Name: 유전자 표현 기계의 기능 Assays을위한 소규모 핵 추출물 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 학습하세요 소규모 HeLa 세포 핵 추출물 제작 방법으로 유전자 발현 분석을 수행하는 기술입니다. 이 프로토콜은 적은 세포 수로도 전사 및 스플라이싱 활성을 평가할 수 있어 다양한 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 M. Winkelbauer - 상처, E. 이브라힘, P. 발렌시아, K. Dufu, 유용한 토론을위한 H. 쳉에게 감사합니다. HELA 세포는 국립 셀 문화 센터 (미네 아 폴리스, 미네소타)에서 얻은되었다. 우리는 또한 가벼운 현미경으로 도움을 하버드 의대에서 E7107과 니콘 이미징 센터를 제공하는 Eisai 주식 회사 감사합니다. 이 작품은 JLH하는 RR과 EGF와 NRSA 사귐에 NIH 교부금 GM043375에 의해 지원되었다.

1. 핵 추출을위한 성장 HELA 셀 <ol><li> DMEM 미디어 세 가지 150mm 차량 번호판 플레이트 HELA 세포는 10 % FBS와 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충. 세포가 90 % 합류 때까지 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 성장. </li></ol> 삼일 분할 후 합류 판과 수확의 1시 10분 팁 - 분할 세포. 팁 - 추가 판은 세 접시와 충분한 세포 (예를 들어, 세포 이하 90 % 이상 합류하는 경우)가 아닌 경우에 성장 할 수 있습니다. 2. 원자력 추출 솔루션을 준비하고 풀어 <ol><li> 표 2에 명시된 바와 같이 신선한 솔루션을 준비합니다. </li><li> 15 ML 팔콘 튜브에 Hypotonic 버퍼의 나누어지는 10 ML. 1.5 ML Eppendorf 튜브로 나누어지는 높은 소금 버퍼와 낮은 소금 버퍼 1 ML 1 ML합니다. 얼음 버퍼를 풀어. (참조 사용하기 각각의 버퍼에 PMSF와 DTT의 해당 볼륨을 추가합니다 즉시 이전 <strong&gt; 표 1). </li></ol> 3. 핵 추출을위한 HELA 세포를 수확 <ol><li> 세포에서 미디어를 대기음 및 플레이트 방마다 온도 1X PBS 13 ML과 함께 한 세포를 씻는다. </li><li> PBS 세척 소 기음. </li></ol> 그리고 몇 초 정도 대기하고, 나머지는 aspirating 그 쪽 플레이트 서 먼저 aspirating하여 많은 PBS의 가능한 한 팁 - 기음. <ol start="3"><li> 셀 리프터를 사용하여 플레이트의 하단 가장자리로 세포를 밀고하고 Eppendorf 튜브에 세포를 전송합니다. 거품을 만들어 피하십시오. 스크랩한 세포의 세 접시 하나 1.5 ML Eppendorf 튜브에 맞게해야합니다. </li></ol> 팁 - 그건 Eppendorf 튜브를 사용하는 경우에는 세포의 볼륨을 추정하는 것이 더 쉽습니다. 스케일에, 팔콘 튜브를 사용합니다. <ol start="4"><li> 펠렛 세포에 XG 100에서 5 분 microfuge에서 4 ° C에서 원심 분리기. </li></ol> 4. Hypotonic 버퍼에 HELA 세포를 팽창 </p&gt; <ol><li> 조심스럽게 세포 펠렛에서 PBS를 기음과 튜브에 그라데이션을보고하여 포장 셀 볼륨 (PCV)가 예상됩니다. HELA 세포의 세 지류 번호판은 PCV의 약 500 μl를 얻을 수 있습니다. </li><li> 세포 펠렛에 Hypotonic 버퍼의 PCV를 2X 추가합니다. 세포를 resuspend 위해 부드럽게 흔들어. 부드럽게 필요한 경우와 아래로 pipetting하여 세포를 resuspend하기 P1000 Pipetman을 사용합니다. </li><li> 펠렛 세포에 XG 100에서 5 분 microfuge에서 4 ° C에서 원심 분리기. * 세포 이번에 의해 팽창하기 시작하며, 세포 볼륨은 이제 750 μl-1000 μl에 대해 여야합니다. </li><li> 조심스럽게 Hypotonic 버퍼를 기음과 1.5 ML의 최종 볼륨에 새 Hypotonic 버퍼를 추가합니다. 세포를 Resuspend. </li><li> 10 분 동안 얼음 resuspended 부풀어 세포를 품어. </li></ol> 5. 다운스 호모 지 나이저를 사용하여 셀을 Lyse <ol><li> dounce을 씻어 후 얼음에 진정 Hypotonic 버퍼를 사용합니다. 섬세한 작업 wip와 유봉 건조를 닦아어 (예 : Kimwipe). 1000 μl 확장 micropipette 팁을 사용하여 dounce에서 나머지 버퍼를 제거합니다. </li><li> dounce에 부풀어 세포를 전송합니다. 천천히 거품을 피하기 위해주의되고, 세포 lyse 위해 5 번 dounce의 꽉 유봉을 아래로 이동. </li><li> dounce로부터 세포를 5 μl 나누어지는를 사용하여 세포 용해에 대한 분석. Eppendorf 튜브에 나누어지는를 삽입하고 Trypan 블루의 동등한 볼륨을 추가합니다. 슬라이드에 섞어 넣고 가벼운 현미경을 사용하여 세포를 검사합니다. lysed 세포의 핵은 파란색으로 표시됩니다. 90 %의 용해가 이상적입니다. </li></ol> 팁 - 세포 dounced되어야 횟수가 dounce의 죄어져 있음에 따라 달라질 수 있습니다. 처음으로이 프로토콜을 수행하면 dounce 각 뇌졸중 후 단계 5.3 실시하여 dounce하는 횟수를 결정합니다. 오버 dounce하지 마, 과도한 douncing은 핵을 파괴합니다. <ol start="4"><li> 미리 chille로 lysed 세포를 전송D Eppendorf 튜브와 1500 X g에서 5 분 4 ° C에서 microfuge에 스핀. 펠렛은 핵이 들어 있습니다. 조심스럽게 핵을 방해하지 않고 새로운 튜브로 뜨는을 전송. 뜨는는 세포질이 들어 있습니다. </li></ol> 팁 - 세포질은 대량 추출물 (대량 추출물에서 활성 S100을 준비를 위해 1 참조)에 사용된 것과 같은 고속 스핀을 사용하여 그대로 사용하거나 더 S100으로 처리할 수 있습니다. 6. 핵에게 소금 추출 <ol><li> 튜브에 그라데이션을보고하여 포장 원자력 볼륨 (PNV)를 예상됩니다. 500 μl의 PCV는 일반적으로 400 μl의 PNV를 얻을. </li><li> 튜브의 바닥에 micropipette 팁을 삽입하고 천천히 한동안 부드럽게 혼합 핵으로 버퍼를 squirting하여 핵으로 낮은 소금 버퍼의 ½ X PNV를 추가합니다. pipet 위아래하지 마십시오. 부드럽게 펠렛 완전히 계속하기 전에 낮은 소금 버퍼에 resuspended되어 있는지 확인하기 위해 튜브를 버려. </li> &lt;리&gt; 추가 ½ X 높은 소금 버퍼 빠르게 반전 튜브로 1 시간을 믹스 PNV. 흔들지 마세요. 30 분 동안 4 ° C에서 회전합니다. </li></ol> 그들을 lysing 피하기 위해 높은 소금 버퍼에있는 핵 신사가 참고하라. <ol start="4"><li> 18,000 X g에서 15 분 microfuge에서 4 ° C에서 봐. 뜨는가 높은 소금 핵 추출물 (HS-NE)입니다. 세포의 세 접시는 일반적으로 HS-NE의 500-600 μl를 얻을 수 있습니다. </li></ol> 7. 핵 추출을 집중하고 Dialyze <ol><li> 냉장 미니 centricons (Amicon) 및 14,000 X g에서 microfuge 4시 50 분 ° C에 대한 핸들을 HS-NE 500 μl를 전송합니다. 미니 centricon (Amicon) 반전과 새로운 Eppendorf 튜브에 넣습니다. 4에서 2 분 스핀 ° C HS-NE를 복구하기 위해 1,000 XG. HS-NE는 약 115 μl에 집중됩니다. </li><li> P200 Pipetman 이용하여 미니 투석 슬라이드--Lyzers으로 HS-NE 45 μl aliquots를 전송, 및 50에 배치냉장 투석 버퍼 0 ML. 슬라이드-A-Lyzer의 바닥은 시체의 하단에 정렬되었는지 확인하십시오. 4 ° C.에 1-2 시간 동안 저어 NE는 투석 후 흐림 나타납니다. </li></ol> 팁 - 기분이 원심 분리는 추출물의 활동을 감소로서, 투석 후 관찰되는 뿌연 침전물을 제거하기 위해 원심 분리기 없습니다. <ol start="3"><li> NE는 즉시 사용하거나 aliquoted 수 있습니다. Aliquots는 플래시가 액체 질소에 냉동 및 -80 ° C.에 저장해야합니다 NE는 저장 및 활동을 잃지 않고 최소한 두 냉동 해동 사이클을 받아야 할 수 있습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 최근 접합에 RNAP II의 전사를 커플링에 대한 체외 시스템의 효율은 2-5 개발되었다. 이러한 시스템은 대량 재배 HELA 세포를 고용하기 때문에 빠른 속도로 여러 샘플을 특정 세포 치료의 효과를 테스트 의무가 없습니다. 을 바탕으로이 필요ND 소규모 추출물 프로토콜의 일반 유틸리티 (토론 참조), 우리는 강력한 소규모 핵 추출 방법을 만들었습니다. 대량 핵 추출물과 소규모 핵 추출물에 RNAP II의 전사 / 접합 반응을 비교하는 대표적인 데이터는 그림 2에 표시됩니다. CMV 프로 모터를 포함하고 표준 접합 기판 (Ftz 3, 그림 2A)이 분석에 사용된 인코딩 CMV-DNA 구조. 이 구조는 대량 (차선 1-3) 또는 소규모 (4-6 차선) 추출물에 incubated되었을 때, 미리 mRNA 어렸을때 비슷한 수준은 5 분 시점 (그림 2, 레인 1과 4에 의해 합성되었다 ). 추가 전사를 차단하는 α-amanitin의 추가에 따라 접합의 중간체 및 spliced ​​제품 추출물의 두 가지 유형 (그림 2, 레인 2, 3, 5, 6)에서 유사한 운동으로 시간이지나면서 누적. 이러한 대표적인 결과가 보여 그 쿠데타의 효율성<html> LED RNAP II의 전사 / 접합 시스템은 벌크 및 소규모 핵 추출물에서 비슷합니다. 소규모 추출 방법의 유틸리티를 보여주려면 추출물은 접합 억제제, E7107, 또는 부정적인 제어 화합물 pladienolide F 6,7 그리고 결합 RNAP II의 전사 / 접합 분석이 진행되었습니다 대우 HELA 세포에서 준비되었다. 그림 3 Pladienolide의 F와 E7107 치료 세포 (10 분 시간 점) 모두에서 준비 추출물에 효율적으로 발생 RNAP II에 의해 전사로 표시. 반대로, 접합은 Pladienolide F-취급 세포에서 준비 추출물에 정상적으로 발생하지만, (그림 3, 20-60 분 시간 점) E7107-대우 세포에 폐지되었다. 이러한 데이터는 작은 규모의 셀 특별한 치료 소규모 핵 추출물을 사용하기위한 개념 증명을 제공합니다. JPG &quot;/&gt; 1 그림. 소규모 추출 프로토콜의 개략도. P1으로 나오세요. 셀은 monolayers으로 성장 세포 리프터를 사용하는 접시에서 수확 및 hypotonic 버퍼의 추가에 의해 부었어요. P2 단계. 세포 Dounce의 균질 화기를 사용 lysed 및 펠렛에 핵 centrifuged있다. P3 나오세요. 핵은 세포질에서 분리하고 소금 추출을 받아야합니다. P4 단계. 핵 추출물을 농축하고 dialyzed됩니다. P5 단계. 결과는 핵 추출물은 (더 자세히 그림 2 참조) 작동하는 그 드라마를 얻을 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig2.jpg" /> 그림 2. 소규모 핵 추출물이 결합 RNAP II의 전사 / 접합 분석에 강력한 있습니다. A. 결합 RNAP II 전사 / 접합에 사용되는 CMV-Ftz의 DNA 템플릿의 개략도. CMV 프로 모터와 exons과 인트론의 크기가 표시됩니다. 결합 RNAP의 B. 비교대량 핵 추출물 또는 소규모 핵 추출물을 사용하여 II 전사 / 접합 분석. 전사 및 접합의 5 분, 30 및 60 분 동안 발생하는 허용된 이후 α-amanitin가 추가되었습니다. RNA가 추출되고 fractionated 5 % denaturing polyacrylamide 겔와 phosphoimager에 의해 발견되었다. 접합의 중간체 및 제품이 표시됩니다. 내생 U6 snRNA와 tRNA는 추출물에 제시 및 32 인큐베이션 기간 동안 P-레이블이 표시됩니다 특징이다. 결합 RNAP II의 전사 / 접합 시스템의 상세한 프로토콜에 대해 3을 참조하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig3.jpg" /> 그림 3. 접합 억제제 약물 E7107로 치료 HELA 세포에서 준비 소규모 핵 추출물은 접합에 결함이 있습니다. 셀은 3 μm의 제품 Pladienolide로 치료되었다 F 또는 E7107 등6을 설명하고 소규모 핵 추출물 준비를 위해 사용됩니다. 시간 과정은 그림 2에서와 같은 녹음 / 접합 분석을 사용하여 실시되었다. 접합의 중간체 및 제품, U6 snRNA와 tRNA가 표시됩니다.

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<li>Ghosh, S., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+in+vitro+synthesis+and+splicing+of+RNA+polymerase+II+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Coupled in vitro synthesis and splicing of RNA polymerase II transcripts.</a> Rna. 6, 1325-1334 (2000).</li>
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</ol>

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우리는 monolayers으로 성장 HELA 전지의 소량의 핵 추출물의 준비를 위해 신속하고 재현성 방법을 확립했습니다. 우리는이 추출물은 RNAP II의 전사 / 접합 assays의 동력학과 효율성은 소규모 및 대량 핵 추출물에서 유사한 것을 보여주는 것만으로도 강력한는 것을 보여주었다. 우리는 접합 억제제 약물로 치료 세포에서 준비 추출물이 전사하지만, 접합의 결함에 대해 활성 중입니다 그 입증하여 추출물의 유틸리티를 보여주었다. 소규모 핵 추출물 준비를위한 우리의 방법은 이전에 대규모 1,8의 정지 재배 HELA 세포의 추출물과 추출물 9 소규모 준비를위한 방법을 만들기 위해 정해진 방법을 결합 및 최적화에 의해 설립되었습니다. 이전의 소규모 추출물 등 결합 녹음 / SP로, 일부 assays를위한 기능성하지 않았기 때문에 우리는 우리의 프로토콜을 설립분석을 licing. 이전의 소규모 프로토콜 9과 우리 사이의 중요한 차이점은 이전 프로토콜이 작은 게이지 바늘 9까지 그들을 추진하여 세포를 lysed 반면, 우리가 미니 dounce을 사용하여 세포를 lysing위한 조건을 최적화한다는 것입니다. 추출물 일부 assays에 대한 재현해 비활성 및 / 또는 어려웠다 이유를 설명 수도 거품의 바늘 용해 결과. 우리는 또한 우리의 프로토콜에 농도 단계를 추가했다. 이 단계는 농도에 매우 민감 추출물의 활동을 증가 시키며, 또한 소규​​모 준비에 내재된입니다 추출물 간의 다양성을 제한합니다. 마지막으로, 우리의 준비는 일상적으로 대량 추출에 비해 활동에 어떤 큰 영향없이 단일층 전지의 세 개만 150mm 접시로 수행됩니다. 따라서, 프로 시저는 값비싼 시약 또는 제한된 셀 가용성을 필요로 소규모 준비를위한 즉시 의무가있다. 예를 들어, 우리는 SMA를 준비했습니다됩니다 규모 RNAi의 최저 세포에서와 만성 림프 백혈병 (CLL) 환자 세포에서 추출물,하고 기능 및 / 또는 생화 학적 assays (EGF, JLH, 타이와 RR, 게시되지 않은)에 대해 이러한 추출물를 사용했습니다. 우리는 RNAi와 같은 immunopreciptations, 서부 영화, 그리고 실버 염색법과 같은 특정 생화 학적 assays, 그 다음에 대한 추출물은 가치있는 것으로 나타났습니다. 특정 단백질을 노크의 효능을 맺은 후, 더 자세한 연구는 저렴한 비용으로 추가 추출물을 준비하는 데 사용할 수있는 안정적인 최저의 세포 라인을 만들어 실시 할 수 있습니다. 단백질의 질량 분광법은 또한 메서드의 유용한 어플 리케이션이 될 것입니다 이러한 최저의 세포 라인에서 얻은 immunoprecipitates로 제시. 우리 마을은 우리가 프로토콜에 대한 예제로 사용되는 결합 전사 / 접합 분석 이외에 소규모 추출물은 다른 일에 사용되는 것처럼 다양한 기능 및 생화 학적 assays에 일반적으로 적용되어야유전자 발현의 EPS (상한, 접합, 전사, polyadenylation, microRNA 처리 예). 프로토콜도 어느 서스펜션에서 얻어진 (예 : CLL 세포) 또는 (예 : 환자의 섬유아 세포 등) 문화로 성장하실 수 있습니다 환자의 세포 유형에 적응하실 수 있습니다. 마지막으로, 절차를 수행하는 동안 얻은 세포질 분획은 세포질이 필요한 기능과 생화학 두 assays에 대한 유용합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 시약의 전체 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 4 - (2 - 히드록시 에틸) piperazine-1-ethanesulfonic 산 </td><td> 시그마 </td><td> H3375-500G </td></tr><tr><td> MgCl 2 0.6 H 2 O </td><td> 마그네슘 염화물 Hexahydrate </td><td> 시그마 </td><td> M2670-500G </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 염화칼륨 </td><td> 어부 </td><td> P335-212 </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Phenylmethanesulfonyl 불소 </td><td> 시그마 </td><td> P7626-100G </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Dithiothreitol </td><td> Bioanalytical 미국 </td><td> AB00490-5G </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Ethylenediaminetetraacetate, 나트륨, 이수화물 </td><td> Bioanalytical 미국 </td><td> AB00500-01000 </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td></td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 800,689 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Dulbecco의 최소 필수 매체 </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 태아 소 혈청 </td><td> Gibco </td><td> 16,140 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15,070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 인산염은 염분 버퍼 </td><td> Cellgro </td><td> 21-040 - 이력서 </td></tr><tr><td> Trypan 블루는 0.4 %를 청바지 </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15,250 </td></tr><tr><td> 세포 흡착지 </td><td></td><td> 코닝 </td><td> 29442-200 </td></tr><tr><td> 150mm 플레이트 </td><td></td><td> VWR </td><td> 353,025 </td></tr><tr><td> 확장 Micropipette 팁 </td><td></td><td> Denville </td><td> P1126 </td></tr><tr><td> 꽉 유봉과 균 질기, 1ml를 Dounce </td><td></td><td> Wheaton의 </td><td> 357,538 </td></tr><tr><td> Slidealyzers, MWCO 10kDa </td><td></td><td> ThermoScientific </td><td> 69,572 </td></tr><tr><td> 미니 Centricons, MWCO 3kDa </td><td></td><td> Millipore (Amicon) </td><td> UFC500396 </td></tr></tbody></table> 표 1. 특정 시약 및 장비. <table border="1"><tbody><tr><td> 용액 </td><td> 최종 </td><td> 재고 </td><td> 조제하다 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hypotonic </td><td> 10 MM HEPES, pH를 7.9 </td><td> 1M HEPES, pH를 7.9 </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td></td> &lt;TD&gt; 1.5 밀리미터 MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 750 μl </td></tr><tr><td></td><td> 10 MM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 1.67 ML </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 MM PMSF </td><td> 200 MM PMSF </td><td> 500 μl </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 밀리미터 DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125 μl </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 물 500 ML까지 지참 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 낮은 소금 </td><td> 20 MM HEPES, pH를 7.9 </td><td> 1M HEPES, pH를 7.9 </td><td> 이 ML </td></tr><tr><td></td><td> 1.5 밀리미터 MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 150 μl </td></tr><tr><td></td><td> 20 MM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 667 μl </td></tr><tr><td> &amp; NBSP; </td><td> 0.2 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 40 μl </td></tr><tr><td></td><td> 25 % 글리세롤 </td><td> 글리세린 </td><td> 25 ML </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 MM PMSF </td><td> 200 MM PMSF </td><td> 100 μl </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 밀리미터 DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25 μl </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 물 100 ML까지 지참 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 높은 소금 </td><td> 20 MM HEPES, pH를 7.9 </td><td> 1M HEPES, pH를 7.9 </td><td> 이 ML </td></tr><tr><td></td><td> 1.5 밀리미터 MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 150 μl </td></tr><tr><td></td><td> 1.4M KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 48 ML </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 40 μl </td></tr><tr><td></td><td> 25 % 글리세롤 </td><td> 글리세린 </td><td> 25 ML </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 MM PMSF </td><td> 200 MM PMSF </td><td> 100 μl </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 밀리미터 DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25 μl </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 물 100 ML까지 지참 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 투석 </td><td> 20 MM HEPES, pH를 7.9 </td><td> 1M HEPES, pH를 7.9 </td><td> 10 ML </td></tr><tr><td></td><td> 100 MM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 16.625 ML </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td></td><td> 20 % 글리세롤 </td><td> 글리세린 </td><td> 100 ML </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 MM PMSF </td><td> 200 MM PMSF </td><td> 500 μl </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 밀리미터 DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125 μl </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 물 500 ML까지 지참 </td></tr></tbody></table> 표 2. 핵 추출물 준비를위한 솔루션.

유전자 표현 기계의 기능 assays을위한 소규모 핵 추출물

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

이해 유전자 발현의 진행의 큰 거래는 체외 시스템에 사용하였습니다. 대부분의 연구 내용은 기능적인 assays는 정지 재배 세포의 10-50 이상 리터에서 대량으로 준비하고 있습니다 추​​출물을 사용하여 수행됩니다. 그러나 이러한 대규모 준비는 체외 효과에 신속하게 테스트하는 의무가없는 그 생체내 세포 치료법이나 조건에서 다양한 따른 모든 책임은 사용자에게 있습니다. 이 저널 비디오 기사는 예로 HELA 세포를 이용하여 기능성 소규모 핵 추출물 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 자기편 monolayers로 성장 세포와 같은 몇 가지 150 셋처럼 mm 접시를 사용하여 수행됩니다. 소규모 추출물의 효율성을 설명하기 위해, 우리는 그들이 결합 RNA 중합 효소 II의 전사 / 접합 반응에 대한 대량 핵 추출물만큼 활성임을 보여줍니다. 추출물 프로토콜의 유틸리티를 입증하기 위해, 우리는 접합이 HELA 세포에서 준비 추출물에 폐지되는 표시S는 접합 억제제 약물 E7107로 치료. 소규모 프로토콜은 세포 추출물을 사용하여 체외에서 조사받을 수있는 절차 또는 세포 유형에 일반적으로 적용할 수 있어야합니다. 이들은 작은 세포 집단의 사용을 요구 약물, DNA를 손상 대리인, RNAi, 또는 transfection 등 다수의 대리인에 노출 한정된 수량이나 세포에서만 사용할 수있는 환자의 세포를 포함합니다. 또한, 갓 자란 세포의 소량이 편리 및 / 또는 일부 응용 프로그램이 필요합니다.

강력한, 소규모 HELA 핵 추출물의 준비를위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 이러한 약물이나 RNAi로 치료 세포와 같은 세포의 작은 인구의 사용을 요구 assays를위한 가치있는 것입니다. 방법은 유전자 발현 assays 및 환자 세포 등 다른 세포 유형의 다양한 적용해야합니다.

유전자 표현 기계의 기능 Assays을위한 소규모 핵 추출물

인비트로(in vitro) 시스템을 이용하여 유전자 발현에 대한 이해에 있어 상당한 진전이 이루어졌습니다. 대부분의 연구에서 기능 분석은 ...을 사용하여 수행됩니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 세포에서 추출한 기능적 핵 기구를 사용하여 유전자 발현을 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 HeLa 세포를 수확하여 팽창시킵니다. 그다음 세포를 용해하여 분해하고, 세 번째 단계에서 원심분리를 통해 핵을 침전시킵니다.수용성이고 기능적인 유전자 발현 기구를 얻기 위해 핵을 염분 추출, 농축 및 투석합니다. 최종적으로, RNA 중합효소 전사 및 스플라이싱 결합 시스템으로 평가한 전사와 스플라이싱 활성을 바탕으로 핵 추출물의 기능성을 평가할 수 있습니다. 대량 핵 추출물 준비와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 적은 양의 세포로도 핵 추출물을 준비할 수 있다는 점입니다.FBS와 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 HeLa 세포를 150 mm 플레이트 3개에 분주하는 것으로 시작합니다. 세포가 90% 합류도(confluency)에 도달할 때까지 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에서 배양합니다. 이 시점에서 HeLa 세포 배양물에서 배지를 흡입하여 제거하고, 플레이트당 13 mL의 상온 PBS로 한 번 세척한 다음 PBS를 흡입하여 제거합니다. 각 플레이트를 몇 초 동안 옆으로 세운 뒤 남은 PBS를 모두 흡입하여 제거합니다.다음으로, 셀 리프터를 사용하여 각 플레이트의 하단 가장자리로 세포를 긁어모은 후, 1.5 milliliter einor 튜브로 세포를 끌어당깁니다. 마지막으로, 마이크로 원심분리기를 사용하여 100×g, 4 °C에서 5분 동안 세포를 펠렛화합니다. 이제 세포 펠렛에서 PBS를 흡입하여 제거하고, 튜브의 눈금을 확인하여 적혈구 용적 또는 PCV를 추정합니다.그 다음 PCV 부피의 2배에 해당하는 저장성 완충액을 세포 펠릿에 추가합니다. 튜브를 부드럽게 흔들어 재현탁합니다. 필요에 따라 1000 µL 피펫으로 세포 현탁액을 부드럽게 파이펫팅하여 세포 응집물을 풀어줍니다.그 다음 이전과 동일한 원심분리 조건으로 세포를 펠릿화합니다. 원심분리가 끝나면 저장 버퍼 층을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 이때 세포가 팽창하기 시작하여 세포 부피가 약 750 to 1000 microliters까지 증가하게 됩니다.최종 부피가 1.5 milliliters가 되도록 새로운 저장성 버퍼를 추가하고, 버퍼 내에서 세포를 다시 현탁합니다. 마지막으로, 현탁된 팽윤 세포를 얼음 위에서 10분 동안 냉각하며 배양합니다. 균질기를 저장성 버퍼로 헹군 다음 세포와 함께 얼음 위에 둡니다.그런 다음 Kimwipe와 같이 섬세한 작업용 와이퍼를 사용하여 유발을 건조합니다. 1000 µL 연장 마이크로 피펫 팁을 사용하여 다운스(downs)에서 버퍼를 제거합니다. 이제 피펫을 사용하여 냉각된 팽윤 세포를 다운스 다운(downs Down)으로 옮깁니다.본 절차에서 성공을 위해 가장 까다로운 부분은 세포 용해 여부를 확인하는 것입니다. 각 단계 후 현미경으로 확인하며, 기포가 생기지 않도록 주의하면서 용해용 페스틀을 천천히 위아래로 5회 움직여 세포를 용해시킵니다. 다음으로, 용해된 세포 현탁액 5 µL를 에펜도르프 튜브에 옮기고 trypan blue 10 µL와 1X PBS 15 µL를 추가합니다.슬라이드에 세포 용액을 첨가하고 광학 현미경으로 세포의 용해 여부를 관찰합니다. 용해된 세포의 핵은 3시간 후에 파란색으로 나타납니다. 다수의 살아있는 세포가 관찰되므로 용해가 충분하지 않은 상태입니다. 5시간 후에는 충분히 용해되었습니다.마지막으로 용해된 세포를 미리 냉각시킨 에펜도르프 튜브로 옮기고, 마이크로 원심분리기에서 1500 ×g, 4 °C로 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 그 다음, 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 이제 튜브의 눈금을 확인하여 핵 접합 부피(PNV)를 추정합니다.마이크로 피펫 팁에 PNV의 절반 분량의 저염 버퍼를 채웁니다. 그다음 에핑도르프 튜브 바닥에 있는 핵 내부로 마이크로 피펫 팁을 삽입합니다. 부드럽게 섞으면서 버퍼를 핵 내부로 천천히 분사합니다.튜브를 가볍게 튕겨 펠렛이 완전히 재현탁되었는지 확인합니다. 다음으로, PNV의 절반량에 해당하는 고염 농도 버퍼를 첨가하고 튜브를 한 번 빠르게 뒤집어 섞어줍니다. 4°C에서 30분 동안 튜브를 회전시킵니다.마지막으로, 마이크로 원심분리기를 사용하여 핵을 18,000 ×g, 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다. 상층액 500 µL를 냉각된 마이크로 콘(micro cons)으로 옮깁니다. 고염 핵 추출물을 14,000 ×g, 4°C에서 15분 동안 원심분리한 후, 미니 라콘(mini racon)을 뒤집어 새로운 개별 EOR 튜브에 넣습니다.4°C에서 1000 ×g로 2분 동안 원심분리하면, 고농도 염 핵 추출물은 약 115 µL로 농축됩니다. 이제 고농도 염 핵 추출물을 45 µL씩 소분하여 미니 투석 SLI로 옮깁니다. 이때 슬라이드 바닥이 플로터 바닥과 닿아 있는지 확인하십시오.그런 다음 SLI를 500 milliliters의 냉각된 투석 완충액에 넣습니다. 마지막으로, 분주액을 4 °C에서 1~2시간 동안 교반하며, 투석 후 핵 추출물은 혼탁하게 보일 것입니다. 이 그림은 소규모 핵 추출물과 대량 핵 추출물에서의 결합된 RNA polymerase II 전사 및 splicing 반응을 비교한 대표 데이터를 보여줍니다.A-C-M-V-D-N-A 구조체를 대량 또는 소규모 추출물에서 배양했을 때, 전사를 차단하기 위해 alpha 및 manin을 첨가한 후 5분 시점에서 유사한 수준의 nascent pre mRNA가 합성되었습니다. splicing 중간체와 splice 생성물은 두 종류의 추출물 모두에서 유사한 역학으로 시간이 지남에 따라 축적되었습니다. 이러한 대표적인 결과는 결합된 RNA polymerase II 전사 및 splicing 시스템의 효율이 대량 및 소규모 핵 추출물에서 유사함을 확인시켜 줍니다. 소규모 추출물의 유용성을 입증하기 위해, splicing 억제제인 E 7 1 0 7 또는 음성 대조군 화합물인 Platy analy F로 처리한 HeLa 세포로부터 추출물을 준비한 후, 이 그림에서 보여준 것과 같이 결합된 RNA polymerase II 전사 및 splicing 분석을 수행했습니다. 그 결과, Platy F 및 E 7 1 0 7 처리 세포 모두에서 준비된 추출물에서 RNA polymerase II에 의한 전사가 효율적으로 일어났습니다.반면, analy F 처리 세포로 준비한 추출물에서는 splicing이 정상적으로 일어났으나, E 7 1 0 7 처리 세포에서는 abolished되었습니다. 이러한 데이터는 소규모 세포 특수 처리에 소규모 핵 추출물을 사용하는 것에 대한 개념 증명을 제공합니다. 이 기술을 숙달하면 5시간 이내에 완료할 수 있습니다.

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유전자 표현 기계의 기능 Assays을위한 소규모 핵 추출물

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