Substantia Nigra 및 복부 Tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일

이 절차의 전반적인 목표는 중뇌 상부의 체성 수지상 영역에서 단일 조직 절편을 통해 도파민 조절과 관련된 분자 판독 정보의 획득을 최대화하는 것입니다. 이는 먼저 정밀한 절제를 통해 흑질을 복측 분절 영역과 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 HPLC를 통한 도파민 분석을 위해 조직을 처리하고, 침전된 내인성 단백질을 분석하기 위해 추가 처리하는 것입니다.

다음으로, 총 단백질 함량을 위해 침전된 단백질을 처리함으로써 샘플 내 도파민 조직 함량의 판독값과 함께 어떤 도파민 조절 단백질이나 단백질 인산화를 측정할 수 있는지 결정할 수 있습니다. 궁극적으로, 중뇌의 개별 체세포 수지상 돌기 영역에서 도파민 및 그 조절 단백질을 분석함으로써 도파민 조절과 관련된 분자 기제에 대한 결론을 도출할 수 있습니다.

모노아민은 많은 행동 결과에 영향을 미치며, 실제로 중독, 생물학 및 파킨슨병과 같은 운동 기능 장애 분야의 연구자들은 저희 실험실에서 연구하는 도파민과 같은 모노아민이 행동 결과에 어떻게 영향을 미치는지에 대해 매우 큰 관심을 가지고 있습니다. 하지만 모노아민이 분자 수준에서 어떻게 조절되는지를 이해한다면, 이를 연구하는 것의 중요성은 더욱 커질 것입니다. 저희 기술의 장점은 CNS 조직에서 얻은 단일 샘플로부터 여러 가지 판독값을 얻을 수 있다는 점이며, 이를 통해 분자적 사건이 모노아민의 조절 장애에 어떻게 영향을 미치는지 전체적인 판독값을 얻을 수 있습니다.

해당 데이터를 활용하여 행동이 어떻게 영향을 받을지 맥락을 파악할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 조사자가 선택한 항체에 따라 정확한 판독에 필요한 총 단백질 양이 얼마인지에 대한 지식이 단백질 및 인산화 측정에 필요하기 때문입니다. 따라서 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

해부 기술과 조절 단백질을 이용한 mono 평균의 결정은 생체 내 조절을 분석하는 비교적 새로운 접근 방식입니다. 이 절차를 시작하려면 설치류 뇌 매트릭스, 면도날 5개가 들어 있는 페트리 접시, 11번 메스를 젖은 얼음 위에 준비하여 냉각하십시오. 또한 드라이아이스를 사용하여 해부에 필요한 만큼의 튜브를 미리 냉각해 두십시오.

그 후 쥐를 희생시킨 다음 뇌를 적출하여, 외측 소뇌가 얼음처럼 차가운 매트릭스의 홈에 맞도록 뇌를 뒤집어 놓습니다. 1분 후, 선조체와 측좌핵 분석을 위해 시신경교차 전방 약 2mm 지점부터 차가운 면도날을 차가운 뇌에 삽입합니다. 그런 다음 뇌교 중간 부분까지 1mm 간격으로 차가운 면도날을 계속 삽입하며, 이때 매트릭스에서 쉽게 제거할 수 있도록 각 면도날의 배치 간격을 엇갈리게 합니다.

면도날을 뺄 때, 해마가 중뇌를 완전히 감싸고 있는 위치에서 SN과 VTA의 존재를 확인하는 가장 좋은 지표가 되는 해마의 시작 부분을 확인하십시오. 11번 메스 날을 사용하여 먼저 SN과 VTA를 분리하는 단면을 절개하십시오. 그 위에 덮여 있는 피질과 해마를 제거하십시오.

그 다음, 면도날이 해부 과정 동안 젖은 얼음에 계속 접촉하도록 유지하며, SN의 색소 침착 부위를 VTA와 분리하는 수직 절개를 수행합니다. 이어서 SN의 가장 등쪽 및 외측 부분 바로 위, 정중선 또는 그 근처에서 수평 절개를 수행합니다. 마지막으로, 나머지 뇌줄기에서 SN을 조심스럽게 떼어냅니다.

SN을 제거한 후, VTA를 중뇌의 나머지 부분에서 조심스럽게 분리합니다. 분리된 조직을 즉시 미리 냉각된 마이크로 원심분리관에 넣습니다. 그 다음, 처리 준비가 될 때까지 조직을 -80 °C에서 보관합니다.

이 절차에서는, 드라이아이스에서 조직을 꺼낸 직후 얼음처럼 차가운 0.1 molar per chloric acid EDTA 용액을 사용하여 부드럽게 균질화합니다. 그 후, 샘플을 다시 드라이아이스 위에 보관하십시오. 다음으로, 샘플을 12,000 RPM에서 원심분리하여 침전시킵니다.

웨스턴 블롯 분석에 사용할 단백질 펠렛을 위해 상층액을 HPLC 바이알로 흡입하여 옮깁니다. HPLC 버퍼 처리로 인해 침전되어 여전히 냉동 상태인 단백질 펠렛을 젖은 얼음 위에 올려 해동하고, 모든 버퍼가 제거되어 보관되었는지 확인합니다. SN의 양측 처리를 위해서는 5 mM Tris와 1 mM EDTA가 포함된 1% SDS 300 µL를 펠렛에 첨가하고 초음파 처리하며, VTA의 양측 처리를 위해서는 1% SDS 200 µL면 충분합니다.

다음으로, 단백질 변성을 완료하기 위해 샘플을 끓는 물에 약 5분 동안 넣습니다. 그 후 실온에서 냉각시키며, 이 단계에서 캡이 단단히 닫혀 있는지 확인하십시오. 그런 다음 2~40 µg의 단백질 표준 곡선 범위를 사용하여 BCA 분석을 수행합니다.

5 µL 샘플의 단백질 농도를 결정하려면, 3회 반복 분석을 통해 얻은 중앙값을 사용하여 표준 곡선에 대비한 단백질 양을 결정하십시오. 해당 결과를 샘플 부피로 나누어 단백질 농도를 구합니다. 그 후, 샘플 버퍼의 색상으로 확인하여 필요한 경우 10% acrylamide 젤에서 환원 SDS 전기영동을 수행하기 위해 DIO three etol이 포함된 샘플 버퍼로 샘플을 준비하십시오.

노란색으로 변할 때까지 시료에 1 M Tris base (pH 8.2)를 10 µL씩 추가하여 파란색이 나타나게 합니다. 적절한 pH를 확인하기 위해 10% acrylamide gel에서 SDS-PAGE를 사용하여 적정량의 총 단백질을 전기영동한 후, 단백질을 0.45 micron 공극 크기의 Nitrocellulose 막으로 전이시킵니다. Hoffer tank를 최소 27 V로 설정하고 하룻밤 동안 전이 과정을 진행합니다.

다음 날, 블롯을 최소 30분 동안 건조하십시오. 그 후 폰초 S 용액으로 약 5분간 염색합니다. 그런 다음 개별 단백질 밴드가 뚜렷하게 분리되고 배경 염색이 제거될 때까지 0.2% 염산 용액으로 강력하게 탈색하십시오.

그런 다음 Image J를 사용하여 poncho S 염색 이미지를 얻어 각 레인의 상대적 단백질 함량을 정량화하고, 여기에 제시된 tyrosine hydroxylase, dopamine transporter 또는 vesicular monoamine transporter two의 결과를 정규화합니다. 다음은 쥐의 흑질 시료에서 Ser31 phosphorylated tyrosine hydroxylase의 웨스턴 블롯 결과입니다. 보정된 Ser31 phosphorylated tyrosine hydroxylase 표준 곡선은 0.3 ng에서 2.0 ng 범위이며, 이는 검출 가능한 선형 범위 내에 있습니다. 여기는 쥐의 복측 피개 구역 시료에서 Ser40 phosphorylated tyrosine hydroxylase의 웨스턴 블롯 결과입니다.

보정된 SN 40 인산화 티로신 수산화효소 표준 곡선은 0.2 nanograms에서 1.5 nanograms 범위이며, 이는 검출 가능한 선형 범위 내에 있습니다. 튜브에 라벨을 붙이는 것뿐만 아니라 적절한 온도를 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 결과의 변동성을 줄이기 위해 단백질을 정규화하는 것이 중요합니다.

이 프로토콜을 철저히 따르면, 운동 기능 및 중독 행동 분야의 연구자들은 뇌의 모노아민 조절, 특히 우리가 관심을 가지고 있는 도파민에 영향을 미치는 광범위한 분자적 판독값을 얻을 수 있습니다. 결과적으로, 이러한 판독값들은 행동 결과가 무엇을 의미하는지에 대해 매우 상세하고 철저한 분석을 제공할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단일 조직 절편으로부터 흑질과 복측 피개야의 모노아민 조절 판독값을 최대화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.