Waterborne를 검색하는 접선 흐름 빈 섬유 Ultrafiltration 및 열 분해 단계를 사용 수정일 EPA 방법 1,623

본 절차의 전반적인 목표는 수인성 크립토스포리디움(cryptosporidium) 및 지아르디아(giardia) 종을 검출하고 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 접선 유동 중공사 한외 여과(tangential flow, hollow fiber, ultra filtration)를 사용하여 수중 시료를 농축함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 원심분리 단계를 거쳐 필터로부터 미생물을 용리하고 잔해물을 포집하는 것입니다.

면역 자성 분리를 통해 농축된 잔해물로부터 기생충을 선택적으로 분리할 수 있습니다. 열 해리를 통해 자성 비드를 기생충에서 떼어낸 후 자석을 사용하여 제거합니다. 그런 다음 포낭(Cysts)과 오포낭(O cysts)을 슬라이드 위에 올리고, 면역형광 현미경으로 시각화하기 위해 시료를 염색합니다.

기존 기술과 비교하여 hofi 여과법의 주요 장점은 초여과 필터의 비용이 훨씬 저렴하며, Cryptosporidium 및 Giardia 외에도 바이러스 및 박테리아와 같은 다양한 미생물을 포집할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 면역 분리가 처음인 연구자는 매우 다양한 기후 조건에서 채집된 서로 다른 시료에 포함된 잔해물의 양과 종류로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내부에서 초여과 장치를 조립하는 것으로 시작하십시오.

장치가 조립되면 다음과 같이 작동합니다. 수성 시료가 검은색 T형 커넥터를 통해 시스템으로 유입되어 펌프 헤드와 압력계를 거쳐 중공사 한외여과 필터로 이동하며, 여과된 물은 필터 측면을 통해 폐액 용기로 배출됩니다. 생물체가 포함된 잔류액은 잔류액 병으로 강제 이동하며, 수량이 감소할 때까지 시스템을 통해 재순환됩니다. 절차를 시작하려면 벤트 캡을 제거하고 핀치 클램프 2번을 제외한 모든 클램프를 엽니다. 이때 잔류액 병에 물이 채워질 수 있도록 핀치 클램프 2번은 닫아 두어야 하며, 수성 시료가 필터로 흐르도록 펌프 방향을 설정합니다.

그 다음 펌프 속도를 25%로 조절하고, 리네이트 병(renate bottle)이 2/3 정도 찼을 때 펌프를 켭니다. 핀치 클램프 2번을 잠그고 벤트 캡을 사용하여 병을 빠르게 밀폐합니다. 모든 라인과 피팅을 점검하여 누출이 없는지 확인하십시오.

그런 다음 메스실린더와 타이머 또는 유량계를 사용하여 펌프 속도를 분당 약 1.5 liters로 천천히 높이고, 유출 라인에서 나오는 물의 여과 속도가 실제로 분당 1.5 liters인지 확인하십시오. 여과 과정 중 리텐 병이 비지 않도록 모니터링하되, 부피는 약간 증가하거나 감소할 수 있습니다. 부피가 1/3 미만으로 떨어지면 통기 캡을 제거하고 핀치 클램프 2를 닫으십시오.

다시 병 안의 부피가 3분의 2가 될 때까지 기다립니다. 그런 다음 환기 캡을 단단히 닫고 클램프 2를 다시 엽니다. 샘플 용기가 비면 즉시 핀치 클램프 1을 닫고 펌프 속도를 20%로 낮춥니다. 농축액 병에서 환기 캡을 제거하고 필터 컬럼 유출 튜브와 폐액 탱크를 연결하는 램프 클램프를 닫습니다.

램프 클램프를 조이거나 풀어 잔류물 병의 부피를 약 200 milliliters로 조정합니다. 그 다음, 샘플을 용출시키기 위해 용출액용 램프 클램프를 조입니다. 먼저, 샘플 컨테이너 내부를 헹구면서 용출액 500 milliliters를 샘플 컨테이너에 넣습니다.

그 다음, 시료 흡입 라인과 연결된 10 milliliter 피펫을 용출액 용기에 넣습니다. 핀치 클램프 1을 열고 핀치 클램프 2를 잠시 닫아 용출액을 빨아들입니다. 용액이 모두 채워지면, 핀치 클램프 1을 닫고 핀치 클램프 2를 열어 20%의 펌프 속도로 5분 동안 용액을 순환시킵니다. 램프 클램프를 조이거나 풀어서 리네이트 병의 시료 부피를 약 100 milliliters로 조정합니다.

그 다음 램프 클램프를 완전히 조이고 샘플이 1분 동안 재순환되도록 합니다. 이때 펌프의 방향을 20초 동안 반대로 바꿉니다. 이렇게 하면 테이트 병에 약 225 milliliters의 샘플이 축적됩니다.

그런 다음 펌프를 끕니다. 펌프 헤드에서 튜빙을 제거하고 필터에서 나오는 튜빙을 분리한 뒤, 튜빙을 tate bottle 위에 대고 남아 있는 모든 샘플이 병 속으로 들어가도록 밀어냅니다. 이후 병에서 모든 튜빙을 분리하고 통기성 캡을 비통기성 캡으로 교체합니다.

농축된 시료를 250 milliliter 원추형 원심분리 튜브로 옮깁니다. 시료 병을 10 milliliters의 시약수로 두 번 헹구고, 헹굼액을 원심분리 튜브에 넣습니다. 시료를 최소 1500 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다.

원심분리를 중단하기 위해 브레이크를 사용하지 마십시오. 원심분리가 끝나면, 펠릿에서 5 mL 위쪽까지 상층액을 조심스럽게 흡입하십시오. 액체 표면의 높이를 유지하며 펠릿 내의 O낭(O cysts)과 낭(cysts)을 흡입하지 않도록 각별히 주의해야 합니다.

튜브를 볼텍싱하여 펠렛을 완전히 재현탁합니다. 그런 다음 샘플을 10 X SL buffer A와 buffer B가 각각 1 mL씩 들어 있는 평면형 dyal L 10 튜브로 옮깁니다. 원심분리 튜브를 2.5 mL의 시약수로 두 번 헹구고, 이 세척액을 dyal L 10 튜브에 추가합니다. 최종 부피가 12 mL가 되도록 맞춘 후, 마그네틱 비드가 결합된 anti cryptosporidium 및 anti giardia 항체를 각각 100 µL씩 튜브에 첨가합니다.

그 후, 회전 믹서에서 실온으로 18 RPM에서 1시간 동안 튜브를 회전시킵니다. 튜브의 평평한 면을 MP six 마그넷에 밀착시키고, 튜브를 마그넷에서 떼지 않은 상태로 2분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 평평한 면이 위로 오도록 유지한 채 상층액을 따라냅니다.

자석 근처 튜브의 평평한 면에 붙어 있는 비드가 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 샘플 튜브를 자석에서 분리하고, 튜브의 둥근 면에 있는 찌꺼기가 섞이지 않도록 주의하며 튜브의 평평한 면을 500 µL의 buffer A로 3회 세척하십시오. 각 세척액을 MPCS 자석 안에 놓인 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기십시오.

자석을 수직 방향으로 둔 상태에서 튜브를 닫고 1분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 그다음 자석을 그대로 둔 채, 파스퇴르 피펫을 튜브 바닥에 위치시켜 상층액을 흡입하여 제거하고 튜브에 PBS 1 mL를 조심스럽게 첨가합니다.

비드 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 자석과 인접한 튜브 벽면에 부착하십시오. 마그네틱 스트립을 제거하고 비드가 다시 부유될 때까지 튜브를 부드럽게 흔들어 섞어줍니다.

마그네틱 스트립을 다시 수직 위치로 삽입하십시오. 튜브를 1분 동안 부드럽게 흔든 후 상층액을 흡입하여, 비즈를 건드리지 않고 최대한 많은 부유물을 제거하십시오. 이 세척 단계 후에 자석을 제거하고 50 µL의 시약수를 비즈 펠릿 위에 직접 첨가하십시오.

비드를 재현탁시키기 위해 튜브를 최대 속도로 50초 동안 볼텍싱합니다. 그다음 시료를 80 °C에서 10분 동안 배양하여 Giardia 시스트와 cryptosporidium o 시스트가 비드로부터 분리되도록 합니다. 배양이 끝나면 시료를 30초 동안 볼텍싱합니다. 그런 다음 마그네틱 스트립을 기울어진 위치로 MPCS에 배치하여 현탁액 내의 시스트 및 O 시스트로부터 비드를 분리합니다.

시스트와 O 시스트가 포함된 상층액을 웰 슬라이드로 옮깁니다. 상층액을 동일한 슬라이드에 추가하며, 물 첨가, 볼텍싱 및 열 해리 단계를 두 번째로 반복합니다. 그런 다음 현탁액을 건조시키기 위해 슬라이드를 37 °C 슬라이드 워머 위에 놓습니다.

먼저 슬라이드에 50 µL의 메탄올을 처리하여 시료를 고정하고 실온에서 건조시킵니다. 다음으로, 50 µL의 DPI 용액을 첨가하고 슬라이드를 실온에서 2분 동안 배양합니다. 핵을 염색하기 위해 Kim wipe를 사용하여 웰의 액체를 흡수하되, 웰 내부를 건드리지 않도록 주의합니다.

그 다음, Giardia 포낭과 cryptosporidium o 포낭의 세포벽을 염색하기 위해 easy stain 50 µL를 첨가합니다. 시료를 35 °C에서 30분 동안 배양합니다. 이전과 마찬가지로 Kim wipe를 사용하여 염색약을 제거합니다.

그 다음, 피펫 팁을 웰 바깥쪽에 조심스럽게 배치하여 액체가 웰 내부로 흘러 들어가게 함으로써 차가운 easy stain fixing buffer 300 µL를 천천히 첨가합니다. 슬라이드를 실온에서 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 Kimwipe를 사용하여 버퍼를 제거하고 mounting medium 10 µL를 도포합니다. 샘플 위에 커버 슬립을 조심스럽게 덮어 기포를 제거하고, 투명 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉합니다. 형광 현미경을 사용하여 200배에서 1000배 배율로 슬라이드를 관찰하며, 200배 배율에서는 fse 및 DPI 필터를 사용합니다. 시스트와 O-시스트는 가장자리가 밝게 강조된 선명한 사과색 녹색 형광의 난형 구조로 나타납니다.

Cryptosporidium O 낭종은 둥근 모양이며 크기는 4~6 µm입니다. Giardia 낭종은 더 크며 너비 5~15 µm, 길이 8~18 µm로, 1000배 배율에서 둥글거나 난형으로 보일 수 있습니다. DPI 필터를 사용하면 낭종과 CYS의 내부 구조를 더 명확하게 관찰할 수 있습니다.

일반적으로 Cryptosporidium O cys 및 Giardia Cys.DIC 내에서 하늘색 DPI 염색 핵으로 보이는 최대 4개의 포자소체가 관찰됩니다. 추가적인 형태학적 특성을 확인할 수 있으므로, 현미경 관찰은 기생충의 정확한 식별에 도움이 될 수 있습니다. Cryptosporidium 포자소체는 DIC로 관찰될 수 있으며, Giardia 포낭은 가시적인 핵, 중간체(median bodies)라고 불리는 초승달 모양의 소기관, 액손(axons)이라고 불리는 내부 편모 구조와 같이 하나 이상의 식별 가능한 내부 구조를 흔히 나타냅니다.

홀로 파이버(holo fiber) 초여과 과정은 여러 미생물을 포집할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 또한, 농축된 시료에 qPCR 및 유전자형 분석(genotyping)과 같은 다른 검출 분석법을 적용할 수 있어, 이 방법은 더욱 유연하며 사용자의 응용 분야에 더 적합하게 조정될 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 궁금한 점이 있으시면 문의해 주시기 바랍니다.