Name: 복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화에서 시츄 재관류 lacZ 태그 종양 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 배우세요 마우스 폐 전이를 단일 세포 해상도로 검출하는 시츄 퍼퓨전 및 X-Gal 염색법을 통해. 이 방법은 혈액 배경을 제거하여 미세 전이의 가시성을 크게 향상시킵니다.

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저자는 폐 관류의 기술에 대한 그의 조언 박사 Lubor Borsig을 (생리학 연구소, 취리히 대학) 감사드립니다. 이 작품은 Kanton 취리히 (Zurich)의 Krebsliga, 월터 L.와 요한나 늑대 재단, 취리히, 리디아 Hochstrasser 재단, 취리히, 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation), SNF, 스위스, Schweizerischer Verein Balgrist, 그리고 대학에서 보조금에 의해 지원되었다 취리히 (Zurich).

1.에서 시츄의 폐 관류 및 고정 <ol><li> ~ 150 μl 인산염의 IP 주입하여 마우스를 마취는 생리가 (PBS) 112.5 밀리그램 / kg (체중) 케타민, 16.5 밀리그램 / kg xylazine, 15 밀리그램 / kg acepromazine (또는 적절한 진통제를 포함하는 다른 마취로).를 포함하는 버퍼 </li><li> 마우스 반사 신경이 더 이상 관찰되지 않을 때, 다시 다운 운영 테이블에 문제를 해결 아래로 매끄러운 머리카락에 70 %의 에탄올과 모피 젖었 어. </li><li> 목으로 복부의 피부를 열고 측면에 당기거나 제거 할 수 있습니다. </li><li> 충분한 크기로 복막과 가슴을 엽니 다. 이후 재관류의 감소 효율을 피하기 위해 큰 혈관의 파열 (예를 들면 베나의 jugularis) 방지합니다. </li><li> 간 아래 대정맥 caudalis 잘라. </li><li> 폐 완전히 흰색이며 때까지 뛰는 심장의 우심실로 천천히 10-15 ML PBS를 주입 24G 바늘 - 21G를 갖춘 20 ML의 주사기를 사용하여마음 (심장 수 축제) 박동을 멈 춥니 다. </li><li> 혈관 클램프로 간, 횡경막 위의 혈관을 찔러. </li><li> 오른쪽 심실로 PBS에 3 % paraformaldehyde의 ~ 2 ML (PFA)를 삽입 24G 바늘 - 21G를 갖춘 10 ML의 주사기를 사용합니다. </li><li> 가슴 이외의 기관을 발견. 폐는 증가 될 때까지 기관에 PBS 두개골 (가슴 이외의)에 3퍼센트 PFA의 ~ 3 ML를 삽입 할 때 동일한 주사기를 사용합니다. 즉시 바늘을 제거 후 혈관 클램프로 펑크의 기관 꼬리를 찔러 및 고정 할 수 있도록 10 분 기다립니다. </li><li> 혈관 클램프 위의 혈관을 가로로 쪼개다, 클램프를 제거하고 초과 PFA를 제거 할 수 우심실로 ~ 2 ML PBS를 삽입. </li><li> 찔린 바늘이있는 모든 폐 엽 (叶)의 하단 부분은 기관에서 혈관 클램프를 제거하고의 PFA까지 첫 번째 구멍의 기관 꼬리에 중간 / PBS 1:1 삽입 PolyFreeze의 솔루션 3-5 ML를 삽입 공기가 신선한 빈터엽은 솔루션으로 대체됩니다. </li><li> 집게로 마음을 당겨와 결합 조직 인대, 혈관 및 기관을 끊어 버렸네하여주의 깊게 폐를 제거합니다. 폐에 연결된 마음을 유지. </li><li> 폐 조직 분석을 진행하는 방법에 따라 섹션 2 또는 3에 명시된 프로토콜로 진행합니다. 이 두 분석을 수행하려는 경우, 한 폐 엽을 제거하고 3에서 설명 된대로 진행합니다. 이 아래 설명 된대로 마음에 연결된 나머지 엽 (叶)을 처리합니다. </li></ol> 2. 전체 폐 엽 (叶)에 lacZ 태그 전이성 종양 세포의 시각화 <ol><li> 단단히 닫는 뚜껑이있는 플라스틱 컵에 폐를 놓고 30-60 분 동안 실온에서 PBS에 2 %의 포름 알데히드로 해결할 수 있습니다. </li><li> 고정 솔루션을 제거하고 PBS로 철저하게 3 회 씻는다. </li><li> 갓 5 - 브로 모 -4 - 클로로-3-인돌 릴-β-D-galactoside (X-걸) 착색 솔루션 (X-걸 주식 솔루션 [40 MG / ML에서 조리 적어도 10 ML을 추가Dimethylformamide] 1시 40분 기본 착색 솔루션에 희석, pH를 7.1 (표 1), 빛으로부터 보호). </li><li> 솔루션에 완전히 유지하고 공기의 교환을 허용하도록 포트에만 느슨하게 뚜껑을 배치 할 수있는 수영 폐의 상단에 거즈 조각을 놔. </li><li> 빛으로부터 보호 3-5 시간에 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> X-걸 솔루션을 제거 잔류 X-걸 솔루션을 (선택 사항) 제거하고 4% PFA를 추가 할 수 PBS로 한 번 씻어. </li></ol> 3. 폐 Cryosections에 lacZ 태그 전이성 종양 세포의 시각화 <ol><li> undiluted PolyFreeze 퍼가기 매체와 3분의 1에 미리 기입 표시 퍼가기 금형. 상단에있는 폐 엽을 넣고 엽이 완전히 덮여 때까지 매체를 삽입 따라 작성하십시오. 거품을 억제하기 위하여 노력하고 있습니다. </li><li> 20 분에 4 ° C에 포함 된 폐를 품다. </li><li> 그런 다음 -80 ° C.에 천천히 드라이 아이스와 이소 펜탄 및 매장의 혼합물에 포함 된 폐를 고정 </li><li> 7-10 μm cryo 잘라그라 이오 스탯에 섹션 및이 SuperFrostPlus 현미경 슬라이드에 올려 탑재합니다. </li><li> humidified 챔버에서 24 시간에 ° C 37 X-걸의 착색 솔루션을 즉시 절을 품다. </li><li> 증류수에 잠시 후 5 분에 있고 PBS 2 회에서 슬라이드를 씻어. </li><li> , 10-30 초에 대한 핵 빠른 붉은 색과 반대 얼룩은 증류수에 씻어 Immu 마운트와 슬라이드를 탑재합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 아사이 외. 높은 전이성 LM8 하위 세포 라인에서 파생 된 것과 다른 부모 던 세포에서 파생 된 SC 기본 종양, 저절로에서 감지 폐 ​​metastases를 형성하지 않는 것이 던 - 파생 LM8 OS 마우스 모델에있는 원본 문서에보고 syngeneic C3H 마우스 14. 여기에보고 된 기술을, 우리는 Dunn/LM8 마우스 OS 모델의 metastases의 형성을 reinvestigated. 우리는 안정적인 lacZ-transduced 던과 LM8 셀을 이용했다s와 쥐의 시츄 폐 관류 및 고정을위한 프로토콜. 피하에 주입 쥐 perfused 및 비 perfused 폐의 대표 이미지 lacZ는 - transduced 및 제어 던과 LM8 세포를 그림 1에 표시됩니다 비 transduced. 제어 던 세포를 주입 생쥐에서 매크로 및 미세 metastases은 비 perfused와 perfused 폐 (그림 1A, I-IV)에 탐지가 남아 있었다. 그러나, 흥미롭게도, 던 - lacZ 세포와 함께 주입 마우스에 X-여자의 얼룩은 비 perfused 폐 (그림 1A, 누나)의 표면에 단일 세포 또는 작은 세포 클러스터 (&lt;0.1 mm)의 푸른 micrometastatic foci을 공개했다. 인 폐의 현장 재관류와 고정 더욱 던-lacZ micrometastases (그림 1A, VIII)의 detectability을 개선. 그러나, 매크로 foci로 가지 (그림 1A, V, VII) 관찰되지 않았습니다. &lt;이/ P&gt; 반투명 제어 LM8 세포, 거의 감지 macrometastatic foci로 주입 마우스에 직경 0.1 mm보다 큰이 아닌 perfused 폐 (그림 1B, 난)에서 인정되었다. 폐의 재관류 (그림 1B, III)는 foci의 검출이 향상되지 않았다. 그러나, 쥐에서 여러 LM8-lacZ 세포를 주입 X-걸 스테인드 푸른 매크로 (그림 1B, V)와 micrometastases (그림 1B, 누나)가 아닌 perfused 장기의 표면에 발견되었다. 또한, 폐의 재관류는 추가의 detectability 매크로 및 micrometastases을 (- VIII 그림 1B, VII) 개선. 따라서, 마이크로 및 macrometastases은 주로 인해 장기의 표면 아래에 foci도 보게되었습니다 된 perfused 조직의 투명도에, 높은 밀도 및 더 많은에 표시되었다. 추가 H폐 조직의 cryosections를 사용하여 istological 분석 lacZ-transduced 던과 LM8 세포를 주입 쥐 폐 metastases의 개선 detectability을 확인했습니다. 던 - lacZ 또는 LM8-lacZ 세포에서 파생 된 주요 악성 종양으로 마우스에서 각각의 제어 세포, micrometastases 또는 단일 셀 foci의 주요 악성 종양으로 쥐와 달리 폐 섹션 (그림 2)에서 인정되었다. 또한, macrometastases 또한 제어 LM8 세포 (그림 2C, D)으로 주입 동물보다 LM8-lacZ 세포를 주입 쥐에 더 명확하게 볼 수 있었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> 그림 1.의 자연 metastases의 검색이 아닌 transduced (I-IV)와 lacZ는 - transduced (V-VIII) 던 (A)와 LM8 (B) 비 perfused (I, II, V, VI)와 perfused의 셀 C3H 마우스의 (3, 4, VI​​I, VIII) 폐. 대표 X-걸 - 역에서 Metastasesined 전체 폐 (V, A와 B의 VII)와 각각의 클로즈업 (바이올렛에서 VIII A와 B) 파란색 표시됩니다. 비 태그 LM8 세포 (B에 I-IV)에 주입 쥐 기관의 Macrometastatic foci가 (&gt; 0.1 mm) 별표로 표시됩니다. 클로즈업에 표시된 영역은 전체 폐에 대표입니다. 스케일 바는 전체 폐의 ​​이미지에서 1 mm와 클로즈업의 0.1 mm를 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> 그림 2. 던과 폐 cryosections에 LM8 micrometastases의 감지. 10월 임베디드 폐 조직의 섹션은 humidified 챔버에서 24 시간에 37 ° C에서 X-걸의 착색 솔루션에 incubated하고 핵 빠른 빨간색으로 counterstained했다. 화살표 던-lacZ (B) 또는 LM8-lacZ 전지 (D)와 함께 주입 마우스의 폐 섹션에서 인정 micrometastatic foci를 가리 킵니다. 엠icrometastases가 아닌 transduced 던 (A) 또는 LM8 셀 (C)와 함께 주입 마우스의 폐 섹션에서 탐지가 남아 있었다. 스케일 바는 0.1 mm를 나타냅니다.

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<li>Steinmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimetastatic+activity+of+honokiol+in+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma.</a> Cancer. , (2011).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Dunn/LM8 마우스 OS 모델의 여기에 제시된 결과는 인 시츄 재관류 / 폐 조직의 고정와 lacZ 태그 종양 세포의 X-걸의 착색을 결합 새로 설립 방법의 힘을 보여줍니다. 두 기술의 조합은 단일 세포 수준 micrometastatic 병변의 고감도 검출을 할 수 있으며, 폐 표면 (그림 1)뿐만 아니라 폐 섹션에서 (그림 2)에 macrometastases의 시각화을 향상시킵니다. X-걸의 얼룩도 있기 때문에 자연 혈액 및 조직 관련 색 다른 기관에서 시츄 재관류 / 고정의 (마이크로) metastases의 검출은 약간 폐 이외의 조직에서 전이성 foci의 detectability을 향상 할 수 있지만 이러한 기관 13. 재관류가 다른 기관에 전달됩니다 경우에도 간을 예를 들어, 혈액의 제거는 부분적으로 대비 베팅을 향상시킬기대하다 X-걸의 착색과 장기의 자연 색상입니다. 그러나, 방법은 lacZ 태그 종양 세포의 모든 종류에 적용됩니다, 극적 휴지 단일 셀 micrometastases의 수준에 폐 전이의 detectability을 개선하고, 매크로 및 micrometastases의 쉽고 신뢰할 수있는 정량화 수 있습니다. 이 방법과 루시 페라와 형광 단백질을 포함한 기자 유전자를 기반으로하는 다른 모든 기술의 한계는 transgene 표현의 안정성입니다. 그림 2D에 도시 된 바와 같이, macrometastatic foci 내 모든 종양 세포는 베타 갈 락토 활동의 부족을 나타내는 파란색 얼룩이 있습니다. 이 괴사에 관련된 될 수 있지만, 더 많은 가능성이 transgene 표현의 손실 때문입니다. 우리는 던과 LM8 세포가 표현에도 지속적인 선택에 따라 lacZ와 다른 transgenes의 다운 규제에 매우 효과적인 것을 관찰했다. 따라서 우리는 손쥐 K12에 최근의 연구에서 전환그리고 K7M2 모든 체외뿐만 아니라 최대 시간이 지남에 따라 100 % 생체 내 안정성 lacZ 식을 유지 인간의 호수, 143B와 미친-2 osteosarcoma 세포 라인. lacZ 표현되면 안정이 보장되고,이 기법은 mechanistically 조직 식민지 13뿐만 아니라 전이성 병변 (15)의 근절을 목표로 새로운 치료법의 개발과 테스트 과정을 조사 할 예를 들어 유전자 조작 종양 세포와 연구에 적용 할 수 16. 또한, 전이성 병변의 조기 발견을 위해 사용되는 등 PET (마이크로) 중부 표준시와 MRI 등 최신 방사선 이미징 기술,의 개선을위한 벤치 마크 역할을 할 수 있습니다. 다른 추적기와 최근 PET 연구 (게시되지 않은)에서 우리는 생체 감지 폐에서의 설명 프로토콜 이후 전 생체을 metastases 확인했습니다. 새로운 작은 동물 마이크로-CT와 지속적인 연구에서는 (SkyScan) 우리가 지금까지 AB입니다르 0.5 mm 및 예 생체 다운 0.3 mm까지의 크기로 생체에 폐 metastases를 감지 할 수 있지만, 우리는 0.1 mm의 해상도로 목표로하고 있습니다. 흥미롭게도, 우리가 인 시츄 재관류와 X-걸의 착색의 결합 방법에 micrometastases 매크로에서 구별 할 설정 한 크기 제한입니다. 이 다시 쉽게하고 비용 효율적인 기술의 감도와 유용성을 강조.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Narketan10 (케타민) </td><td> Vétoquinol AG </td><td></td><td> 100 MG / ML 솔루션 </td></tr><tr><td> Xylazin (xylazine) </td><td> Streuli 제약 AG </td><td></td><td> 20 MG / ML 솔루션 </td></tr><tr><td> Prequilan (acepromazine) </td><td> Fatro 스파 </td><td></td><td> 10 MG / ML 솔루션 </td></tr><tr><td> 불독 유형 혈관 클램프를 Serrefine </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 18051-35 </td><td> 곡선, 35mm </td></tr><tr><td> 뚜껑이있는 플라스틱 컵 </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 뚜껑 25 ML 컵 </td></tr><tr><td> 5 - 브로 모 -4 - 클로로-3-인돌 릴-β-D-galactoside (X-걸), 분말 </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002 - G005 </td><td> 저장, N-디 - methylformamide 40 MG / ML에, N에 용해 가벼운 보호 -20 ° C에서 </td></tr><tr><td> 최대에 빛을 보호 4에 ° C 저장 산도 7.1 equilibrated 기본 착색 솔루션. 1개월 </td><td> 자수성가 </td><td></td><td> 100 ML / L 10xPBS, 1.64 g / L K3Fe (CN) 6, 2.1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 ML / L 1M MgCl2, 2 ML / L 10% NP40, 1 ML / L 10 % 나트륨 - Deoxycholate </td></tr><tr><td> PolyFreeze 임베딩 매체 </td><td> Polysciences, 스위스 대리점 : Brunschwig </td><td> 19636-1 </td><td></td></tr><tr><td> 금형을 삽입 </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Leica CM1850 그라 이오 스탯 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost 슬라이드 </td><td> Menzel </td><td> J1800AMN​​Z </td><td></td></tr><tr><td> 핵 빠른 레드 - 황산 알루미늄 용액 </td><td> 부 채도 Waldeck GmbH의 및 공동 KG 지구ributor : Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Immu 마운트 </td><td> 열 전자, 스위스 배급 : Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 시약 및 장비.

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 metastases의 향상된 시각화<em&gt;에서 시츄</em폐 조직 및 x-걸의 착색의&gt; 재관류<em&gt; lacz</em&gt; 태그 종양 세포

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

전이 암 유형의 대부분의 사망의 주요 원인과 암 연구에 따라서 주요 초점입니다. 그러나, radiologic 이미징 및 치료 퇴치의 성공에 의해 micrometastases의 검출이 제한 남아 있습니다. 동물 모델은 암 연구 1 귀중한 도구가 될 입증하고 있지만, 모니터링 / micrometastases의 시각화는 잠복기 연구의 도전과 전이성 확산의 부정확 한 평가를 잠재적으로 임상 실험 2에서 실망스러운 결과로 연결 남아 있습니다. 따라서, 마침내 정상 조직에있는 단일 세포 수준 metastases의 재현하고 안정적​​으로 감지 할 수 있도록 방법을 조정에 큰 관심이 있습니다. 주요 초점은 따라서 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로-CT), 양전자 방출 단층 촬영 장치 (PET), bioluminescence 또는 형광 이미징과 같은 생체에 종양 세포의 검출을 허용 기법,에 &lt;&gt; 3,4을 논의하게 될 것입니다. 현재 다른 osteosarcoma 모델의 기본 종양의 성장과 전이의 생체 모니터링에 대해 이러한 기술을 최적화하고 있습니다. 이러한 기술 중 일부는 qPCR 5, FACS 6 조직 학적 염색법의 다른 유형과 같은 고전적인 방법 옆에 전이의 예 생체 분석에 사용할 수 있습니다. 벤치 마크로서, 우리는 안정 transfection 또는 lacZ 유전자와 종양 세포의 형질 도입이 박테리아 효소 chromogenic 기판 5 - 브로 모 -4 - 클로로-3-인돌 릴 - 베타-D를 대사 β-갈 락토 인코딩 본 연구에서 설정 한 불용성 인디고 염료 7 여기에 표시된대로 단일 세포 수준에 마우스 조직 예를 생체 내 종양 세포의 매우 민감하고 선택 histochemical 파란 착색을 할 수 있습니다 투 - galactopyranoside (X-걸). 이 연구에 전이 8 정밀한 검증이 새로운 평가 할 수있는 저가의 장비를 많이 사용하지 도구입니다ticancer 요법 9-11. X-여자의 착색의 제한 요소는 잘 vascularized의 조직의 혈액 관련 붉은 얼룩을 지정할 수있는 낮은 콘트라스트입니다. 폐 조직에서이 문제가 인 시츄 폐 관류, 최근 Borsig 외 12. 혈액을 취소하고 아래 시츄에 문제를 해결하고 삽입 마취에서 마우스의 폐를 perfused에 의해 설립 된 기술로 해결 될 수 기관을 통해 인플레이션. 이 방법은 또한 폐의 붕괴를 방지함으로써 조직 학적 분석을위한 조직의 품질을 향상 기능 폐 폐포의 형태를 유지하고 있습니다. 본 연구에서 우리는 lacZ - 표현 종양 세포의 X-여자의 착색의 조합을 활용하고 인 시츄 살포 및 폐 조직의 고정. 새로운 프로토콜을 설명 이 세련된 프로토콜은 폐의 단일 전이성 세포의 높은 감도 감지 할 수 있습니다 및 D에 대한 최근의 연구에서 우리를 활성화원래 14 비 전이성로 설명 된 마우스 모델 13의 &quot;휴지&quot;폐 micrometastases를 etect.

본 연구에서보고 된 소설 프로토콜 결합에 의한 마우스의 단일 셀 해상도로 폐 metastases의 선택적 검출 할 수 있습니다<em&gt;에서 시츄</em&gt; 폐 관류 및 고정하고 X-걸 착색<em&gt; lacZ</em종양 세포를&gt; 태그.

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화<em&gt;에서 시츄</em폐 조직 및 X-걸의 착색의&gt; 재관류<em&gt; lacZ</em&gt; 태그 종양 세포

전이는 대다수 암종에서 사망의 주요 원인이며, 따라서 암 연구의 핵심 초점이 되고 있습니다. 그러나 ...의 검출은

본 절차의 전반적인 목표는 팽창된 폐 구조를 유지하면서 마우스 폐의 ex vivo 미세 전이를 더 잘 검출하는 것입니다. 이를 위해 먼저 PBS를 이용해 in situ 폐 관류를 수행하여 해당 조직의 주요 색상 배경 원인인 혈액을 제거합니다. 다음 단계로 PFA를 주입하여 폐를 팽창시킨 후, 폐 조직이 팽창된 상태로 고정되도록 꼬집어 차단합니다.다음으로, 폐를 적출하여 PFA로 추가 고정하거나, 동결 절편 제작을 위해 단일 폐엽을 포매합니다. 마지막 단계로, Xal 용액으로 조직을 염색하여 LA zag 종양 세포를 시각화합니다. 궁극적으로 전체 폐엽 또는 폐 조직 절편 내의 전이를 쌍안 현미경이나 광학 현미경을 통해 단일 세포 수준까지 검출할 수 있습니다. 기존의 sky standing on its own과 같은 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 혈액 관련 배경 잡음이 제거되어 미세 전이의 검출 능력이 상당히 향상되었다는 점입니다.약 150 µL의 PBS에 녹인 케타민, 자일라진 및 아세프로마진을 복강 내 주사하여 마우스의 마취를 유도함으로써 프로토콜을 시작합니다. 마우스의 통증 반사가 더 이상 관찰되지 않으면 수술대 위에 고정합니다. 뒷부분을 아래로 향하게 한 뒤 70% ethanol로 털을 매끄럽게 정리합니다.복부에서 목까지 피부를 절개합니다. 피부를 양옆으로 당기거나 제거하십시오. 경정맥과 같은 큰 혈관의 파열을 방지하기 위해 흉강의 복막을 조심스럽게 절개합니다.이렇게 하면 관류 효율이 향상됩니다. 이제 21-24 gauge 바늘이 장착된 20 milliliter 주사기를 사용하여 간 아래의 vena cava cardis를 절단하십시오. 뛰고 있는 심장의 우심실에 10-15 milliliters PBS를 천천히 주입하여 폐가 완전히 하얗게 변하고 심장 박동이 멈출 때까지 계속합니다.그 다음 혈관 클램프를 사용하여 간과 횡격막 위의 혈관을 집어 차단합니다. 10 mL 주사기에 3% paraform aldehyde를 채우고, 21~24 gauge 바늘을 사용하여 우심실에 약 2 mL를 주입합니다.흉곽 외부에서 기관을 노출시키고, 흉곽 외부에서 기관 내로 알데히드 약 3 mL를 주입하여 폐를 팽창시킵니다. 그 후 바늘을 제거한 즉시 혈관 클램프로 천자 부위에 인접한 기관을 집어 고정하고, 고정이 이루어질 때까지 10분 동안 기다립니다. 다음으로, 혈관 클램프 윗부분의 혈관들을 절단합니다.그런 다음 클램프를 제거하고 우심실에 PBS 약 2 mL를 주입하여 과량의 파라포름알데히드를 제거합니다. 바늘로 모든 폐엽의 하단을 찌르고 기관에 있는 혈관 클램프를 제거합니다. 이제 다른 주입 단계와 마찬가지로 희석된 매립액 3~5 mL를 기관에 주입합니다.폐엽 내의 파라포름(paraform)이 용액으로 대체되면 주입을 중단합니다. 핀셋으로 심장을 당기고 결합 조직 인대, 혈관 및 기관을 절단하여 폐를 조심스럽게 제거합니다. 이때 심장이 폐에 연결된 상태를 유지해야 합니다.한 개의 엽은 동결 절편 제작을 위해 따로 떼어 두고, 나머지 폐 조직은 전체 염색에 사용합니다. 밀폐 뚜껑이 있는 플라스틱 컵에 폐를 넣고 2% formaldehyde와 PBS로 고정합니다. 폐가 용액에 잠겨 있도록 위에 거즈를 덮어 실온에서 30분 동안 둡니다.30분 후, 고정액을 제거하고 PBS로 조직을 3회 충분히 세척합니다. Xal 스톡 솔루션 1 mL를 기본 염색액에 1:40 비율로 희석하여 즉시 사용 가능한 Xal 솔루션을 조제하고, 이를 컵에 최소 10 mL 넣습니다. 거즈 조각을 이용하여 폐 조직을 담급니다. 공기 교환이 가능하도록 뚜껑을 느슨하게 닫고, 빛이 차단된 상태에서 37 °C로 3~5시간 동안 배양합니다.배양 후, xal 용액을 제거합니다. 잔류 xal 용액을 제거하기 위해 PBS로 폐를 한 번 헹군 다음, PBS에 희석된 4% paraform aldehyde 10 mL 이상을 첨가합니다. 이제 조직은 조직학 분석 준비가 완료되었으며, 4 °C의 4% PFA에 장기간 보관할 수 있습니다.먼저 임베딩 몰드의 3분의 1을 희석하지 않은 poly forze 임베딩 매질로 채웁니다. 그다음 폐엽을 몰드에 넣고, 폐엽이 완전히 덮일 때까지 매질을 계속 추가합니다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의하며, 임베딩된 폐엽을 4 °C에서 20분 동안 배양합니다.다음으로, 드라이아이스와 이소펜테인 혼합물에서 천천히 동결시켜 포매된 폐를 절편 제작이 가능하도록 준비합니다. 필요한 경우, 이를 -80 °C 냉동고로 옮겨 보관할 수 있습니다. 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 폐엽의 7~10 µm 두께의 동결 절편을 제작하고, 이를 시중에서 판매되는 동결 절편 전용 슬라이드에 부착합니다. 부착 후, 즉시 가습 챔버 내에서 37 °C의 xal 염색액으로 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, PBS로 슬라이드를 5분씩 2회 헹굽니다.이어서 증류수로 짧게 헹굽니다. 이제 핵 전용 패스트 레드(nuclear fast red)로 슬라이드를 10초 동안 대조 염색하여 xal이 더 두드러지게 보이도록 약하게 염색한 후, 즉시 증류수로 대조 염색액을 헹굽니다. 더 진한 대조 염색을 원할 경우, 시간을 30초 또는 그 이상으로 연장하십시오.면역 마운팅 용액을 사용하여 슬라이드를 마운팅합니다. done LM eight 마우스 OS 모델에서 전이 형성 여부를 재조사했습니다. laxy가 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 대조군 done 및 LM eight 세포를 동시에 주입한 마우스, 그리고 대조군 done 세포만을 주입한 마우스의 관류 및 비관류 폐에서 얻은 대표 이미지를 사용하여 여기에 기술하였습니다.비관류 및 관류 폐에서 거시적 및 미세 전이는 검출되지 않은 상태로 남아 있었습니다. 하지만 흥미롭게도 dun LA Z 세포가 주입된 생쥐의 경우, xgl 염색을 통해 비관류 폐 표면에서 단일 세포 또는 소규모 세포 군집으로 이루어진 푸른색 미세 전이 초점이 확인되었습니다. 폐의 in situ 관류 및 고정은 dun la z 미세 전이의 검출 능력을 더욱 향상시켰으나, 대조군인 LM eight 세포가 주입된 생쥐에서는 거시적 초점으로의 성장이 관찰되지 않았습니다. 비관류 폐에서는 직경 0.1 millimeter 이상의 반투명하고 거의 검출하기 어려운 거시 전이 초점이 인식되었습니다. 폐 관류는 이러한 초점의 검출 능력을 향상시키지 않았습니다.그러나 LacZ 세포를 주입한 마우스의 경우, 관류되지 않은 장기 표면에서 X-gal 염색으로 푸르게 나타나는 다수의 거대 전이 병변이 검출되었습니다. 또한, 관류되지 않은 장기 표면에서 미세 전이 병변도 검출되었습니다. 더욱이, 폐 관류를 시행했을 때 거대 및 미세 전이의 검출 능력이 더욱 향상되었습니다.결과적으로, 관류된 조직의 투명도 덕분에 장기 표면 아래의 병소들도 관찰 가능해졌으며, 이에 따라 미세 및 거대 전이 병소가 더 높은 밀도와 더 많은 수로 나타났습니다. 폐 조직의 동결 절편을 이용한 추가 조직학적 분석을 통해, LAX Z가 형질전환된 Dun 및 LM8 세포를 주입한 마우스와 Dun LAX Z 세포 유래의 원발성 종양을 가진 마우스에서 폐 전이의 검출 능력이 향상되었음을 확인하였습니다. 폐 절편에서 미세 전이 또는 단일 세포 병소까지 식별되었습니다.이는 각각의 대조군 세포로 일차 종양을 형성한 생쥐에서는 관찰되지 않았습니다. 또한, LM eight LA C 세포를 주입한 생쥐는 대조군 LM eight 세포를 주입한 동물보다 거시 전이가 더 명확하게 관찰되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 ZI 2에서 폐 관류 및 고정법을 수행하는 방법과 절제된 폐에서 전이 부위를 exci 염색하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 기술은 모든 종류의 암 연구에서 폐 내 전이 분포를 확인하는 매우 민감한 최종 시점 판독법이며, 전이성 병변의 조기 진단에 사용되는 micro CT, PET 및 MRI와 같은 현재의 생체 내 영상 기술의 개선을 위한 벤치마크로도 활용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 안티 - 암 치료에 영상 응답하는 방법을...

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

우리는 쥐에 형광 기자를 활용, 폐 전이에서 종양 세포 기질 상호 작용의 생체 라이브 영상에 대한 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 스피닝 디스크 공 촛점 현미경을 사용하여,이 기술은 최소 4 시간 동안 생균의 시각화를 가능하게하고 다른 염증성 폐 상태를 학습하도록 구성 될 수있다.

예는 폐 전이 및 그들의 미세 환경의 라이브 영상을 생체 내

이 프로토콜은 단일 셀 해상도 생체 내에서 실시간으로 상호 작용 다세포 장시간 경과 이미징을 수행하는 다 광자 현미경의 사용을 설명한다.

종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

이 프로토콜은 다광자 현미경을 사용하여 진공 안정화 이미징 창을 사용하여 실시간으로 온전한 폐의 장기 고해상도 단일 세포 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다.

진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경

순환 종양 세포 (CTCs) 암 전이 동안 폐 식민을 촉진 역할을 해독 하는 동물 모델 필요 합니다. 여기, 우리가 설립 하 고 성공적으로 수행는 vivo에서 시험의 구체적으로 테스트를 폐 식민 CTCs에 고분자 fibronectin (polyFN) 어셈블리의 요구.

순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

기술된 접근법은 실험적인 꼬리 정맥 전이 실험과 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰을 결합하여 폐에 있는 전이 수 그리고 크기의 정량화 이외에 유방암 전이 대형 및 성장의 실시간 감시를 허용합니다.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

암세포의 정맥 주사는 전이 연구에서 자주 사용되지만 전이성 종양 부담은 분석하기 어려울 수 있습니다. 본명, 전이의 꼬리 정맥 주사 모델을 시연하고 결과전이성 폐 종양 부담을 분석하는 새로운 접근법을 포함한다.

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

우리는 내인성 HER2 증폭 염증성 유방암 세포주의 꼬리 정맥 주사를 통해 생성된 유방암 뇌 전이의 이종이식 마우스 모델을 설명합니다.

염증성 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입을 통한 뇌 전이 모델링

여기에서, 우리는 폐의 고해상도, 인트라비티 이미징을 가능하게 하는 뮤린 흉부에 대한 영구적으로 깃드는 광학 창의 외과 이식을 위한 프로토콜을 제시합니다. 창의 영속성은 폐에 있는 동적 세포 프로세스의 연구 결과, 특히 보급된 종양 세포의 전이성 진행과 같이 천천히 진화하는 그들에 적합합니다.

폐에 암 전이를 조사하기위한 영구적 인 창

이 원고는 전이성 캐스케이드의 모든 단계에서 개입할 수 있는 orthotopically 주입된 유방 종양의 자발적 폐 전이의 확립 및 종단 성장 모니터링을 위한 방법론을 설명합니다.

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

폐암에 대한 새로운 치료법 개발의 주요 과제에는 국소 질환이 전이성 질환으로 진행됨에 따라 종양 미세 환경을 모델링하는 것이 포함됩니다. 여기에서는 시간이 지남에 따라 질병의 생체 내 추적을 가능하게 하는 폐암의 동소 동계 모델을 확립하는 간단한 방법을 설명합니다.

폐암의 동계 동소 마우스 모델을 생성하기 위한 최소 침습적 방법

배우세요 마우스 폐 전이를 단일 세포 해상도로 검출하는 시츄 퍼퓨전 및 X-Gal 염색법을 통해. 이 방법은 혈액 배경을 제거하여 미세 전이의 가시성을 크게 향상시킵니다.

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화

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