Name: 실험실 규모의 합성 거미의 실크 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: 배우세요 실험실에서 거미의 실크 방사 과정을 모방하여 합성 거미 실크를 생산하는 방법을. 대장균에서 재조합 실크 단백질을 생산하고 크로마토그래피로 정제한 후 동결건조하여 농축합니다. 이 기술은 저렴한 비용과 대규모 생산 가능성으로 생체재료 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 각각 NSF 루이 보조금 MCB-0950372와 DMR-1105310받을 권리를 가진다 &quot;블랙 위도우 거미의 실크와 거미의 실크 접착제의 기계적 동작의 분자 특성화&quot;에 의해 지원되었다.

<ol><li>Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+design+of+spider+silks%3A+from+fibroin+sequence+to+mechanical+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function.</a> J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).</li>
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<li>Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+spider+silk+proteins+for+applications+in+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials.</a> Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).</li>
<li>Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+fibers+self-assembled+from+recombinant+miniature+spider+silk+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins.</a> Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).</li>
<li>Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+Silk+Fibers+Spun+from+Soluble+Recombinant+Silk+Produced+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells.</a> Science. 295, 472-476 (2002).</li>
<li>Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+production+of+recombinant+spider+silk-like+proteins+for+artificial+fiber+spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning.</a> Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).</li>
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<li>Xu, M., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+protein+superfiber%3A+Spider+Dragline+Silk%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).</li>
<li>Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+mechanical+characterization+of+aciniform+silk%3A+uniformity+of+iterated+sequence+modules+in+a+novel+member+of+the+spider+silk+fibroin+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family.</a> Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).</li>
<li>Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+silk+fibers+spun+from+soluble+recombinant+silk+produced+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells.</a> Science. 295, 472-476 (2002).</li>
<li>Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+recombinant+spider+silk+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).</li>
<li>Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+dragline+silk+proteins+in+transgenic+tobacco+leaves%3A+accumulation+and+field+production%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production.</a> Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).</li>
<li>Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+spider+silk+proteins+in+tobacco+and+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of spider silk proteins in tobacco and potato.</a> Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).</li>
<li>An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+beta-sheets+formation+in+synthetic+spider+silk+fibers+by+aqueous+post-spin+stretching%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching.</a> Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).</li>
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<li>Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+spider+silk+proteins+in+tobacco+and+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of spider silk proteins in tobacco and potato.</a> Nature Biotechnology. 19, (2001).</li>
<li>Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+removal+during+synthetic+and+Nephila+fiber+spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning.</a> Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).</li>
<li>Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+Black+Widow+Spider+Silk-producing+Glands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands.</a> J. Vis. Exp. (47), e2382(2011).</li>
<li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyriform+spidroin+1%2C+a+novel+member+of+the+silk+gene+family+that+anchors+dragline+silk+fibers+in+attachment+discs+of+the+black+widow+spider%2C+Latrodectus+hesperus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus.</a> J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).</li>
<li>La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+minor+ampullate+silk+proteins+are+constituents+of+prey+wrapping+silk+in+the+cob+weaver+Latrodectus+hesperus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus.</a> Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).</li>
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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이 방법론에서 냈지 합성 섬유는 천연 섬유에 비해 크기의 순서에 기계식입니다. 스풀 링 및 게시물 스핀 추첨 프로세스를 mechanizing하여 인간의 오류의 양을 줄임으로써, 샘플 간의 실험 유사 콘텐츠를 더 많은 제어와 획기적으로 줄일 수 있습니다. 우리의 방법론은 거미 유전자 가족의 다른 구성원의 cDNAs에서 인코딩 재조합 단백질에서 돌다가있는 다른 섬유의 기계적 특성을 조사하기위한 가능성을 제공합니다. 잠재적으로, 그것은 피브로인 내에서, 또는 다른 피브로인 유형 간의 서로 다른 단백질 모듈의 기계적 역할을 결정할 수 있습니다. 23 개 이상의 실크 단백질이나 다른 분자가 결합하거나 추가할 수있는대로 또한, 복합 재료 등의 실크 섬유의 시험을 허용 와 단백질 혼합물로 불러 냈어요. 이 방적 방법론 appa으로 쉽게 따라 확장할 수있는 다른 실험실을위한 플랫폼입니다ratuses는 손쉬운 방식으로 건...

거미 실크는 고장력 강판, 방탄과 나일론을 포함한 밖으로 몇 가지 인공 물질을 수행 놀라운 기계적 성질을 가지고 있습니다. 1 거미들은 다양한 기계적 특성을 표시하는 적어도 6-7 가지 섬유 종류, 인장 강도와 확장성의 다양한 양의 설계된 각 스핀 특정 생물 학적 작업을 수행합니다.이 연구 과학자들은 급속하게 때문에 식인의 3,4. 때문에 그들의 뛰어난 기계적 특성, 그들의 biocompatibility, 그들의 무독성과 녹색 - 재료 자연의 차세대 biomaterials 같은 거미 실크 옷의 사용을 추구하고있다 그의 거미들도 악의에 찬 성격은 농업을 통해 거미 실크 옷을 수확하는 것은 산업 규모의 제조에 필요한 요구 사항을 충족하기위한 실용적인 전략이 아닙니다. 따라서 과학자들은로부터 합성 섬유의 방적 체외에서 결합 유전자 변형 생물체에 재조합 실크 단백질의 생산으로 향했다했습니다SE 정화 단백질이 있습니다. 전체 길이 재조합 거미 실크 단백질의 5-8 표현들은 고도로 반복적인 자연과 물리적 길이를 (&gt; 15킬로바이트) 등이 자신의 유전자 시퀀스의 본질적인 속성, GC 풍부한 컨텐츠 주어진 기술적으로 곤란했던과 편견되었습니다 알라닌과 글리신 코돈 사용. 날짜 9-11, 대부분의 실험실 부분 cDNA 시퀀스 또는 합성 유전자를 사용하여 주요 ampullate 실크 단백질 MaSp1 또는 MaSp2의 잘린 형태의 표현에 주력했습니다. 12-15 스피닝 합성 거미 실크 옷이 필요 도전적인 과정이다 여러 과학 분야, 그리고 방적 공정의 복잡한에 숙달과 지식 완전히 영상 표현하여 일반 대중에게 공개되지 않았습니다. 사실, 전세계 실험실만이는 거미 실크 cDNAs을 표현 실크 단백질 정화, 합성 섬유를 돌려서 후 스핀 추첨을 수행할 수있는 전문 지식을 가지고, 그리고 마지막으로 그들의 biomaterial 속성을 테스트합니다. 8,방적 합성 섬유에 대한 16,17 다른 접근 방식은 습식 및 건식 방사뿐만 아니라 electrospinning 방법을 포함하고있다 16,18,19 모든 절차는 공통점이 한 가지 목표가 -. 기계적 성질과 합성 거미 실크를 생산 프로토콜의 개발을 그 라이벌 천연 스레드 대규모 상업 생산 공정입니다. 여기 젖어도 회전하는 방법을 사용하여 실험실 규모의 인공 거미 실크 옷을 생성하는 절차를 설명합니다. 다른 방적 방법에 대한 상대, 젖은 지어내는 섬유 분석을위한 가장 일관성있는 결과를 생산하고있다. 우리는 그들의 정화이어서 박테리아 재조합 실크 단백질의 표현으로이 절차를 시작하는을 요약한 다음으로 스레드를 얻을 &quot;로-잣고&quot;섬유에 적용된 이후의 스핀 추첨 방법론을 포함하여, 방적 용 단백질 준비 단계를 설명 자연 거미 실크 옷의 품질을 접근 재료의 특성. 우리 methodologY가 밀접 실크 섬유의 자연적인 회전 과정을 모방하도록 설계하고 건축과 더 나아가 구를 및 COB-직조 거미. 20-22에서 비단 생산 땀샘의 기능은 우리의 전문 기술에 따라 크게 그리는되고, 우리는 필요로 결론 수사관은 궁극적인 강도, 궁극적인 변형, 그리고 섬유의 인성을 계산할 수 응력 - 변형 곡선을, 모략하는 tensometer를 사용하여 합성 섬유의 재료 특성을 결정하는 단계. 마지막으로,하지만 중요한 가치 때문에, 스풀 링 방적 및 그리기 apparatuses 오히려 정교하고 값비싼 맞춤형 장비를 구입하는 것보다 상용 부품을 사용하여 가정에서 만들 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> pBAD / TOPO ThioFusion 식 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> K370-01 </td><td></td></tr><tr><td> 10X FastBreak 세포 용해 시약, </td><td> Promega </td><td> V857C </td><td></td></tr><tr><td> 니켈-NTA 아가로 오스 </td><td> Qiagen </td><td> 30,210 </td><td> 버퍼에 대한 지침이 포함되어 있습니다 </td></tr><tr><td> ProteoSilver 실버 얼룩 키트 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> PROTSIL1-1KT </td><td></td></tr><tr><td> FreeZone Lyophilizer </td><td> Labconco </td><td> 7,960,041 </td><td> FreeZone 12Plus </td></tr><tr><td> Hexafluoroisopropanol (HFIP) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 52,512 </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 </TD&gt; <td> 해밀턴 </td><td> 7657-01 </td><td> 250 μL </td></tr><tr><td> 바늘 </td><td> 해밀턴 </td><td> 7780-01 </td><td> 26s 게이지, 무딘 끝 이동식 바늘 </td></tr><tr><td> 주사기 펌프 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 702,208 </td><td> 11Plus </td></tr><tr><td> 디지털 캘리퍼스 </td><td> Carrera </td><td> CP5906 </td><td> 0-150밀리미터 범위 </td></tr><tr><td> 스테인레스 스틸 포셉 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 501,764 </td><td> 미니 뒤몽 # M5S </td></tr><tr><td> 모터 </td><td> 자연 밀 </td><td> 7,090,529 </td><td> 12VDC, 2 RPM 속도 </td></tr><tr><td> 리니어 액츄에이터 </td><td> 워너 전기 </td><td> 01-D024-0050-A06-LP-IP65 </td><td> 24VDC, 6 인치 범위 </td></tr><tr><td> 현미경 해부 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> Leica MZ16 </td><td></td></tr><tr><td> 디지털 microscope 카메라 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> DFC320 </td><td> 소프트웨어 : Leica 애플 리케이션 스위트 v2.8.1 </td></tr><tr><td> Vannas 가위 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 500,260 </td><td></td></tr><tr><td> Microtensometer </td><td> 오로라 과학 </td><td> 310C </td><td> 5N 듀얼 모드 시스템 </td></tr></tbody></table>

실험실 규모의 합성 거미의 실크 생산

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

사회가 진행하고 자원 scarcer되기 때문에, 새로운 기술을 육성하는 것이 점차 중요 해지고 고성능 특성을 가진 엔지니어 차세대 biomaterials니다. 이러한 새로운 구조 재료의 개발 비용 효율, 빠른이어야하며 처리 방법과 환경 친화적이고 지속 가능한 제품을 포함해야합니다. 거미는 biomimicry 그 라이벌 최고의 인조 및 천연 재료를위한 차세대 엔지니어링 재료의 풍부한 소스를 제공하고, 다양한 기계적 특성과 서로 다른 파이버 유형의 수많은 스핀. 자연 거미 실크의 대량의 컬렉션 허무이기 때문에, 합성 실크 생산이 스레드의 무제한 공급에 대한 액세스와 과학자를 제공할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 스피닝 프로세스가 간편하고 완벽하게 될 수 있습니다 따라서, 인공 거미 섬유 갑옷에서부터 애플 리케이션의 광범위한, 수술 봉합에 대한 잠재적인 사용을초, 로프 및 케이블, 타이어, 악기를위한 문자열, 그리고 항공 및 우주 항공 기술에 대한 복합 재료. 합성 실크 생산 과정을 진행하고 회전하는 스핀에서 그들의 물질적 속성에서 낮은 편차를 표시할 수 섬유를 양보하기 위해, 우리는 박테리아, 정화 및 단백질의 농도에서 재조합 거미 실크 단백질의 표현을 통합 젖어도 회전하는 프로토콜을 개발 , 섬유 압출 및 기계적 이후 스핀 치료로 따라갔다. 이것은 실험실 규모의 인조 실크 섬유를 돌려서 분석 단계별 프로세스를 보여 최초의 시각적 표현이다. 또한 동일한 회전 마약에서 냈지 섬유 간의 다양성의 도입을 최소화하기 위해 세부 사항을 제공합니다. 이하 이러한 방법은 자연 거미 실크 옷을 능가하는 높은 품질의 섬유로 이어지는, 인조 실크 생산의 공정을 추진합니다.

거미 실크 옷의 뛰어난 기계적 및 생화 학적 특성에도 불구하고,이 재료는 종래의 방법으로 대량 수확 할 수 없습니다. 여기 차세대 biomaterials 같은 거미 실크의 생산과 사용을 공부 수사관을위한 중요한 과정입니다 인공 거미 실크 섬유를 스핀하는 효율적인 전략을 설명합니다.

사회 가 발전하고 자원이 희소해짐에 따라, 차세대 ...를 설계하는 새로운 기술을 개발하는 것이 점점 더 중요해지고 있습니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 거미의 천연 실크 방사 과정을 모방하여 실험실 내에서 실크 방사 과정을 재현함으로써 합성 거미 실크를 제조하는 것입니다. 대량의 재조합 실크 단백질을 박테리아에서 생산한 후, 크로마토그래피를 통한 정제와 동결 건조를 통한 농축 과정을 거칩니다. 이후 단백질을 용해하고, 소구경 바늘이 달린 주사기를 통해 방사 도프(spinning dope)를 탈수 알코올 배스(alcohol bath)로 밀어 넣습니다.마지막으로, 합성된 방사 섬유는 단백질 사슬의 분자 배향을 향상시키기 위해 방사 후 연신 공정을 거칩니다. 전기 방사나 건식 방사와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 비용이 저렴하고 조작이 용이하며, 해당 절차를 대규모 생산 방식으로 확장할 가능성이 있다는 점입니다. 이 기술의 함의는 새로운 부류의 생체 재료 개발로 이어집니다.이러한 재료들은 봉합사, 방탄복뿐만 아니라 악기용 현과 같이 광범위하고 다양한 용도로 사용될 수 있습니다. 이 방법은 거미 실의 재료적 특성에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 재조합 단백질로 방사된 다른 유형의 생체 고분자를 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 바이오엔지니어링, 생물물리학, 세포 및 분자 생물학, 생화학 등 여러 분야의 전문 지식이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.우리는 거미의 천연 방사 과정을 모방하여 합성 섬유를 생산하려는 시도 중에 이 방법의 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 거미 실크 생산에 사용할 플라스미드를 생성하기 위해, 원하는 거미 실크 cDNA를 특정 프라이머 세트를 사용하여 증폭하고 pBBA topo thio fusion과 같은 원핵생물 발현 벡터에 결합합니다. 이 벡터는 실크 단백질의 가용화를 돕기 위한 N-말단 thio redoxin 태그와 단백질 정제를 위한 C-말단 6x his 태그를 가지고 있습니다.결합이 완료되면, 결합 생성물을 컴피턴트 E. coli 세포에 형질전환시키고 플라스미드를 포함하는 콜로니를 배양합니다. 그 후 aose를 첨가하여 거미줄 단백질 발현을 유도하고, 세포를 펠렛화하여 사용 전까지 -80 °C에서 보관합니다. 박테리아 세포를 용해하기 위해 세포 펠렛에 20 mL의 1x lysis buffer를 가하여 세포를 완전히 재부유시킵니다. 다음으로, 세포 용해를 더욱 촉진하기 위해 리소자임을 1 mg/mL 농도로 첨가하여 염색체 DNA를 분해함으로써 용액의 점도를 낮추고 DNA 100 µg을 얻습니다.그런 다음 샘플을 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에 넣고 상온에서 20분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 용액을 명확하게 만들기 위해 설정값 19에서 1분 동안 초음파 처리(sonicate)를 합니다. 4°C에서 16,000 Gs로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액이 점성이 없고 투명한지 확인하며, 만약 용액에 점성이 있고 탁하다면, DNA를 더 추가한 후 다시 초음파 처리하고 상층액을 회수합니다.상층액이 투명해지면, 니켈 NTA 친화성 컬럼 크로마토그래피를 위해 깨끗한 25 milliliter BioRad poly prep 컬럼으로 옮깁니다. 융합 단백질을 정제하기 위해, 0.5 milliliter 비즈가 포함된 니켈 NTA 슬러리 1 milliliter를 컬럼에 넣고 캡과 스톱콕(stop cock)을 단단히 고정한 후, 로커(rocker) 위에 1시간 동안 두어 평형을 맞추고 6X his 태그가 니켈 NTA 비즈에 결합되도록 합니다. 컬럼을 스탠드 위에 수직으로 세우고 니켈 NTA 비즈가 약 2분 동안 가라앉도록 기다립니다.비드가 완전히 가라앉으면 바닥에 연한 파란색 층이 보입니다. 캡을 제거하고 정지 콕(stop cock)을 통해 용액이 흐르게 합니다. 용액을 15 milliliter 원추형 튜브에 수집합니다.추가 분석을 위해 1x 세척 버퍼 20 milliliters를 첨가하고 비트가 가라앉을 때까지 기다립니다. 스톱콕을 열어 통과액을 5 milliliter씩 4개의 분주액으로 수집합니다. 추가 분석을 위해, 단기 보관 시에는 4 degrees Celsius에, 장기 보관 시에는 minus 80 degrees Celsius에 분주액을 보관하십시오.오염된 단백질을 줄이기 위해 추가 세척액을 사용할 수 있으나, 이는 전체 단백질 수율을 감소시킬 수 있습니다. 다음으로, 1x 용출 버퍼 20 mL를 첨가하고 수지가 가라앉을 때까지 기다린 후, 스톱콕을 열어 용액이 흐르게 합니다. 이 용액 20 mL를 분석을 위해 5 mL씩 4개의 분주액으로 수집합니다.단기 보관 시에는 4 °C에, 장기 보관 시에는 -80 °C에 보관하십시오. 필요한 경우 니켈 NTA 레진에서 추가 용출액을 더 수집할 수 있음에 유의하십시오. 다음으로, 단백질을 분자량에 따라 분리합니다.SDS page 분석을 사용하여 silver 또는 kumasi brilliant blue R 250으로 단백질을 시각화하며, 이후 단계에는 순수 분획물만 사용해야 합니다. Western blot 분석을 통해 정제된 단백질의 정체성을 확인하십시오. 염을 제거하고 단백질을 농축하기 위해 동봉된 문서의 지침에 따라 투석 및 동결 건조를 수행하고, 동결 건조된 샘플은 -80 °C에서 보관하십시오. 다음 단계의 목적은 안전 후드 내에서 작업하며 방사 공정을 위한 도프(dope)와 주사기를 준비하는 것입니다.건조된 단백질 분말이 담긴 각 튜브에 hexafluoro-isopropanol 또는 HFIP를 적절한 양으로 조심스럽게 첨가하여 200 mg/mL에서 500 mg/mL, 즉 20%에서 50%(w/v)가 되도록 합니다. HFIP를 첨가한 즉시 튜브의 캡을 닫고, 파라필름으로 밀봉한 후 로커(rocker) 위에 올려 단백질을 가용화합니다. 가용화를 촉진하기 위해 볼텍스(vortex)를 사용하십시오. 이 과정은 최대 2일까지 소요될 수 있습니다.가용화가 완료되면 시료를 16,000 Gs에서 2~3분 동안 원심분리합니다. 단백질이 용액 상태가 되면 이를 스피닝 도프(spinning dope)라고 합니다. 이 용액은 매우 높은 점성을 띠게 됩니다.주사기가 막힐 수 있으므로 응집물이 없는지 확인하십시오. 다음 단계에서는 127 micron 내경의 바늘이 장착된 Hamilton Gast tight 주사기에 스피닝 도프를 최소 25 microliters 조심스럽게 로드하며, 플런저를 누를 때 바늘이 위를 향하도록 주사기를 잡으십시오. 공기 방울은 섬유에 불균일함을 유발하므로 이를 제거하는 것이 매우 중요합니다.다음으로, 주사기를 하버드 장치(Harvard apparatus) 11 플러스 시린지 펌프에 고정합니다. 95% isopropanol이 채워진 400 milliliter 비커를 이동식 스탠드 위에 놓고, 주사기 팁이 알코올 표면에 살짝 닿도록 조절합니다. 시린지 펌프를 15 microliters per minute로 설정하고 시작 버튼을 누릅니다.섬유의 압출 과정입니다. 방사 도프의 초기 부피에 따라 약 1~2분 정도 소요됩니다. 모든 용액이 섬유로 방사되면, 섬유가 완전히 평형을 이룰 수 있도록 이소프로판올에 20분 동안 그대로 둡니다.다음으로, 스풀링 장치를 사용하여 샘플을 수집합니다. 여기에서 사용된 스풀링 장치는 디지털 캘리퍼스에 금속 빗을 접착하여 제작되었습니다. 이 이미지에서 보는 바와 같이, 스풀링 장치의 빗 양면에 양면테이프를 부착합니다.그런 다음 스풀링 장치를 모터에 부착하십시오. 모터가 2 RPM의 속도로 실을 감도록 설정합니다. 다음으로, 포셉을 사용하여 섬유의 한쪽 끝을 조심스럽게 잡고 이소프로판올에서 천천히 끌어냅니다.이를 스풀의 콤 암(comb arm) 중 하나의 가장자리에 부착하십시오. 양면테이프를 사용하여 다음 몇 가지 단계는 섬유가 마르는 것을 방지하기 위해 중단 없이 진행해야 합니다. 모터를 켜고 유리 막대를 사용하여 섬유가 스풀링 장치 위로 부드럽게 안내되도록 하십시오.섬유가 겹치거나 쌓이지 않도록 하십시오. 양면테이프는 섬유 전체가 미끄러지는 것을 방지하며, 캘리퍼 암 내부에 있는 섬유의 내부 세그먼트를 선택적으로 신장시킬 수 있게 합니다.전체 섬유가 스풀에 모두 감기면, 모터에서 스풀을 분리하고 양면 테이프 위에 각 실크 섬유의 끝부분에 접착제를 바릅니다. 이렇게 하면 거미줄이 장치에 고정됩니다. 스풀을 선형 액추에이터에 부착하여 방사 후 연신(post spin draw)을 수행합니다.C를 사용하여 섬유의 초기 길이를 측정하십시오. 이는 섬유의 내부 길이입니다. 스풀에 접착되어 감긴 길이는 포함되지 않습니다. 스풀을 75% isopropanol 용액에 담그십시오.섬유를 10분 동안 평형 상태로 둡니다. 리니어 액추에이터의 속도를 1.5 millimeters per second로 설정합니다. 초기 길이를 바탕으로, 원하는 포스트 빈 드로우 비율(post bin draw ratio)에 따른 최종 길이를 계산합니다.신장되는 양은 설정에 따라 속도 또는 길이를 기준으로 조절할 수 있습니다. 예를 들어, 초기 길이가 15 millimeters이고 원하는 bin draw ratio가 3배인 경우, 최종 길이는 45 millimeters가 되어야 합니다. 이는 또한 리니어 액추에이터를 1.5 millimeters/s의 속도로 20초 동안 작동시키는 것으로 계산할 수 있습니다.둘째, 포스트 빈 드로우(post bin draw)가 완료되면 스풀을 이소프로판올에서 천천히 들어 올립니다. 샘플을 수집하기 위해 이소프로판올 방울이 1분 동안 증발하도록 둡니다. 먼저, 핀셋으로 한쪽 끝을 잡은 상태에서 섬유의 다른 쪽 끝을 자릅니다.해당 끝부분을 자르고 테스트를 위해 광섬유를 카드스톡이나 호일 프레임에 고정하십시오. 추가적인 포스트 빈 연신비(post bin draw ratios)가 필요한 경우, 스풀을 다시 75% isopropanol 용액에 담그십시오. 광섬유가 10분 동안 평형을 이룰 때까지 기다린 후 다음 포스트 빈으로 진행하십시오.연신비. 섬유에 영향을 줄 수 있는 습도와 온도를 기록하십시오. 기계적 특성.수집한 샘플이 표준 실험실 환경에 적응하도록 둡니다. 기계적 테스트 전 최소 1시간 동안 습도 40%, 온도 25 °C를 유지하는 것이 이상적입니다. 섬유를 카드스톡 프레임에 장착한 후, 카드스톡이나 호일의 가장자리에 순간접착제를 도포하여 섬유를 프레임에 고정합니다.프레임 개구부의 크기를 확인하십시오. 이것이 테스트할 섬유의 초기 길이입니다. 여기서는 1인치 개구부 프레임이 표시되어 있으며, 100배 이상의 배율을 가진 광학 현미경을 사용하여 섬유의 장축 방향을 따라 직경을 측정합니다.최소 3회 이상의 측정값을 기록해야 합니다. 배율을 높게 설정하고 더 많은 횟수를 측정할수록 정확도가 향상됩니다. 카드스톡 프레임을 텐터 기계적 하중 프레임에 고정하십시오.그 다음 프레임의 양쪽을 절단하여 장력이 섬유에만 가해지도록 합니다. 텐터를 찢고 데이터를 수집합니다. 표준 변형률로 초당 2%를 권장합니다.기계적 데이터 수집 절차는 연구에 사용된 텐터(tenter) 브랜드에 따라 달라질 수 있습니다. 평균 직경으로 수집된 데이터를 사용하여 Microsoft Excel에서 응력-변형률 곡선을 그릴 수 있습니다. 이제 파단된 섬유를 주사 전자 현미경(SEM)에 장착하여 형태학적 분석 및 파단점 직경 측정을 수행할 수 있습니다.파단점으로부터 떨어진 섬유 세그먼트를 사용하여 광학 현미경으로 측정한 초기 직경을 추정하고 확인할 수 있습니다. 섬유를 방사하기 전 단백질의 순도를 결정하기 위해 거미 실크 단백질 MASP one을 박테리아에서 발현 및 정제하였으며, 단백질들은 크기 분획법을 거쳤습니다. 여기에서 보여주는 바와 같이 SDS page 분석 후 은 염색으로 시각화한 결과, 6개의 용액 중 대부분의 샘플이 처음 4개의 분획 내에서 방출됨을 알 수 있습니다.본 프로토콜에 따라 거미 실크 단백질 TUSP 1을 생산하였으며, 이를 섬유로 방사하여 합성 관형 실크 섬유의 기계적 특성을 결정하였습니다. 실크 섬유를 방사한 후 연신비를 점차 높여 후연신을 수행하였습니다. 이 이미지의 색상은 2.5배에서 6배까지 서로 다른 후연신비가 적용된 섬유들을 나타냅니다. 섬유들은 동일한 연신비 그룹 내에서 낮은 변동성을 보입니다.포스트맨(postman) 연신비가 증가함에 따라 섬유의 강도는 증가하는 반면 신연성은 감소합니다. 그러나 섬유들은 동등한 수준의 인성을 나타냈습니다. 섬유의 초미세 구조를 평가하기 위해, 여기에 나타난 바와 같이 재조합 tsp one 단백질로 방사한 섬유의 주사 전자 현미경 이미지를 획득했습니다. 500배 배율과 5,000배 배율에서 매끄러운 외표면을 확인할 수 있습니다.섬유의 자연스러운 단면을 통해 밀도가 높은 내부 코어를 관찰할 수 있습니다. 이는 압출 과정 동안 재조합 단백질이 잘 조립되고 패킹되고 있음을 시사합니다. 숙달되면, 적절히 수행했을 때 이 기술은 10일 이내에 완료될 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 동결 건조 단계 전에 정제된 재조합 단백질에서 모든 염을 제거하는 것이 중요하며, 압출 과정 중 바늘이 막히는 것을 방지하기 위해 적절한 방사 도프 농도가 사용되었는지 확인해야 합니다. 이 절차에 따라 mes, P one TUSB one, P ysb one과 같은 다른 피브로인을 개별 섬유 또는 복합체로 방사하여 광범위한 생체 재료를 제조할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 생체공학 및 재료 과학 분야의 연구자들은 군사, 의료 분야, 예술, 스포츠 및 자동차 산업에 영향을 줄 수 있는 응용 분야에 합성 거미줄을 사용하는 방법을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 영상을 시청하신 후, 박테리아에서 정제한 단백질을 사용하여 합성 실크 섬유 또는 복합 재료를 방사하는 방법에 대해 더 잘 이해하시게 될 것입니다. AFib을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 흄 후드 내에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

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배우세요 실험실에서 거미의 실크 방사 과정을 모방하여 합성 거미 실크를 생산하는 방법을. 대장균에서 재조합 실크 단백질을 생산하고 크로마토그래피로 정제한 후 동결건조하여 농축합니다. 이 기술은 저렴한 비용과 대규모 생산 가능성으로 생체재료 개발에 활용됩니다.

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