Name: CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:34:55.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 배우세요 마우스 림프절에서 Miltenyi MACs 키트를 사용하여 CD4+ T 세포를 분리하는 음성 선택법을. 이 방법은 96% 이상의 순도로 면역학 연구에 필수적인 림프구를 정제합니다.

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우리는 맥 버퍼의 준비에 대한 레베카 Paquett 감사하고 싶습니다.

에서 Miltenyi 키트 또는 온라인에 포함되어있는 프로토콜 읽고 따르십시오 <a href="http://www.miltenyibiotec.com/">http://www.miltenyibiotec.com/을</a> .

<ol><li>Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+repertoire+scanning+is+promoted+by+dynamic+dendritic+cell+behavior+and+random+T+cell+motility+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).</li>
<li>Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+IA+phosphoinositide+3-kinase+modulates+basal+lymphocyte+motility+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node.</a> J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

기본 소스에서 세포의 격리는 많은 복잡한 프로토콜에 필요한 단계입니다. Miltenyi 인간이 아닌 인간 영장류, 쥐, 그리고 우리가 여기에 설명된 것과 같이, 마우스를 포함한 여러 생물에서 세포를 분리하는 키트를 제공합니다. 마그네틱 비드 기반 세포 분리는 긍정적인 선택 (또는 세포 고갈)뿐만 아니라 부정적인 선택 중 하나를 허용합니다. 여기, 우리는 온전히 나 나 곳을 CD4 + T 헬퍼 세포의 부정적인 선택을 보여줍니다. 우리가 일반적으로 ≥ 96% 순수 CD4 + / 인 경우에는 3 번 CD + 아르 세포를 정화이 표준 프로토콜을 사용합니다. 우리가이 프로토콜 비디오 외과 분석을 발휘하지 못했지만, 그것은 매우 외과를 통해 적절한 항체를 사용하여 격리 세포의 전반적인 순도를 확인하는 것이 좋습니다. 또한, 우리는 T 세포 격리의 비 멸균 방법을 보여줍니다. 무균 세포가 특정 최종 사용자 응용 프로그램에 필요한 경우, 표준 무균 조건 하에서 조직 문화 후드의 증명 절차의 모든 일을해야합니다.

<table><tbody><tr><td>MACS 버퍼</td><td>시약</td><td>없음</td><td>없음</td><td>Miltenyi의 설명대로 준비하십시오.</td></tr><tr><td>CD4+ T 세포 분리 키트: Untouched Isolation</td><td>시약</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-860</td><td>Miltenyi 시스템과 함께 사용하십시오.</td></tr><tr><td>멸균 인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>시약</td><td></td><td></td><td>MACS 버퍼 준비에 사용합니다.</td></tr><tr><td>Corning 35mm Not TC-Treated 배양 접시</td><td>기타</td><td>Corning</td><td>430588</td><td>단일 세포 현탁액 준비에 사용합니다.</td></tr><tr><td>70 micron 세포 스트레이너</td><td>도구</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td>단일 세포 현탁액 준비에 사용합니다.</td></tr><tr><td>6 mL 주사기</td><td>도구</td><td>Tyco Healthcare, Covidien</td><td>8881516051</td><td>단일 세포 현탁액 준비에 사용합니다.</td></tr><tr><td>10x Dulbecco&amp;rsquo;s 인산염 완충 식염수 (DPBS)</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>14200-075</td><td>적혈구 용해에 사용합니다.</td></tr><tr><td>멸균 증류수</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td>적혈구 용해에 사용합니다.</td></tr></tbody></table>

cd4의 분리 + miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 t 세포

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

기본 소스에서 세포의 격리는 많은 복잡한 프로토콜에 필요한 단계입니다. Miltenyi 인간이 아닌 인간 영장류, 쥐, 그리고 우리가 여기에 설명된 것과 같이, 마우스를 포함한 여러 생물에서 세포를 분리하는 키트를 제공합니다. 마그네틱 비드 기반 세포 분리는 긍정적인 선택 (또는 세포 고갈)뿐만 아니라 부정적인 선택 중 하나를 허용합니다. 여기, 우리는 온전히 나 나 곳을 CD4 + T 헬퍼 세포의 부정적인 선택을 보여줍니다. 우리가 일반적으로 ≥ 96% 순수 CD4 + / 인 경우에는 3 번 CD + 아르 세포를 정화이 표준 프로토콜을 사용합니다. 이 프로토콜은 프로토콜 해부 및 adoptively 이미징 목적으로 전송하는 T 세포와 다른 세포 유형의 정화를 위해, 목성의 문제 7 출판 마우스에서 주변 림프절의 2 광자 영상과 함께 사용됩니다. 우리가이 프로토콜 비디오 외과 분석을 발휘하지 못했지만, 그것은 매우 외과를 통해 적절한 항체를 사용하여 격리 세포의 전반적인 순도를 확인하는 것이 좋습니다. 또한, 우리는 T 세포 격리의 비 멸균 방법을 보여줍니다. 무균 세포가 특정 최종 사용자 응용 프로그램에 필요한 경우, 표준 무균 조건 하에서 조직 문화 후드의 증명 절차의 모든 일을해야합니다. 자신의 실험과 관찰과 행운을 빌어 주셔서 감사합니다!

Miltenyi 맥스 키트를 사용 lymphocytes의 격리는 전체 림프 조직 homogenates에서 세포를 정화하는 안정적인 방법입니다. Miltenyi 시스템을 사용하여 정화 세포는 일반적으로 ≥ 96% 순수하고 있습니다. 여기, 우리는 CD4 + T 세포, Miltenyi에서 제공하는 많은 키트 중 하나를 분리하기 위해 취한 단계를 보여줍니다.

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

1차 소스로부터 세포를 분리하는 것은 더 복잡한 많은 프로토콜에서 필수적인 단계입니다. Miltenyi는 다음과 같은 여러 소스로부터 세포를 분리할 수 있는 키트를 제공합니다...

이것은 Max MIDI 자석입니다. 매우 강한 자기장이 발생하므로 주의하라는 문구가 적혀 있습니다. 안녕하세요, 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스 생리학 및 생물물리학과 Mike Collins 실험실의 Melanie Matthew입니다.오늘은 Milton biotechnology 키트를 사용하여 CD4 양성 T 세포의 음성 선택 준비 과정을 보여드리겠습니다. 여기에는 minimax와 minimax magnets가 있는데, minimax는 대용량 분리에 사용됩니다. minimax에 맞는 컬럼을 통해 최대 10⁹개의 세포를 처리할 수 있으며, minimax magnets는 훨씬 더 적은 양의 세포를 처리할 때 사용됩니다.따라서 양성 분리 또는 음성 분리 여부에 따라 적절한 항체로 세포를 라벨링합니다. 항체에는 자석에 부착되는 자기 비드가 달려 있습니다. 음성 선택의 경우, 관심 세포는 컬럼을 통과하여 빠져나오며, 관심 세포가 포함된 용출액(eluate)을 수집할 수 있습니다.오늘 밤 여러분께 보여드릴 기술들은 멸균 상태가 아니라는 점을 말씀드려야겠습니다. 따라서 이 세포들을 세포 배양에 사용하시려면, 반드시 조직 배양 후드 내에서 멸균된 기구들을 사용하여 모든 과정을 수행해야 합니다. 비록 제가 CD4 양성 T 세포의 준비 과정을 보여드리고 있지만, 이러한 기술들 중 상당수는 Miltenyi Biotec 키트를 사용하여 다른 세포 유형을 정제하는 데에도 적용 가능합니다.마우스에서 림프절을 제거하였으며, 이 과정에 대한 자세한 방법은 JoVE 7권의 '이광자 이미징을 위한 림프절 준비(lymph node preparation for two photon imaging)'에서 보여드렸습니다. 이제 70 µm 셀 스트레이너(cell strainer) 내부에서 림프절을 분쇄하여 단일 세포 현탁액으로 만들겠습니다. 6 mL 주사기의 뒷부분을 사용하여 림프절을 단일 세포 현탁액으로 분쇄하겠습니다.림프절은 필터 내부의 RPMI 배지에 들어 있으며, 적절한 단일 세포 현탁액을 만드는 것이 중요합니다. 필터를 사용하는 이유는 세포 덩어리가 생기지 않도록 하기 위함입니다. 분쇄 과정을 마친 후, 배지에서 필터를 꺼내 체를 통과한 모든 세포를 회수하여 단일 세포 현탁액으로 사용합니다.조직을 갈 때, 가능한 한 모든 조직을 충분히 분쇄해야 합니다. 이 단일 세포 현탁액에서 CD4 양성 T 세포를 정제하게 됩니다. 이제 조직 분쇄가 완료되었으며, 림프절의 대부분이 거의 다 분쇄된 것을 확인하실 수 있습니다.여기에 여전히 소량의 지방 조각들과 약간의 결합 조직이 섞인 림프절 껍질 같은 부분들이 6개의 림프절 모두에서 엉겨 붙어 있습니다. 이제 셀 스트레이너(cell strainer)를 제거합니다. 보시면 배지가 매우 탁한 것을 확인할 수 있습니다.필터에 붙는 세포가 있을 수 있으므로, 필터로부터 최대한 많은 수의 세포를 얻기 위해 단일 세포 현탁액으로 가득 채웁니다. 배지 몇 mL로 세척한 다음, 모든 배지를 15 mL Falcon 튜브에 피펫으로 옮기고 원심 분리하여 추후 정제를 위해 세포를 펠렛화합니다. 여기 300 G에서 10분 동안 원심 분리하여 펠렛으로 만든 단일 세포 현탁액이 있습니다.단일 세포 현탁액에 사멸 세포의 비율이 높을 것으로 예상된다면, Miltenyi Biotec의 사멸 세포 제거 키트를 사용하는 것이 좋습니다. 이제 펠렛을 형성했으므로, 배지를 따라내고 적혈구 용해를 진행하겠습니다. 그 다음 세포 수를 측정하고, 이 특정 세포들에 대해 CD4 양성 T 세포 음성 선택 키트를 사용하겠습니다. 이제 RBC 용해를 시작하겠습니다.먼저 물을 추가하여 용액의 삼투압을 낮춘 다음, 10 X-D-B-P-S를 추가하여 다시 1 x 용액으로 맞춰줌으로써 림프구와 함께 펠렛화한 적혈구를 용해할 것입니다. 림프구는 적혈구보다 삼투압 변화에 더 강하지만, 여전히 신속하게 작업해야 하며 그렇지 않으면 우리가 원치 않는 림프구까지 용해될 수 있습니다. 신속한 작업을 위해, 시스템에 실제로 물을 추가하기 전에 용해에 필요한 부피를 미리 준비해 둡니다.림프구의 용해는 방지하고 적혈구만 선택적으로 용해시키기 위해, 물을 넣은 후 몇 초 뒤에 10 X-D-B-P-S-A를 추가하려고 합니다. 따라서 물 900 µL(거의 1 mL)와 10 X-D-B-P-S 100 µL를 취합니다.두 파이펫을 모두 준비합니다. 용해 단계에서 물을 넣고 몇 초간 기다린 후, 튜브를 가볍게 흔들어 섞고 10 X-D-B-P-S를 추가한 다음 튜브를 조금 더 흔들어 줍니다. 용해하려는 적혈구가 많을 경우, 파괴된 세포막들이 뭉쳐 커다란 무정형 덩어리가 형성되는 것을 볼 수 있습니다.여기에 소량이 있으며, 세포막이 약간 파괴된 것을 확인할 수 있습니다. 따라서 세포 용해(lysis)를 마친 후, 피펫팅 과정에서 실수가 있었을 경우에 대비해 배지를 수 mL 추가하여 삼투압을 적절하게 조절하고 세포 용해가 더 이상 진행되지 않도록 합니다. 이제 림프구를 단일 세포 현탁액 상태로 준비하였습니다.다시 한번, 적혈구 용해를 마쳤으므로 이제 세포를 원심 분리하여 펠릿으로 만들겠습니다. 이 작업을 수행하기 전에, CD4 양성 T 세포 음성 선택 키트에 추가해야 할 항체의 양을 결정하기 위해 혈구계수기로 세포 수를 측정하겠습니다. 이제 Max buffer에서 세포를 원심 분리했으며, RBC 용해 후 펠릿이 훨씬 더 하얗게 변한 것을 확인할 수 있습니다.이제 CD4 양성 T 세포에 대한 음성 선택(negative selection)을 진행하겠습니다. 먼저 세포를 원심분리하는 데 사용한 모든 배지와 Max buffer를 따라내어 제거합니다. 그런 다음, CD4 양성 T 세포 음성 선택의 첫 번째 단계인 biotin 항체 칵테일로 라벨링을 수행하겠습니다.그런 다음 냉장고에서 10분 동안 배양합니다. 이제 세포의 초기 배양이 완료되었습니다. 이제 항생제가 결합된 마이크로비드를 첨가하고 다시 냉장고에 15분 동안 보관하겠습니다.이번 세포 분리를 위해 Miltenyi Biotec의 LS 컬럼을 사용하겠습니다. 먼저 컬럼을 자성 홀더에 장착하고, 3 mL의 MACS 버퍼를 흘려보내 컬럼을 준비하겠습니다. 컬럼을 열어 돌출부가 자석 안쪽을 향하도록 배치합니다. 이제 컬럼에 MACS 버퍼를 첨가하면, 버퍼가 LS 컬럼을 따라 내려가 바닥으로 떨어지기 시작하는 것을 볼 수 있습니다. 컬럼의 용액이 모두 빠져나가 마르는 것에 대해서는 걱정하지 않으셔도 됩니다.액체의 표면 장력으로 인해 세포를 추가할 때까지 용액이 마르지 않고 유지됩니다. 세포를 추가하기 전에 max 버퍼가 컬럼을 통해 완전히 통과하도록 하는 것이 중요합니다. 자시 biotin 자성 비드, 세포 및 max 버퍼를 넣고 15분간 배양한 후, 버퍼를 따라내고 세포 수에 적합한 양의 버퍼로 다시 현탁하겠습니다.따라서 이에 대해서는 Milli-tiny 프로토콜을 확인해야 합니다. 그런 다음 Max 버퍼로 방금 헹군 컬럼에 이를 적용하겠습니다. 이제 컬럼에 세포 현탁액을 추가하겠습니다.또한, 이것은 음성 선택 컬럼이므로, 통과하여 흘러나온 세포들을 수집할 것이며, 이 경우 이들은 모두 CD4 양성 T 세포여야 합니다. 이제 12 mL의 MAC 버퍼로 컬럼을 세척할 것이며, 다시 한번 CD4 양성 T 세포만 포함되어 있어야 할 용출액을 수집하겠습니다. 이제 CD4 양성 T 세포를 원심 분리하여 가라앉히고, 이를 재부유시킨 다음, tau 이미징에 사용할 적절한 염색약으로 라벨링하겠습니다.또한 정제한 세포의 소량을 취해 anti CD3 및 anti CD4로 라벨링한 후 FACS로 분석하여 CD4 양성 T 세포의 순수한 집단이 확보되었는지 확인할 것입니다. 여기 방금 원심 분리한 세포의 모습입니다. 이들은 순수한 CD3, CD4 양성 T 세포 집단이어야 합니다.지금까지 CD4 양성 T 세포의 음성 선택 과정을 보여드렸습니다. Miltenyi Biotec 키트를 사용하여 이 세포들을 마우스에 입양 이식하고, 이를 저희의 T-cell receptor-engineered mouse 실험에 활용할 예정입니다. 여러분의 실험에서도 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

isolation-cd4-t-cells-from-mouse-lymph-nodes-using-miltenyi-macs

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

마우스 폐 돌기 세포의 고도 정화 준비가 설명되어 있습니다. 구체적인 중점이 종래의 돌기 세포 집합의 고립에 제공됩니다.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

이 비디오는 자기 분리기를 사용하여 음성 선택을 통해 마우스의 비장에서 T 세포를 농축하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 특정 세포 표면 항원에 대한 항체 또는 리간드를 사용하여 고갈을 위해 샘플의 다른 세포를 표적으로 삼는 것을 포함합니다.

T-세포 농축: 자기 분리를 통해 혼합 세포 집단에서 T-세포를 분리하는 기술

이 비디오는 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD4+Vδ1+γδ T 세포의 저농도 집단을 자기 라벨링 기반으로 분리하는 프로토콜을 보여줍니다. FITC-conjugated anti-Vδ1 antibodys, magnetic anti-FITC microbeads 및 anti-CD4 antibody-coated superparamagnetic beads의 조합을 사용하여 CD4+Vδ1+ T cell은 PBMC 집단에서 성공적으로 정제될 수 있습니다.

인간 말초 혈액 단핵 세포에서 CD4+ Vδ1+ γδ T 세포의 선택적 분리

다른 T 세포의 하위 집합에서 별개의 이펙터 기능으로, TH17 세포는 중앙 염증성자가 면역 질환에 연루되어있다. 이 체외 TH17 분화 프로토콜은 순진 CD4 + T 림프구는 TH17 세포로 분화 할 수 있고, 또한자가 면역 및 호스트 응답에서 자신의 역할을 조사할지 여부를 결정하는 방법을 제공합니다.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

이 프로토콜은 항원 밀도 단일 세포 현탁액을 원심 분리하고 그 세포 집단의 마지막 자석 및 / 또는 FACS 정렬 뒤에 조직의 소화 효소의 여러 단계를 통해 인간 흉선에서 제시 세포 분리하는 방법을 자세히 설명.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

순진한 CD4+ T cell은 활성화 시점의 환경에 따라 다양한 subset으로 분극화합니다.  naive CD4+ T cell을 다양한 effector subset으로 분화하는 것은 T cell receptor stimuli 및 specific cytokine signal의 추가를 통해 in vitro에서 달성할 수 있습니다.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

뚜렷한 수지상 세포 부분 집합은 림프 기관에서 드문 집단으로 존재하므로 면역학 실험을 위한 충분한 수와 순도로 분리하기가 어렵습니다. 여기에서는 현재 알려진 마우스 비장 수지상 세포의 모든 주요 부분 집합을 분리하기 위한 고효율, 고수율 방법에 대해 설명합니다.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

여기, 선물이 자기 세포 분류와 순진한 쥐로 후속 입양 전송 murine spleens에서 수지상 세포를 분리 하는 프로토콜. 높은 소금 활성화 수지상 세포의 모델 입양 전송 및 cytometry의 단계별 절차를 설명 하기 위해 선택 되었다.

절연 및 높은 소금의 입양 전송 처리 수지상 세포를 항 원 제시

두 광자 영상은 기저 조건에서 림프절 이내에 면역 반응 한 중 림프구 세포 운동성 및 상호 작용을 밝혀있다. 여기, 우리는 T 세포, 림프절의 고립, 그리고 CD4의 영상 운동성 + explanted 림프절의 T 세포의 입양 전송을 보여줍니다.

해부와 마우스에서 주변 림프절의 2 광자 이미징

배우세요 마우스 림프절에서 Miltenyi MACs 키트를 사용하여 CD4+ T 세포를 분리하는 음성 선택법을. 이 방법은 96% 이상의 순도로 면역학 연구에 필수적인 림프구를 정제합니다.

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

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