CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

이것은 Max MIDI 자석입니다. 매우 강력한 자기장이 발생하므로 주의하라는 문구가 적혀 있습니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스 생리학 및 생물물리학과 Mike Collins 연구실의 Melanie Matthew입니다.

오늘은 Miltenyi Biotec 키트를 사용하여 CD4 양성 T 세포를 음성 선택법으로 분리하는 과정을 보여드리겠습니다. 여기에는 MiniMACS와 MicroMACS 자석이 있는데, MiniMACS는 더 많은 양의 세포를 분리할 때 사용합니다. MiniMACS에 맞는 컬럼으로는 최대 10⁹개의 세포까지 처리할 수 있으며, MicroMACS는 훨씬 적은 양의 세포를 분리할 때 사용합니다.

따라서 양성 선택 또는 음성 선택 여부에 따라 적절한 항체로 세포를 표지합니다. 이 항체에는 자석에 부착되는 자기 비드가 달려 있습니다. 음성 선택의 경우, 관심 세포는 컬럼을 통과하여 흘러나오며, 관심 세포가 포함된 용출액(eluate)을 수집할 수 있습니다.

오늘 밤 제가 보여드릴 기술들은 무균 상태가 아니라는 점을 말씀드려야겠습니다. 따라서 이 세포들을 세포 배양에 사용하시려면, 반드시 조직 배양 후드 내에서 멸균된 기구를 사용하여 모든 과정을 진행해야 합니다. 비록 지금은 CD4 positive T 세포의 준비 과정을 보여드리고 있지만, 이러한 기술들 중 상당수는 Miltenyi Biotechnology 키트를 이용한 다른 세포 유형의 정제에도 적용 가능합니다.

마우스에서 림프절을 적출했으며, 이에 대한 자세한 방법은 JoVE 7권의 '이광자 이미징을 위한 림프절 준비' 편에서 확인하실 수 있습니다. 이제 70 µm 셀 스트레이너 내에서 림프절을 갈아 단일 세포 현탁액으로 만들겠습니다. 6 mL 주사기의 뒷부분을 사용하여 림프절을 단일 세포 현탁액으로 갈아내겠습니다.

림프절은 필터 내부의 RPMI 배지에 들어 있으며, 적절한 단일 세포 현탁액을 만드는 것이 중요합니다. 필터를 사용하는 이유는 세포 덩어리가 생기지 않도록 하기 위함입니다. 분쇄를 마친 후, 배지에서 필터를 꺼내 거름망을 통과한 모든 세포, 즉 단일 세포 현탁액을 사용하겠습니다.

조직을 갈 때, 가능한 한 모든 조직을 최대한으로 분쇄해야 합니다. 이 단일 세포 현탁액으로부터 CD4 양성 T 세포를 정제하게 됩니다. 이제 조직 분쇄가 완료되었으며, 림프절의 대부분이 거의 다 분해된 것을 확인하실 수 있습니다.

여기에 6개의 림프절 모두에서 유래하여 서로 엉겨 붙은 소량의 지방 조각들과 결합 조직이 약간 포함된 림프절의 피막 같은 성분들이 남아 있습니다. 이제 셀 스트레이너를 제거합니다. 보시면 배지가 매우 탁한 것을 알 수 있습니다.

필터에 부착될 일부 세포를 고려하여, 필터로부터 최대한 많은 수의 세포를 얻을 수 있도록 단일 세포 현탁액으로 가득 채웁니다. 배지 몇 mL로 이를 세척한 다음, 모든 배지를 15 mL Falcon 튜브에 피펫으로 옮기고 원심 분리하여 이후 정제 과정을 위해 세포를 펠렛화합니다. 여기 300 G에서 10분 동안 원심 분리하여 펠렛화한 단일 세포 현탁액이 있습니다.

단일 세포 현탁액 내에 사멸 세포의 비율이 높을 것으로 예상된다면, Miltenyi Biotec의 사멸 세포 제거 키트를 사용하는 것이 좋습니다. 이제 세포를 펠렛으로 만들었으므로, 배지를 따라내고 적혈구 용해를 진행한 다음, 세포 수를 측정하고 이 특정 세포들에 대해 CD4 양성 T세포 음성 선택 키트를 사용하겠습니다. 이제 RBC 용해를 진행하겠습니다.

먼저 물을 추가하여 용액의 삼투압을 낮춘 다음, 10 X-D-B-P-S를 추가하여 다시 1 x 용액으로 맞춤으로써 림프구와 함께 펠렛화한 적혈구를 용해하겠습니다. 림프구는 적혈구보다 삼투압 변화에 더 강하지만, 그렇지 않으면 우리가 원하지 않는 림프구까지 용해될 수 있으므로 여전히 빠르게 작업해야 합니다. 신속한 작업을 위해, 시스템에 실제로 물을 넣기 전에 용해에 필요한 부피를 미리 채워둡니다.

림프구의 용해는 방지하고 적혈구만 선택적으로 용해시키기 위해, 물을 넣은 후 몇 초 뒤에 10 X-D-B-P-S-A를 추가하고자 합니다. 따라서 물 900 µL(약 1 mL)와 10 X-D-B-P-S 100 µL를 준비합니다.

두 파이펫을 모두 준비했습니다. 용해 단계에서 물을 추가하고 몇 초간 기다린 후, 튜브를 가볍게 흔들어 주고 10 X-D-B-P-S를 추가한 뒤 다시 한번 튜브를 흔들어 줍니다. 용해시키는 적혈구가 많을 경우, 파괴된 세포막들이 뭉쳐 커다란 무정형 덩어리가 형성되는 것을 볼 수 있습니다.

여기 소량이 준비되어 있으며, 세포막이 약간 파괴된 것을 확인하실 수 있습니다. 따라서 용해를 마친 후, 피펫팅 과정에서 실수가 있었을 경우를 대비해 배지를 몇 mL 추가하여 삼투압을 적절하게 유지하고 추가적인 용해가 일어나지 않도록 합니다. 이제 림프구를 단일 세포 현탁액 상태로 준비했습니다.

다시 말씀드리면, 적혈구 용해를 수행하였으며 이제 원심분리하여 세포 펠렛을 형성하겠습니다. 이 작업을 수행하기 전, CD4 양성 T 세포 음성 선택 키트에 추가해야 할 항체의 양을 결정하기 위해 헤모사이토미터(hemo cytometer)로 세포 수를 측정하겠습니다. 이제 Max buffer가 들어있는 상태에서 세포를 원심분리했으며, 적혈구 용해 후 펠렛의 색이 훨씬 더 하얗게 변한 것을 확인할 수 있습니다.

이제 CD4 양성 T 세포에 대한 음성 선택을 진행하겠습니다. 먼저 세포를 원심 분리하는 데 사용한 모든 배지와 MACS 버퍼를 따라내어 제거합니다. 그런 다음, CD4 양성 T 세포 음성 선택의 첫 번째 단계인 비오틴 항체 칵테일을 사용하여 라벨링하겠습니다.

그런 다음 냉장고에서 10분 동안 배양합니다. 이제 세포의 초기 배양이 완료되었습니다. 이제 항생제가 결합된 마이크로비즈를 첨가하고 다시 냉장고에 넣어 15분 동안 보관하겠습니다.

이 특정 세포 분리를 위해 Miltenyi Biotec의 LS 컬럼을 사용합니다. 먼저 컬럼을 자성 홀더에 고정하고 3 mL의 MACS 버퍼를 흘려보내 컬럼을 준비하겠습니다. 컬럼을 열어 프롱(prong)이 자석의 안쪽을 향하도록 배치합니다. 이제 컬럼에 MACS 버퍼를 첨가하며, 버퍼가 LS 컬럼을 타고 내려가 바닥으로 떨어지는 것을 확인할 수 있습니다. 컬럼이 완전히 마르는 것에 대해서는 걱정하지 않으셔도 됩니다.

액체의 표면 장력 덕분에 세포를 첨가할 때까지 용액이 마르지 않고 유지될 것입니다. 세포를 첨가하기 전에, max 버퍼가 컬럼을 통해 완전히 스며들게 하는 것이 중요합니다. 좋습니다, biotin 자성 비드, 세포 및 max 버퍼를 넣고 15분 동안 배양한 후, 버퍼를 따라내고 세포 수에 적절한 양의 버퍼로 다시 부유시키겠습니다.

따라서 해당 내용은 milli tiny 프로토콜을 확인하시기 바랍니다. 그런 다음 max buffer로 방금 헹군 컬럼에 이를 적용하겠습니다. 이제 컬럼에 세포 현탁액을 추가하겠습니다.

본 컬럼은 음성 선택(negative selection) 컬럼이므로, 통과하여 흘러나온 세포들을 수집하며, 이 경우 수집된 세포들은 모두 CD4 양성 T세포여야 합니다. 이제 12 mL의 max buffer로 컬럼을 세척하며, 마찬가지로 CD4 양성 T세포만 포함되어 있을 용출액을 수집합니다. 이제 CD4 양성 T세포를 원심 분리하여 침전시킨 후 재현탁하고, tau 이미징에 사용할 적절한 염료로 라벨링하겠습니다.

또한, 정제한 세포의 소량 샘플을 취해 anti CD3 및 anti CD4로 표지한 후 FACS 분석을 실시하여, CD4 양성 T 세포의 순수한 집단이 확보되었는지 확인하겠습니다. 여기 방금 원심 분리한 세포의 모습입니다. 이는 순수한 CD3, CD4 양성 T 세포 집단이어야 합니다.

지금까지 CD4 양성 T 세포의 음성 선택 과정을 보여드렸습니다. Miltenyi Biotec 키트를 사용하여 이 세포들을 마우스에 입양 전이한 후, 저희의 T-cell receptor-engineered T cell(T Photon) 기계 실험 중 하나에 사용할 예정입니다. 여러분의 실험에서도 좋은 결과가 있기를 바랍니다.