가변 각도 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)시 세포 접착의 Nanotopology

이 절차의 전반적인 목표는 나노미터 정밀도로 기판 위의 세포 접착 토폴로지를 측정하는 것입니다. 이는 먼저 투명 유리 슬라이드에서 세포를 배양하고 형광 마커와 함께 배양함으로써 수행됩니다. 그런 다음 현미경 조절 거울의 각도 위치를 보정하고 해당 위치를 거울 위치 제어 프로그램에 저장합니다.

다음 단계는 약 10가지의 서로 다른 각도에서 조사 시 형광 이미지를 기록하는 것입니다. 마지막 단계는 수 나노미터의 정밀도로 세포-기질 간 거리를 계산하는 것입니다. 최종적으로, 기질 위 세포 접착의 토폴로지 결과는 예를 들어 암세포와 덜 악성인 세포와 같이 다양한 세포주 간의 접착 차이를 보여주는 데 사용됩니다.

공초점 현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 실제 해상도가 수 나노미터 범위라는 점입니다. 이 방법은 세포막에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 작은 소포나 나노 물질과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

실험 시연은 세포 샘플을 준비할 박사후 연구원 Petra와 실험을 수행할 엔지니어 Michael Wagner가 진행하겠습니다. 가변각 전반사 형광 현미경 관찰을 위한 세포 준비를 위해, 10% fetal calf serum과 항생제가 첨가된 배양액이 담긴 유리 슬라이드 위에 개별 세포를 mm²당 100 cells의 밀도로 접종합니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 72시간 동안 배양합니다.

다음으로, 배양 배지 내 8 µM 농도의 형광 막 마커 6-DDEC(2,6-diaminonaphthalene 또는 lorane)를 세포에 처리하고, 형광 현미경 관찰 전 60분 동안 배양합니다. PBS로 세포를 세척하며, 배지를 제거하기 위해 목적 슬라이드 위에 완충액을 피펫으로 분주한 후 슬라이드 뒷면의 완충액을 닦아냅니다. 가변 각도 관찰을 위해 후면 조명 및 AxioCam EMCCD 카메라가 장착된 Zeiss Axio plan과 같은 정립 현미경을 사용합니다.

T-I-R-F-M은 콘덴서를 제거하고, 오브젝트 슬라이드와 광학적으로 결합된 반원통형 유리 프리즘이 포함된 맞춤 제작 조명 장치로 대체합니다. 레이저 빔은 콜리메이트된 단일 모드 파이버로부터 입사하며, 유리 프리즘과 추가 광학 부품을 통해 이미징된 후 샘플 표면에서 다시 평행 빔이 됩니다. 이때 전기장 벡터가 입사면에 수직으로 편광되었는지 확인하십시오.

이 위치는 파이버의 출력 커플러에 표시되어 있습니다. 컨덴서 내부에 위치하여 샘플 평면에 이미징되며, 가변 입사각 또는 물체 광선 하에서 샘플을 조사하는 조절 가능 거울을 사용하십시오. 조절 가능 거울은 소프트웨어로 제어되는 스테핑 모터에 의해 구동될 수 있습니다.

각 위치는 go metric 방식의 측정으로 결정된 명확한 입사각에 해당합니다. 조절 가능한 거울의 각도 위치를 교정하려면, 물에 용해된 1 mM flavin nucleotide와 같은 형광 염료를 사용하십시오. 입사각 변화에 따른 임계각을 시각화하려면, 유리-물 계면의 임계각인 61.3도를 고정 값으로 사용하며, 입사각이 임계각과 일치하는 거울의 각도 위치는 거울 위치 제어 프로그램에 저장됩니다.

카메라 소프트웨어를 사용하여 온도 이득, 기록 시간 및 시프트 속도를 포함한 E-M-C-C-D 카메라의 파라미터를 설정합니다. 시료의 광학적 접촉을 보장하기 위해 침유를 사용하십시오. 유리 프리즘을 이용하여 세포에 적합한 배율과 중간 정도의 수치 구경을 가진 대물렌즈를 선택합니다.

현미경으로 물체를 시각화하려면 형광 검출에 적합한 롱패스(long pass) 또는 밴드패스(band pass) 필터를 사용하십시오. 조명 각도를 변화시키면서 동일한 시료의 형광 이미지를 기록하십시오. 입사각은 임계각과 같거나 그보다 커야 합니다.

세포-유리 계면의 임계각이 64.5도인 경우, 0.5도 또는 1도 간격으로 66도에서 74도 사이의 각도 범위를 권장합니다. 데이터 분석을 시작하려면 LabVIEW 프로그램을 사용하여 다양한 각도에서 기록된 이미지뿐만 아니라 카메라 설정, 여기 파장 및 굴절률을 읽어옵니다. 데이터의 적절한 평가를 위해 유리의 굴절률인 1.52와 세포의 굴절률인 1.37 설정값을 가져옵니다.

각 파라미터 세트에 대하여, 침투 깊이와 투과 계수가 자동으로 계산됩니다. 절차의 성공을 위해서는 이미지를 주의 깊게 기록하고 분석용 이미지를 선택하는 것이 중요합니다. 방정식에 따라 세포-기질 간 거리 평가에 사용할 이미지를 선택하십시오.

막 마커의 경우, 이 예시에서 보여주는 것과 같이 균일한 조명 내의 개별 이미지는 제외될 수 있습니다. 세포 기질 토폴로지 이미지를 계산하고, 평가 중에 표시할 적절한 색상 코드를 선택하십시오. 개별 픽셀의 프로필은 이 그림에 묘사된 대로 표시될 수 있습니다.

이 프로필들은 피팅 품질의 지표로 사용될 수 있습니다. 마지막으로 평가 프로토콜을 저장하십시오. 이 그림은 TP 53 종양 억제 유전자가 활성화된 U2 51 mg 교모세포종 세포의 전반사 이미지를 보여줍니다.

다양한 입사각에서 기록한 결과, evanescent 전자기장의 침투 깊이가 약 140 nm인 66도, 75 nm인 69도, 60 nm인 73도로 침투 깊이가 감소함에 따라 형광 강도가 감소하며, 이는 세포의 가장자리 focal contact와 같이 더 표면에 가까운 부위에서 유래함을 알 수 있습니다. 세포-기질 간 거리는 여기에서 보는 바와 같이 0 nm에서 600 nm까지의 색상 코드로 패널 D에 표시되어 있습니다.

세포-기질 간 거리는 흰색에서 노란색으로 표시된 단 몇 나노미터에서 진한 빨간색으로 표시된 250 내지 300 나노미터까지 세포마다 매우 다양하게 나타납니다. 이는 초점 접촉 부위와 더 넓은 세포-기질 간 거리가 매우 가까운 위치에 있음을 나타냅니다. 유사한 세포-기질 간 거리 변동이 종양 억제 유전자 P 10이 활성화된 U2 51 mg 교모세포종 세포에서도 계산되었습니다.

이와 대조적으로, 노란색으로 표시된 U2 51 mg 대조군 세포와 주황색에서 빨간색으로 표시된 야생형 세포의 세포-기질 간 거리는 발달 후 상당히 일정하게 유지됩니다. 이 기술은 세포-기질 위상 분야의 연구자들이 종양 세포와 레이저 치료에 따른 형태학적 변화를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 생물체에 무해한 낮은 광노출 상태에서 나노미터 범위의 실제 해상도로 표면을 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.