Name: 감염성 Murine 노로 바이러스의 역방향 유전학 중재 복구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: 배우세요 감염성 Murine 노로 바이러스의 역방향 유전학 복구 방법을. 세포 배양에서 RNA 전사 및 cDNA 기반 전략을 활용하여 바이러스 복제와 병원성 연구에 활용할 수 있는 효율적인 실험 기법을 익히세요.

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이 연구는 이안 Goodfellow, 그리고 아르 아리아스에게 수여 마리 퀴리 사내 유럽 원정대 (FP7 유럽 연구 협의회)에게 수여 Wellcome 트러스트 수석의 원정대에 의해 후원되었다. 우리는 우리 자신 애질런트의 bioanalyser를 사용할 수있는 권한을 갖게하고 RNA 샘플을 실행에 도움을 주셔서 이오 홍 청, 닥터 레베카 Robey 및 박사 마이크 스키너 감사드립니다.

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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

여기에서 우리는 세포 배양에서 전염성 MNV의 회복을 허용 서로 다른 두 역방향 유전자 접근 방법을 보여주고있다. 효과적으로 그리고 세포 변이에 의해 인정되는 뒤덮힌 MNV 성적 증명서의 생성을 통해 바이러스성 RNA를 게놈의 5 &#39;끝에 VPg의 covalently 연동을위한 절대적인 요구를 우회 접근 둘 다. 효소 상한 다음에 시험 관내 전사에서 더 효율적이다 성적표가 FPV 상한 효소에 의해 공을 수있는 T7 RNA의 효소를 표현하는 세포에서 전염성 plasmids의 전사보다 전염성 MNV의 회복. 이러한 역방향 유전학 시스템과 복구 바이러스 titres는 감염된 세포 배양 17 (그림 5)에서 정화 바이러스성 VPg 연결된 RNA의 transfection에 의해 얻은 이들과 비슷합니다. 허용 Raw264.7 세포로 덮힌 MNV RNA의 transfection은 transfectio 관련된 실험이 겨우 1-로그 낮은 바이러스 titre를 렌더링N 바이러스성 VPg 연결된 RNA를 (그림 5)가 포함된 감염된 세포로부터 총 RNA의. 이 사실은 이러한 시스템에 의해 생성된 성적의 5 &#39;끝에 VPg 분자의 추가가 VPg에 관련된 세포에 MNV의 감염의 기본 기능적인 측면을 나타낼 수 증가 바이러스 수율 초래할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 추가 조사를 장려한다. 다른 RNA 바이러스에 비해 고효율 하나가 유전 시스템은 현재 체외 베꼈는데 RNA에이 virions 19, 20와 실제 감염에 비해 전용 10-100 낮은 titres의 회복을 허용하는 데 사용 반대로 그럼에도 불구하고, 우리는이 역방향 유전학 시스템을 생각한다. 전체적으로 현재의 방법론은 노로 바이러스 분자 생물학 분야에서 앞으로 중요한 단계를 구성하며, 노로 바이러스의 genomes에서 단백질과 RNA의 보존 작품의 기능적 역할을 조사하는 도구를 제공. 이러한 접근 방식은 이미 C와 결합되어이내 10 일 4, 21의 생쥐 - urrent 마우스 모델 사용 가능하고 MNV은 전염성 cDNA로부터 복구하는 것으로 나타났습니다 정보&gt; 80% STAT1-/ 중 치명적인 감염을 일으킬 수 있습니다. 우리가 capsid 단백질 및 생체내 21, 22에서 다소 감쇠 phenotypes을 표시할 다른 호스트 요인 (PTB와 PCBP)의 바인딩에 관여 polypyrimidine 넓이의 유력한 murine 노로 바이러스의 돌연변이를 회복이 시스템의 활용. 또한, 최근에 다시 세포 배양에 복제 효율적 ORF4에서 VF1 단백질을 표현할 수있는 능력이지만 부족한 바이러스 WT MNV 8 관련하여 생쥐에 독성을 감소 것을 증명하고있다. 이러한 연구는 우리가 잠재적인 백신 후보로 조사 수 MNV 연구를 토대로 인간 noroviruses의 감쇠 버전을 설계하는 것이 좋습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 염화 리튬의 석출 솔루션 </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA 스토리지 솔루션 </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 스크립트 </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap 677은 시스템 상한 </td><td> Epicentre의 Biotechnologies </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> 네온 transfection 시스템 </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> 네온 transfection 시스템 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM 전 </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 Transfection 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> 애질런트 RNA 600 나노 키트 </td><td> 애질런트 </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> 애질런트 2100 BIoanalyzer </td><td> 애질런트 </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR DNA와 젤 밴드 정제 키트 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX 대규모 RNA 생산 시스템-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

감염성 murine 노로 바이러스의 역방향 유전학 중재 복구

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

인간 noroviruses 인간 위장염 (GE) 전 세계의 대부분의 경우에 대한 책임이며, 가까운 사람 대 사람의 접촉이 1, 2를 피할 수없는 환경에서 반복 문제입니다. 지난 몇 년 동안 병원에서 발병의 발병률 증가는 자신의 경영 능력뿐만 아니라, 큰 경제적 손실에 상당한 혼란을 초래보고되었습니다. 새로운 항바이러스 접근 방식의 식별은 세포 배양 3에서 생산적인 감염을 완료하는 인간 noroviruses의 무능력으로 인해 제한되었습니다. 밀접하게 인간의 노로 바이러스 네하지만 어떤 관련이 murine 노로 바이러스 (MNV)의 최근의 분리는 세포 5에서 증식 수있는 이러한 병원균 6, 7의 조사를위한 새로운 길을 열었습니다. 새로운 긍정적인 감각의 게놈과 subgenomic RNA 분자의 합성에 MNV 복제 결과, 후기 지난 생에 해당바이러스 게놈의 RD (그림 1). MNV는 ORF1은 게놈의 대부분을 점유하고 polyprotein 전구체에서 발표된 일곱 비 구조 단백질 (NS1-7) 인코딩 중 네 가지 열린 독서 프레임 (ORFs)를 포함합니다. ORF2 및 ORF3는 subgenomic RNA 지역 내에 포함된 및 capsid 단백질 (각각 VP1과 VP2) (그림 1) 인코딩됩니다. 최근, 우리는 ORF2 중복되는 추가 ORF4을 확인하지만, 색다른 열람 프레임에 기능이며, mitochondrial화된 독성 계수 (VF1) 8을 위해 인코딩했습니다. noroviruses 포함하여 긍정적인 감각 RNA 바이러스, 대한 복제는 새로운 uncapped RNA의 genomes의 합성 결과 세포질에서 이루어진다. 바이러스 번역을 촉진하기 위해 바이러스가 세포의 단백질 합성 기계 9-11을 모집 겨냥한 다양한 전략을 악용. 흥미롭게도, 노로 바이러스 번역은 다기능 바이러스성 단백질 프라이머의 VPg에 의해 주도되고covalently 게놈과 subgenomic RNAs 12-14 모두의 5 &#39;끝에 연결되어. 번역의 이러한 복잡한 메커니즘은 기존의 역방향 유전학 방법에 의한 바이러스 복구의 제한된 효율성의 주요 요소가 될 가능성이 높습니다. 여기 murine 노로 바이러스-1 세대 (이것과 함께 MNV으로 함) 5 &#39;끝에 공을 성적을 바탕으로 두 가지 전략을보고합니다. 두번째 접근법은 T7 RNA 중합 효소의 표현 세포의 cDNA MNV의 해독을 수반하는 반면 방법 중 하나는 체외 합성과 바이러스의 RNA의 상한을 모두 포함합니다. MNV의 연구와 작은 동물 모델에 대한 이러한 역방향 유전학 시스템의 가용성 복제 및 pathogenesis 15-17에서 바이러스 시퀀스의 역할을 해부하기 위해 전례없는 능력을 제공합니다.

Noroviruses들이 특성화를위한 위장염 아직 분자 기술의 주요 원인은 아직 비교적 새로운입니다. 여기 murine 노로 바이러스 (MNV), 세포 배양에서 증식 수있는이 속의 유일한 구성원의 효율적인 복구를위한 두 개의 역방향 유전학 방법을보고합니다.

감염성 Murine 노로 바이러스의 역방향 유전학 중재 복구

인체 노로바이러스는 전 세계적으로 발생하는 대부분의 인체 위장관염(GE) 사례의 원인이며, 밀접한 접촉이 빈번한 환경에서 반복적으로 발생하는 문제입니다...

이 프로시저의 전체적인 목표는 두 가지 역전이 유전학 시스템을 사용하여 감염성 mu eye neurovirus를 회복하는 것입니다. 안녕하세요, 임페리얼 칼리지 런던의 바이러스학 섹션에 근무하는 Armando Arias입니다. 저희 연구 그룹에서는 neurovirus 복제의 기저에 있는 분자적 메커니즘을 분석하는 데 관심을 두고 있습니다.노로바이러스는 위장염의 주요 원인입니다. 전 세계적으로 노로바이러스의 특성 분석을 위한 분자 기술은 여전히 상대적으로 초기 단계에 있습니다. 세포 배양에서 효율적인 감염을 완결시키지 못했기 때문에, 새로운 항바이러스 접근법의 발견과 노로바이러스의 생애 주기에 대한 통찰력 확보에 한계가 있었습니다.최근 마우스에 감염시키고 세포 배양에서 증식시킬 수 있는 항바이러스제, 즉 mirror neurovirus의 분리는 이러한 중요한 병원체 연구의 새로운 길을 열었습니다. 본 보고서에서 우리는 세포 배양 내에서 유전적으로 정의된 neuro neurovirus 분리주를 생성할 수 있는 두 가지 전략을 제시할 것입니다. 두 전략 모두 5' 말단에 캡핑된 바이러스 전사체의 생성을 기반으로 합니다.첫 번째 방법은 세포 내로 형질전환시키기 전, 인비트로(in vitro)에서 바이러스 RNA의 캡핑(capping) 및 합성을 포함합니다. 두 번째 접근법은 T7 RNA 중합효소를 발현하는 세포 내에서 노로바이러스 cDNA의 전사를 수반합니다. 절차 개요. 캡핑된 RNA 전사체로부터 노로바이러스를 회수하는 프로토콜은 선형화(linearization)부터 시작됩니다.mmv one을 위한 MV CD NA가 포함된 플라스미드입니다. 이는 제한 효소 NHE one을 사용하여 수행됩니다. 다음으로 DNA는 T seven RNA polymerase를 사용하여 in vitro에서 RNA로 전사됩니다.그 후, M-M-V-R-N-A를 인비트로(in vitro)에서 캡핑하고 세포에 형질전환하여 감염성 MMV를 회복시킵니다. 직접 형질전환된 cDNA 클론으로부터 감염성 MNV를 직접 회복시키기 위해 T7 RNA 중합효소를 발현하는 FAL PX 바이러스를 사용하는 경우, 먼저 세포를 T7 RNA 중합효소를 발현하는 재조합 FAL PX 바이러스로 감염시킵니다. FAL PX 감염은 T7 RNA 중합효소뿐만 아니라 합성된 RNA의 일부를 캡핑할 수 있는 바이러스 RNA 캡핑 효소의 발현을 유도합니다. 그런 다음 지질 매개 형질전환법을 통해 FPV 감염 세포에 M-M-V-C-D-N-A를 형질전환합니다. 그러면 T7 RNA 중합효소가 M-M-V-R-N-A를 생성하며, 생성된 RNA의 일부는 F-P-V-R-N-A 캡핑 기전에 의해 캡핑될 수 있습니다.리보자임 서열은 각 RNA 전사체가 정의된 3' 말단을 갖도록 보장합니다. 캡핑된 MMV 전사체는 이후 복제 전 단백질로 번역되어 새로운 감염성 입자의 생성으로 이어집니다. 감염성 MMV 회수를 위한 RNA 전사 및 캡핑 프로토콜: 감염성 캡핑 MMV 전사체의 합성.먼저 전사 버퍼, 뉴클레오타이드, 물, 그리고 M-M-V-C-D-N-A가 포함된 선형화된 플라스미드와 같은 다음 시약들을 혼합합니다. 그런 다음 반응 혼합물에 RNA와 T7 RNA polymerase를 첨가합니다. 이러한 목적을 위해 다양한 상용 키트를 사용할 수 있으며, 이는 RNA 합성을 위한 재현 가능한 방법을 제공합니다.전사 반응은 혼합물을 37 °C에서 최소 2시간 동안 배양하여 수행합니다. 비변성 아가로스 겔에서 이 전사 반응물의 소량을 분석하십시오. 먼저, 사용 전에 세제로 겔 장비를 세척하고 RNase-free water로 헹궈내십시오.RNA-free 시약을 사용하여 아가로스 겔을 준비하십시오. M-V-R-N-A는 비변성 아가로스 겔에서 약 3 kb 부근에서 이동합니다. 또한, Agilent Bioanalyzer를 사용하여 RNA 무결성을 신속하게 분석하는 방법을 사용할 수 있습니다.그 다음, 결합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거하기 위해 RNA를 정제해야 합니다. 다양한 방법이 존재하지만, 본 프로토콜에서는 비용 효율적인 대안으로 염화리튬 침전법을 통해 RNA를 정제하며, 최대 속도로 15분 동안 원심분리하여 RNA 펠렛을 형성합니다. 반투명한 펠렛이 손상되지 않도록 주의하며 상층액을 제거하고 70% 에탄올을 사용하여 세척합니다.MMV 전사물을 RNA 보관 용액에 다시 현탁하고 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 나중에 RNA를 65 °C로 가열하면 이 과정에 도움이 될 수 있습니다. 분광 광도계를 사용하여 RNA를 정량하십시오.1% 비변성 아가로스 겔(non denaturing agarose gel)에 소량의 시료를 전기영동하여 RNA 무결성을 분석합니다. 보시는 바와 같이, 캡핑 효율을 높이기 위해서는 염화리튬 침전 후에도 RNA 무결성이 그대로 유지되어야 합니다. RNA 소량을 65°C에서 10분 동안 가열합니다.튜브를 즉시 얼음에 배치하십시오. 분해 또는 리폴딩(refolding)을 방지하기 위해, 제조사가 제안한 대로 캡핑 반응 혼합물을 준비하십시오. 일반적으로 최종 반응 부피 100 microliters에 약 60 micrograms의 M-N-V-R-N-A를 첨가합니다.반응 규모를 줄일 수 있지만, 충분히 혼합한 후 37°C에서 1시간 동안 배양하고, 이전과 동일하게 염화리튬 침전법으로 RNA를 정제하십시오. transfection을 진행하기 전에 RNA의 무결성을 다시 확인하는 것이 필수적입니다. 생세포 내 RNA 전기천공을 통한 MMV 회수 단계별 프로토콜. 재현탁.원시 세포가 담긴 플라스크를 DMEM에 현탁합니다. 단일 세포 현탁액이 형성되었는지 확인하십시오. 트리판 블루 배제법을 이용하여 혈구계수기로 생존 세포의 농도를 측정합니다.세포를 펠렛화하고 조심스럽게 재현탁합니다. 항생제가 없는 신선한 배지에 세포를 부유시키고, transfection당 8 million cells씩 분주하여 마이크로 원심분리기로 펠렛화합니다. 배지를 제거하고 500 µL의 PBS로 세포를 세척한 후, 다시 원심분리하여 PBS를 제거하고 세포를 실온의 130 µL 용액에 재현탁합니다.Neon 재현탁 현탁액. 일반적으로 600만 개의 세포당 1 µg의 RNA에 해당하는 양인 130 µL의 세포당 1.3 µg의 캡핑된 RNA를 적절한 양으로 첨가합니다. 전사체와 혼합된 세포는 100 µL Neon transfection tip에 수집합니다.이 단계에서는 기포가 유입되지 않도록 각별히 주의해야 합니다. 그런 다음 1700V 전압으로 25ms 동안 단일 펄스를 사용하여 전기천공을 수행합니다. 세포를 1mL의 항생제가 없는 배지가 들어 있는 eend orph 튜브에 회수합니다.튜브의 세포를 10% FCS가 포함된 항생제 무첨가 DMEM이 들어 있는 개별 웰에 분주하고, 37°C에서 24~72시간 동안 배양합니다. 이전과 동일하게 BSR T7 세포에 RNA lipofection을 통한 MMV 회복을 진행합니다. 캡핑된 MMV 전사체는 MMV cDNA 플라스미드의 선형화, T7 polymerase를 이용한 인비트로(in vitro) 전사 및 인비트로 캡핑을 통해 생성됩니다. 이후 전사체를 BSR T7 세포에 lipofection합니다. BSR T7 세포 단층을 트립신 처리하고, 6-웰 플레이트 디쉬에 생존 세포 7.5 × 10⁵개를 분주합니다.세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 세포에서 배지를 제거하고 항생제가 없는 신선한 배지 3 mL로 교체합니다. 형질전환 효율을 최대화하기 위해, 1~2 µg의 capped M-M-V-R-N-A를 100 µL의 optimum과 혼합합니다.또한 4 µL의 lipectomy 2000을 100 µL의 optimum과 혼합합니다. RNA와 lipectomy가 포함된 샘플들을 결합하고, 피펫팅을 15회 반복하여 충분히 혼합합니다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 둡니다.그다음 캡핑된 MMV 전사체가 포함된 transfection 복합체를 세포 단층 위에 방울 형태로 첨가합니다. 플레이트를 수직 방향으로 흔들어 줍니다. 세포를 24시간에서 72시간 동안 배양합니다.앞서 설명한 바와 같이, T7 RNA polymerase를 발현하는 세포에서 감염성 MMV를 직접 회복하기 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 helper oxx 바이러스에 감염된 세포 내의 T7 RNA polymerase 및 oxx 바이러스 capping 효소의 발현을 기반으로 합니다. 그 후 T7 프로모터의 제어를 받는 M-N-V-C-D-N-A를 세포에 트랜스펙션합니다.먼저, 세포 배양 배지를 제거하고 각 웰에 항생제가 없는 배지로 희석한 F pox virus 700 µL를 첨가합니다. 일반적으로 세포당 약 0.5 PFU의 감염 다중도를 사용하며, 플레이트를 수직으로 세워 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 항생제가 없는 배지 2 mL를 첨가하고 37 °C에서 1시간 더 배양하여 T7 RNA polymerase 발현 및 MNV CG NNA transfection이 이루어지도록 합니다. 감염된 세포에서 배지를 제거하고 항생제가 없는 신선한 배지 3 mL를 첨가합니다.이전 섹션에서 설명한 대로 1 µg의 M-M-V-C-D-N-A와 lipectomy 혼합물을 준비하십시오. 파이펫팅을 통해 충분히 혼합하십시오. 튜브를 상온에서 20분 동안 유지한 후, 다시 혼합하여 세포 단층(cell monolayer)에 한 방울씩 첨가하십시오.플레이트를 수직 방향으로 가볍게 흔들어 줍니다. 이 비디오 릴리스 과정에서 제시된 서로 다른 역유전학적 접근법을 통해 감염성 MMV의 회복을 확인하기 위해 세포를 37°C에서 24~72시간 동안 배양합니다. 반복적인 동결-해동을 통해 세포로부터 감염성 바이리온을 방출시킵니다. TCID$_{50}$ 또는 플라크 분석과 같은 표준 절차를 통해 각 샘플의 역가를 측정하여 대표적인 결과를 확인합니다.mi Neurovirus를 연구하기 위한 이러한 역유전학 시스템의 가용성은 천연 숙주 내에서 뉴로바이러스의 복제 및 병원성에 있어 바이러스 서열의 역할을 분석할 수 있는 전례 없는 능력을 제공하였습니다. 이 비디오에서 설명한 두 가지 역유전학 접근 방식 모두 감염성 뉴로 및 뉴로바이러스의 회수와 세포 배양에 매우 효율적입니다. 이 그림에서 보여주는 바와 같습니다.캡핑된 MMV 전사체를 raw 세포 또는 BSRT7 세포에 트랜스펙션한 후, 10⁵ TCID₅₀/mL를 초과하는 감염성 MMV가 회수되었습니다. fowl pox virus의 도움으로 사전에 감염된 BSRT7 세포에 MMV-cDNA를 트랜스펙션한 결과, 10⁴ TCID₅₀/mL를 초과하는 바이러스 타이터가 나타났습니다. 역유전학적 접근법으로 얻은 바이러스 타이터는 감염성 바이러스에서 분리한 RNA를 트랜스펙션하여 회수한 타이터와 유사하며, 이는 여기서 설명한 역유전학 시스템의 높은 효율성을 강조합니다.

reverse-genetics-mediated-recovery-of-infectious-murine-norovirus

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

primers와 열린 독서 프레임 1 (ORF1) ORF2 접합 영역입니다 노로 바이러스의 게놈 중 가장 보존 지역에 대한 구체적인 TaqMan 프로브를 이용하여 아이들의 stools에서 탐지 및 노로 바이러스의 분리의 genogroup 식별을위한 원 - 스텝 RT-PCR 분석 설명했다. 비상업적인 비용 효율적인 RNA 추출 방법을 자세히 설명하고 있습니다.

Taqman함으로써 어린이 Stools에서 Noroviruses의 감지 및 Genogrouping 한 단계 RT-PCR

리프트 밸리 열병 바이러스 MP - 12 백신 스트레인에 대한 역방향 유전 시스템은 증가 감쇄 및 immunogenicity로 추가 MP - 12 돌연변를 만들기위한 유용한 도구입니다. 우리는 NSS 돌연변이 변종을 생성하고 특성화 프로토콜을 설명합니다.

리프트 밸리 열병 바이러스 백신 안전 및 효능을 향상하기 위해 MP - 12 스트레인의 NSS 진을 조작하는 역방향 유전자를 사용하여

여기 효율적으로 세포 배양에 복제 유일한 노로 바이러스입니다 손쥐 노로 바이러스 (MNV)의 전염성 입자를 정량화하는 방법을 설명합니다. 플라크 분석은 손쥐 대 식세포에 대한 MNV의 tropism을 활용하고 MNV를 포함하는 생물이나 환경 샘플에서 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다.

손쥐 노로 바이러스에 대한 상패 분석

출처: Leuthold, M. M., et al. X선 결정학을 위한 대 장균 에서 인간 노로바이러스 돌출 도메인 생산. J. Vis. 경험. (2016).이 비디오는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 재조합 인간 노로바이러스 P 도메인을 정제하는 방법을 보여주며, 차등 기공 접근성을 기반으로 고분자량 및 저분자량 불순물로부터 표적 단백질을 분리하는 방법을 강조합니다. 이 공정은 UV 흡광도로 모니터링되고 용출된 분획의 SDS-PAGE 분석을 통해 확인됩니다.

인간 노로바이러스의 박테리아 유래 재조합 P 도메인 단백질의 정제

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

복제 cDNA를 같은 유전자를 역 참조 방식에서 재조합 arenaviruses의 구조는 연구자 arenavirus의 생물학의 다양한 측면, 특정 바이러스 유전자 산물의 역할뿐만 아니라, 서로 다른 특정 도메인 및 잔류의 기여를 조사 할 수 있습니다 . 마찬가지로, 인간의 병원성 arenaviruses을 방지하기 위해 효과적이고 안전한 백신의 생성에 새로운 가능성을 제공하는 백신 개발을위한 FDA 승인 세포주 (베로)의 유전학 기술을 역으로 수행합니다.

FDA 승인 베로 세포 백신 개발을위한 재조합 Arenavirus의 생성

뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV)는 광범위 중에서도, 백신 및 치료를위한 새로운 벡터를 개발하기 위해 지난 몇 년 동안 연구되어왔다. 이 연구로 인해 이러한 우리가 여기에서 설명하는 것과의 cDNA에서 재조합 바이러스를 구출하는 기술로 가능했습니다.

의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조

여기에서는 역전사-정량적 PCR을 사용하여 환경 및 음용수에서 엔테로바이러스와 노로바이러스를 정량화하는 절차를 제시합니다. EPA Method 1615의 표준화된 절차를 통해 지하수에서 바이러스가 회수되는 평균 비율은 소아마비 바이러스의 경우 20%, 쥐 노로바이러스의 경우 30%였다.

엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출

일상적인 탐지 방법 바이러스 성 게놈 증폭을 이용 하는 비 전염 성 입자에서 전염 성 차별을 그들의 무 능력에 의해 제한 됩니다. 이 문서의 목적은 aptamer 바인딩, 동적 산란, 및 전송 전자 현미경 검사 법을 사용 하 여 감염 노로바이러스 입자의 차별에 도움이 다른 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하는 것입니다.

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플라스미드 DNA로부터의 재조합 로타바이러스 생성은 로타바이러스 복제 및 병인, 및 로타바이러스 발현 벡터 및 백신의 개발을 위한 필수적인 도구를 제공한다. 본 명세서에서, 우리는 형광 리포터 단백질을 발현하는 균주를 포함하는 재조합 로타바이러스를 생성하기 위한 단순화된 역유전학 접근법을 설명한다.

리포터 단백질을 발현하는 재조합 로타바이러스를 회수하는 역유전학 방법 간소화

이 프로토콜의 목적은 진핵 병원체 인간 노로바이러스의 결합을 박테리아에 정량화하는 것이다. 초기 바이러스-박테리아 부착 분석을 수행한 후, 유동 세포측정은 집단 내에서 바이러스 결합 박테리아를 검출하는 데 사용된다.

유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화

배우세요 감염성 Murine 노로 바이러스의 역방향 유전학 복구 방법을. 세포 배양에서 RNA 전사 및 cDNA 기반 전략을 활용하여 바이러스 복제와 병원성 연구에 활용할 수 있는 효율적인 실험 기법을 익히세요.

감염성 Murine 노로 바이러스의 역방향 유전학 중재 복구

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