CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

이것은 Max MIDI 자석입니다. 매우 강력한 자기장이 발생하므로 주의하라는 문구가 적혀 있습니다. 안녕하세요, 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스 생리학 및 생물물리학과의 Mike Collins 연구실 소속 Melanie Matthew입니다.

오늘은 Milton Biotechnology 키트를 사용하여 CD4 양성 T 세포를 음성 선택법으로 준비하는 과정을 보여드리겠습니다. 여기에는 Minimax와 MiniMax 자석이 있는데, Minimax는 더 대규모의 분리에 사용됩니다. Minimax에 맞는 컬럼을 통해 최대 10⁹개의 세포를 처리할 수 있으며, MiniMax는 훨씬 적은 양의 세포 분리에 사용됩니다.

따라서 양성 분리 또는 음성 분리 여부에 따라 적절한 항체로 세포를 라벨링합니다. 이 항체들에는 자석에 부착되는 자기 비드가 달려 있습니다. 음성 선택의 경우, 관심 세포들은 컬럼을 통과하여 빠져나오게 되며, 관심 세포가 포함된 용출액(eluate)을 수집할 수 있습니다.

오늘 밤 제가 보여드릴 기술들은 무균 상태가 아니라는 점을 말씀드려야겠습니다. 따라서 이 세포들을 세포 배양에 사용하시려면, 반드시 무균 도구를 사용하여 조직 배양 후드 내에서 모든 과정을 수행해야 합니다. 제가 CD4 양성 T 세포 준비 과정을 보여드리고 있지만, 이러한 기술들 중 상당수는 Miltenyi Biotec 키트를 이용한 다른 세포 유형의 정제 과정에도 적용 가능합니다.

마우스에서 림프절을 제거했으며, 이 과정에 대한 자세한 내용은 JoVE의 '이광자 이미징을 위한 림프절 준비' 7호에서 확인하실 수 있습니다. 이제 70 µm 셀 스트레이너 내에서 림프절을 분쇄하여 단일 세포 현탁액으로 만들겠습니다. 6 mL 주사기의 뒷부분을 사용하여 림프절을 단일 세포 현탁액으로 분쇄하겠습니다.

림프절은 필터 내부의 RPMI 배지에 들어 있으며, 적절한 단일 세포 부유액을 만드는 것이 중요합니다. 필터를 사용하는 이유는 세포 덩어리가 생기지 않도록 하기 위해서입니다. 분쇄 작업을 마친 후, 배지에서 필터를 꺼내 체를 통과해 나온 모든 세포를 사용하여 단일 세포 부유액을 준비합니다.

조직을 마쇄할 때는 가능한 한 모든 조직이 충분히 분쇄되도록 해야 합니다. 이렇게 만들어진 단일 세포 현탁액에서 CD4 양성 T 세포를 정제하게 됩니다. 이제 조직 마쇄가 완료되었으며, 림프절의 대부분이 거의 다 분쇄된 것을 확인하실 수 있습니다.

여기에 6개의 림프절 모두에서 엉겨 붙은 약간의 지방 조각들과 결합 조직이 포함된 림프절 외피 일부가 남아 있습니다. 이제 셀 스트레이너를 제거합니다. 보시는 바와 같이 배지가 매우 탁한 상태입니다.

필터에서 최대한 많은 수의 세포를 얻기 위해 단일 세포 현탁액으로 가득 채웠으며, 일부 세포는 필터에 부착될 것입니다. 배지 몇 mL로 세척한 후, 모든 배지를 15 mL Falcon 튜브에 옮기고 원심 분리하여 추후 정제를 위해 세포를 펠렛화합니다. 여기 300 G에서 10분 동안 원심 분리하여 펠렛화한 단일 세포 현탁액이 있습니다.

단일 세포 현탁액에 죽은 세포의 비율이 높을 것으로 예상된다면, Miltenyi의 죽은 세포 제거 키트를 사용하는 것이 좋습니다. 이제 세포를 펠렛 형태로 가라앉혔으므로, 배지를 따라내고 적혈구 용해를 수행한 다음, 세포 수를 측정하고 이 특정 세포들에 대해 CD4 양성 T 세포 음성 선택 키트를 사용하겠습니다. 이제 RBC 용해를 진행하겠습니다.

림프구와 함께 침전시킨 적혈구를 용해하기 위해, 먼저 물을 첨가하여 용액의 삼투압을 낮춘 후 10X DPBS를 추가하여 다시 1X 용액으로 맞추겠습니다. 림프구는 적혈구보다 삼투압 변화에 더 강하지만, 림프구까지 용해되는 것을 방지하기 위해 신속하게 작업해야 합니다. 따라서 실제 시스템에 물을 넣기 전에 용해 단계에 필요한 부피의 용액들을 미리 준비해 둡니다.

림프구의 용해를 방지하고 적혈구만 선택적으로 용해하기 위해, 물을 첨가한 후 몇 초 뒤에 10 X-D-B-P-S를 추가하고자 합니다. 따라서 물 900 µL와 10 X-D-B-P-S 100 µL를 사용합니다. 물의 양은 거의 1 mL에 해당합니다.

두 파이펫을 모두 준비했습니다. 용해 단계에서 물을 넣고 몇 초간 기다린 뒤, 튜브를 가볍게 흔들어 주고 10 X-D-B-P-S를 추가한 다음 튜브를 조금 더 흔들어 줍니다. 용해하는 적혈구의 양이 많을 경우, 파괴된 세포막들이 뭉쳐 크고 무정형의 덩어리가 형성되는 것을 볼 수 있습니다.

여기에 약간의 샘플이 있는데, 세포막이 조금 파괴된 것을 볼 수 있습니다. 따라서 용해 과정을 마친 후, 피펫팅 과정에서 실수가 있었을 경우를 대비해 배지를 몇 mL 추가하여 삼투압을 적절하게 맞추고 더 이상의 용해가 진행되지 않도록 합니다. 이제 림프구를 단일 세포 부유액 상태로 준비했습니다.

다시 한번, 적혈구 용해를 수행했으며 이제 세포를 원심분리하여 펠렛(pellet)으로 만들겠습니다. 그전에 헤모사이토미터(hemo cytometer)로 세포 수를 측정하여 CD4 양성 T 세포 음성 선택 키트에 추가해야 할 항체의 양을 결정하겠습니다. 이제 MAX 버퍼에서 세포를 원심분리하였으며, 적혈구 용해를 거친 후 펠렛이 훨씬 더 하얗게 변한 것을 확인할 수 있습니다.

이제 CD4 양성 T 세포를 위해 음성 선택을 진행하겠습니다. 우선 세포를 침강시키는 데 사용한 모든 배지와 MACS 버퍼를 따라내겠습니다. 그다음 CD4 양성 T 세포 음성 선택의 첫 번째 단계인 비오틴 항체 칵테일로 표지하겠습니다.

그 다음 냉장고에서 10분 동안 배양합니다. 이제 세포의 초기 배양이 완료되었습니다. 이제 항생제가 결합된 마이크로비드를 첨가하고 다시 냉장고에 15분 동안 넣어두겠습니다.

이번 세포 분리를 위해 Miltenyi Biotec의 LS 컬럼을 사용합니다. 먼저 컬럼을 자석 홀더에 장착하고, 3 mL의 MACS 버퍼를 흘려보내 컬럼을 준비하겠습니다. 컬럼을 열어 갈고리 부분이 자석 안쪽을 향하도록 배치합니다. 이제 컬럼에 MACS 버퍼를 첨가하면, 버퍼가 LS 컬럼을 통해 내려가 바닥으로 떨어지기 시작하는 것을 볼 수 있습니다. 컬럼의 용액이 완전히 빠져나가는 것에 대해 염려하지 마십시오.

액체의 표면 장력 덕분에 세포를 추가하기 전까지 용액이 마르지 않고 유지됩니다. 세포를 추가하기 전에 MAX buffer가 컬럼을 완전히 통과하도록 하는 것이 중요합니다. 이제 an biotin magnetic beads, 세포, MAX buffer를 함께 15분 동안 배양한 후, buffer를 따라내고 세포 수에 적절한 양의 buffer로 세포를 재현탁하겠습니다.

따라서 해당 내용은 milli tiny 프로토콜을 확인하셔야 합니다. 그런 다음 max 버퍼로 막 헹궈낸 컬럼에 이를 적용하겠습니다. 이제 세포 현탁액을 컬럼에 첨가하겠습니다.

이 컬럼은 음성 선택(negative selection) 컬럼이므로, 통과하여 흘러나온 세포들을 수집하며, 이 경우 해당 세포들은 모두 CD4 양성 T 세포여야 합니다. 이제 12 mL의 max 버퍼로 컬럼을 세척하며, 다시 한번 CD4 양성 T 세포만이 포함되어 있을 용출액을 수집합니다. 이제 CD4 양성 T 세포를 원심 분리하여 가라앉히고, 이를 재현탁한 후 tau 이미징에 사용할 적절한 염색약으로 표지하겠습니다.

또한 정제한 세포의 소량 샘플을 채취하여 anti CD three 및 anti CD four로 표지한 후, FACS 분석을 통해 CD4 양성 T 세포가 순수하게 분리되었는지 확인하겠습니다. 여기 방금 원심 분리한 세포들을 보시면, 순수한 CD3, CD4 양성 T 세포 집단이어야 합니다.

지금까지 CD4 양성 T 세포의 음성 선택 과정을 보여드렸습니다. Miltenyi Biotec 키트를 사용하여 이 세포들을 마우스에 입양 전이하고, 이를 저희의 T-cell receptor-engineered mouse 실험에 활용할 예정입니다. 여러분의 실험에서도 좋은 결과가 있기를 바랍니다.