마우스의 Macrophages의 고갈과 Reconstitution

다음 실험의 목적은 생체 내 생물학적 과정에서 편광 대식세포의 역할을 결정하는 것입니다. 이것은 먼저 마우스에서 대식세포를 고갈시킴으로써 달성됩니다. 다음으로, 고유한 특징을 표현하고 고유한 기능을 가진 새로운 대식세포가 생성됩니다.

그런 다음 편광된 대식세포는 관심 있는 생물학적 과정에서 자신의 역할을 결정하기 위해 마우스로 채택적으로 전달됩니다. 궁극적으로, 임상적 및 조직학적 질환에 따른 대식세포 매개 염증의 차이를 측정할 수 있습니다. CD 11 BDTR 배경에 마우스를 교차시키는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 마우스를 육종하는 것보다 빠르다는 것입니다.

실험용. 비교적 쉽고 비용 효율적이며 모든 유전적 배경을 가진 마우스로 수행할 수 있습니다. 이 방법은 장에서 대식세포의 역할에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 간, 비장 및 폐를 포함한 다양한 다른 장기에도 적용할 수 있습니다.

주사 2시간 전에 섭씨 4도 온도에서 리포솜 튜브와 PBS 튜브를 제거합니다. 리포좀이 실온에 도달하면 튜브를 8-10회 뒤집어 균일한 분포를 보장합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 따뜻한 리포좀 현탁액을 1ml 주사기에 넣고 26게이지 바늘을 부착합니다.

양손의 손바닥 사이에 주사기를 굴려 6회 뒤집어 주사 전에 리포좀 용액을 고르게 분배합니다. 이제 한 손으로 귀 바로 아래에 있는 쥐의 머리와 팔다리를 움직일 수 없을 만큼 충분한 피부를 잡고 머리를 기울인 다음 머리가 약간 땅을 향하도록 마우스를 기울입니다. 그런 다음 주사기를 30-40도 각도로 잡습니다.

복부의 오른쪽 하단 사분면에 바늘을 삽입하고 200마이크로리터의 리포좀 용액을 주입합니다. 생후 8주에서 12주 된 쥐를 안락사시키고 팔다리를 쭉 뻗은 자세로 고정한 후 대퇴골과 경골을 제거하여 해부 과정에서 가능한 한 많은 근육을 잘라냅니다. 그런 다음 10%FCS가 있는 IMDM이 있는 5ml 주사기를 로드합니다.

26게이지 바늘을 연결하고 뼈에서 골수를 씻어냅니다. 골수 흡인을 40ml의 IMDM에 FCS로 희석한 다음 세포를 75cm 정사각형의 조직 배양 플라스크에 옮깁니다. 4시간 후 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양합니다.

50ml 원뿔형 튜브에 supnate를 수집하고 300배 G 및 실온에서 5분 동안 비부착성 전구 물질을 원심 분리합니다. 계수 후, 회수 된 세포를 신선한 75cm 정사각형 플라스크에서 밀리리터 당 6 개 세포 농도의 0.5 곱셈으로 배양한다. 4일차에는 비부착 세포를 스핀다운하여 새로운 배지의 플라스크로 되돌려 놓습니다.

7일째에 비부착 세포를 버리고 새로운 배지로 교체합니다. 10일째에는 미디어를 폐기합니다. 그런 다음 플라스크에 5ml의 세포 해리 완충액을 추가합니다.

5 분 후 한 손바닥의 발 뒤꿈치로 플라스크 측면을 여러 번 단단히 두드립니다. 현미경으로 세포를 검사하여 플라스크 바닥에서 들어 올려졌는지 확인합니다. 그런 다음 재현탁된 세포를 15ml 원뿔형 튜브에 피펫으로 넣습니다.

추가로 10ml의 IMDM과 FCS로 플라스크를 세척한 다음 300배 G 및 실온에서 5분 동안 셀을 스핀다운합니다. 계수 후, 회수된 세포를 멸균 PBS에서 밀리리터당 7개의 세포 농도로 10 - 7개의 농도로 재현탁시키고, 대식세포 표현형 평가를 위해 100마이크로리터로 채워진 1밀리리터 주사기를 방금 준비된 대식세포 현탁액에 26 게이지 바늘을 장착하여 시작합니다. 다음으로 더 따뜻한 마우스는 꼬리 정맥을 확장하기 위해 5-10분 동안 열 램프를 사용합니다.

마우스를 구속 장치로 옮긴 후 정맥이 위쪽을 향하도록 꼬리를 90도 회전합니다. 알코올 면봉으로 주사 부위를 닦은 다음 베벨 면이 위를 향하도록 바늘을 잡습니다. 그리고 약간의 각도로 바늘을 정맥과 거의 평행하게 삽입하십시오.

바늘이 제대로 삽입되면 저항이 느껴지지 않고 주사 후 정맥이 깨끗해져야 하며 출혈이 멈출 때까지 주사 부위에 부드러운 압력을 가합니다. 마우스 결장의 이러한 면역조직화학적 절편은 리포솜을 함유한 클로드로네이트의 복강내 주입이 DSS 유발 대장염 동안 F 4개의 80 양성 대식세포의 감소를 초래한다는 것을 보여주며, 이는 대조군 PBS 주입 마우스 아르기나아제 1개의 양성과 비교하여 갈색에서 4개의 80 염색이 감소한 것으로 입증되었습니다. 대안적으로, 갈색의 활성화된 대식세포도 클로드로네이트 리포좀 주사를 사용하여 성공적으로 고갈시킵니다.

이 그림과 이전 그림의 파란색 염색은 핵을 나타내며, 막대 그래프는 F 4 개의 80 양성 MCSF 유래 대식 세포 및 arginase의 정량적 평가를 보여줍니다. 대안적으로, 활성화된 MCSF 유래와 IL 4개의 처리된 대식세포는 클로드로네이트 리포좀의 복강내 주사를 받은 마우스에서 두 집단이 모두 현저히 고갈되었음을 나타냅니다. 이러한 데이터는 다운스트림 대사 산물 아질산염을 검출하여 지질다당류에 대한 반응으로 산화질소의 수준을 측정하는 일반적인 그리스 분석의 결과를 보여줍니다.

따라서 고전적으로 활성화된 MCSF 유래 대식세포는 대안적으로 활성화된 MCSF 유래 및 IL 4개의 처리된 대식세포에 비해 상당히 높은 수준의 아질산염을 생성합니다. 고전적으로 활성화된 대식세포는 또한 ELA에 의해 측정된 바와 같이 선택적으로 활성화된 대식세포에 비해 더 높은 IL 12 P 70 대 IL 10 비율을 생성하며, 이는 선택적으로 활성화된 표현형과 일치합니다. IL 4로 처리된 MCSF 유래 대식세포는 서양 면역 치실에 의해 검출된 바와 같이 YM 1 및 arginase 1을 구성적으로 발현합니다.

여기서, 편광 골수 유래 대식세포를 주입한 마우스의 조직학적 단면에 열거된 고전적으로 활성화된 M1 대식세포의 총 수와 대안적으로 활성화된 M2 대식세포의 수가 도시된다. C 데이터 바는 대식세포 없이 PBS 주사를 받은 대조군 마우스를 나타냅니다. DSS 유발 대장염 동안 편광 대식세포의 이동이 결장에 미치는 영향은 체중 감소, 직장 출혈 및 대변 일관성 감소를 기반으로 한 추가 점수인 질병 활성 지수로 표시됩니다.

M1 대식세포는 염증에 영향을 미치지 않는 반면, M2개의 대식세포는 질병 활성 지수를 유의하게 감소시킵니다. 따라서, 이러한 결과는 양양으로 전달된 대식세포가 유래된 dex vivo가 결장으로 이동하여 발달 후 유발 염증에 영향을 미칠 수 있음을 보여줍니다. 이 기술은 대식세포 생물학을 연구하는 연구자들이 생쥐에서 대식세포 분극의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 마우스의 항상성과 질병에서 편광 대식세포의 역할을 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.