단일 Oocyte의 Bisulfite의 돌연변이 유발

이 절차의 전반적인 목표는 단일 난모세포에서 DNA 메틸화를 분석하는 것입니다. 이것은 먼저 수집된 난모세포에서 적운 세포와 비누 팔리타를 제거함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 2:1 aros lysis 용액에 난모세포를 삽입하여 미세한 양의 DNA가 손실되거나 분해되는 것을 방지하는 것입니다.

다음으로 바이 아황산염 돌연변이 유발을 수행 한 다음 중첩 중합 효소 연쇄 반응을 통한 증폭을 수행합니다. 마지막 단계는 PCR 산물을 접합하고 복제하는 것입니다. 그런 다음 클론을 선별하여 PCR 증폭하고 염기서열분석을 위해 보냅니다.

궁극적으로, 이중 아황산염 돌연변이 유발 및 염기서열분석은 단일 난모세포에서 관심 영역의 시토신 인산염 구인 또는 CPG 디뉴클레오티드에서 DNA 메틸화를 보여주는 데 사용됩니다. 큰 세포 수의 이중 아황산염 돌연변이 유발과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 풀링 파이트 PCR 편향 및 화학 세포 오염 없이 단일 난모세포에서 데이터를 얻을 수 있다는 것입니다. 난모세포 채취 당일, 용액을 만들 때 서면 프로토콜에 나열된 용액을 새로 준비하고, 장갑을 자주 교체하고, 필터 팁을 사용하여 튜브를 열 때 각도를 유지하고 사용하지 않을 때 모든 튜브를 다시 닫아 DNA 오염 가능성을 줄입니다.

절개된 마우스 배란관을 M 두 배지에 배치하고 M 풀리를 뜯어 적운 세포 복합체를 추출하여 OSI 수집을 시작합니다. 그런 다음 M 2 배지 30마이크로리터 방울에 히알루로니다아제 용액 1밀리리터당 0.3mg을 사용하여 적운 세포 복합체에서 세포를 분리합니다. 세포를 용액에 보관하면 적운 세포가 손상될 수 있으므로 적운 세포를 제거하는 데 걸리는 동안만 보관하십시오.

난모세포를 한 방울에서 한 방울로 옮겨 M 두 매체의 30마이크로리터 방울로 난모세포를 세척합니다. 총 3회 세척을 위해 주기적으로 적운 세포를 제거합니다. 산성 티로 용액을 사용하여 LUCITA의 Z를 제거합니다.

먼저 난모세포를 30마이크로리터 용액 한 방울에 넣은 다음 다른 30마이크로리터 방울로 옮깁니다. 운반 된 모든 매체는 산을 희석하고 효율을 감소시킵니다. 장시간 노출되면 손상될 수 있으므로 zona를 제거하는 데 걸리는 동안만 cyte를 용액에 보관하십시오.

구역을 제거한 후, 30 마이크로 리터의 M 2 매체 방울로 세포를 다시 세척하여 섭씨 70 도의 열 블록에 용해 용액을 먼저 배치하는 아그로스 임베딩을 수행합니다. 예열된 저융점 또는 LMP Agros를 용해 용액에 첨가하여 2:1 AGROS에서 용해 용액을 생성합니다. 그런 다음 단일 난모세포를 최소 M 2개의 매체로 깨끗한 유리 슬라이드에 놓습니다.

다음 단계는 단일 cyte를 Agros 및 lysis 용액에 삽입하는 것입니다. 아그로스는 섭씨 65도 이하의 온도에서 굳어지기 때문에 이 작업은 신속하게 이루어져야 합니다. 10마이크로리터의 Agros 용해 용액을 현미경으로 피펫 팁에 넣습니다.

약 1마이크로리터 이하의 아그로스 용해 용액을 유리 슬라이드에 부드럽게 배출하여 최소한의 매체와 혼합되도록 합니다. 난모세포를 피펫 팁으로 부드럽게 집어 올립니다. 그런 다음 10마이크로리터를 모두 300마이크로리터의 미네랄 오일이 들어 있는 einor 튜브에 넣어 결과 비드가 구형을 갖도록 합니다.

얼음 위에서 튜브를 10분 동안 배양하여 용해를 수행합니다. 300마이크로리터의 미네랄 오일을 제거하고 500마이크로리터의 SDS 용해 완충액을 추가합니다. 둘째 날에는 섭씨 50도로 설정된 수조에서 밤새 샘플을 배양합니다.

서면 프로토콜에 설명된 대로 이중 황화물 돌연변이 유발 용액을 신선하게 준비합니다. 500마이크로리터의 SDS 용해 완충액을 완전히 제거하여 돌연변이 유발을 시작합니다. 남아 있는 모든 용해 완충액은 가열될 때 아그로스를 희석시키고 비드는 후속 단계에서 용해되기 더 쉽다는 점을 명심하십시오.

용해 완충액을 완전히 제거한 후 300마이크로리터의 미네랄 오일을 추가합니다. 섭씨 90도의 열 블록에서 샘플을 2분 30초 동안 배양합니다. 캐럿을 취하여 온도를 혼합하거나 저어주거나 늘리거나 변동시킵니다.

2분 30초 후. 얼음 위에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 변성을 수행하려면 미네랄 오일을 제거하고 0.1 몰 수산화 나트륨 1 밀리리터를 튜브 플릭에 넣고 튜브를 5-6 번 뒤집습니다.

샘플을 15분 동안 배양합니다. 섭씨 37도로 설정된 수조에서 3-4분마다 뒤집으면 비드가 수산화나트륨에 떠야 합니다. 비드가 더 이상 튜브 바닥에 있지 않습니다.

아황산염 처리로 수행하려면 먼저 수산화나트륨을 제거한 후 튜브를 부드럽게 회전시킵니다. 미네랄 오일 300마이크로리터와 BIS 아황산염 용액 500마이크로리터를 추가합니다. 빛에 노출되지 않도록 주의하고 섭씨 50도의 수조에서 3시간 30분 동안 튜브를 배양하십시오.

이제 desination을 수행합니다. 먼저 미네랄 오일과 BIS 아황산염 용액을 제거하기 전에 얼음에서 샘플을 3분 동안 배양합니다. 부드럽게 돌린 후 0.3몰 수산화나트륨 1ml를 넣고 튜브를 5-6회 뒤집습니다.

샘플을 15분 동안 배양합니다. 3-4분마다 뒤집는 섭씨 37도의 수조에서 다시 비드는 PCR을 시작하기 전에 수산화나트륨에 떠 있어야 합니다. 먼저 부드럽게 회전시켜 샘플을 씻으십시오.

그런 다음 수산화 나트륨을 제거하고 1 xte pH 7.5의 1 밀리리터를 첨가하십시오. 실온에서 5-10분 동안 흔듭니다. 두 번째 부드럽게 돌린 후 하나의 XTE를 제거합니다.

이 세탁 과정을 두 번 반복하십시오. 그런 다음 1ml의 오토클레이브, 이중 증류수를 추가합니다. 실온에서 5-10분 동안 흔든 후 세 번째 부드럽게 돌리고 물기를 제거합니다.

이중 증류수 세척을 두 번 반복합니다. 마지막으로 모든 상등액을 제거하고 aros bead 만 남깁니다. 상등액의 pH가 5.0인지 확인하십시오.

상층액이 여전히 염기성이도가 너무 높으면 이중 증류수로 비드를 다시 씻으십시오. 한편, 서면 프로토콜에 설명된 대로 PCR 튜브에 첫 번째 라운드 PCR 혼합물을 추가합니다. 솔리드 어그로 스피드를 einor 튜브의 가장자리로 밉니다.

그런 다음 조심스럽게 PCR 튜브로 농업 속도를 옮기고 1 분 동안 섭씨 70도까지 가열하고 혼합 한 다음 증폭하십시오. 1차 증폭 후 1차 생성물 5마이크로리터를 주형으로 사용하여 2차 PCR 반응을 준비합니다. 미네랄 오일 층 아래에서 bipa를 사용하십시오.

진단 테스트로 텍스트의 지시에 따라 두 번째 증폭 라운드를 계속 진행합니다. 두 번째 라운드 샘플은 메틸화 또는 변형 특정 전기 영동인 제한 효소로 8%아크릴아미드 겔의 소화 생성물을 절단할 수 있습니다. 그 결과로 생성된 모든 이질적인 띠는 2차 산물을 벡터로 복제하고 TA 클로닝 플레이트에 이어 이 비디오에 첨부된 원고에 설명된 대로 TA 클로닝을 수행하기 위한 하나 이상의 염기서열을 나타내며, 모든 반응 혼합물을 한천 및 LB 플레이트에 혼합하고 암피실린, ex gal 및 IPTG를 보충하고 밤새 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.

그런 다음 서면 프로토콜에 나열된 대로 콜로니 PCR 마스터 믹스를 PCR 튜브에 추가합니다. 피펫 팁으로 플레이트에서 백색 박테리아 콜로니를 선택하고 PCR 튜브에 담긴 콜로니 PCR 마스터 믹스 35마이크로리터로 소용돌이칩니다. 1.5%AGROS 겔에 PCR 산물 4마이크로리터를 PCR 증폭 전기영동 후 텍스트에 설명된 대로 현탁액을 증폭합니다.

마지막으로, 세포당 5개의 colony PCR의 염기서열분석을 위해 약 30마이크로리터의 PCR 산물을 보냅니다. 염기서열분석 결과가 얻어지면, 메틸화 패턴은 메틸화된 상태로 남아 있는 원래의 시토신 구아닌을 판독할 수 있습니다. 반대로, 지금 티아민 구아닌인 어떤 본래 cytosine guanine든지 비스무트 아황산염에 의하여 개조된 뇌관을 사용하여 중첩된 PCR 확대 후에 unmethylated unmethylated.

aros gel 개별 metaphase에서 올바른 단편 크기를 시각화하여 성공적인 변환을 확인할 수 있습니다. 두 개의 난모세포는 하나의 부모 대립유전자를 나타내며 이론적으로 하나의 각인된 메틸화 패턴을 가지고 있습니다. 2차 PCR 제품은 의도하지 않은 오염 여부를 테스트할 수 있습니다.

DNA 메틸화에 민감한 제한 효소를 사용하여 2차 PCR 산물을 분해하여 메틸화 또는 비메틸화 대립유전자를 포함하는지 여부를 평가할 수 있습니다. 여기서, 효소 인식 서열 내의 메틸화된 시토신(cytosine)이 절단됩니다. 티민(thymine)으로 전환된 메틸화되지 않은 시토신(cytosine)은 더 이상 효소에 의해 인식되지 않고 절단되지 않은 반면, 메틸화 및 비메틸화 대립유전자를 모두 포함하는 모든 중기 2 난모세포 샘플은 적운 세포 오염 또는 결찰 및 형질전환에 따른 극체 포함을 나타내므로 폐기해야 합니다.

성공적인 콜로니 PCR 증폭을 AROS 겔에서 시각화하여 올바른 제품 크기의 샘플이 염기서열분석을 위해 전송되도록 할 수 있습니다. 이 예의 경우, 접합 후 예상되는 앰플리콘 크기는 156 염기쌍입니다. 여기서 클론 5는 잘못된 앰플리콘 크기를 가지며 염기서열분석을 위해 전송해서는 안 됩니다.

중기 2 난모세포에서 5개의 개별 클론 염기서열은 5개의 동일한 메틸화 패턴과 동일한 비CPG 전환율을 생성해야 합니다. 둘 이상의 패턴이 포함된 모든 샘플은 폐기해야 합니다. 배란된 중기 2개의 세포는 두 개의 염색체 사본 또는 부착된 극성체를 가지고 있기 때문에 두 개의 유사한 서열 패턴을 얻을 가능성이 있습니다.

메틸화 패턴이 매우 다른 모든 cyte에서 데이터를 폐기해야 합니다. 적운 세포 오염을 배제할 수 없기 때문에 이 절차를 시도할 때 먼저 HI IDE 처리 후 가능한 한 많은 적운세포를 제거하기 위해 새로운 배지에서 난모세포를 여러 번 세척하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 둘째, 저융점 아그로스는 섭씨 65도 미만의 온도에서 경화되므로 신중하지만 빠르게 작업하십시오.

마지막으로, 황산비스나트륨과 하이드로퀴논은 빛에 민감하므로 반응 튜브와 용액을 호일로 감싸야 합니다.