Name: Waterborne를 검색하는 접선 흐름 빈 섬유 Ultrafiltration 및 열 분해 단계를 사용 수정일 EPA 방법 1,623 Cryptosporidium과 Giardia SPP. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: 배우세요 수돗물에서 Cryptosporidium과 Giardia를 검출하는 방법으로, 접선 흐름 빈 섬유 초여과와 면역자기 분리를 사용합니다. 면역형광 현미경으로 시각화하여 비용 효율적인 병원체 식별이 가능합니다.

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우리는 그의 기술 지원이 원고와 더그 해밀턴의 비판적 검토를 위해 앤은 그림과 마이클 짐머만 감사드립니다.

1. 접선 흐름 빈 섬유 Ultrafiltration 절차 <ol><li> 버퍼 및 솔루션의 준비 : 용출 솔루션 (1 패) : 시약 등급 물 1 L은 0.1 g 나트륨 polyphosphate, 0.1 ML 십대 초반-80 및 0.01 ML Y-30 antifoam을 추가하려면. </li><li> 생물 학적 안전 캐비닛에 필터 어셈블리 (그림 1) 준비 : <ol><li> Masterflex I / P 정밀 brushless 드라이브에 연결된 Masterflex I / P 쉬운로드 펌프 헤드를 통해 Masterflex I / P 73 실험실 튜브를 삽입합니다. </li><li> 나사 클램프와 펌프 헤드의 상류 NPT 지점 T-커넥터가 장착되어 0-60 PSI, 글리세린 가득한 압력 게이지에 튜브를 확보하고, 펌프 헤드의 HDPE T-커넥터 하류에. </li><li> Nalgene Masterflex L / S 15 실험실 튜브와 53-B 충전 / 방출 모자와 T-커넥터를 맞추려고하고 1 패 Nalgene 무거운 듀티 폴리 프로필렌 병에 확보하여 retentate 병을 조립. </li><li> Masterflex L / S 24 튜빙 W를 맞추기ith 핀치 클램프 (핀치 클램프 2)와 HDPE T-커넥터에 retentate 병에서 연결합니다. </li><li> 압력 게이지에서 아사히 Kasei에 Masterflex L / S 24 실험실 튜브를 연결은 나사 클램프와 초 하이 플럭스 dialyzer을 Rexeed하고 dialyzer에서 retentate 병. 중공 섬유 ultrafilter에 튜브를 연결 ¼ &quot;ID 튜빙을 수용하도록 설계된 맞춤 DIN 어댑터를 사용하십시오. </li><li> 핀치 클램프 (핀치 클램프 1) Masterflex L / S 24 실험실 튜브를 장착하고 샘플 이해 라인 역할을 제거 팁 및 목화 플러그와 함께 10 ML 플라스틱 피펫에 연결하고 HDPE에 튜브를 장착 T- 커넥터. </li><li> 램프는 필터의 출구 끝 부근 유출물 포트에 튜브 클램프 접속과 Masterflex L/S-36 실험실 튜브의 한쪽 끝을 어울린다. 폐기물 컨테이너의 다른 쪽 끝을 놓으십시오. </li></ol></li><li> 0.01 % (W / V) 10 L의 물을 샘플로 나트륨 polyphosphate 및 3 분 혼합을 추가합니다. </li><li> 핀치 클램프 2 닫기그리고 retentate 병의 배출구 뚜껑을 제거합니다. 다른 모든 클램프가 열려 있어야합니다. </li><li> 압력 게이지 (왼쪽 아래 그림 1 오른쪽)에 T-커넥터에서 유체를 이동하기 위해 펌프의 방향을 설정합니다. 최대 속도의 25 %로 펌프 속도를 조절하고 펌프를 켜십시오. </li><li> retentate 병이 3분의 2 전체, 오픈 핀치 클램프 2 빠르게 retentate 병에 환기구 뚜껑을 교체합니다. 라인과 전혀 누수가없는 있도록 부속품을 모두 확인합니다. </li><li> 천천히 누수를 확인하고, 원하는 여과 속도 (약 1.5 L / 분)로 펌프 속도를 향상시킬 수 있습니다. 졸업 실린더와 타이머 또는 플로우 미터를 사용하여 방류수 라인 (그림 1의 파란색 L / S 36 관)에서 종료 물을 여과물 속도를 확인합니다. 기포가 일반적으로 어렵게 안정적인 압력과 여과 속도를 달성하는 필터의 출구 끝에 형성할 수 있습니다. 이것은 잠시 손으로 유출물 라인을 곤란에 의해 수정되었습니다. 이 작업은일반적으로 여과물 포트에 공기 방울이 동축 케이블되며 유출물 라인을 통해 종료합니다. 완두콩 크기의 공기 방울은 종종 불가 피한 것을 염두에두고 필요에 따라 반복합니다. </li><li> 여과 과정을 모니터링합니다. 필요에 따라 압력과 여과 속도를 측정하고 기록합니다. 압력이 20 Psi를 초과하지 않습니다. 이것은 여과 속도가 2.0 L / 분을 초과하지 말아야하는 것이 좋습니다. 그것은 retentate 병의 물을 볼륨은 강물을 쏟아 내죠 결코 않도록 감시하는 것이 중요합니다. 그것은 약간 높이거나 줄일 수있는 볼륨 정상입니다. retentate 병의 저수량은 아래 3분의 1 전체 떨어지는 경우 배출구 뚜껑을 제거하고 가까운 핀치는 retentate 병 라인에서 2 클램프. 대한 삼분의이 전체로 볼륨을 지참, 클램프를 열고 신속하게 단단히 밀봉을 보장, 환기구 뚜껑을 교체하십시오. retentate 병의 볼륨이 신속하고 지속적으로 떨어지는 경우 retentate 병 뚜껑을 꽉이며 배출구 캡이 제자리에 안전을 보장하고 있다고 tubiNG는 물 시료와 접촉 여전히입니다. 이러한 문제가 발생하지 않는 경우, 그때 그것은 retentate 병 뚜껑의 봉인이 불량이므로 교체해야 가능성이 높습니다. </li><li> 샘플 컨테이너가 비어있는 경우, 즉시 가까운 핀치 클램프 1, 최대 20 %까지 펌프 속도를 줄이고, retentate 병에서 배출구 뚜껑을 제거하고 램프 클램프를 닫습니다. </li><li> 램프 클램프를 강화하거나 풀어하여 약 200 ML에 retentate 병에 시료의 볼륨을 조정합니다. 볼륨이 약 200 ML되면 용출 단계 (1.11-1.12)에 대한 경사로 클램프를 조입니다. </li><li> 샘플 용기에 용출 용액 500 ML을 추가하고 컨테이너의 내부를 씻어. 용출 용액이 들어있는 용기에 시료 이해 라인에 연결된 10 ML의 피펫를 놓습니다. 진입로 클램프가 닫혀 있는지 확인합니다. 오픈 핀치 1 클램프와 가까운 핀치는 용출 솔루션을 구축하기 위해 일시​​적으로 2 클램프. </li><li> 용출 용액의 500 ML이 수립되면가까이 클램프 1과 오픈 핀치 클램프 2 꼬집어. 용출 솔루션은 최대 20 %의 펌프 속도를 5 분 동안 순환하도록 허용합니다. </li><li> 유출물 줄에 램프 클램프를 강화하거나 풀어하여 약 100 ML에 retentate 병에 시료의 볼륨을 조정합니다. 램프 클램프를 조여하고 예제 1 분 순환 수 있습니다. retentate 병에 시료의 볼륨을 확보하여 튜브에 공기를 당기는 것은 피한다 retentate 병을 입력 L / S 15 튜빙을 감추기에 충분 할만큼 높습니다. </li><li> retentate 병에 시료를 강제 펌프의 방향을 역방향. 펌프 retentate 병에 ~ 225 ML의 총 발생 20 초 동안 반대로 실행하도록 허용합니다. 펌프의 전원을 끕니다. </li><li> 펌프 헤드에서 Masterflex I / P 73 튜브를 제거하고 압력 게이지를 분리합니다. 중공 섬유 ultrafilter을 종료 Masterflex L / S 24 튜브 연결을 끊습니다. 로 모든 나머지 샘플을 강제로 retentate 병 위에 튜브를 잡아병을 retentate. </li><li> 병에서 모든 튜브를 분리하고 비 방출 캡으로 방출 뚜껑을 교체하십시오. </li><li> ~ 225 ML의 retentate으로 IMS / IFA 절차로 진행합니다. </li></ol> 2. Immunomagnetic 분리 절차 <ol><li> 버퍼 및 솔루션의 준비 : <ol><li> Cryptosporidium / Giardia 콤보 키트는 실내 온도에 도달 : Dynabeads에 포함된 버퍼를 허용합니다. </li><li> 1X SL-버퍼 : 10X SL-버퍼 9 ML 시약 등급 물 1 ML을 추가합니다. </li></ol></li><li> 라벨 250 ML 원추형 원심 관에 retentate 병에서 액체 ~ 225 ML을 전송합니다. 시약 물 10 ML로 두 번 retentate 병을 씻어하고, 원추형 원심 튜브에 물에 빨고을 추가합니다. 4에 15 분 °없이 브레이크와 C에 대해 1,500 XG에 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 펠렛 볼륨의 모든 0.5 ML (즉, 기음 1을위한 공기 물 인터페이스에서 포장 펠렛 위의 5 ML에 뜨는을 기음5 1.3 ML의 펠릿 볼륨 위의 ML, 그리고 대기음 0.5 ML 이하)의 펠렛 5 ML합니다. </li><li> 철저하게 vortexing 및 / 또는 피펫 혼합하여 뜨는로 펠렛을 resuspend. 한 ML을 포함하는 평면 양면 Dynal 10 파운드 라니 튜브에 액체 각 1 부​​ 5 ML 볼륨을 전송하고 SL-버퍼 B. 10X는 시약 물 2.5 ML로 두 번 원추형 원심 튜브를 씻어과에 린스를 추가 SL-버퍼 10X 각 버퍼를 포함하여 10 파운드 라니 튜브 ~ 12 ML의 전체 볼륨을 데려오 10 파운드 라니 튜브. </li><li> 10 파운드 라니 튜브에 100 μl 잘 혼합 resuspended 안티 Cryptosporidium 및 안티 Giardia Dynabeads를 각각 추가합니다. 회전 믹서에 실온에서 1 시간 18 rpm으로 10 파운드 라니 튜브를 회전합니다. </li><li> MPC-6 자석 부드럽게 손으로 바위 2 분을 튜브 엔드 - 투 - 엔드, 180 ° 반대 10 파운드 라니 튜브의 평평한 면을 넣습니다. </li><li> 자석 측면과 MPC-6 자석에 10 파운드 라니 튜브를 유지할 수있다는 것은 최대, 비드 / (OO) 낭종 단지 보우 멀리 뜨는을 가만히 따르다자석에 ND. 자석에서 10 파운드 라니 튜브를 제거하고 튜브에 1X SL-버퍼 0.5 ML을 추가합니다. 수직 위치에있는 자석으로 MPC-S에서 열리는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로를 SL은 버퍼 1X 0.5 ML의 두 개의 추가 물에 빨고을 사용하여 현탁액을 전송합니다. </li><li> 부드럽게 1 분 MPC-S 자석 180 °에서 튜브를 흔들. 대신에 자석으로 microcentrifuge 튜브의 하단으로 이동 파스퇴르 피펫을 사용하여 표면에 뜨는을 기음. </li><li> microcentrifuge 튜브의 전면 측면에 1X PBS 1 ML 추가 자석을 제거하고 구슬이 resuspended 때까지 그냥 부드럽게 튜브를 흔들. 수직 위치에 자석을 교체하고 부드럽게 1 분 관 180 °를 흔들. PBS는 가능한 한 많은 파편으로 제거하는 파스퇴르 피펫을 사용하여 비드 펠렛을 방해하지 않고, 린스 기음. </li><li> 자석을 제거하고 microcentrifuge 튜브의 뒷면에 시약 물을 50 μl를 추가합니다. 와동 50 초만 전속력으로 튜브,다음 삼십초 와동이어서 10 분 동안 80 ° C에서 튜브를 품어. 자석에 비즈를 묶는 방식과 액체에 (OO) cysts두고, 한쪽으로 치우 쳤던 위치에서 MPC-S에 자석을 교체하십시오. SingleSpot 아니라 슬라이드에 (OO) 낭종 서스펜션을 적용합니다. </li><li> 최초의 분리를 포함하는 동일한 잘으로 액체를 적용, 단계 2.10를 반복합니다. 37 ° C 슬라이드도 슬라이드에 현탁액을 건조하여 1 시간 정도 따뜻한 장소에 슬라이드. </li></ol> 3. 염색법 및 심사 <ol><li> 버퍼 및 솔루션의 준비 : DAPI 솔루션을 일하는 것은 : 1X PBS의 25 ML에 DAPI 증권 솔루션 (메탄올 2 밀리그램 / ML) 25 μl를 추가합니다. 매장 재고와 1 ° C와 어둠 속에서 10 ° C 사이에서 작동 솔루션. </li><li> 물론 슬라이드에 메탄올 50 μl를 적용하고 실온에서 건조하실 수 있습니다. </li><li> 물론 슬라이드로 작동 DAPI 용액 50 μl을 넣고 실온에서 2 분 동안 품어. </li><li> Kimwi 사용PE는 우물에서 DAPI를 심합니다. EasyStain 50 μl을 적용합니다. 30 분간 35 ° C에서 품어. </li><li> Kimwipe으로 잘를 착색하고 천천히 그것이 잘 끄트머리로 흐를 수 있도록 추운 EasyStain 고정 버퍼 300 μl를 추가 위크. 실온에서 2 분 동안 품어. </li><li> 우물에서 버퍼를 등심과 EasyStain 장착 매체의 10 μl을 적용하는 Kimwipe을 사용합니다. </li><li> 조심스럽게 발생하는 기포를 제거, 커버 전표를 적용합니다. 투명 매니큐어로 커버 슬립을 봉쇄해. </li><li> oocyst이나 낭종 유사 난형 또는 원형 사과 녹색 형광 개체, 200X 총 배율에서 FITC 필터를 사용하여 전체 슬라이드를 검사합니다. 또한 1000X 총 배율에서, 1000X 총 배율에서 DAPI 필터와 함께 다음 DIC있는 이러한 모든 개체를 검사합니다. 보정 안구 마이크로 미터 및 형태학의 특성을 사용하여 크기를 기록합니다. </li><li> 문서 결과입니다. </li></ol> 참고 : 추가 infor원래 프로 시저에 대한 mation은 EPA 방법 1623 12 2005년 12월 버전에서 찾을 수 있습니다. 설명 접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration 절차는 EPA 방법 1623의 섹션 12.0 대신 사용됩니다. 열 분해는 EPA 방법 1623의 섹션 13.3.3을 수정합니다. 절차는 또한 추가적인 PBS 섹션 13.3.2.16 후에 방법 1623의 2005년 12월 버전에 삽입될 수 IMS 과정 린스 설명합니다. 이러한 수정 사항을 포함하여 EPA 방법 1623에 사용되는 소모품, 시약 및 장비의 전체​​ 목록은 장비 목록에 나열됩니다. 4. 대표 결과 여과 및 immunomagnetic 분리의 과정을 통해 복구된 Cryptosporidium의 oocysts과 Giardia의 cysts는 현미경 분석에 의해 감지됩니다. 그림 2와 같이 200X 전체 배율에서, 각 유기체는 일반 염색법 패턴, 크기 및 모양을 전시 </stronG&gt;는 더욱 1000X 전체 배율에서 기름 침지를 사용하여 관찰해야한다. 이것은. 일반적인 정의 기능이나 긍정적인 신분을 배제 것이 비정형 특징 중의 측정 및 식별을 위해 수 Cryptosporidium은 구면 개체 난형이다 밝게 강조 모서리 (그림 3A와 함께 빛나는 사과 녹색의 FITC의 형광을 전시 직경 4-6 μm의 ). 녹색 테두리없이 뚜렷한 핵 (DAPI 제외), 강렬한 파란색 내부 염색법, 또는 최대 4 개의 별개의, 스카이 블루 핵 (DAPI와 하늘색 내부 염색법 : DAPI 자외선으로 oocyst는 다음과 같은 일반적인 기능 범주 중 하나를 전시합니다 긍정 - 그림 3B). 비정형 특징은 색깔, 구조, 또는 DAPI 형광 (예를 들어, 너무 많은 스테인드 핵, 붉은 색은 내부 구조를 fluorescing)의 편차를 포함합니다. 형광 객체가 일반적인 FITC와 DAPI 염색법에 대한 기준을 충족하고있다면, 그것은 차동 간섭 죄수를 사용하여 검사하고 있습니다trast (DIC). 개체는 같은 세포 벽 장식, 또는 셀을 채울 하나 또는 두 개의 커다란 핵 같은 비정형 외부 또는 내부 형태학의 특성을 면밀히 검토합니다. 비정형 구조가 관찰되지 않은 경우 개체가 전체 IFA 카운트에 기록하고 빈 비정질 구조이나 현재 1-4 sporozoites (그림 3C)로 분류됩니다. 마찬가지로, Giardia와 같은 개체는 FITC와 DAPI 염색법뿐만 아니라 axonemes, 중간 기관, 그리고 핵 같은 DIC 특성에 관한 검토되고 Giardia의 cysts는 난형의 사과 - 그린 화려한 개체, 8 라운드가 - 5.에 의해 긴 18 μm의 - 15 μm의 밝게 강조 모서리 (그림 3D)와 폭. DAPI 자외선으로 Giardia의 포낭은 DAPI-부정적인 염색법, 또는 DAPI - 긍정적인 특성 (그림 3E) 전시됩니다. Cryptosporidium에 대해 설명한 것처럼 형광 객체는 같은 방식으로 전형 및 비정형 특징을위한 DIC을 면밀히 검토합니다.비정형 기능이 관찰되지 않으면 개체는 총 IFA 카운트에 기록하고 빈 함유 비정질 구조로서, 또는 현재의 내부 구조 (그림 3 층) 중 하나 이상의 유형으로 분류됩니다. 비정형 특징을 가지고 관찰되는 모든 유기체는 (OO) 낭종으로 계산해서는 안됩니다. 환경 시료의 현미경 분석은 자동 형광 또는 FITC-복합 백신 Cryptosporidium 및 / 또는 방지 Giardia 항체 1 교차 반응 있습니다 유기체가로 도전하실 수 있습니다. 그것은 분석가가 수생 미생물, Cryptosporidium 및 Giardia을 파악 경험을 쌓을 수있는 슬라이드를 검토 수십 잘 알고 있어야하는 것이 좋습니다. 최소한 세 (OO) 긍정적인 염색법 컨트롤 슬라이드에 cysts 전에 현미경의 모든 세션에 대한 특징으로한다. 품질 관리 표본 %의 우물을 결정하기 위해 (OO) cysts를 타서 수 있습니다계산을 사용하여 각 protozoan에 대한 보임 : (OO) 낭종 비율 복구 = ((QC 샘플 백작 - Unspiked 샘플로부터 세어) / 스파이크) × 100. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig1.jpg" /> 그림 1. 접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration 시스템의 그래픽 표현. 튜빙은 원조를 담고 색깔 것은 시스템의 조립입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig2.jpg" /> 그림 2. Cryptosporidium 및 Giardia (OO) cysts 대표 형광 이미지. Cryptosporidium의 oocysts과 Giardia의 cysts는 FITC 분류 안티 Cryptosporidium / Giardia 항체 물들일되었다. 화살표, Giardia의 cysts, 화살촉, Cryptosporidium oocysts. 네 Cryptosporidium oocysts 여섯 Giardia의 cysts의 총 초점 비행기에서 발견되었다. 샘플 observ200X 배율 미만의 에드. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig3.jpg" /> . 특성화에 사용 Cryptosporidium oocysts 및 Giaridia의 cysts의 그림 3 대표 미세한 이미지 Cryptosporidium의 oocysts (- C가).. 뚜렷한, 스카이 블루 DAPI의 핵 (B)와 oocyst 당 1-4 sporozoites (S) (C)까지 포함하고 밝게 강조 가장자리 ()와 직경 구형 물체 4-6 μm의의 빛나는 사과 녹색의 FITC의 형광. Giardia의 cysts (D - F). 난형의 개체에 둥근 8의 빛나는 사과 녹색의 FITC 형광 - 5에 의한 길이 18 μm의 - 포 스카이 블루 DAPI의 핵 (E)까지 포함하고 밝게 강조 가장자리 (D)와 등 하나 이상의 뚜렷한 내부 구조와 폭 15 μm의 핵 등 (N), 중간 몸 (M) 및 또는 axonemes () (F). 흰색 화살표, 화려한 사과 녹색 형광 염색법의 Cryptosporidium의 oocysts 및 Giardia cysts walls, 흰 화살촉, DAPI 긍정적인 핵. 샘플 1000X 배율 하에서 관찰했다.

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<li>Zuckerman, U., Tzipori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable+continuous+flow+centrifugation+and+method+1623+for+monitoring+of+waterborne+protozoa+from+large+volumes+of+various+water+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Portable continuous flow centrifugation and method 1623 for monitoring of waterborne protozoa from large volumes of various water matrices.</a> J. Appl. Microbiol. 100, 1220-1227 (2006).</li>
</ol>

미국 환경 보호국은 지하수 및 먹는물의 기술 지원 센터의 사무소와 공동 연구 및 개발에 자사의 오피스를 통해 여기에서 설명한 연구 자금. 모든 작품은 미국 EPA, 신시내티, 오하이오에서 현장에서 지원되었다. 이 문서에서 설명하는 정보가 쏘 환경 및 인프라, INC에 계약 하에서 미국 환경 보호청 (계약 EP-C-06-031)에 의해 전적으로 혹은 부분적으로 재정 지원되었지만, 그것은 필연적으로의 전망을 반영하지 않습니다 대행사없이 공식적인 승인은 그렇게 유추 해서도 안됩니다. 이것은 기관 평가를 받게 및 게시를 위해 승인되었습니다.

접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration은 Cryptosporidium의 oocysts와 물에서 Giardia의 cysts의 초기 농도에 대한 대안과 효과적인 기술입니다. 중공 섬유 ultrafiltration은 기존의 필터보다 저렴합니다. 그것이 다른 수상 매트릭스의 다양한 Cryptosporidium oocysts과 Giardia의 cysts을 집중하는 능력을 가지고 있기 때문에 그것은 EPA 방법 1623에 사용되는 현재의 여과 기술에 대한 유용한 대안입니다. 대부분의 다른 여과 방식과 마찬가지로 중공 섬유 ultrafiltration은 매우 흐린 샘플과 오염하는 경향이있다. 높은 수압에 필터가 오염으로부터 초래 하리라는 않으므로 그것은 여과 실행하는 동안 압력을 모니터링하는 것이 좋습니다. Cryptosporidium oocysts과 Giardia의 cysts 이외에 중공 섬유 ultrafiltration은 박테리아와 바이러스 1-3,5,8을 집중시킬 것으로 표시되었습니다. 중공 섬유 ultrafiltration O이 방법에 utlined은 하나의 샘플에서 여러 생물을 집중하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 200 및 250 ML 사이에 최종 볼륨을 취득하면 (OO) 낭종의 손실을 초래할 수도 여분 원심 분리 단계 있으므로 농도 절차에서 중요한 마지막 단계, (단계 2.2) 피할 수있다는 것을 주목할 것입니다. retentate 병으로 모든 oocysts 또는 cysts를 강제로 충분한 액체 부피 없을 것이다 때문에 그러나 병의 볼륨이 너무 낮게 떨어뜨 수 있도록하는 것은 recoveries에 불리한 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 그것은 200 및 250 ML 사이에 최종 볼륨을 유지하는 것이 좋습니다. 열 분해는 방법 1623의 산성 분해 단계에 대한 대안입니다. 이 대안이 단계는 Cryptosporidium oocyst 복구를 개선하고 하천이나 시약 물 9 중 격리 때 메서드 편차를 줄이기 위해 표시되었습니다. 산성 및 열 분해 방법 나란히 비교 시연 그 dissocia에 열을 사용소리지르는 immunomagnetic 구슬의 생물은 Cryptosporidium 및 Giardia 모두 높은 뜻 recoveries을 생산했다. 또한, Cryptosporidium 및 Giardia recoveries의 정밀도 산성 분리 구에 비해 열 분해로 처리된 시료에서 더했습니다. 농도 단계로 HFUF의 설립은 여러 유기체를 집중하는 능력을 제공함으로써 더 많은 유연성을 허용합니다. 또한 그것은 현재의 방법 1,623 여과 옵션에 대한 저렴한 대안입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 장비 / 시약 </td><td> 공급 업체 </td><td> # 카탈로그 </td></tr><tr><td> 아사히 Kasei는 25 S / R 서부 유럽 표준시 중공 섬유 ultrafilters을 Rexeed </td><td> 의료를 여세요 </td><td> REXEED25S / R </td></tr><tr><td> I / P 73 (Masterflex R-3603) 또는 동급 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-06408-73 </td></tr><tr><td> L / S 24 (Masterflex 플래티넘 - 치유) 또는 동급 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-96410-24 </td></tr><tr><td> L / S 15 (Masterflex 플래티넘 - 치유) 또는 동급 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-96410-15 </td></tr><tr><td> L / S 36 (Masterflex 플래티넘 - 치유) 또는 동급 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-96410-36 </td></tr><tr><td> I / P 정밀 Brushless 드라이브 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-77410-10 </td></tr><tr><td> I / P 쉬운로드 펌프 헤드 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-77601-10 </td></tr><tr><td> 블랙 HDPE의 티, 1 / 4 &quot;X 3 / 8&quot;× 3 / 8 &quot; </td><td> 미국 플라스틱 </td><td> 62,064 </td></tr><tr><td> Masterflex T-커넥터 L / S 15-25 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EG-30613-12 </td></tr><tr><td> Nalgene 강력 응용 프로그램 1 패 병 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-06257-10 </td></tr><tr><td> 10 ML의 pipettes </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-678-11C </td></tr><tr><td> 1 / 4 &quot;튜브 용 Nalgene 충전 / 방출 모자, 53B </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-06258-10 </td></tr><tr><td> 압력계 </td><td> 콜 Parmer </td><td> -680-46-10 </td></tr><tr><td> 스트레이트 커플링, NPT (F), 1 / 4 &quot; </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-06469-18 </td></tr><tr><td> NPT 지점 티, 천연 PP </td><td> 콜 Parmer </td><td> - 30610-75 </td></tr><tr><td> 핀치 클램프, 1 / 2 &quot; </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-06833-00 </td></tr><tr><td> 잘라내기stom 적합한 DIN 어댑터 </td><td> 성형 제품 사 </td><td> MPC-855NS.250 </td></tr><tr><td> 링 스탠드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14-670B </td></tr><tr><td> 링 스탠드 클램프 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 05-769 - 6Q </td></tr><tr><td> 중사님 램프 클램프, 14mm </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-06835-10 </td></tr><tr><td> 나트륨 polyphosphate </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 305,553 </td></tr><tr><td> 나트륨 thiosulfate의 pentahydrate </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 72,050 </td></tr><tr><td> Antifoam Y-30 에멀젼 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> A5758 </td></tr><tr><td> 십대 초반-80 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> 10 패 축소 고밀도 폴리에틸렌 cubitainer </td><td> VWR </td><td> IR314-0025 </td></tr><tr><td> 병 랙을 원심 분리기 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 05-663-103 </td></tr><tr><td> 250 ML 원추형 원심 분리기 튜브 </td><td> 코닝 </td><td> 430,776 </td></tr><tr><td> 일회용 깔때기 </td><td> 콜 Parmer </td><td> U-6122-10 </td></tr><tr><td> 병을 씻으십시오 </td><td> 콜 Parmer </td><td> U-06252-40 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> Allegra X-15R </td></tr><tr><td> 섹시한 버킷 로터 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 양자리 SX4750 </td></tr><tr><td> 250 ML 원뿔 튜브에 대한 버킷 어댑터를 원심 분리기 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 349,849 </td></tr><tr><td> 200 μl 대형 배기량 피펫 팁 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 02-707-134 </td></tr><tr><td> VacuShield 필터 </td><td> Gelman </td><td> 629-4402 </td></tr><tr><td> 5 ML의 pipettes </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-678-11D </td></tr><tr><td> Dynabeads : Cryptosporidium / Giardia 콤보 키트 </td><td> 나DEXX </td><td> 73,002 </td></tr><tr><td> 50 ML 원추형 원심 분리기 튜브 </td><td> 매 </td><td> 352,098 </td></tr><tr><td> Dynal 10 파운드 라니 평면 단면 튜브 </td><td> IDEXX </td><td> 74,003 </td></tr><tr><td> 타이머 </td><td> VWR </td><td> 23609-202 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-6 자석 </td><td> IDEXX </td><td> 12002D </td></tr><tr><td> 한 ML의 pipettes </td><td> VWR </td><td> 53283-700 </td></tr><tr><td> 1.5 ML 낮은 접착 microcentrifuge 튜브 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 02-681-320 </td></tr><tr><td> 1000 μl 피펫 및 대응 장벽 팁 </td><td> Gilson </td><td> P1000/DF1000ST </td></tr><tr><td> 100 μl 피펫 및 대응 장벽 팁 </td><td> Gilson </td><td> P100/DF100ST </td></tr><tr><td> 9 인치 파스퇴르의 pipettes </td><td> VWR </td><td> 14672-412 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-S 자석 </td><td> IDEXX</td><td> 12020D </td></tr><tr><td> 와동 </td><td> VWR </td><td> 14216-188 </td></tr><tr><td> Dynabeads의 회전 믹서 </td><td> IDEXX </td><td> 94,701 </td></tr><tr><td> 히트 블록 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 11-718-2 </td></tr><tr><td> 랩 갑옷 비즈 </td><td> 연구소 갑옷 </td><td> 42370-750 </td></tr><tr><td> 디지털 온도계 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 15-077-60 </td></tr><tr><td> 인산 버퍼 식염수 1X 산도 7.4 (1X PBS) </td><td> 시그마 </td><td> P4417 </td></tr><tr><td> 단일 스팟 슬라이드 </td><td> IDEXX </td><td> 30,201 </td></tr><tr><td> 유리 커버 </td><td> 코닝 </td><td> 287,018 </td></tr><tr><td> 직접 키트를 EasyStain </td><td> BTF </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 μl 피펫 및 대응 장벽 팁 </td><td> Gilson </td><td> P10 &amp; DF10ST </td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6&#39;-Diamid아니라 구-2-페닐 인돌의 dihydrochloride (DAPI) </td><td> 시그마 </td><td> D9542 </td></tr><tr><td> 매니큐어네 지우기 </td><td> 피셔 과학 </td><td> S30697 </td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td> 피셔 과학 </td><td> L6815 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> 킴벌리 클라크 </td><td> 34,155 </td></tr><tr><td> 보육기 </td><td> Boekel 과학 </td><td> 133,000 </td></tr><tr><td> 따뜻한 밀어 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 11-474-521 </td></tr><tr><td> 집중 훈련 오일은 노스다코타 = 1.515를 입력 </td><td> 니콘 </td><td> MXA20234 </td></tr><tr><td> DIC 기능을 갖춘 니콘 90i 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> MBA 77,000 </td></tr><tr><td> 계획 APO 100X 오일 목표 </td><td> 니콘 </td><td> MRD01901 </td></tr><tr><td> Achro 20X 계획 </td><td> 니콘 </td><td> MRL00202 </td></tr><tr><td> FITC 필터 </td><td> 니콘 </td><td> 96,302 </td></tr><tr><td> DAPI 필터 </td><td> 니콘 </td><td> 96,301 </td></tr><tr><td> 형광 조명기을 X-인용 </td><td> 니콘 </td><td> 87,540 </td></tr><tr><td> 렌즈 페이퍼 </td><td> 니콘 </td><td> 76,997 </td></tr><tr><td> 바이오 해저드 일회용 봉투 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 01-829D </td></tr><tr><td> 바이오 해저드 sharps 용기 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14-827-117 </td></tr><tr><td> 3 % 과산화수소 </td><td> VWR </td><td> BDH3540-2 </td></tr><tr><td> 표백 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 1,952,030 </td></tr><tr><td> Wypall </td><td> 킴벌리 클라크 </td><td> 34,790 </td></tr></tbody></table>

waterborne를 검색하는 접선 흐름 빈 섬유 ultrafiltration 및 열 분해 단계를 사용 수정일 epa 방법 1,623<em&gt; cryptosporidium</em&gt;과<em&gt; giardia spp.</em

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Cryptosporidium 및 Giardia 종, 그 원인 waterborne diarrheal 질병 발생은 전세계 원생 동물문 가장 널리 두 가지입니다. 나은이 병원체의 유행을 특성화하기 위해 EPA 방법 1623가 개발하고 미국의 식수에서 이러한 유기체의 수준을 모니터링하는 데 사용된 것은 12 공급하고 있습니다. 방법은 세 가지 주요 부분으로 구성되어 있으며, 첫 번째는 원시 표면의 물이 적어도 10 패가 필터링되는 시료 농도입니다. 생물과 덫에 파편 나서 필터에서 eluted 및 추가 샘플을 집중 centrifuged있다. 메서드의 두 번째 부분은 농축 물 샘플은 특히 농축 잔해에서 기생충의 특정 제거 허용 Cryptosporidium oocysts과 Giardia의 cysts에 바인딩 immunomagnetic 구슬에 적용됩니다 immunomagnetic 분리 절차를 사용합니다. 이러한 (OO) cysts 그러면 산성 분해 proce에 의해 자석 구슬로 떨어뜨려졌다dure. 메서드의 마지막 부분 (OO) cysts는 슬라이드, 스테인드에 적용하고, 현미경으로 열거됩니다 immunofluorescence 염색법과 열거입니다. Envirochek 필터 (막 공사, 앤아버 미시건), Envirochek HV 필터 (막 공사), Filta - 맥스 필터 (IDEXX, 웨스트 브룩, MA) : 방법 1623은 물 속에 Cryptosporidium oocysts과 Giardia의 cysts를 캡처 목록에 명시된 4 가지 시료 농도 시스템을 가지고 또는 연속 흐름 원심 분리 (Haemonetics, Braintree, MA). 그러나, Cryptosporidium 및 Giardia (OO) 낭종의 recoveries는 1,14를 사용한 소스 물 매트릭스 및 필터에 따라 매우 다양합니다. 새로운 접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration (HFUF) 시스템은 최근 Cryptosporidium oocysts를 복구에서보다 효율적이고보다 강력한 것으로 표시되었습니다 각종 수상 매트릭스에서 Giardia의 cysts는, 또한, 다른 캡슐 필터 옵션을보다 저렴S는 동시에 1-3,5-8,10,11을 여러 병원균을 집중하실 수 있습니다. 또한, 힐 및 동료에 의해 ​​이전의 연구들은 직접 Envirochek HV 필터 4 비해 HFUF 크게 Cryptosporidium oocysts의 recoveries를 개선한다는 보여주었다. 현재의 방법에 대한 추가적인 수정은 또한 방법의 성능을 향상시키기 위해보고되었습니다. 열 분해하여 산성 분해 절차를 교체하는 것은 어떤 매트릭스 9,13의 자석 구슬에서 Cryptosporidium를 분리에서보다 효과적인 것으로 표시되었습니다. 이 프로토콜은 열 분해 단계로 새로운 HFUF 여과 시스템을 사용하는 수정된 방​​법 1623에 대해 설명합니다. 이 수정된 방​​법으로 HFUF의 사용은 현재 EPA 방법 1,623 여과 옵션 저렴한 대안이며, 여러 생물의 농도를 허용함으로써 더 많은 유연성을 제공합니다.

이 프로토콜은 waterborne의 검출을위한 다른 단계로 접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration 샘플 농도 시스템의 사용 및 열 분해를 설명<em&gt; Cryptosporidium</em&gt;과<em&gt; Giardia</emEPA 방법 1623을 사용하여&gt; 종.

Waterborne를 검색하는 접선 흐름 빈 섬유 Ultrafiltration 및 열 분해 단계를 사용 수정일 EPA 방법 1,623<em&gt; Cryptosporidium</em&gt;과<em&gt; Giardia SPP.</em

Cryptosporidium 및 Giardia 종은 전 세계적으로 수인성 설사병 발생을 일으키는 가장 흔한 원충 두 가지입니다. 보다 더...

본 절차의 전반적인 목표는 수인성 크립토스포리디움(cryptosporidium) 및 지아르디아(giardia) 종을 검출하고 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 접선 유동 중공사 한외 여과(tangential flow, hollow fiber, ultra filtration)를 사용하여 수중 시료를 농축함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 원심분리 단계를 거쳐 필터로부터 미생물을 용리하고 잔해물을 포집하는 것입니다.면역 자성 분리를 통해 농축된 잔해물로부터 기생충을 선택적으로 분리할 수 있습니다. 열 해리를 통해 자성 비드를 기생충에서 떼어낸 후 자석을 사용하여 제거합니다. 그런 다음 포낭(Cysts)과 오포낭(O cysts)을 슬라이드 위에 올리고, 면역형광 현미경으로 시각화하기 위해 시료를 염색합니다.기존 기술과 비교하여 hofi 여과법의 주요 장점은 초여과 필터의 비용이 훨씬 저렴하며, Cryptosporidium 및 Giardia 외에도 바이러스 및 박테리아와 같은 다양한 미생물을 포집할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 면역 분리가 처음인 연구자는 매우 다양한 기후 조건에서 채집된 서로 다른 시료에 포함된 잔해물의 양과 종류로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내부에서 초여과 장치를 조립하는 것으로 시작하십시오.장치가 조립되면 다음과 같이 작동합니다. 수성 시료가 검은색 T형 커넥터를 통해 시스템으로 유입되어 펌프 헤드와 압력계를 거쳐 중공사 한외여과 필터로 이동하며, 여과된 물은 필터 측면을 통해 폐액 용기로 배출됩니다. 생물체가 포함된 잔류액은 잔류액 병으로 강제 이동하며, 수량이 감소할 때까지 시스템을 통해 재순환됩니다. 절차를 시작하려면 벤트 캡을 제거하고 핀치 클램프 2번을 제외한 모든 클램프를 엽니다. 이때 잔류액 병에 물이 채워질 수 있도록 핀치 클램프 2번은 닫아 두어야 하며, 수성 시료가 필터로 흐르도록 펌프 방향을 설정합니다.그 다음 펌프 속도를 25%로 조절하고, 리네이트 병(renate bottle)이 2/3 정도 찼을 때 펌프를 켭니다. 핀치 클램프 2번을 잠그고 벤트 캡을 사용하여 병을 빠르게 밀폐합니다. 모든 라인과 피팅을 점검하여 누출이 없는지 확인하십시오.그런 다음 메스실린더와 타이머 또는 유량계를 사용하여 펌프 속도를 분당 약 1.5 liters로 천천히 높이고, 유출 라인에서 나오는 물의 여과 속도가 실제로 분당 1.5 liters인지 확인하십시오. 여과 과정 중 리텐 병이 비지 않도록 모니터링하되, 부피는 약간 증가하거나 감소할 수 있습니다. 부피가 1/3 미만으로 떨어지면 통기 캡을 제거하고 핀치 클램프 2를 닫으십시오.다시 병 안의 부피가 3분의 2가 될 때까지 기다립니다. 그런 다음 환기 캡을 단단히 닫고 클램프 2를 다시 엽니다. 샘플 용기가 비면 즉시 핀치 클램프 1을 닫고 펌프 속도를 20%로 낮춥니다. 농축액 병에서 환기 캡을 제거하고 필터 컬럼 유출 튜브와 폐액 탱크를 연결하는 램프 클램프를 닫습니다.램프 클램프를 조이거나 풀어 잔류물 병의 부피를 약 200 milliliters로 조정합니다. 그 다음, 샘플을 용출시키기 위해 용출액용 램프 클램프를 조입니다. 먼저, 샘플 컨테이너 내부를 헹구면서 용출액 500 milliliters를 샘플 컨테이너에 넣습니다.그 다음, 시료 흡입 라인과 연결된 10 milliliter 피펫을 용출액 용기에 넣습니다. 핀치 클램프 1을 열고 핀치 클램프 2를 잠시 닫아 용출액을 빨아들입니다. 용액이 모두 채워지면, 핀치 클램프 1을 닫고 핀치 클램프 2를 열어 20%의 펌프 속도로 5분 동안 용액을 순환시킵니다. 램프 클램프를 조이거나 풀어서 리네이트 병의 시료 부피를 약 100 milliliters로 조정합니다.그 다음 램프 클램프를 완전히 조이고 샘플이 1분 동안 재순환되도록 합니다. 이때 펌프의 방향을 20초 동안 반대로 바꿉니다. 이렇게 하면 테이트 병에 약 225 milliliters의 샘플이 축적됩니다.그런 다음 펌프를 끕니다. 펌프 헤드에서 튜빙을 제거하고 필터에서 나오는 튜빙을 분리한 뒤, 튜빙을 tate bottle 위에 대고 남아 있는 모든 샘플이 병 속으로 들어가도록 밀어냅니다. 이후 병에서 모든 튜빙을 분리하고 통기성 캡을 비통기성 캡으로 교체합니다.농축된 시료를 250 milliliter 원추형 원심분리 튜브로 옮깁니다. 시료 병을 10 milliliters의 시약수로 두 번 헹구고, 헹굼액을 원심분리 튜브에 넣습니다. 시료를 최소 1500 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다.원심분리를 중단하기 위해 브레이크를 사용하지 마십시오. 원심분리가 끝나면, 펠릿에서 5 mL 위쪽까지 상층액을 조심스럽게 흡입하십시오. 액체 표면의 높이를 유지하며 펠릿 내의 O낭(O cysts)과 낭(cysts)을 흡입하지 않도록 각별히 주의해야 합니다.튜브를 볼텍싱하여 펠렛을 완전히 재현탁합니다. 그런 다음 샘플을 10 X SL buffer A와 buffer B가 각각 1 mL씩 들어 있는 평면형 dyal L 10 튜브로 옮깁니다. 원심분리 튜브를 2.5 mL의 시약수로 두 번 헹구고, 이 세척액을 dyal L 10 튜브에 추가합니다. 최종 부피가 12 mL가 되도록 맞춘 후, 마그네틱 비드가 결합된 anti cryptosporidium 및 anti giardia 항체를 각각 100 µL씩 튜브에 첨가합니다.그 후, 회전 믹서에서 실온으로 18 RPM에서 1시간 동안 튜브를 회전시킵니다. 튜브의 평평한 면을 MP six 마그넷에 밀착시키고, 튜브를 마그넷에서 떼지 않은 상태로 2분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 평평한 면이 위로 오도록 유지한 채 상층액을 따라냅니다.자석 근처 튜브의 평평한 면에 붙어 있는 비드가 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 샘플 튜브를 자석에서 분리하고, 튜브의 둥근 면에 있는 찌꺼기가 섞이지 않도록 주의하며 튜브의 평평한 면을 500 µL의 buffer A로 3회 세척하십시오. 각 세척액을 MPCS 자석 안에 놓인 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기십시오.자석을 수직 방향으로 둔 상태에서 튜브를 닫고 1분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 그다음 자석을 그대로 둔 채, 파스퇴르 피펫을 튜브 바닥에 위치시켜 상층액을 흡입하여 제거하고 튜브에 PBS 1 mL를 조심스럽게 첨가합니다.비드 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 자석과 인접한 튜브 벽면에 부착하십시오. 마그네틱 스트립을 제거하고 비드가 다시 부유될 때까지 튜브를 부드럽게 흔들어 섞어줍니다.마그네틱 스트립을 다시 수직 위치로 삽입하십시오. 튜브를 1분 동안 부드럽게 흔든 후 상층액을 흡입하여, 비즈를 건드리지 않고 최대한 많은 부유물을 제거하십시오. 이 세척 단계 후에 자석을 제거하고 50 µL의 시약수를 비즈 펠릿 위에 직접 첨가하십시오.비드를 재현탁시키기 위해 튜브를 최대 속도로 50초 동안 볼텍싱합니다. 그다음 시료를 80 °C에서 10분 동안 배양하여 Giardia 시스트와 cryptosporidium o 시스트가 비드로부터 분리되도록 합니다. 배양이 끝나면 시료를 30초 동안 볼텍싱합니다. 그런 다음 마그네틱 스트립을 기울어진 위치로 MPCS에 배치하여 현탁액 내의 시스트 및 O 시스트로부터 비드를 분리합니다.시스트와 O 시스트가 포함된 상층액을 웰 슬라이드로 옮깁니다. 상층액을 동일한 슬라이드에 추가하며, 물 첨가, 볼텍싱 및 열 해리 단계를 두 번째로 반복합니다. 그런 다음 현탁액을 건조시키기 위해 슬라이드를 37 °C 슬라이드 워머 위에 놓습니다.먼저 슬라이드에 50 µL의 메탄올을 처리하여 시료를 고정하고 실온에서 건조시킵니다. 다음으로, 50 µL의 DPI 용액을 첨가하고 슬라이드를 실온에서 2분 동안 배양합니다. 핵을 염색하기 위해 Kim wipe를 사용하여 웰의 액체를 흡수하되, 웰 내부를 건드리지 않도록 주의합니다.그 다음, Giardia 포낭과 cryptosporidium o 포낭의 세포벽을 염색하기 위해 easy stain 50 µL를 첨가합니다. 시료를 35 °C에서 30분 동안 배양합니다. 이전과 마찬가지로 Kim wipe를 사용하여 염색약을 제거합니다.그 다음, 피펫 팁을 웰 바깥쪽에 조심스럽게 배치하여 액체가 웰 내부로 흘러 들어가게 함으로써 차가운 easy stain fixing buffer 300 µL를 천천히 첨가합니다. 슬라이드를 실온에서 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 Kimwipe를 사용하여 버퍼를 제거하고 mounting medium 10 µL를 도포합니다. 샘플 위에 커버 슬립을 조심스럽게 덮어 기포를 제거하고, 투명 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉합니다. 형광 현미경을 사용하여 200배에서 1000배 배율로 슬라이드를 관찰하며, 200배 배율에서는 fse 및 DPI 필터를 사용합니다. 시스트와 O-시스트는 가장자리가 밝게 강조된 선명한 사과색 녹색 형광의 난형 구조로 나타납니다.Cryptosporidium O 낭종은 둥근 모양이며 크기는 4~6 µm입니다. Giardia 낭종은 더 크며 너비 5~15 µm, 길이 8~18 µm로, 1000배 배율에서 둥글거나 난형으로 보일 수 있습니다. DPI 필터를 사용하면 낭종과 CYS의 내부 구조를 더 명확하게 관찰할 수 있습니다.일반적으로 Cryptosporidium O cys 및 Giardia Cys.DIC 내에서 하늘색 DPI 염색 핵으로 보이는 최대 4개의 포자소체가 관찰됩니다. 추가적인 형태학적 특성을 확인할 수 있으므로, 현미경 관찰은 기생충의 정확한 식별에 도움이 될 수 있습니다. Cryptosporidium 포자소체는 DIC로 관찰될 수 있으며, Giardia 포낭은 가시적인 핵, 중간체(median bodies)라고 불리는 초승달 모양의 소기관, 액손(axons)이라고 불리는 내부 편모 구조와 같이 하나 이상의 식별 가능한 내부 구조를 흔히 나타냅니다.홀로 파이버(holo fiber) 초여과 과정은 여러 미생물을 포집할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 또한, 농축된 시료에 qPCR 및 유전자형 분석(genotyping)과 같은 다른 검출 분석법을 적용할 수 있어, 이 방법은 더욱 유연하며 사용자의 응용 분야에 더 적합하게 조정될 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 궁금한 점이 있으시면 문의해 주시기 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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