야생 유충에서 Hemocytes을 추출하기위한 간단한 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 야생 애벌레에서 세포를 추출, 시각화 및 계수하는 것입니다. 이는 먼저 애벌레를 얼음 위에 올려 마취하고, 항응고제가 함유된 완충 용액을 주입하고, 애벌레를 얼음으로 되돌려 발치 전에 세포가 순환계로 다시 들어갈 수 있도록 함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 깨끗한 메스를 사용하여 애벌레의 뒤쪽 끝을 얕게 절개

다음으로, 부드러운 집게를 사용하여 애벌레를 부드럽게 짜냅니다. 그런 다음 완충 용액 혈우 림프 혼합물을 마이크로 피펫을 사용하여 흡인하고 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다. 마지막 단계는 혈 림프 용액을 동일한 부피의 완충 용액과 부드럽게 혼합하고 용액 10마이크로리터를 혈구 분석기로 옮겨 세포 수를 시각화하고 계수하는 것입니다.

궁극적으로 이 혈구 추출 방법은 다양한 애벌레 종의 세포를 계수하고 곤충 세포 면역 반응의 생리학적 측면을 조사하는 도구로 보존하는 빠르고 효과적인 방법으로 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 프록시가 매우 감소된 애벌레에서 hemo sot를 추출하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 다른 애벌레 모델은 전문가 중 하나를 절단하여 피를 흘리며, 나오는 액체에서 세포를 추출합니다.

또한 이 기술은 다른 곤충 종에서 혈형을 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 곤충 세포 면역 반응이 식단의 질, 발달 단계 또는 다양한 병원체에 대한 노출에 따라 어떻게 달라지는지와 같은 생태 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 끝에서 두 번째 instar 유충을 혈구 추출 전에 20분 동안 얼음에서 식혀 마취합니다.

그런 다음 깨끗한 16게이지 모세관 바늘의 뭉툭한 끝을 20밀리리터 유리 주사기에 연결된 튜브에 끼웁니다. 수집 용액이 들어 있는 튜브를 실험실 벤치에 열어 둡니다. 모세관에 약 10-15 마이크로리터의 완충액을 천천히 채웁니다.

그런 다음 해부 현미경 옆에 놓인 점토 공에 바늘을 놓습니다. 애벌레를 페트리 접시에 담습니다. 곤충은 구형이 명확하게 보이도록 옆으로 위치해야 합니다.

해부 현미경으로 보는 동안 한 쌍의 집게로 애벌레를 제자리에 잡고 바늘을 곤충 표피가 일반적으로 더 부드러운 구형 중 하나에 가깝게 놓습니다. 그런 다음 모세관 바늘을 곤충의 몸에 부드럽게 누릅니다. 바늘이 큐티클을 관통하면 총 용액의 부피를 애벌레에 주입합니다.

애벌레의 몸은 주사 후 부풀어 오르지만 터지거나 진물이 나서는 안 됩니다. 애벌레를 얼음이 묻은 페트리 접시에 다시 넣으세요. 완충액이 상처에서 새는 것을 방지하기 위해 곤충을 등쪽으로 배치하십시오.

혈구 절뚝 추출에 사용되는 각 애벌레에 대해 주사를 반복합니다. 그런 다음 모든 곤충을 얼음 위에서 30분 동안 식히십시오. 이제 애벌레를 페트리 접시에 담아 해부 현미경 아래에 놓습니다.

애벌레의 뒤쪽 부위를 약 2-3mm 길이의 얕은 절개를 조심스럽게 만들고 멸균 메스를 사용하여 장이나 다른 내부 장기를 손상시키지 않습니다. 다음으로, 한 쌍의 유연한 플라스틱 집게를 사용하여 애벌레를 부드럽게 짜면서 10 마이크로 리터 피펫 팁으로 약 10-20 마이크로 리터의 헤모 림프 믹스를 수집합니다. 다시 말하지만, 내부 조직을 손상시키지 않도록 주의하십시오.

그 후, 애벌레 잔해를 버리십시오. 각 애벌레의 헤모 림프를 별도의 라벨이 부착된 실리콘화된 0.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 수집합니다. 그런 다음 약 10-20마이크로리터의 배양 용액을 개별 애벌레에서 채취한 각 hemo limp 샘플에 추가합니다.

이 단계에서 항상 혈림프 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 혈림프 샘플과 배양 용액을 계수 직전에 혼합합니다. 그는 싸운다.

이 치료법은 세포의 적절한 분리를 가능하게 하고 응집을 방지합니다. 깨끗한 피펫 팁을 사용하여 배양 용액과 혼합된 10마이크로리터의 혈류 림프 샘플을 혈구 분석기로 옮깁니다. 그런 다음 복합 현미경을 사용하여 혈구 분석기의 중앙 그리드의 큰 사각형 중 적어도 15 개에서 세포 수를 계산하고 기록합니다.

이 값을 더하여 15개의 사각형에 있는 혈구 세포 수의 총 합계를 구합니다. 다음으로, 혈세포 분석기와 그 덮개 슬라이드를 증류수 및 탈이온수가 담긴 세척 병을 사용하여 철저히 헹굽니다. 그런 다음 Kim 물티슈로 물기를 닦으십시오.

나머지 hemo limp 샘플에 대해 절차를 반복하고 각 애벌레에 대한 hemo limp volume 밀리리터당 평균 세포 수를 계산합니다. 명시야 현미경 이미지는 20배 배율에서 nucle hin ai 애벌레에서 추출된 he cytes를 보여줍니다. 이 절차에 따라 수집된 헤모 세포는 세포 면역 반응을 연구하고 식세포작용 및 캡, 선택적 캡슐화 및 pH 산화효소 활성과 같은 분석을 설정하는 데 사용할 수 있습니다.

또한 곤충에서 이러한 세포 면역 반응을 연구하기 위해 추가 분석을 위해 사용하지 않은 R-N-A-D-N-A 및 단백질을 수집할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 혈림프를 추출할 목적으로 애벌레를 주입하는 방법과 살아있는 혈구가 포함된 혈림프를 수집하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.