절연 Biventricular의 NADH 형광 이미징은 토끼 하트 워킹

이 절차의 전반적인 목표는 신진대사를 연구하는 것입니다. 작동하는 심장 준비에 NADH 이미징을 사용하여 먼저 토끼 심장을 분리하여 이를 수행합니다. 절차의 두 번째 단계는 작동하는 심장 모델을 달성하기 위해 심장의 4개 챔버를 모두 성공적으로 캐뉼레이션하는 것입니다.

마지막 단계는 이미징 장비를 설정하고 다양한 페이싱 속도로 NADH 데이터를 수집하는 것입니다. 궁극적으로 결과는 형광 NADH의 이미징을 통해 심장의 대사 변화를 보여줄 수 있습니다. lanor retro profusion과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 심장이 정상적인 방향으로 흐르고 심장이 관상 동맥 관류를 위한 자체 압력을 제공하는 생리학적 상태에서 작동한다는 것입니다.

이 방법은 전기생리학과 치명적인 부정맥의 메커니즘에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 관상동맥 흐름 대사와 전기 활동 사이의 연관성을 연구하기 위한 생리학적 모델을 제공함으로써 수행됩니다. 이 방법의 시각적 시연은 혈관 및 심실 캐뉼레이션 단계를 배우기 어렵기 때문에 중요합니다.

부적절한 기술은 심장을 손상시키고 나머지 실험을 위태롭게 할 수 있습니다. 실험을 실행하기 전에 작동 중인 심장 시스템의 챔버에 있는 모든 튜브를 정제수로 헹구고 펌프를 작동하여 시스템에서 물을 제거합니다. LOR 관류 펌프, 좌측 심장 관류 펌프, 오른쪽 심장 관류 펌프에 맞춰 셀룰로오스 멤브레인 필터를 추가합니다.

시스템에 퍼퓨즈 8을 추가한 후 각 압력 센서에 대해 2점 보정을 수행합니다. 물 재킷 튜브와 열교환기를 데우는 가열된 순환 수조를 켜고 수조를 켭니다. PERFUSE 8을 가열하는 데 사용됩니다.

폐쇄 루프에서 PERFUSE 8을 순환시키는 펌프를 켜고 순환 탱크를 켜서 Perfuse에 산소를 공급합니다. 여덟, 극세사 산소공급기 또는 헤모 필터가 80킬로파스칼의 관류 8에 95%산소를 공급하고 있는지 확인하십시오. 마지막으로, 열교환기가 순환 관류의 온도를 유지하고 있는지 확인하십시오.

8 섭씨 37도에서 먼저 작동 중인 심장 시스템이 일정한 압력으로 작동하도록 설정하여 심장 절제를 시작합니다. LRF 모드. 대동맥 차단의 압력을 토끼를 진정시킨 후까지 50에서 60 사이로 설정합니다.

펜토바르비탈과 헤파린을 뒷다리 안쪽의 가장자리 귀 정맥 또는 외측 복재 정맥에 주입합니다. 토끼가 통증 반사가 부족하면 빠르게 흉강을 엽니다. 심낭을 잘라내고, 대동맥을 고정하고, 심장과 폐를 절제합니다.

폐는 폐정맥을 더 쉽게 분리할 수 있도록 부착된 상태로 유지됩니다. 다음으로, 주사기에 F 8당 60밀리리터와 헤파린 200단위를 채웁니다. 5mm 캐뉼라를 부착하고 대동맥을 캐뉼러합니다.

크기가 0인 실크 봉합사로 대동맥을 캐뉼라에 고정합니다. 그런 다음 주사기를 천천히 눌러 심장을 통해 혈액을 씻어냅니다. 먼저 심장을 대동맥 블록에 연결하여 작동하는 심장 시스템을 설정합니다.

비스듬한 각도로 커넥터에 접근하고 Perfuse Eight이 연결되어 있는 동안 커넥터에서 캐뉼라로 부드럽게 떨어지도록 합니다. 이렇게 하면 공기가 대동맥으로 들어가는 것을 방지하여 심장이 일정한 압력으로 관류되는 동안 관상 동맥 색전을 방지할 수 있습니다. L 엔도르프 모드.

지방과 결합 조직을 제거하고 다음 혈관을 찾습니다. 하대정맥 및 상대정맥, aose 정맥, 폐동맥 및 폐정맥. 다음으로, 상대대정맥을 접합합니다.

폐동맥이 오른쪽과 왼쪽으로 갈라지는 바로 아래의 폐동맥을 절단합니다. 나머지 혈관은 폐정맥입니다. 심장과 폐 사이에 그룹화하고 하나의 봉합사를 사용하여 모두 결찰합니다.

이는 두 가지 이유로 중요합니다. 첫째, 폐에 연결된 혈관을 묶으면 삽관이 완료된 후 누출이 발생하지 않습니다. 둘째, 나중에 캐뉼레이션을 벌리는 두 VNA cavas를 모두 분리하는 것이 중요합니다.

이제 폐를 제거하십시오. 좌심방 부속기의 모서리에 적절한 크기의 구멍을 뚫고 여덟 개로 채워져 있는지 확인합니다. 다음으로, 캐뉼라가 관류 8로 완전히 채워지는 동안 부속물을 캐뉼레이션합니다.

그런 다음 조직을 잡고 캐뉼라를 부속물에 봉합합니다. 좌심방 부속기의 조직은 매우 섬세하여 쉽게 찢어질 수 있습니다. 따라서 첫 번째 시도에서 왼쪽 심방을 캐뉼레이션하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 불가능할 수 있습니다.

2번 펌프를 켜서 왼쪽 심방에 흐름을 제공합니다. 실험 전반에 걸쳐 예압을 2에서 6tor 사이로 설정합니다. 압력을 조정해야 할 수도 있습니다.

목표 압력에서 2mm 이내로 유지하십시오. 이제 1번 펌프인 langor 펌프를 잠시 꺼서 심장을 작동 심장 모드로 전환하십시오. 대동맥 압력을 낮추어 토르를 경향하게 한 다음 80에서 100 토르 범위 내로 천천히 증가시킵니다.

이를 통해 대동맥 판막이 정상적인 생리학적 조건에서와 같이 열리고 기능할 수 있습니다. 최종 후부하 압력을 약 20의 값으로 설정합니다. 시스템에 직접 부착된 캐뉼러를 사용하여 최대 LV 압력보다 낮게 찢어졌습니다.

하대정맥 CVA를 통해 우심방을 캐뉼러하고 캐뉼라를 정맥으로 봉합합니다. 기포가 유입되지 않도록 하십시오. 오른쪽 펌프인 3번 펌프를 켜서 오른쪽 아트리움으로 흐름을 제공합니다.

압력을 약 3tor로 설정합니다. 마지막으로, 공기가 유입되지 않도록 우심실을 캐뉼러하고 캐뉼라를 폐동맥으로 봉합합니다. 이것으로 양심실 캐뉼레이션이 완료됩니다.

이제 신호 수집을 진행합니다. 압력 변환기 카테터를 대동맥 캐뉼라를 통해 대동맥에 조심스럽게 삽입합니다. 대동맥 판막을 지나 lv로 부드럽게 이동합니다.

카테터 팁이 올바른 위치에 있을 때 LV 압력 신호가 예상대로 나타납니다. 다음으로, 단상 작용 전위 전극을 심실 심외막에 부드럽게 누릅니다. 전극 신호에서 약간의 움직임 아티팩트가 나타나는 것은 정상입니다.

다음으로, 우심방에 양극성 자극 전극을 배치하여 실험 설계 위치에 따라 심장의 속도를 조절합니다. 그리고 CCD 카메라는 심장의 관심 영역에 초점을 맞춥니다. 카메라에 투광 필터가 부착되어 있어야 합니다.

NADH 형광을 통과하려면 주변 조명을 끄고 카메라가 부착된 워크스테이션에서 UV 광원으로 심외막을 균일하게 비춥니다. 초당 2개의 프레임으로 이미지를 획득하도록 소프트웨어를 설정합니다. 그런 다음 라이브 업데이트 모드를 선택하여 관심 영역 내의 평균 픽셀 강도를 모니터링합니다.

풍부함이 적절하다면 형광으로 표시되는 NADH 수치는 심외막 표면에서 낮고 안정적이어야 합니다. 이제 완료되면 실험을 실행합니다. 심장을 제거합니다.

PERFUSE 8과 시스템 튜브 및 챔버를 정제수로 배출합니다. 설명된 프로토콜을 사용하여 점막 TM 용액 또는 희석된 과산화수소 용액으로 시스템을 주기적으로 헹굽니다. 심장은 분당 200회에서 400회 사이의 주기 길이로 붙여졌습니다.

이완기 LVP는 일반적으로 0에서 10 tor 사이였고, 최소 이완기 대동맥 압력은 약 60 Tor, 최대 수축기 LVP는 충전 압력과 수축성에 따라 달라지며 최적은 60에서 80 사이여야 합니다. Tor, 최대 대동맥 압력과 최대 LVP는 단상 작용과 밀접하게 일치해야 합니다: 토끼 심장의 전형적인 전위는 빠른 탈분극 단계와 특징적인 재분극 단계를 가지고 있습니다. 활동 전위는 제제에서 쉽게 기록되었지만 일반적으로 이완기 동안 작은 운동 아티팩트를 가지고 있습니다.

빨간색 상자의 관심 영역에서 평균 형광 NADH 값을 측정하여 페이싱 속도가 부비동 리듬에 가까울 때 300, 200 및 150밀리초의 사이코 길이에서 세 번의 페이싱 주기 동안 미토콘드리아 산화 환원 상태의 변화를 모니터링했습니다. 기준선 NADH 수준은 사이클 길이가 짧아짐에 따라 상대적으로 일정했습니다. 300밀리초 미만의 기준선 NADH 수치는 150밀리초에서 가장 크게 증가하며 신호는 수축과 함께 진동하고 진동 빈도는 심박수에 해당합니다.

이러한 진동의 진폭은 허혈 또는 저산소증으로 인한 더 긴 시간 척도 추세보다 항상 작았습니다. 분당 200회에서 전체 전방 표면의 고해상도 형광 NADH 이미징은 분당 400회에서 일정하고 공간적으로 균일했습니다. NADH 수치는 외심 전반에 걸쳐 상당히 증가했습니다.

상당한 공간적 이질성이 관찰되었으며, 가장 큰 증가는 RV와 LV의 중격 영역 내에서 발생했다. 이 기술은 올바르게 수행되면 45분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 기포가 대동맥 또는 좌심방으로 유입되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따르십시오.

전압에 민감한 염료를 심장에 주입하는 것과 같은 추가 방법을 사용하여 발병 후 국소 허혈과 같은 병리학적 시나리오 동안 심장 표면의 전기 및 대사 활동을 연결하는 것과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 심장 생리학 연구자들이 생리학적으로 더 관련성이 높은 모델을 사용하여 병리학적 상태에서 심장 대사 및 전도 장애를 연구할 수 있는 길을 열었습니다.