Name: 가변 각도 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)시 세포 접착의 Nanotopology (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 배우세요 VA-TIRFM을 이용해 세포 접착의 나노토폴로지를 측정하는 방법을. 형광 마커와 가변 각도 조절 거울을 사용하여 암세포와 비암세포의 접착 차이를 나노미터 정밀도로 분석합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 나라 바덴 - 뷔 르템 베르크와 Europäische 연합 (EU) - Europäischer Fonds 모피 다이 regionale Entwicklung 감사합니다 - 자금 ZAFH - 광자 N, 아니 기금 연구 기금에 대한 Bundesministerium 털 Bildung 숙녀 Forschung (BMBF)에. 1792C08뿐만 아니라 프로젝트 &quot;Aurami&quot;을 융자의 바덴 - 뷔 르템 베르크 - Stiftung GmbH가.

1. 셀 심는과 부화 <ol><li> 시드 개별 세포, 예를 들어 U373-MG 나 U-251-MG의 glioblastoma 세포 유리 슬라이드에 100 세포 / mm 2의 전형적인 밀도와 (예 : RPMI 1640 10% 태아 송아지 혈청 보충 문화 매체에서 4,872 시간을 위해 성장 37에서 보육을 사용하여 항생제) ° C 5 % CO 2. </li><li> 막 마커, 예를 들어 6 dodecanoyl-2-디메틸 아미노 8 μM (문화 매체)를 4 또는 세포질 표시의 농도에서 60 분 신청 나프탈렌 (laurdan)는, 예를 들어 calcein acetomethlyester은 40 분 신청과 함께 세포를 배양 4,5, 5 μM 3 또는 photosensitizer 관련된 멤브레인의 농도는, 예를 들어 protoporphyrin IX는 전구체 5 aminolevulinic 산 (1 MM 5 알라)는 4 시간의 부화에 유도. </li><li> 문화 중간이나 인산염으로 세포를 씻어 염분 (PBS)는 형광 현미경하기 전에 버퍼. &lt;이/ 리&gt; </ol> 2. VA-TIRFM <ol><li> 수직 현미경, 예를 Zeiss Axioplan를 사용하여 참조에 설명 된대로, 조명 장치에 의해 그것의 콘덴서를 교체하십시오. 헤미 - 구형 또는 광학 (그림 1 참조) 객체 슬라이드에 커플 링 된 헤미 - 원통형 유리 프리즘과 3. </li><li> 병렬 평형 레이저 빔을 사용하는 유리 프리즘 다시 추가로 광학 부품 (예 : 오목 거울) 샘플의 표면 (텔레 센 트릭 학생 선)에 평행 빔의 결과로 이미징 후. 전기장 벡터가 입사 평면에 수직 편광 것을 조심하고. </li><li> 샘플면에서 이미징 및 발생의 변수 각도 (개체 레이)에서 샘플을 조명하는 콘덴서 내부에 위치한 조절 미러를 사용합니다. 각 위치 입사 잘 정의 된 각도에 해당하는 곳 goniometric 측정 3 결정으로 조절 거울은, 단계 모터에 의해 구동 될 수있다 </&gt;를 논의하게 될 것입니다. </li><li> 중요한 각도를 사용하여 조절 미러의 각도 위치를 보정 Θ C = 61.3 ° 고정 값으로 유리 물 전환을위한. Θ C는 형광 염료 (예 : 1 ㎜ 플라 빈의 mononucleotide, FMN)가 물에 용해되어 Θ의 변화에 따라 시각화 할 수 있습니다. 에서 거울의 위치 Θ = Θ C 미러 위치 프로그램에 저장됩니다. </li><li> 온도, 이득, 녹화 시간과 이동 속도를 포함하여 카메라의 매개 변수를 (다시 조명 ANDOR Ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR 기술, 벨파스트, UK 6)으로 설정합니다. </li><li> 적절한 배율과 우선적으로 적당한 숫자 개구 (예 : 40 × / 0.75 또는 63 × / 0.90 물 침적)의 목적 렌즈를 사용하고 현미경의 객체 슬라이드를 현지화. 유리 프리즘과 샘플의 광학 접촉을 보장하기 위해 집중 오일을 사용합니다. 의 변화에​​ 따라 동일한 샘플의 형광 이미지를 기록조명의 각도 (Θ ≥ Θ C Θ와 C 셀 유리 인터페이스 64.5 °에 해당). 0.5 ° 또는 1 °의 단계를 66 ° -74 °의 각도 범위를 권장합니다. 형광 검출에 적합한 긴 패스 또는 밴드 패스 필터를 사용합니다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 다양한 각도 Θ뿐만 아니라 카메라 설정 (배경 차별에 대한), 여기 파장과 유리의 굴절 지수 (= 1.52 N 1) 셀에 기록 된 이미지를 (ASCII 형식으로 예를 들어) (N 2 = 1.37) 읽기 평가 프로그램에 (LabView, NanoCell). 에 대한 매개 변수 침투 깊이 D (Θ)와 전송 계수 T (Θ)의 각 집합이 자동으로 계산됩니다. </li><li> 수식 5 (막 마커) 또는 수식 4 (세포질 마커), inhomogeneous있는 개별 이미지에 따라 Δ 셀 기판 거리의 평가에 사용되는 이미지를 선택조명 (누설 E, G. 줄무늬)이 제외 될 수 있습니다. </li><li> 셀 기판 토폴로지의 이미지를 계산 및 디스플레이에 적합한 색상 코드를 선택합니다. 도 2에 도시로 개별 픽셀의 평가 프로파일 동안은 표시 할 수 있습니다. 이 프로필은 피팅의 품질에 대한 지표로 사용할 수 있습니다. </li><li> 평가 프로토콜을 저장합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 대표 실험은 친절 교수 월 Mollenhauer, 분자 종양학학과, 남부 덴마크 대학, 오덴세 (Odense)가 제공하는 유전 공학 U251-MG의 glioblastoma 세포를 수행하고 있습니다. 그 U251 세포의 두 subclones에서 종양 억제 유전자 TP53 또는 PTEN이 사용하는 오버 표현됩니다 Tet-에 inducible 표현 시스템이 세포가 감소 tumorigenic 잠재력을 전시하고 더 악성으로 간주 될 수 있다는 등.주세요 억제 유전자가없는 높은 악성 U251-MG 세포는 컨트롤로 사용하고, U251-아르MG 야생 형 세포는 더 비교 제공합니다. picosecond 펄스의 준 연속 시리즈 (; 391 나노 미터, 펄스 에너지 : 12 PJ, 반복 속도 : 파장 드라이버 PDL 800-B, Picoquant, 베를린, 독일과 LDH400 40 MHz의) 배출 레이저 다이오드는 여기 소스로 사용됩니다. 그림에서 활성 TP53 종양 억제 유전자로하고 laurdan (8 μM, 60 분)와 incubated U251-MG의 glioblastoma 세포의 3 TIRFM 이미지는 66.0 °의 입사 각도 69.0 °와 73.0 °의 침투 깊이에 해당하는에 그려져있다 약 140 nm의 사라져가는 전자기 분야, 75 nm의 60 nm의, 각각. 침투 깊이 형광을 감소와 함께 강도 감소 (비늘 참조) 세포의 더 많은 외면 사이트 (자신의 가장자리에 예를 들면 초점 연락처)에서 유래 된 것입니다. 셀 - 기판 거리가 (0-600 나노 미터 사이 인 색상 코드로 그림 3D로 시각화) 강력에 간 세포를 통해 다양통증이 몇 나노 미터 (흰색 - 노란색)과 250-300 nm의 (어두운 빨강), 즉 초점 연락처 및 큰 셀 기판 거리가 가까운 근처에 있습니다. 그림 4B, 셀 기판 거리가 U251-MG 제어 및 80-100 nm의 전형적인 값으로 야생 형 세포 (노란색에 오히려 상수를하는 동안 동일한 활성 억제 유전자 PTEN (그림 4D)와 U251-MG의 glioblastoma 세포에 대한 보유 )과 150-200 nm의 (오렌지 레드,도 4a). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" /> 그림 1. 직립 현미경의 VA-TIRFM을위한 조명 장치. 단계 모터에 의해 구동 조절 거울은 ± 0.25 °의 각도 해상도를 할 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" /> 한 PIX에 대한 그림 2. 평가의 프로필엘 (설계도). 언제 에선 [I F / T (Θ)]는 1 / D (Θ)의 함수로 도시된다, 경사가 셀 - 기판 거리 Δ를 나타냅니다. 이 경사는 일반적으로 약 정밀 ± 10 %로 결정된다. 한 값은 - inhomogeneous 조명으로 인한 - 표시 및 평가에서 제외되었습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" /> 그림 3 laurdan (8 μM, 60 분)와 부화시 활성 TP53 억제 유전자와 U251-MG의 glioblastoma 세포의 TIRFM 이미지를 표시합니다. 조명의 다양한 각도 (AC)로 기록, 0-600 nm의 범위에서 셀 기판 거리가 게재 391 나노 미터, 감지 : ≥ 420 nm의, 이미지 크기 : 여기 파장, 색상 코드 (D)에 의해. 210 μm × 210 μm은 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 그림 4 색 코드에 의해 표시 0-600 nm의 범위에서 U251-MG의 glioblatoma 전지의 셀 - 기판 거리,. () 야생 유형 (B) 컨트롤, 활성 억제 유전자 TP53와 (C) 전지, (D) 활성 억제 유전자 PTEN과 세포, 여기 파장 : 391 nm의, 감지 : ≥ 420 nm의, 이미지 크기 :. 210 μm × 210 μm은 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

<ol><li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+reflection+microscopy%3A+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li>
<li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+%28I%29+Modelling+cell+contact+region+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li>
<li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28VA-TIRFM%29%3A+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li>
<li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Opt.+Technol%22%5BJournal%5D)">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317(2008).</li>
<li>Lassalle, H. -P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28VA-TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Pathol.+Toxicol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li>
<li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device%3A+enhanced+sensitivity%2C+speed+and+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li>
<li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+with+continuous+wave+beams%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li>
<li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li>
<li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensitizers%3A+therapy+and+detection+of+malignant+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li>
<li>Ölveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+microscopy%3A+technical+innovations+and+novel+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

방법은 나노 미터 정밀도와 셀 기판 거리를 측정하기위한 설명되어 있습니다. 현재, 슈퍼 해상도 현미경의 방법은, 예를 들어 구조화 된 조명 7 일 또는 단일 분자 검출 8-10뿐만 아니라 자극 방출 고갈 (전혀 두려움을 모르는 강인한) 현미경 11 상당한 관심을 끌 수있는을 기반으로합니다. 이러한 기술 중 어느 것도 그러나, 50 nm의 아래 축 해상도를 허용하지 않습니다. 또한, 50,100의보다 높은 방사는 W / cm 2도 전혀 두려움을 모르는 강인한 현미경위한 단일 분자 방법과 3,000여 W / cm 2가 필요합니다. 이러한 문제가 발생할 가능성이 크기의 여러 명령, 살아있는 세포에 있도록 빠른 손상에 의해 (MW / cm 100 2) 태양 복사를 초과합니다. VA-TIRFM 실험에서, 그러나, 조사량은 세포 12 생활에 악영향없이 몇 분 또는 시간의 노출 시간을 허...

굴절률 N (1)의 중간을 통해 확산 광 빔이 굴절률 N 2의 두 번째 중간에 인터페이스를 만났을 때 &lt;N 1, 총 내부 반사가 중요한 각도보다 큰 발생 Θ의 모든 각도에서 발생 Θ C = arcsin (N 2 / N 1). 완전히 반영되지에도 불구하고 입사 광 빔은 I에 따라 두 번째 매체와 인터페이스에서 수직 거리를 Z로 기하 급수적으로 쇠퇴에 침투 사라져가는 전자기 필드를 세상의 시작과 끝 (Z) = I 0 EZ / D (Θ). I (z는) 등으로 주어진 파장 λ의 침투 깊이로 전자 분야와 D (Θ)의 강도에 해당 D (Θ) = (λ/4π) (N 1 2 죄가 두 Θ - N 2 2) -1 / 2 문학 1,2에보고로서, 0 </sUB&gt;는 I 이메일이 전송 요소 T (Θ) 및 비율 N 2 / N 1 곱한 입사광의 강도에 해당합니다. 이 광 빔의 전기장 벡터가 입사 평면 (사건과 반사 빔이 사라지는 비행기 IE)에 편광 수직 인 경우,이 전송 요소가 주어집니다 T (Θ) = 4 왜냐하면이 Θ / [1 - (N 2 / NL 1) 2] TIRFM 측정에서 검출 된 형광 강도를 들어, 광 흡수는 시료의 모든 레이어를 통해 통합과 관련 염료의 형광 양자 수율 η로뿐만 아니라 감지 Ω의 고체 각도 곱해야합니다. 이전에 3보고,이 강도는에 의해 설명 될 수있다 I F (Θ) = (Θ) OC (Z) AT 전자 Z / D (Θ) dz 경우 독립적 인 F있는 모든 요소<html> fluorophores의 농도 C (Z)이 거의 일정으로 간주되는 경우 ROM이 입사 각도 Θ과 좌표 Z는 실험 상수 A. 방정식 3에서 포함되어 있습니다이 analytically 해결 될 수 - 중 모든 좌표 Z ≥ Δ에서 인터페이스에서 거리 Δ을 갖는 세포의 세포질 내에서 지정할 수있다. 이 경우 적분은 Z = Δ부터 Z = ∞ 결과 계산해야합니다 I F = C T (Θ) D (Θ) E-Δ / D (Θ) - 또는 Z 사이 = Δ - t / 2, Z = Δ + t / 2, 두께 t의 얇은 층 내에서 즉, 예를 들어 인터페이스에서 거리 Δ에있는 세포막. 이 경우 형광 강도는 다음과 같이 계산 될 수있다 I F = C T (Θ) 테-Δ / D (Θ), t는 Δ에 비해 작은 경우. 형광 강도 I F의 이미지가 변수 각도에 기록하는 경우 방정식 (4)와 (5) 셀 기판 거리에서 다닐 &quot;&gt;는 Δ는 계산 될 수있다 Θ 있으며, 경우 후면 (I F / T D) (Eq. 4) 또는 후면 (I F / T) (Eq. 5) 이러한 각도 1 / D의 함수로 계산됩니다.이 문서에 사용 된 막 마커 laurdan (S. 아래)에 대한 평가가 EQ 5.에 따라 수행되었다. 이전 3, 이미지 수집보고 및 평가가 필요로 - 샘플을 여기 빛의 균일 한 분배, - 2 층 모델 (기판과 세포질의 굴절 지수 N 1과 N 2, 각각)의 타당성. 플라즈마 막가 매우 얇은 경우이 보유하고 있으며, 세포 매체 (셀과 기판 사이)의 층은 입사광의 파장에 비해 작은 경우. 또한, 중간 수치 개구(일반적으로 ≤ 0.90) 현미경 대물 렌즈의는 유전체 인터페이스의 가까운 분야에서 방사선의 이방성에 의한 밝기의 편차를 방지하기 위해 바람직하다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 유형 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 보육기 </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> 층류 </td><td> 안전 Holten </td><td> S2010 1.2 EN GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> BIOCHROM </td><td></td><td> 재배 매체 </td></tr><tr><td> 유리 객체 슬라이드 </td><td> Marienfeld </td><td> 순수 흰색 유리 </td><td> 사용되는 특별한 청소 절차 </td></tr><tr><td> 6 - dodecanoyl-2-디메틸 아미노 나프탈렌 (laurdan) </td><td> 분자 프로브 </td><td></td><td> 형광 마커 (증권 솔루션 : 에탄올 2 ㎜) </td></tr><tr><td> 현미경 </td><td> 칼 Zeiss </td><td> Axioplan 1 </tD&gt; <td></td></tr><tr><td> 레이저 다이오드 </td><td> PicoQuant </td><td> 드라이버 PDL 800-B와 LDH 400 </td><td> 파장 : 391 nm의 </td></tr><tr><td> 단일 모드 광섬유 시스템 </td><td> 포인트 소스 </td><td> kineFlex </td><td> collimating 광학와 함께 사용 </td></tr><tr><td> EMCCD 카메라 </td><td> ANDOR </td><td> DV887DC </td><td> 다시 조명 카메라 </td></tr></tbody></table>

가변 각도 총 내부 반사 형광 현미경 (va-tirfm)시 세포 접착의 nanotopology

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

표면 토폴로지, 기판에 성장 세포의 예는 가변 각도 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)에 의해 나노 미터 정밀도로 결정됩니다. 전지는 투명 슬라이드에 재배하고 homogeneously의 플라즈마 막에 배포 형광 마커와 incubated 수 있습니다. 조명이 사라져가는 전자기 필드의 다른 침투 깊이있는 총 내부 반사 (티르)의 변수 각도에 따라 병렬 레이저 빔에 의해 발생합니다. 10 다른 각도에서 조사시 형광 이미지의 기록은 몇 나노 미터의 정밀도로 셀 기판 거리를 계산 할 수 있습니다. 다양한 세포 라인, 예를 들어 암 세포의 정확성과 악성 세포 사이 접착력의 차이 따라서 결정됩니다. 또한, 화학 또는 photodynamic 치료시 세포 접착의 가능한 변경 사항은 검사를 할 수 있습니다. 슈퍼 해상도의 다른 방법에 비해 현미경 조명에 노출이 유지된다살아있는 세포의 아주 작은, 알 수없는 피해가 발생할 것으로 예상된다.

기판 상에 세포 접착의 토폴로지는 가변 앵글 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)에 의해 나노 미터의 정밀도로 측정됩니다.

가변 각도 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)시 세포 접착의 Nanotopology

기질 상에서 성장하는 세포와 같은 표면 토폴로지는 가변 각도 전반사 형광(Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence)을 통해 나노미터 정밀도로 결정됩니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 나노미터 정밀도로 기판 위 세포 접착의 토폴로지를 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 투명 유리 슬라이드에서 세포를 배양하고 형광 마커와 함께 인큐베이션합니다. 그런 다음 현미경 조절 거울의 각도 위치를 보정하고 해당 위치를 거울 위치 설정 프로그램에 저장합니다.다음 단계는 약 10가지의 서로 다른 각도에서 조사 시 형광 이미지를 기록하는 것입니다. 마지막 단계는 수 나노미터의 정밀도로 세포-기질 간 거리를 계산하는 것입니다. 궁극적으로, 기질 위 세포 부착의 토폴로지 결과는 예를 들어 암세포와 덜 악성인 세포와 같이 다양한 세포주 간의 부착 차이를 보여주는 데 사용됩니다.공초점 현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 실제 해상도가 단 몇 나노미터 범위라는 점입니다. 이 방법은 세포막에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 작은 소포나 나노 물질과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.실험 시연은 세포 샘플을 준비할 박사후 연구원 Petra와 실험을 진행할 엔지니어 Michael Wagner가 맡을 예정입니다. 가변각 전반사 형광 현미경 관찰을 위한 세포 준비를 위해, 10% fetal calf serum 및 항생제가 첨가된 배양액이 담긴 유리 슬라이드 위에 개별 세포를 100 cells/mm² 밀도로 분주합니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 72시간 동안 배양합니다.다음으로, 배양 배지 내 8 µM 농도의 형광 막 마커 6-Dapio 2, dimethyl amino naphthalene 또는 lorane을 세포에 처리하고 형광 현미경 관찰 전 60분 동안 배양합니다. PBS로 세포를 세척하고, 버퍼 용액을 목적 슬라이드 위에 피펫팅하여 배지를 제거한 후, 목적 슬라이드 뒷면의 버퍼 용액을 닦아냅니다. 가변 각도 관찰을 위해 배면 조명 및 Axion E-M-C-C-D 카메라가 장착된 Zeiss Axio plan과 같은 정립 현미경을 사용합니다.T-I-R-F-M은 컨덴서를 물체 슬라이드에 광학적으로 결합된 반원통형 유리 프리즘이 포함된 맞춤형 조명 장치로 교체합니다. 레이저 빔은 콜리메이티드 단일 모드 파이버로부터 입사되며, 유리 프리즘과 추가 광학 부품을 통해 결상된 후 샘플 표면에서 다시 평행 빔이 됩니다. 전기장 벡터가 입사면과 수직이 되도록 편광되었는지 확인하십시오.이 위치는 파이버의 출력 커플러에 표시되어 있습니다. 콘덴서 내부에 위치하며 시료 평면에 결상되어 다양한 입사각 또는 물체 광선으로 시료를 조사하는 가변 거울을 사용하십시오. 가변 거울은 소프트웨어로 제어되는 스테핑 모터에 의해 구동될 수 있습니다.각 위치는 go metric 측정으로 결정된 명확한 입사각에 대응합니다. 조절 가능한 거울의 각도 위치를 보정하려면, 물에 용해된 1 mM flavin nucleotide와 같은 형광 염료를 사용하십시오. 입사각 변화에 따른 임계각을 시각화하기 위해 glass-water 계면의 임계각인 61.3°를 고정값으로 사용하며, 입사각이 임계각과 일치하는 거울의 각도 위치는 거울 위치 제어 프로그램에 저장됩니다.카메라 소프트웨어를 사용하여 온도 게인, 기록 시간, 시프트 속도를 포함한 E-M-C-C-D 카메라의 파라미터를 설정합니다. 샘플의 광학적 접촉을 보장하기 위해 침전유를 사용하십시오. 유리 프리즘을 사용하여 세포에 적합한 배율과 적절한 개구수(numeric aperture)를 가진 대물렌즈를 선택합니다.현미경으로 시료를 관찰하려면 형광 검출에 적합한 롱패스(long pass) 또는 밴드패스(band pass) 필터를 사용하십시오. 조명 각도를 변경하며 동일한 시료의 형광 이미지를 기록하십시오. 입사각은 임계각과 같거나 그보다 커야 합니다.셀-유리 계면의 임계각이 64.5도인 경우, 0.5도 또는 1도 간격으로 66도에서 74도 사이의 각도 범위를 권장합니다. 데이터 분석을 시작하려면 LabVIEW 프로그램을 사용하여 다양한 각도에서 기록된 이미지와 카메라 설정, 들뜸 파장 및 굴절률을 읽어옵니다. 유리의 굴절률인 1.52와 셀의 굴절률인 1.37 설정을 가져와 데이터를 적절하게 평가합니다.각 매개변수 세트에 대해, 절차의 성공을 위해 침투 깊이와 투과 계수가 자동으로 계산됩니다. 이미지를 신중하게 기록하고 분석 대상으로 선택하는 것이 중요합니다. 식에 따라 세포-기질 간 거리 평가에 사용할 이미지를 선택하십시오.막 마커의 경우, 이 예시와 같이 균일한 조명 하에서 촬영된 개별 이미지는 제외될 수 있습니다. 세포 기질 토폴로지 이미지를 계산하고, 평가 중에 표시할 적절한 색상 코드를 선택하십시오. 개별 픽셀의 프로파일은 이 그림에 표시된 것과 같이 나타낼 수 있습니다.이 프로파일들은 적합도의 품질을 나타내는 지표로 사용될 수 있습니다. 마지막으로, 평가 프로토콜을 저장하십시오. 이 그림은 TP 53 종양 억제 유전자가 활성화된 U2 51 mg 교모세포종 세포의 전반사 이미지를 보여줍니다.다양한 입사각에서 기록한 분석 결과, 66도는 소멸 전자기장의 침투 깊이가 약 140 nanometers에 해당하며, 69도는 침투 깊이 75 nanometers, 73도는 침투 깊이 60 nanometers에 해당하여 침투 깊이가 점차 감소합니다. 침투 깊이가 얕아질수록 형광 강도가 감소하며, 이는 세포 가장자리의 초점 접착(focal contacts)과 같이 세포의 더 표면적인 부위에서 기인합니다. 세포와 기판 사이의 거리는 여기에서 보는 바와 같이 0에서 600 nanometers까지의 색상 코드로 패널 D에 표시되어 있습니다.세포-기질 간 거리는 흰색에서 노란색으로 표시된 단 몇 나노미터부터 진한 빨간색으로 표시된 250 to 300 나노미터까지 세포마다 매우 다양하게 나타납니다. 이는 초점 접촉 부위와 더 큰 세포-기질 간 거리가 서로 인접해 있음을 나타냅니다. 이와 유사한 세포-기질 간 거리의 변화가 종양 억제 유전자 P 10이 활성화된 U2 51 mg 교모세포종 세포에서도 계산되었습니다.대조적으로, 노란색으로 표시된 U2 51 mg 대조군 세포와 주황색에서 빨간색으로 표시된 야생형 세포의 세포-기질 거리는 발달 이후 상당히 일정하게 유지됩니다. 이 기술은 세포-기질 위상 분야의 연구자들이 종양 세포와 레이저 치료에 따른 형태학적 변화를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 생물체에 무해한 낮은 광노출 상태에서 나노미터 범위의 실제 해상도로 표면을 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

nanotopology-cell-adhesion-upon-variable-angle-total-internal

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 가까이 높은 콘트라스트와 시간적 해상도의 세포 표면 구조를 관찰하기위한 강력한 방법입니다. 우리는 TIRF은 세포 벽 - 동봉된 세균과 곰팡이 세포의 피질에서 단백질 역학을 공부 고용 수있는 방법을 보여줍니다.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

이 동영상은 액틴 및 미세소관 중합 역학을 시각화하기 위한 전반사 현미경 기반 기술인 TIRF에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하면 액틴과 미세소관 결합 역학의 고해상도 이미징을 실시간으로 수행할 수 있으며, 이는 세포 누화를 이해하는 데 필수적입니다.

액틴과 미세소관 결합 역학을 시각화하기 위한 TIRF 현미경 검사

출처: Daniele, F., et. SH-SY5Y 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 평가하기 위한 al TIRFM 및 pH 민감성 GFP 프로브: 세포 이미징 및 데이터 분석. J. Vis. 특급. (2015). 이 동영상은 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용하여 형광단 태그가 지정된 시냅스 소포를 시각화하는 인간 신경모세포종 세포의 이미징을 보여줍니다. 세포는 먼저 형광 모드에서 초점을 맞춥니다. 그런 다음 내부 전반사를 달성하기 위해 조정이 이루어지며, 멤브레인 근처의 형광단을 선택적으로 여기시키는 소멸파를 생성합니다. TIRF 이미징 전에 획득 매개변수가 구성되고 샘플링 주파수가 설정됩니다.

전반사(Total Internal Reflection) 형광 현미경을 사용한 세포 이미징

신속 하 고 높은 해상도 허용 하는 고급 현미경, 고립 된 플라즈마 멤브레인와 주변 세포내 볼륨의 이미지를 제시 한다. 회전 디스크 및 총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 한 설정의 통합 3.5까지 높은 수집 속도에서 라이브 이미징 실험을 허용 이미지 스택 당 s.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

우리는 살아있는 세포의 혈장 막에서 리간드 결합에 의해 유도된 mEGFP 태그-수용체 올리고머의 평균 올리고머 상태의 측정을 위한 이미징 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사법과 숫자 및 밝기(N&amp;B) 분석을 기반으로 합니다.

총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다

이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.

접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

거의 UV 리소그래피 및 견인력 현미경 검사법은 마이크로패턴 하이드로겔의 세포력을 측정하기 위해 결합됩니다. 단일 셀의 표적 광 유도 방출은 동일한 샘플에서 많은 수의 측정을 가능하게 합니다.

견인력 현미경 검사법의 응용을 위한 하이드로겔 패터닝 기술을 사용하여 세포 접착 제어

우리는 동적 미세 소관 및 형광 표지 된 미세 소관 관련 단백질의 동시 이미징을 위해 간섭 반사 현미경 검사 및 전체-내부-반사-형광 현미경을 구현하기위한 프로토콜을 제시합니다.

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

이 프로토콜은 시험관내 총 내부 형광 (TIRF) 현미경 분석을 사용하여 동적 액틴 및 미세 소관을 시각화하기위한 가이드입니다.

액틴과 미세소관 커플링 다이내믹스 를 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 시각화

이 프로토콜은 TIRF 현미경을 사용하여 개별 이온 채널을 추적하고 지지된 지질막에서 그 활성을 결정하여 측면 막 이동과 채널 기능 간의 상호 작용을 정의하는 방법을 설명합니다. 멤브레인을 준비하고, 데이터를 기록하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.

TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

배우세요 VA-TIRFM을 이용해 세포 접착의 나노토폴로지를 측정하는 방법을. 형광 마커와 가변 각도 조절 거울을 사용하여 암세포와 비암세포의 접착 차이를 나노미터 정밀도로 분석합니다.

가변 각도 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)시 세포 접착의 Nanotopology

더 많은 동영상 탐색