세포 생존에 박테리아와 그 영향의 동결 건조 공법

다음 실험의 목적은 서로 다른 종류의 동결 건조 제형이 세포 생존율에 미치는 영향을 관찰하는 것입니다. 먼저, 세포 배양액을 동결 건조하기 위한 다양한 제형을 준비합니다. 그다음, 각 제형을 세포 배양액과 혼합하여 동결 건조한 후, 나중에 재수화하여 생존율을 측정합니다.

결과는 특성화된 특성과 연관될 수 있는 생존율의 차이를 보여줍니다. 이 방법은 탈수 과정 중 세포 생존에 중요한 제형의 물리적 및 구조적 특성이 무엇인지 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. pseudomonas putter의 스타터 배양액을 준비하려면, triptych soy broth(TSB) 100 milliliters에 triptych soy broth 또는 TSB가 첨가된 agar에서 배양된 세포 콜로니를 접종하는 것으로 시작하십시오. 배양액을 30 °C에서 130 RPM으로 흔들어주며 7시간 동안 배양하십시오.

배양액의 일부를 신선한 TSB로 옮겨 16시간 동안 배양합니다. 상온에서 1,500 ×g로 20분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 세포 펠릿을 150 mM 염화나트륨에 부유시켜 Resus로 세척합니다.

세포를 펠렛화하고 재부유하십시오. 제형 배지에 현탁하십시오. 세포 동결 건조를 위한 제형 용액을 준비합니다.

각각의 매트릭스 성분을 정량하여 물에 녹여 등장성 조건을 맞춥니다. 부형제, 염화나트륨 또는 기타 세포 호환성 용질을 사용하여 용액을 조정하십시오. 저점도 용액에서 세포를 균질하게 재부유시키려면, 고점도 용액 상태에서 볼텍싱을 수행하십시오.

교반 바를 넣고 혼합물을 흔들어 섞습니다. 다음으로, 제형을 미리 무게를 잰 동결 건조 바이알에 나누어 담고 바이알의 무게를 측정합니다. 각 샘플에서 100 µL를 취해 10배 연속 희석을 수행하고, 원하는 희석 배수를 도말한 후 실온에서 배양합니다. 바이알을 동결 건조기 내부에서 밀봉할 경우, 도말한 세포의 각 바이알에 고무 마개를 씌웁니다.

각 제형의 세포 수를 측정하십시오. dune, we 방법을 사용하여 건조된 박테리아 혼합물의 표면 장력을 측정합니다. 백금 링을 무색 화염에 넣어 붉게 변할 때까지 가열하여 세척하십시오.

아세톤과 보풀 없는 티슈를 사용하여 측정 용기를 헹구고 닦아낸 후, 불꽃으로 내부를 태워줍니다. 용기에 용액을 채우고, 평형에 도달하는 데 시간이 걸리는 용액의 경우 표면이 안정될 때까지 기다린 후 측정합니다. 본 실험 설정은 점도가 높은 제형에 대한 정성적 데이터를 제공합니다.

더 낮은 농도의 용액을 사용하여 표면 장력을 측정하고, 동결 건조 조건이 제형의 물리적 특성에 맞게 조정되어야 함을 외삽하십시오. 가장 중요한 파라미터는 제형의 유리 전이 온도 또는 TG이며, 물이 여전히 존재함을 나타내는 동결 농축 시료의 경우 TG'로 표기합니다. 제형의 동결 거동을 결정하기 위해, 5~10 mg의 시료를 뚜껑이 있는 시차 주사 열량 측정법 또는 DSC 알루미늄 팬에 넣으십시오.

기준으로 사용할 빈 팬을 준비합니다. 동결 건조 프로그램의 동결 단계를 모방하도록 DSC 온도 스캔 프로그램을 설정합니다. 이는 가열 스캔이 시작되기 전, 냉각 역학이 동결 건조되지 않은 제형의 TG prime에 영향을 줄 수 있기 때문입니다.

온도를 예상되는 tg보다 훨씬 낮게 내립니다. 조사 대상 제형의 특성에 따라 적절한 가열 속도를 선택하십시오. 기록된 열유속 신호는 와트(watts)로 표시되며, 가열 속도에 따라 영향을 받습니다.

가열 속도가 높을수록 TG Prime 신호가 더 크게 나타나므로, TG prime과 제형의 융점을 모두 포함하도록 온도 범위를 설정하십시오. 동결 거동이 결정되면, 시료의 온도가 항상 시료의 TG보다 낮게 유지되고 챔버 압력이 제형 내 얼음과 잔류 수분의 신속한 승화를 가능하게 하도록 동결 건조 공정의 파라미터를 조정하십시오. 동결 건조 후 건조 제품을 보호하기 위해.

동결 건조 사이클 종료 후 진공을 해제하기 전에 샘플을 동결 건조기 내에서 밀봉하여 샘플 분위기를 제어하십시오. 또는, 바이알을 선호하는 분위기 가스로 충전할 수도 있습니다. 저장 분위기에 존재하는 수분이나 산소는 세포 생존에 영향을 미치므로, 샘플이 주변 환경 조건에 노출되지 않도록 하는 것이 중요합니다.

마지막으로, X선 분석을 위해 바이알의 무게를 잽니다. 소량의 박테리아 매트릭스를 샘플 홀더에 올리고, 샘플 홀더를 X선 굴절계에 장착합니다. X선 장비와 호환되는 소프트웨어를 사용하여 샘플에 존재하는 결정상을 분석합니다.

전자현미경으로 세균 매트릭스를 분석하려면, 주사전자현미경(SEM) 스터브에 고정된 카본 테이프 위에 소량을 부착합니다. SEM 홀더를 스퍼터 코터에 넣고, 시료의 이미징을 위해 금과 팔라듐 또는 백금으로 코팅합니다. SEM 홀더를 챔버에 넣고 적절한 이미징 파라미터를 선택합니다.

예를 들어, 이 기기에서는 5 kV의 가속 전압, 3의 스폿 크기, 5 mm의 작동 거리와 이차 전자 검출기를 사용합니다. 이 표에는 냉동 제형을 가열하는 동안 DSC로 기록된 열적 이벤트, 건조 시료의 구조 및 제형 용액의 표면 장력을 포함하여 서로 다른 제형에 대한 데이터가 나열되어 있습니다. sucrose의 Tg'는 -40 °C이며, 20% w/w 미만의 sucrose 농도는 검출하기 어려울 수 있습니다.

-35 °C에서의 열적 이벤트는 여기에서 보여지는 얼음 용해의 시작과 관련이 있을 가능성이 높습니다. 서로 다른 당류 기반 제형으로 조제된 그람 음성 P putter와 그람 양성 a CHLOROPHYL cus의 생존 데이터입니다. 제형이 세포 생존을 얼마나 잘 지원하는지에 대한 경향이 두 세균 종 모두에서 유사하다는 점에 유의하십시오.

이 그래프는 동결 건조 후의 생존율과 제형의 표면 장력 사이의 상관관계를 보여주며, 표면 장력이 높을수록 생존율이 더 높다는 것을 나타냅니다. 여기에 제시된 SEM 이미지는 네 가지 서로 다른 폴리머의 건조 제형을 나타내며, fi, ccal 및 sucrose의 경우 매트릭스가 바스락거리는 종이 또는 박테리아가 내장된 물결 모양 패턴의 상호 연결된 매끄러운 시트 형태를 띱니다. 시트의 두께는 약 1 µm, 너비는 10 내지 20 µm이며, fi ccal의 표면이 더 매끄럽고 HPMC와 HEC의 시트는 훨씬 더 얇습니다.

또한, 이러한 셀룰로오스 기반 제형에서는 폴리머 대 박테리아 비율이 더 낮기 때문에 박테리아가 더 쉽게 관찰될 수 있습니다. 더욱이, HEC와 HPMC에서 염 결정이 관찰되었으며, 특히 HPMC의 폴리머 시트 표면에서 더 많은 침전물이 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 여기에 제시된 기술들을 사용하여 세포 생존력이 제형 특성에 어떻게 의존하는지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.