Name: Substantia Nigra 및 복부 Tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 학습하세요 중뇌 핵의 도파민 규제 메커니즘을 정밀 해부와 HPLC 분석을 통해 연구하는 방법을. 쥐 모델에서 흑색질과 복측 피개영역을 분리하여 단일 조직에서 다중 분자 판독값을 얻습니다.

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이 작품과 같은 2,10를 인용, 자금은 노화 연구, 에드워드 P. 스타일즈 신탁 기금 및 노스 웨스트 루이지애나의 바이오 메디컬 연구 재단에 대한 미국 연방에서 MF 살바토레에 대한 연구 기금 수상에 의해, 부분적으로 제공된 그리고 아이크 Muslow Predoctoral 원정대에서 학사 Pruett까지 LSU 보건 과학 센터 - 위조.

<ol><li>Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substantia+nigra+pars+reticulate+is+a+highly+potent+site+of+action+for+the+behavioral+effects+of+the+D1+antagonist+SCH23390+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat.</a> Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).</li>
<li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+reveals+a+role+for+nigral+tyrosine+hydroxylase+ser31+phosphorylation+in+locomotor+activity+generation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation.</a> PLoS ONE. 4, e8466(2009).</li>
<li>Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+controls+persistence+of+long-term+memory+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dopamine controls persistence of long-term memory storage.</a> Science. 325, 1017-1020 (2009).</li>
<li>Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+dopamine+regulation+in+mesoaccumbens+pathway+in+response+to+non-contigent+binge+and+escalating+methamphetamine+regimens+in+the+Wistar+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat.</a> Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).</li>
<li>Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+infusion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+into+the+ventral+tegmental+area+induces+long-lasting+potentiation+of+cocaine+seeking+after+withdrawal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal.</a> J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).</li>
<li>Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+reverses+toxin-induced+injury+to+midbrain+dopaminergic+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo.</a> Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).</li>
<li>Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+GDNF+administration+increases+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+rat+striatum+and+substantia+nigra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra.</a> J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).</li>
<li>Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ventral+tegmental+area+glial+cell-line+derived+neurotrophic+factor+in+incubation+of+cocaine+craving%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving.</a> Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).</li>
<li>Lavicky, J., Dunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticotropin-releasing+factor+stimulates+catecholamine+release+in+hypothalamus+and+prefrontal+cortex+in+freely+moving+rats+as+assessed+by+microdialysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis.</a> J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).</li>
<li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dichotomy+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+regulation+between+somatodendritic+and+terminal+field+areas+of+nigrostriatal+and+mesoaccumbens+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways.</a> PLoS ONE. 7, e29867(2012).</li>
<li>Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+nigrostriatal+and+mesolimbic+systems+in+vivo%3A+Effects+of+acute+haloperidol+and+related+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds.</a> J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).</li>
<li>Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarization-stimulated+catecholamine+biosynthesis%3A+involvement+of+protein+kinases+and+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+sites+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ.</a> J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).</li>
<li>Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+serine-19+phosphorylation+in+regulating+tyrosine+hydroxylase+studied+with+site-+and+phosphospecific+antibodies+and+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis.</a> J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).</li>
<li>Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tyrosine+hydroxylase+activity+and+phosphorylation+at+ser19+and+ser40+via+activation+of+glutamate+NMDA+receptors+in+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum.</a> J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

그림 1에 명시된 바와 같이 위에 설명된 방법은 도파민의 여러 설치 했어요 그리고 쥐 드나 마우스 중 하나에서 얻은 SN 또는 VTA 중 하나를 샘플로부터 조절 단백질의 TH, DAT, 그리고 VMAT2를 얻을 수 있습니다. 다시 말하지만,이 프로토콜을 수행의 장점은 조사가 도파민은 거의 모든 실험적인 패러다임 하에서 생체내에서 규제하고, 그동안, 어떤에서 필요한 동물의 수를 줄임으로써 상당한 실험 자료를 저장하는 방법의 작전상-일치 설치 했어요를 얻을 수 있습니다 실험. 이 조사는 얼음처럼 차가운 HPLC 버퍼의 해부 (4 ℃), 조직의 저장 용량 (최소 -70 ° C), 조직 sonication (보관 온도의 탈퇴 후 즉시 sonication)시 부과 온도 요구 사항을 관찰하고있는 절대적으로 필수적입니다 이후 펠렛 형성 및 가공. 펠렛은 sonicated 및 SDS 용액에 삶은되면 샘플 furth가 계속 발생할 수 있습니다어 실온에서 처​​리. 보관된 HP...

HPLC 시스템 : 기본 시스템은 Shimadzu LC10-ADvp HPLC 펌프, 워터스시키는 717 자동 시료 주입기, 250 x 4.4 mm 5 미크론 Spherosorb ODS-1 C18 리버스 상 열 (워터스), Bioanalytical 시스템 (BAS) TL12 이중 유리로 구성되어 있습니다 탄소 전극, 두 BAS LC4B 전기 화학 감지기 및 워터스는 2 데이터 수집 및 통합 시스템의 능력을 주소서. 칼럼은 30-45에서 관리하고 있습니다 ° C (BAS LC22A 열 히터). 모바일 단계는 0.1 M의 인산 나트륨 (산도 3.0), 0.1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1-옥탄 설폰산 (이스트만 - 코닥) 0.2-0.4 밀리미터, 그리고 0.45 미크론 필터를 통해 여과 0.35 %의 acetonitrile (V / V)입니다. 유속은 1.2 ML / 분입니다. 모바일 단계의 네 리터 배치는 산도, 옥탄가 Sulfonic의 산성과 열 온도를 조정하여 분판을 위해 최적화되었습니다. 모바일 단계는 재활용하고 있으며, 지속적으로 용존산소를 제거하는 헬륨 가스를 정화한다. 모바일 위상의 재활용시간의 합리적인 기간에 좋은 해상도를 유지하는 데 거의 필수적입니다. 모바일 위상 보관 수명은 각 실행의 첫 2-7 분 시간을 낭비 돌린다 플로우 스위치 (통합에 의해 제어)를 사용하여 유지됩니다. 전극은 Ag/AgC1 기준 전극에 대하여 약 0.78와 0.95V의 가능성에 유지 관리됩니다. 높은 잠재력의 전극은 트립토판 (및 NMDA 내부 표준)의 결정에 대해 독점적으로 사용됩니다. 0.78 V의 잠재력은 트립토판 이외 monoamines과 화합물의 검출을위한 잡음 비율로 우수한 신호를 제공합니다. chromatograms는 주소서 워크 스테이션의 하드 드라이브에 저장하고, 이후 처리 및 데이터 신진 대사 금액 및 그룹 데이터를 컴파일 계산을위한 Excel 스프레드 시트로 직접 전송됩니다. 펌프 : Shimadzu LC-10AD 셀 : BAS 크로스 흐름. 유리 탄소가 0.780과 0.9에서 전극을 조사50 V의 잠재력. 감지기 : BAS LC-4B는 듀얼 채널 모드에서 운영. 데이터 Acq. 시스템 : 워터스는 프로이 능력을 주소서. 분사기 : 워터시키는 717 칼럼 : 워터스 Spherosorb ODS-1, 5 μm의 입자, 4.4 mm X 250mm. <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 나트륨 Dodecyl 황산 (SDS) </td><td> - JT 베이커 </td><td> 4095-02 </td></tr><tr><td> Trizma 자료 </td><td> 시그마 </td><td> T1503-1KG </td></tr><tr><td> Trizma HCL </td><td> 시그마 </td><td> T3253-1KG </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 시그마 </td><td> G8773-500 ML </td></tr><tr><td> PVP-40 </td><td> 시그마 </td><td> PVP40-1KG </td></tr><tr><td> dPBS </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td></tr><tr><td> Tween20 </td><td> 시그마 </td><td> P1379-500 ML </td></tr><tr><td> 글리신 </td><td> 시그마 </td><td> G8898-1KG</td></tr><tr><td> 개양귀비빛의 S </td><td> Fluka </td><td> 81,460 </td></tr><tr><td> Bromophenol 블루 </td><td> 시그마 </td><td> B8026-5G </td></tr><tr><td> Dithiothreitol </td><td> 시그마 </td><td> D-9163 </td></tr><tr><td> 단백질 표준이 MG BSA </td><td> 시그마 </td><td> P5619-25VL </td></tr><tr><td> 피어스 BCA 단백질 분석 시약 </td><td> 열 피셔 과학 </td><td> 23,223 </td></tr><tr><td> 정밀 플러스 단백질 표준 </td><td> 바이오는 힘이에요 </td><td> 161-0373 </td></tr><tr><td> [125I]-단백질, 특정 활동 </td><td> Perkin-엘머 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 2. 특정 시약. <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 수식 </td></tr><tr><td> 10% SDS </td><td> 10g SDS, 100 ML DI H 2 0 </td></tr><tr><td> 1퍼센트 SDS (산도 8.2) </td><td><ol><li> 10 ML10% SDS </li><li> 60.5 MG Trizma 자료 </li><li> 37.22 MG EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </li><li> 90 ML DI H 2 0 </li></ol></td></tr><tr><td> 구리 II 황산 솔루션 </td><td><ol><li> 1g 구리 II 황산 </li><li> 25 ML DI H 2 0 </li></ol></td></tr><tr><td> 배 샘플 버퍼 </td><td><ol><li> Trizma 자료 2.27 g </li><li> SDS 6g </li><li> Dithiothreitol 0.463 g </li><li> 글리세롤 30g </li><li> Bromophenol 블루 10 밀리그램 </li><li> DIH 2 0 (처음 H의 40 ML에 시약 위에 눈금 실린더에 2 0을 추가, 부피가 100 ML에 도달할 때까지 H 2 0 추가) </li><li> HCL (추가 등 6.85의 산도에 도달하는 데 필요한) </li><li> 50 2.0 ML 튜브의 솔루션을 고정. </li></ol> (100 ML하게) : 3 배 샘플 버퍼의 볼륨이 필요 = 샘플에서 사용되는 SDS의 ½ 볼륨. </td></tr><tr><td> 1X 샘플 버퍼 </td><td> DI H 2 0을 사용하는 1X 샘플 버퍼에 3 배 샘플 버퍼를 희석 </td></tr><tr><td> 10X<html> 버퍼를 실행하면 (4 패를 만듭니다) </td><td><ol><li> Trizma베이스 121.1 g </li><li> 글리신 577g </li><li> SDS 40g </li></ol></td></tr><tr><td> 10X 전송 버퍼 : (4 패를 만듭니다) </td><td><ol><li> 글리신 360g </li><li> Trizma베이스 96g </li></ol></td></tr><tr><td> 개양귀비빛의 </td><td><ol><li> 개양귀비빛의 S. 0.5 g </li><li> 아세트산의 산성 5 ML </li><li> DI H 2 0 95 ML </li></ol></td></tr><tr><td> 0.2 % HCL 솔루션 </td><td> DI H 2 0 500mL에서 5.2 ML HCL </td></tr><tr><td> PVP-T20은 Soln 차단. (4 패를 만듭니다) </td><td><ol><li> PVP-40 40g </li><li> dPBS 38.2 g </li><li> Tween20 2g </li><li> Thimerisol 0.4 g </li><li> 1M 트리스 산도 7.6 (60.6 g 트리스 HCL + 500 ML DI H 2 0에서 13.9 g 트리스 자료) - 50 ML </li></ol></td></tr><tr><td> 10X 얼룩 버퍼 (4 패를 만듭니다) </td><td><ol><li> 십대 초반 20 20g </li><li> 트리스베이스 14g </li><li> 트리스 HCL 61g </li></ol></td></tr></tbody></table>ontent &quot;&gt; 표 3. 단백질 분석과 서양의 모래 바닥 수식. 티로신 hydroxylase 표준은 :이 실험실에서 사용하는 보정 TH 단백질 및 인산화 표준은 궁극적으로 닥터 존 Haycock 11 실험실에서 유래 이전에 보정 TH 표준에 대한 TH 단백질 함량과 인산화의 stoichiometries에 대해 분석했다 PC12 세포 추출물에서 파생됩니다 .

substantia nigra 및 복부 tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

도파민은 CNS에 적극적으로 공부 신경 전달 물질이다. 사실, 전위의 활동 및 보상 관련 행동의 개입은 도파민 조절과 관련된 분자 결함으로 문의 50 여년간을 육성하고있다. nigrostriatal 및 mesoaccumbens 경로의 터미널 필드 지역의 규제에 대한 분자 기초시 뇌 초점에서 도파민 규제 이러한 질문의 대부분은, striatum과 핵의 accumbens. 또한, 이러한 연구는 서부 유럽 표준시 조직 무게로 정상화와 도파민 조직 내용의 분석을 집중하고 있습니다. 같은 티로신 hydroxylase (TH) 단백질 번째 인산화, 도파민 수송 (DAT) 및 기공을 갖는 모노 아민 전송기 2 (VMAT2) 단백질로, 도파민 조절 단백질의 조사는 종종 동일한 예제에서 도파민 조직 내용의 분석에 포함되지 않습니다. 도파민 조직 내용과 그 조절 단백질 (POST-tra를 포함하여 모두를 분석할 수있는 능력nslational 수정)은 단백질 수준과 TH, DAT, 또는 VMAT2의 기능과 도파민의 관계를 해석에 내재된 능력을 제공, 또한 샘플 경제를 확장뿐만 아니라. 아직은 적은 비용,로이 번역은 수사관 &#39;선택의 거의 모든 패러다임에서 도파민의 분자 조절에 대한 식견을 생산하고 있습니다. 우리는 midbrain에 분석을 집중. SN 및 VTA는 일반적으로 도파민 규제 대부분의 연구에서 소홀히하고 있지만, 이러한 핵 쉽게 실천으로 해부한다. 종합 도파민 조직 컨텐츠와 TH의 판독, DAT, 또는 VMAT2가 실시됩니다. 이 행위에 대한 SN 및 VTA의 도파민 기능의 영향에 문학 급성장, 그리고 그 안에 1-5 외인성 물질 또는 질병 프로세스의 impingements있다. 또한, 이러한 성장 요인과 같은 화합물은 SN 또는 VTA에서 비교적 큰 범위까지, 도파민과 도파민 조절 단백질에 지대한 영향을 미칠 <sup&gt; 6-8. 따라서이 방법은 특정 치료 행태 및 도파민 조절을 조절하는 방법에 자신의 질문을 연장하려는 실험실에 대한 참조용으로 제공됩니다. 자, 다단계 방식은 도파민 조직 내용의 분석, TH의 단백질 수준, DAT, 또는 VMAT2, 그리고 쥐 midbrain의 substantia nigra 및 VTA의 TH의 인산화 위해 제공됩니다. 회 인산화의 분석뿐만 아니라 번째 활동 규제하는 방법뿐만 아니라, 주어진 패러다임의 somatodendritic 핵에 영향 신호 폭포에 상당한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 우리는이 두 핵 각각의 핵 (그림 1) 특정 생체내에서 도파민 규정의 분자 메커니즘을 공개 프로필을 생산하고 해부 조직의 샘플 처리를 분리하는 해부의 기술을 설명합니다.

도파민은 분명히 세포 기관 및 도파민 뉴런의 dendrites을 포함 midbrain의 핵에서 규제하고 있습니다. 여기 substantia nigra (SN)과 설치류의 복부 tegmental 지역 (VTA)의 midbrain의 핵에 도파민 규정에 따라서 절개 및 샘플 처리 결과를 극대화하는 접근 방식과 결론 및 통찰력을 설명합니다.

Substantia Nigra 및 복부 Tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일

도파민은 중추신경계(CNS)에서 활발히 연구되는 신경전달물질입니다. 실제로, 운동 능력 및 보상 관련 행동에 관여하는 도파민의 특성은 다섯 가지...

이 절차의 전반적인 목표는 중뇌 상부의 체성 수지상 영역에서 단일 조직 절편을 통해 도파민 조절과 관련된 분자 판독 정보의 획득을 최대화하는 것입니다. 이는 먼저 정밀한 절제를 통해 흑질을 복측 분절 영역과 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 HPLC를 통한 도파민 분석을 위해 조직을 처리하고, 침전된 내인성 단백질을 분석하기 위해 추가 처리하는 것입니다.다음으로, 총 단백질 함량을 위해 침전된 단백질을 처리함으로써 샘플 내 도파민 조직 함량의 판독값과 함께 어떤 도파민 조절 단백질이나 단백질 인산화를 측정할 수 있는지 결정할 수 있습니다. 궁극적으로, 중뇌의 개별 체세포 수지상 돌기 영역에서 도파민 및 그 조절 단백질을 분석함으로써 도파민 조절과 관련된 분자 기제에 대한 결론을 도출할 수 있습니다.모노아민은 많은 행동 결과에 영향을 미치며, 실제로 중독, 생물학 및 파킨슨병과 같은 운동 기능 장애 분야의 연구자들은 저희 실험실에서 연구하는 도파민과 같은 모노아민이 행동 결과에 어떻게 영향을 미치는지에 대해 매우 큰 관심을 가지고 있습니다. 하지만 모노아민이 분자 수준에서 어떻게 조절되는지를 이해한다면, 이를 연구하는 것의 중요성은 더욱 커질 것입니다. 저희 기술의 장점은 CNS 조직에서 얻은 단일 샘플로부터 여러 가지 판독값을 얻을 수 있다는 점이며, 이를 통해 분자적 사건이 모노아민의 조절 장애에 어떻게 영향을 미치는지 전체적인 판독값을 얻을 수 있습니다.해당 데이터를 활용하여 행동이 어떻게 영향을 받을지 맥락을 파악할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 조사자가 선택한 항체에 따라 정확한 판독에 필요한 총 단백질 양이 얼마인지에 대한 지식이 단백질 및 인산화 측정에 필요하기 때문입니다. 따라서 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.해부 기술과 조절 단백질을 이용한 mono 평균의 결정은 생체 내 조절을 분석하는 비교적 새로운 접근 방식입니다. 이 절차를 시작하려면 설치류 뇌 매트릭스, 면도날 5개가 들어 있는 페트리 접시, 11번 메스를 젖은 얼음 위에 준비하여 냉각하십시오. 또한 드라이아이스를 사용하여 해부에 필요한 만큼의 튜브를 미리 냉각해 두십시오.그 후 쥐를 희생시킨 다음 뇌를 적출하여, 외측 소뇌가 얼음처럼 차가운 매트릭스의 홈에 맞도록 뇌를 뒤집어 놓습니다. 1분 후, 선조체와 측좌핵 분석을 위해 시신경교차 전방 약 2mm 지점부터 차가운 면도날을 차가운 뇌에 삽입합니다. 그런 다음 뇌교 중간 부분까지 1mm 간격으로 차가운 면도날을 계속 삽입하며, 이때 매트릭스에서 쉽게 제거할 수 있도록 각 면도날의 배치 간격을 엇갈리게 합니다.면도날을 뺄 때, 해마가 중뇌를 완전히 감싸고 있는 위치에서 SN과 VTA의 존재를 확인하는 가장 좋은 지표가 되는 해마의 시작 부분을 확인하십시오. 11번 메스 날을 사용하여 먼저 SN과 VTA를 분리하는 단면을 절개하십시오. 그 위에 덮여 있는 피질과 해마를 제거하십시오.그 다음, 면도날이 해부 과정 동안 젖은 얼음에 계속 접촉하도록 유지하며, SN의 색소 침착 부위를 VTA와 분리하는 수직 절개를 수행합니다. 이어서 SN의 가장 등쪽 및 외측 부분 바로 위, 정중선 또는 그 근처에서 수평 절개를 수행합니다. 마지막으로, 나머지 뇌줄기에서 SN을 조심스럽게 떼어냅니다.SN을 제거한 후, VTA를 중뇌의 나머지 부분에서 조심스럽게 분리합니다. 분리된 조직을 즉시 미리 냉각된 마이크로 원심분리관에 넣습니다. 그 다음, 처리 준비가 될 때까지 조직을 -80 °C에서 보관합니다.이 절차에서는, 드라이아이스에서 조직을 꺼낸 직후 얼음처럼 차가운 0.1 molar per chloric acid EDTA 용액을 사용하여 부드럽게 균질화합니다. 그 후, 샘플을 다시 드라이아이스 위에 보관하십시오. 다음으로, 샘플을 12,000 RPM에서 원심분리하여 침전시킵니다.웨스턴 블롯 분석에 사용할 단백질 펠렛을 위해 상층액을 HPLC 바이알로 흡입하여 옮깁니다. HPLC 버퍼 처리로 인해 침전되어 여전히 냉동 상태인 단백질 펠렛을 젖은 얼음 위에 올려 해동하고, 모든 버퍼가 제거되어 보관되었는지 확인합니다. SN의 양측 처리를 위해서는 5 mM Tris와 1 mM EDTA가 포함된 1% SDS 300 µL를 펠렛에 첨가하고 초음파 처리하며, VTA의 양측 처리를 위해서는 1% SDS 200 µL면 충분합니다.다음으로, 단백질 변성을 완료하기 위해 샘플을 끓는 물에 약 5분 동안 넣습니다. 그 후 실온에서 냉각시키며, 이 단계에서 캡이 단단히 닫혀 있는지 확인하십시오. 그런 다음 2~40 µg의 단백질 표준 곡선 범위를 사용하여 BCA 분석을 수행합니다.5 µL 샘플의 단백질 농도를 결정하려면, 3회 반복 분석을 통해 얻은 중앙값을 사용하여 표준 곡선에 대비한 단백질 양을 결정하십시오. 해당 결과를 샘플 부피로 나누어 단백질 농도를 구합니다. 그 후, 샘플 버퍼의 색상으로 확인하여 필요한 경우 10% acrylamide 젤에서 환원 SDS 전기영동을 수행하기 위해 DIO three etol이 포함된 샘플 버퍼로 샘플을 준비하십시오.노란색으로 변할 때까지 시료에 1 M Tris base (pH 8.2)를 10 µL씩 추가하여 파란색이 나타나게 합니다. 적절한 pH를 확인하기 위해 10% acrylamide gel에서 SDS-PAGE를 사용하여 적정량의 총 단백질을 전기영동한 후, 단백질을 0.45 micron 공극 크기의 Nitrocellulose 막으로 전이시킵니다. Hoffer tank를 최소 27 V로 설정하고 하룻밤 동안 전이 과정을 진행합니다.다음 날, 블롯을 최소 30분 동안 건조하십시오. 그 후 폰초 S 용액으로 약 5분간 염색합니다. 그런 다음 개별 단백질 밴드가 뚜렷하게 분리되고 배경 염색이 제거될 때까지 0.2% 염산 용액으로 강력하게 탈색하십시오.그런 다음 Image J를 사용하여 poncho S 염색 이미지를 얻어 각 레인의 상대적 단백질 함량을 정량화하고, 여기에 제시된 tyrosine hydroxylase, dopamine transporter 또는 vesicular monoamine transporter two의 결과를 정규화합니다. 다음은 쥐의 흑질 시료에서 Ser31 phosphorylated tyrosine hydroxylase의 웨스턴 블롯 결과입니다. 보정된 Ser31 phosphorylated tyrosine hydroxylase 표준 곡선은 0.3 ng에서 2.0 ng 범위이며, 이는 검출 가능한 선형 범위 내에 있습니다. 여기는 쥐의 복측 피개 구역 시료에서 Ser40 phosphorylated tyrosine hydroxylase의 웨스턴 블롯 결과입니다.보정된 SN 40 인산화 티로신 수산화효소 표준 곡선은 0.2 nanograms에서 1.5 nanograms 범위이며, 이는 검출 가능한 선형 범위 내에 있습니다. 튜브에 라벨을 붙이는 것뿐만 아니라 적절한 온도를 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 결과의 변동성을 줄이기 위해 단백질을 정규화하는 것이 중요합니다.이 프로토콜을 철저히 따르면, 운동 기능 및 중독 행동 분야의 연구자들은 뇌의 모노아민 조절, 특히 우리가 관심을 가지고 있는 도파민에 영향을 미치는 광범위한 분자적 판독값을 얻을 수 있습니다. 결과적으로, 이러한 판독값들은 행동 결과가 무엇을 의미하는지에 대해 매우 상세하고 철저한 분석을 제공할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단일 조직 절편으로부터 흑질과 복측 피개야의 모노아민 조절 판독값을 최대화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

생쥐의 중간 forebrain 번들의 일방적 6-OHDA의 병변을 수행하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법은 striatal 도파민과 90.63의&gt; 95 %의 손실을 보여주는 살아남은 동물의 89 %를 낮은 사망률 (13.3 %) ± -4.02 % 병변의 측면을 향해 ipsiversive 회전 편견을 가지고 있습니다.

파킨슨병의 일방적-6-OHDA lesioned 마우스 모델의 개발

striatal 뇌 조각의 전기적 evoked presynaptic 도파민의 역학을 측정하는 빠른 스캔 순환 voltammetry를 사용하여.

빠른 스캔 순환 Voltammetry와 Striatal 뇌 조각의 Presynaptic 도파민 역학

이 비디오는 마취된 쥐에 전극과 캐뉼라를 이식하여 전위차점 측좌핵의 도파민 방출을 측정하고 복부 피개 영역의 도파민 활성을 조절하기 위한 약물 주입을 보여줍니다.

VTA 도파민 뉴런 수용체 조작을 사용한 쥐 모델에서 도파민 방출 모니터링

이 프로토콜은 성인 마우스의 적응 행동 및 뇌 복구의 기저에 있는 환경적으로 유발된 뇌 변화를 연구하기 위한 두 가지 다른 환경 조작과 동시 뇌 주입 프로토콜을 설명합니다.

성인 마우스의 중간 뇌 도파민 뉴런의 수의 환경 변조

빠른 스캔 순환 voltammetry 약물, 질병 및 기타 실험 조작의 맥락 에서 생체 내 도파민 신경 전달을 모니터링 할 수 있습니다. 이 연구는 도파민 방출 및 재 흡수 역학의 평가를 정량화하기위한 양적 신경 생물학 모델에 따라 전기 자극 된 도파민 반응을 모델링하는 소프트웨어 인 QNsim1.0의 구현을 설명합니다.

QNsim1.0을 이용한 전기 자극 도파민 신경 전달 데이터의 고속 스캔 순환 전압 측정 데이터 모델링

Synaptosomal 도파민 통풍 관 및 고성능 액체 크로마토그래피 분석 대표 실험 도구 마우스에서 도파민 항상성 도파민 운송업 자의 기능과 striatal 조직에서 도파민의 수준을 평가 하 여 조사를 각각. 여기 선물이 도파민 조직 콘텐츠를 측정 하 고 도파민 운송업 자의 기능을 평가 하는 프로토콜.

고성능 액체 크로마토그래피 분석 및 Synaptosomal 도파민 통풍 관의 사용에 의해 쥐에서 Dopaminergic 항상성의 평가

핵 accumbens에 있는 도파민 D1-알파 수용 체의 식별은 중앙 신 경계 질환 중 D1 수용 체 역 기능을 명확히 중요 합니다. 우리는 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 시각화 특정 뇌 영역에 하나의 RNA 분자를 수행.

탐지 기술 현장에서 혁신적인 RNA에 의해 설치류 핵 Accumbens에서 도파민 D1-알파 수용 체의 식별

이 프로토콜의 목표는 직접 서브 두 번째 도파민 방출에 자신의 기여를 연구하는 복부 tegmental 영역 수용체를 조작하는 것입니다.

빠른 스캔 순환 볼탐법 (CIS-FSCV)과 결합 된 주입 및 자극을 결합하여 Phasic 도파민의 복부 테자멘트 영역 수용체 조절을 평가합니다.

여기서 우리는 쥐 실질니그라 파스 콤팩트카에서 도파민성 뉴런 수의 반정적 측정을 위한 자동화된 방법을 제시한다.

자동 이미지 분석을 사용하여 설치류 모델의 실질적인 Nigra에서 도파민성 뉴런 밀도의 반정량 측정

이 프로토콜은 흑질의 뉴로멜라닌 민감성 자기공명영상 데이터를 획득하는 방법을 보여준다.

흑질의 뉴로멜라닌 민감성 자기공명영상을 위한 표준화된 데이터 수집

학습하세요 중뇌 핵의 도파민 규제 메커니즘을 정밀 해부와 HPLC 분석을 통해 연구하는 방법을. 쥐 모델에서 흑색질과 복측 피개영역을 분리하여 단일 조직에서 다중 분자 판독값을 얻습니다.

Substantia Nigra 및 복부 Tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일

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