmethylated 두 제한 효소 사이트를 (절단 및 포경 밴드, 차선 3) 보여주는 소화 적운 세포 오염의 지표. L, 사다리. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig4.jpg" /> 4 그림. </stronG&gt; 1.5 % 아가로 오스 겔에 대한 하나의 MII의 oocyte에서 Snrpn에 대한 식민지 PCR 증폭을위한 대표 결과입니다. 예상 amplicon 크기는 pGEM-T 쉬운 벡터로 Snrpn의 결합에 따라 앞으로 M13을 사용하고 역방향 primers 것은 656 BP이다. 레인 1-8, 클론 1-8에서 amplicons. 클론 5 잘못된 amplicon 크기를 가지고 있으며, 배열 전송해​​서는 안됩니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig5.jpg" /> 그림 5. 대표 단일 MII의 oocyte에서 Snrpn에 대한 결과를 순서. Snrpn가 oocytes에 methylated있다. 검은 동그라미 methylated CpGs를 나타냅니다. 흰색 동그라미는 unmethylated CpGs를 나타냅니다. CPG 번호와 위치는 B6 변형 암컷 마우스에 대한 대표적인 것입니다. ) 단일 MII의 oocyte에서 Snrpn에 대한 결과를 순서 예상. DNA의 단일 가닥은 모두 다섯 클론으로 증폭한다. 하나의 methylation 패턴과 동일한 비 CPG 변환 은어와 OocytesN은 (비 CpGs의 비율 변환 총 비 CPG cytosines의 비율로 thymine로 변환되지 않은 CPG cytosines의 숫자로 계산 오른쪽으로 표시됨) 분석에 포함되어야한다. 적운 세포 오염과 단일 MII의 oocyte에서 Snrpn위한 나) 장면 결과입니다. 여러 개의 스트랜드 증폭을 나타내는 methylation 상태 및 전환 패턴 사이의 차이를 확인합니다. C) 염색체 사본 또는 정반대의 신체를 포함 모두와 함께 단일 MII의 oocyte에서 Snrpn에 대한 결과를 배열.

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</ol>

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이것은 하나의 oocyte 분석이 중요하고 특별한주의를 필요로 번호가 많은 단계가 있습니다. 첫 번째는 oocyte 세척이다. 그것은 가능한 많은 적운 세포로 제거하는 hyaluronidase 치료에 따라 drops 새로운 매체의 각 oocyte 여러 번 씻어 특히 중요합니다. 또한, 조나 pellucida 제거를위한 산성 tyrode의 솔루션으로 oocytes를 전송할 때하는 것은 매체를 둘러싼 것은 적운 세포의 명확한지 확인하십시오. oocyte는 조나 제거에 따라 매우 끈적이고, 모든 주변 적운 세포 쉽게 oocyte에 붙어 될 수 있습니다. 그것은 조나 프리 oocyte에 붙어있는 적운 세포를 제거하는 것은 매우 어렵습니다. 이 프로토콜은 나중에 지점에 적운 세포 오염의 검출을 허용하지만, 그것은 가능성이 폐기됩니다 oocytes에서 전체 프로토콜을 받아야하는 건설하거나 경제적으로하지 않습니다. 두 번째 중요한 단계는 oocyte의 삽입이다. 아가로 오스와 LYS에서 ...

특정 시약 및 장비의 표. <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td colspan="4"> Oocyte 컬렉션 </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> 시그마 </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> 산성 Tyrode </td><td> 시그마 </td><td> T1788 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> 시그마 </td><td> P5568 </td><td></td></tr><tr><td> 10 % IGEPAL </td><td> Bioshop </td><td> NON999.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 용해 용액 </td></tr><tr><td> 트리스 산도 7.5 </td><td> Bioshop </td><td> TRS001.5 </td><td></td></tr><tr><td> LiCl </td><td> 시그마 </td><td> L9650 </td><td> &amp; NBSP; </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 8.0 </td><td> 시그마 </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> 뚜껑 </td><td> Bioshop </td><td> LDS701.10 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> Invitrogen </td><td> P2325 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> SDS의 용해 완충액 </td></tr><tr><td> TE 산도 7.5 </td><td> Bioshop (트리스) 시그마 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) </td><td> TRS001.5 E5134 </td><td></td></tr><tr><td> 10% SDS </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Bisulfite 전환 </td></tr><tr><td> 수산화 나트륨 </td><td> 시그마 </td><td> S8045 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 Hydrogensulfite (나트륨 Bisulfite) </td><td> 시그마 </td><td> 243,973 </td><td>; </td></tr><tr><td> 히드로퀴논 </td><td> 시그마 </td><td> H9003 </td><td></td></tr><tr><td> 낮은 녹는 점 (LMP) 아가로 오스 </td><td> 시그마 </td><td> A9414 </td><td></td></tr><tr><td> 미네랄 오일 </td><td> 시그마 </td><td> M8410 </td><td></td></tr><tr><td> M2 중간 </td><td> 시그마 </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> GIBCO 증류수 물을 </td><td> Invitrogen </td><td> 15230-196 </td><td></td></tr><tr><td> Autoclaved 이중 증류 (DD) 물 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> PCR </td></tr><tr><td> Illustra 핫 스타트 믹스 RTG </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 28-9006-54 </td><td></td></tr><tr><td> 240 NG / ML 효모 tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> 5 배 그린 GoTaq 반응 버퍼 </td><td> 프로메가 </td><td> M7911 </td><td></td></tr><tr><td> 내부 및 외부 중첩된 primers </td><td> 시그마 </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 내고 </td></tr><tr><td> Promega pGEM-T 쉬운 벡터 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A1360 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> TA 복제 </td></tr><tr><td> 유능한 E.coli 세포 </td><td> Zymo 리서치 주식 회사 </td><td> T3009 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 장비 </td></tr><tr><td> 현미경 해부 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 70 ° C와 90 ° C 열 블록 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C와 50 ° C Waterbaths (42 ° C에서 변환을위한) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>흔들리는 것 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR 기계 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

단일 oocyte의 bisulfite의 돌연변이 유발

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics는 모든 물려 전할 수있는 포괄하고 가역 개조 따라서 신 유전자 접근하고,이 유전자 전사 1 규제의 기본 메커니즘임을 염색질합니다. DNA의 methylation은 억압 마르크로 주로 역할을 epigenetic 변형입니다. CPG dinucleotides의 cytosines 향해 메틸 그룹의 공유 결합 외에도 통해 그것은 염색질을 응축하고 유전자에게 2를 입을 관련된 프로세스를 시작하기 위해 추가적인 억압 단백질과 히스톤 수정을 모집할 수 있습니다. 그것이 발달 프로그래밍, 세포 분화, retroviral 요소의 억압, X 염색체 불활 성화 및 게놈 각인에 중요한 역할을 담당으로 DNA의 methylation은 정상 개발을 위해 필수적입니다. 의 DNA methylation 분석을위한 가장 강력한 방법 중 하나는 bisulfite의 돌연변이 유발됩니다. 나트륨 bisulfite은 uracils로 cytosines을 deaminates의 DNA mutagen입니다. PCR 증폭 및 seque 따라<html> ncing는 이러한 변환 이벤트가 thymines으로 감지됩니다. Methylated cytosines는 deamination로부터 보호하기 때문에 각각의 뉴클레오 티드 수준 3에서 DNA의 methylation의 식별을 가능하게, cytosines로 남아있다. bisulfite의 돌연변이 유발 분석의 개발은 원래보다 민감한 및 7 재현할 수있는 것들을 향해 4-6을보고 그에서 고급했다. 하나의 주요 발전은이를 거친 bisulfite 처리 8 일부터 DNA를 보호, 아가로 오스 비드에 DNA의 작은 금액을 삽입했습니다. 이 활성화된 methylation 분석은 oocytes와 blastocyst 단계의 배아 9 수영장에서 수행해야합니다. 날짜까지 가장 정교한 bisulfite의 돌연변이 유발 프로토콜은 개별 blastocyst 단계의 배아 10입니다. blastocysts은 평균 64 셀 (게놈의 DNA 120-720 PG를 포함하는)을 가지고 있기 때문에 그러나이 방법은 개별 oocytes 또는 절단 단 배아의 methylation 연구를위한 효과되지 않습니다. 십t &quot;&gt; oocytes 11 포함해 분의 DNA 양의 아가로 오스의 삽입에서 단서를 타고, 우리가 oocytes 직접 아가로 오스와 용해 용액 비드 후 즉시 검색하고 oocyte에서 조나 pellucida의 제거에 포함된 약자 방법을 제시한다. 이것은 우리에게 수 두 개의 단일 oocyte의 bisulfite의 돌연변이 유발의 주요 과제 우회 :. 열화로부터 DNA를 분 양을 보호하고, 다양한 프로토콜 단계 동안 후속 손실 데이터가 단일 oocytes에서 얻은 때 중요한 것은,, 수영장 이내 PCR 바이어스의 문제가 제거되고 더 나아가. 하나 이상 methylation 패턴과 아무런 샘플이 분석 12 대상에서 제외되므로 부주의 적운 세포 오염.이 방법에 의해 감지가이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 DNA의 methylation의 성공과 재현성 분석을위한 향상된 방법을 제공하고 이상적으로 적합합니다 개별 oocytes뿐만 아니라 절단 - 무대 배아입니다.

Bisulfite의 돌연변이 유발이의 DNA methylation 분석을위한 황금 표준입니다. 우리 수정된 프로토콜은 단일 세포 수준에서 DNA의 methylation 분석을 허용하고 특별히 개별 oocytes를 위해 설계되었습니다. 또한 절단 단 배아 사용할 수 있습니다.

단일 Oocyte의 Bisulfite의 돌연변이 유발

후성유전학은 유전자 접근성을 변화시키는 크로마틴의 모든 유전 가능하며 가역적인 변형을 포괄하며, 따라서 이는 ...를 위한 주요 기전이 됩니다.

본 절차의 전반적인 목적은 단일 난모세포의 DNA 메틸화를 분석하는 것입니다. 이를 위해 우선 수집된 난모세포에서 난구 세포와 소프 팔리타(soap palita)를 제거합니다. 두 번째 단계는 극소량의 DNA가 손실되거나 분해되는 것을 방지하기 위해 난모세포를 2:1 비율의 aros 용해 용액에 임베딩하는 것입니다.다음으로 비설파이트 돌연변이 유발을 수행한 후, 네스티드 중합효소 연쇄 반응(nested polymerase chain reaction)을 통해 증폭합니다. 마지막 단계는 PCR 산물을 결찰 및 클로닝하는 것입니다. 이후 클론을 선택하여 PCR로 증폭시킨 후 서열 분석을 위해 송부합니다.최종적으로, 비설파이트 변이 유도 및 시퀀싱은 단일 난세포 내 관심 영역의 사이토신-포스페이트-구아닌, 즉 CpG 디뉴클레오타이드에서의 DNA 메틸화 상태를 확인하는 데 사용됩니다. 대량의 세포를 대상으로 하는 비설파이트 변이 유도와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 여러 세포를 혼합하여 발생하는 PCR 편향 및 화학물질 오염 없이 단일 난세포로부터 데이터를 얻을 수 있다는 점입니다. 난세포 수집 당일에 서면 프로토콜에 기재된 용액들을 새로 준비하십시오. 용액을 조제할 때 장갑을 자주 교체하고 필터 팁을 사용하여 DNA 오염 가능성을 줄이십시오. 또한, 튜브를 열어둘 때는 입구가 바깥쪽을 향하게 기울여 두고, 사용하지 않을 때는 모든 튜브의 캡을 닫아 두십시오.해부된 마우스 난관을 M2 배지에 넣고 M 펄리를 당겨 난구 세포 복합체(cumulus cell complex)를 추출하여 OSI 수집을 시작합니다. 그런 다음 30 µL의 M2 배지 방울 내에 0.3 mg/mL의 hyaluronidase 용액을 사용하여 난구 세포 복합체에서 난자를 분리합니다. 장시간 노출 시 난자가 손상될 수 있으므로, 난구 세포를 제거하는 데 필요한 최소한의 시간 동안만 난자를 용액에 유지하십시오.난자를 30 µL의 M two 배지 방울로 옮겨가며 세척합니다. 세척 과정 중 주기적으로 누적세포를 제거하며, 총 3회 세척합니다. 산성 tyro 용액을 사용하여 LUCITA의 Z를 제거합니다.먼저 난자를 30 µL의 용액 방울 하나에 넣은 후, 다시 다른 30 µL 용액 방울로 옮깁니다. 이는 함께 이동하는 배지가 산을 희석시켜 효율을 떨어뜨릴 수 있기 때문입니다. 장시간 노출 시 난자가 손상될 수 있으므로, 투명대를 제거하는 데 필요한 시간 동안만 용액에 유지하십시오.투명대를 제거한 후, 난자를 30 µL의 M2 배지 방울에서 다시 세척합니다. Agros 임베딩을 수행하기 위해 먼저 용해 용액을 70 °C 히팅 블록 위에 올립니다. 예열된 저융점(LMP) Agros를 용해 용액에 추가하여 Agros와 용해 용액의 비율을 2:1로 맞춥니다. 그다음, 깨끗한 유리 슬라이드 위에 최소량의 M2 배지와 함께 난자 하나를 올립니다.다음 단계는 단일 세포를 Agros 및 용해 용액에 매립하는 것입니다. Agros는 65 °C 미만의 온도에서 경화되므로 이 작업은 신속하게 수행해야 합니다. 현미경 하에서 피펫 팁을 사용하여 Agros 용해 용액 10 µL를 취하십시오.약 1µL 이하의 agros 용해액을 슬라이드 글라스 위에 조심스럽게 분사하여 최소 배지와 섞이게 합니다. 피펫 팁으로 난모세포를 조심스럽게 집어 올립니다. 그런 다음, 생성된 비드가 구형이 되도록 300µL의 미네랄 오일이 들어 있는 einor 튜브에 10µL 전체를 넣습니다.용해를 수행하기 위해 튜브를 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 미네랄 오일 300 µL를 제거하고 SDS 용해 버퍼 500 µL를 추가합니다. 다음 날, 50 °C로 설정된 워터배스에서 샘플을 하룻밤 동안 배양합니다.서면 프로토콜에 설명된 대로 이설파이드 돌연변이 유발 솔루션을 신선하게 준비하십시오. 500 µL의 SDS 용해 버퍼를 완전히 제거함으로써 돌연변이 유발을 시작합니다. 남아 있는 용해 버퍼는 가열 시 agros를 희석시키며, 이후 단계에서 비드가 더 쉽게 용해될 수 있음에 유의하십시오.용해 버퍼를 완전히 제거한 후, 미네랄 오일 300 µL를 첨가합니다. 시료를 90 °C 가열 블록에서 2분 30초 동안 배양합니다. 혼합하거나 젓거나, 온도를 변화시키지 않도록 주의하십시오.2분 30초 후에 샘플을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 변성을 수행하려면 미네랄 오일을 제거하고 튜브에 0.1 M 수산화나트륨 1 mL를 넣은 후, 튜브를 가볍게 튕겨주고 5~6회 뒤집어 섞습니다.시료를 15분 동안 배양합니다. 37°C로 설정된 항온수조에서 3~4분마다 도립 혼합하며, 비드가 수산화나트륨 용액 속에 떠 있어야 합니다. 비드가 더 이상 튜브 바닥에 있지 않은지 확인하십시오.아황산염 처리를 수행하려면 수산화나트륨을 제거한 후 튜브를 가볍게 원심 분리하십시오. 미네랄 오일 300 µL와 BIS 아황산염 용액 500 µL를 첨가합니다. 빛에 노출되지 않도록 주의하며 50 °C 항온 수조에서 튜브를 3시간 30분 동안 배양하십시오.이제 탈염 과정을 수행합니다. 먼저 샘플을 얼음 위에서 3분 동안 배양한 후 미네랄 오일과 BIS sulfite 용액을 제거합니다. 가볍게 원심 분리한 후, 0.3 M 수산화나트륨 1 mL를 첨가하고 튜브를 5~6회 가볍게 쳐서 뒤집어 섞어줍니다.샘플을 15분 동안 배양합니다. 37°C 항온수조에서 3~4분마다 한 번씩 뒤집어주며, PCR을 시작하기 전에 비드가 수산화나트륨 내에서 부유 상태여야 합니다. 먼저 가볍게 원심 분리하여 샘플을 세척합니다.그런 다음 수산화나트륨을 제거하고 1x TE pH 7.5 1mL를 첨가합니다. 실온에서 5~10분 동안 흔들어 섞어줍니다. 다시 한번 가볍게 원심분리한 후, 1x TE를 제거합니다.이 세척 과정을 두 번 반복합니다. 그 후, 오토클레이브 멸균된 2차 증류수 1 mL를 첨가합니다. 상온에서 5~10분 동안 흔들어 섞은 뒤, 세 번째로 가볍게 원심분리하고 물을 제거합니다.2회 증류수로 세척 과정을 두 번 반복합니다. 마지막으로 상층액을 모두 제거하여 aros bead만 남깁니다. 상층액의 pH가 5.0인지 확인하십시오.상청액이 여전히 너무 염기성인 경우, 2회 증류수로 비드를 다시 세척하십시오. 그동안 서면 프로토콜에 설명된 대로 PCR 튜브에 1차 PCR 믹스를 추가하십시오. 고체 agro speed를 einor 튜브의 입구 부분까지 밀어 넣으십시오.그런 다음 agro speed를 PCR 튜브로 조심스럽게 옮기고 70 °C에서 1분 동안 가열하여 혼합한 후, 서면 프로토콜에 제안된 대로 증폭하십시오. 1차 증폭 후, 1차 산물 5 µL를 템플릿으로 사용하여 2차 PCR 반응을 준비하십시오. 반드시 미네랄 오일 층 아래에서 피펫팅하십시오.본문의 지침에 따라 진단 테스트로서 2차 증폭을 수행하십시오. 2차 라운드 샘플은 메틸화 또는 균주 특이적 제한효소로 절단한 후, 8% acrylamide 겔에서 전기영동하여 소화 산물을 확인합니다. 생성된 불균일한 밴드는 하나 이상의 서열이 존재함을 나타냅니다. 2차 증폭 산물을 클로닝하려면 벡터에 라이게이션하고, 이 비디오에 동반된 원고에 기술된 대로 TA 클로닝을 수행하십시오. TA 클로닝 후, 모든 반응 혼합물을 ampicillin, x-gal 및 IPTG가 첨가된 LB 한천 배지에 도말하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.그 후 서면 프로토콜에 기재된 대로 colony PCR master mix를 PCR 튜브에 추가합니다. 피펫 팁으로 플레이트에서 흰색 세균 콜로니를 선택하여 PCR 튜브에 담긴 35 µL의 colony PCR master mix에 넣고 섞어줍니다. 텍스트에 기술된 대로 현탁액을 증폭합니다. PCR 증폭 후, PCR 생성물 4 µL를 1.5% AGROS 겔에서 전기영동합니다.마지막으로, 사이트당 5개의 콜로니 PCR 결과물에 대해 분석하기 위해 PCR 생성물을 약 30 µL씩 시퀀싱에 보냅니다. 시퀀싱 결과가 나오면 메틸화 패턴을 읽을 수 있는데, 원래의 시토신-구아닌(cytosine guanine) 상태로 남아 있는 경우 메틸화된 것입니다. 반대로, 비설파이트 변환 프라이머를 이용한 네스티드(nested) PCR 증폭 후 원래의 시토신-구아닌이 티민-구아닌(thiamine guanine)으로 바뀌었다면 이는 메틸화되지 않은 것입니다.아가로스 겔(agarose gel)에서 정확한 단편 크기를 시각화함으로써 성공적인 전환 여부를 확인할 수 있습니다. 두 개의 난모세포는 하나의 부모 대립유전자를 나타내며, 이론적으로는 하나의 각인된 메틸화 패턴을 가집니다. 이에 따라, 2차 PCR 산물을 통해 의도치 않은 오염 여부를 테스트할 수 있습니다.DNA 메틸화에 민감한 제한 효소를 사용하여 2차 PCR 산물을 소화함으로써 메틸화된 대립유전자 또는 비메틸화된 대립유전자의 포함 여부를 평가할 수 있습니다. 여기서 효소 인식 서열 내의 메틸화된 사이토신이 절단됩니다. 반면, 티민으로 전환된 비메틸화 사이토신은 더 이상 효소에 의해 인식되지 않아 절단되지 않으며, 리게이션 및 형질전환 후 메틸화 및 비메틸화 대립유전자를 모두 포함하는 모든 제2감수분열 중기 난자 샘플은 난포 세포 오염이나 극체 포함을 나타내므로 폐기해야 합니다.성공적인 colony PCR 증폭 결과는 AROS 젤에서 시각화하여, 정확한 산물 크기를 가진 샘플만 시퀀싱으로 보내도록 확인합니다. 본 예시에서 ligation 후 예상되는 앰플리콘 크기는 56bp입니다. 여기에서 clone 5는 앰플리콘 크기가 부적절하므로 시퀀싱으로 보내지 않아야 합니다.제2 감수분열 중기 난자로부터 얻은 5개 개별 클론의 시퀀싱 결과는 5개의 동일한 메틸화 패턴과 동일한 non-CPG 전환율을 보여야 합니다. 하나 이상의 패턴이 포함된 샘플은 모두 폐기해야 합니다. 배란된 제2 감수분열 중기 난자는 두 개의 염색체 복사본을 가지거나 극체가 부착되어 있으므로, 두 개의 유사한 시퀀스 패턴이 얻어질 가능성이 있습니다.메틸화 패턴이 매우 상이한 세포의 데이터는 폐기해야 합니다. 본 절차를 수행할 때 난구 세포 오염 가능성을 배제할 수 없으므로, HI IDE 처리 후 신선한 배지에서 난자를 여러 번 세척하여 가능한 한 많은 난구 세포를 제거하는 것이 중요합니다. 둘째로, 저융점 아가로스는 65°C 미만의 온도에서 굳으므로 주의하면서 신속하게 작업하십시오.마지막으로, sodium bis sulfate와 hydroquinone은 빛에 민감하므로 반응 튜브와 용액을 알루미늄 호일로 감싸야 합니다.

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연구

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생물학

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마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가

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단일 Oocyte의 Bisulfite의 돌연변이 유발

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