Name: 의 흐름 세포 계측법 기반 정화 S. cerevisiae Zygotes (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 9 s
Description: 학습하세요 흐름 세포 계측법을 이용해 S. cerevisiae 교배체를 정화하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 약 90%의 높은 순도로 교배체를 분리하여 진핵세포의 배아 발생 및 분자 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 그림과 도움을 이전 입력 및 일리아 Aylyarov에 대한 유동 세포 계측법, 박사 뿌르 니마 Jaiswal 박사 디 우와 관련하여 도움이 박사 R. 마이클 Sramkoski 감사드립니다. NIH 그랜트 R01GM089872과 세포 계측법 및 사례 종합 암 센터 (P30 CA43703)의 이미징 현미경 핵심 설비의 지원.

1. Haploid 세포의 성장 <ol><li> S. 성장 표준 조건 10 세 미만 S288C 배경 (BY4741)에서 cerevisiae 세포. </li><li> 두 눈에 형광 마커 10 중 하나를 표현하는 haploids을 변환 할 수 있습니다. 선택의 마커 mCherry (A. 존스턴에서 pAJ1661, URA3/CEN)과 융합 세포질로 표현 가용성 GFP (BglII 11 선형화 pEG220, URA3/YIp)와 하나의 ribosomal 단백질, RPL25입니다. 우리는 동등한 두 컬러 정화 프로토콜은 haploid 부모의 세포에 의해 합성 된 다른 밝은 형광 단백질의 사용을 만들 수 기대하고 있습니다. 또한, 세포 벽은 형광 lectins으로 표시 될 수 있습니다. </li><li> 하루 앞 접합자 정화에서 각 셀 타입의 5 ML 문화의 예방과 ° C가 1.0을 초과하지 A600에 도달 할 23 박 흔들림과 함께 성장. 2 %의 포도당 (CSM-포도당)를 포함한 완전한 합성 중간에 GFP의 transformants (ATY4442)을 성장uracil 10 부족 합성 선택적 중간에 차 RPL25 - mCherry의 transformants (ATY4552). 실온에서 흔들림 각 세포 유형의 병렬 문화를 유지하고 있습니다. </li></ol> 2. 크로스를 수행 <ol><li> 신선한 매체에 1.0으로 각 샘플의 광학 밀도 (A600)를 조정합니다. [1 광학 밀도 단위 ~ 3 X 10 7 세포 / ML] </li><li> 10 초에 대한 하나 이상 소용돌이 다음 간단히 두 문화, 소용돌이 3 회,의 동등한 볼륨을 섞는다. </li><li> CSM-포도당 접시를 준비합니다. 번호판은 일상적인 성장에 사용되는 것과 동일 45 쏟아져 이후 분, 한천 10 응고를 건조되었습니다. </li><li> CSM-포도당 플레이트의 표면의 가장자리에서 혼합 1cm의 많은 스무으로 40 ML 방울를 배포합니다. 작은 물방울이 처음 표면에 적용하는 경우는 시간이 경과 측정 할 수있는 타이머를 시작합니다. 액체 (약 30 분) 흡수되면, 접시를 커버하고 타나로 오에 그대로 남겨둔다는m 온도. </li></ol> 3. 수확 준비 <ol><li> 수확 샘플 23 1.75-2.5 시간 후에 ° C 반복적으로 얼음 접시를 유지, 150 ML 추위 CSM-포도당을 사용하여 접시에서 개인 말린 물방울을 닦고하여. 반복적으로 복구를 극대화 할 수있는 동일한 매체 비말 지역에게 평균의 10 배에서 20 배를 씻는다. 얼음에 15 ML 팔콘 튜브에 수집합니다. </li><li> 얼음에 피셔 FB120의 sonicator (120Volt 120Watt, 주파수 20KHz)로 60 % 진폭에서 샘플 10 배 sonicate 조사. </li><li> 몇 또는 전혀 집계가 유지 위상 현미경으로 확인합니다. 셀의 15-50%이 시점에서 zygotes을 형성 할 것으로 예상됩니다. </li><li> 더 예방책 (집계가 정착 할 수 있도록하기 위해)로 10 분을위한 얼음에 방해받지 수직 위치에있는 셀의 관을 둡니다. </li><li> 볼륨의 최상위 90 %를 복구하고 나일론 메쉬 (BD 매의 폴리 프로필렌 관 스트레이너 캡 (참조 352,235) 포함)를 통해 필터링합니다. 전형적인 실험, 10 7 세포에서한 접시에서 복구는 CSM-포도당 4 ML에 희석이 시점에서 있었다. </li></ol> 4. 유동 세포 계측법 <ol><li> 100 마이크론 팁과 소니 iCyt의 반사 모델 흐름 Cytometer, (고도의 자​​동화 병렬 정렬) HAPS1를 사용하여 정렬 셀. GFP의 여기 들어, 블루 아르곤 이온, 488 nm의 250 milliwatt 레이저를 사용합니다. mCherry에 여기 들어, 561 nm의에서 100 milliwatt 레이저를 사용합니다. 우리가 다른 기계와 경험이 있지 않지만, 우리는 올바른 레이저가 장착 때 Becton 디킨슨 FACSAria, Becton 딕슨의 유입 또는 Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 MoFlo XDP 잘 될 것이라고 기대합니다. </li><li> 베이스 가능한 세포에 게이트 위해 앞으로 대 다시 분산 형 플롯에 매개 변수를 정렬. 615의 방출 계획을 수립 + / - 30 nm의 대역 통과 필터 (mCherry) 대 525 + / - 25 nm의 대역 통과 필터 (GFP) 4 당장 자리로 이벤트를 나눌 수있는, &quot;레드 + 그린 -&quot;, &quot;레드 + 그린 +&quot;, &quot;적목 녹색 &#39;및&#39;레드 - 그린 + &quot;(그림 S2). 표준 F로 nonfluorescent 세포를 사용하여또는 &quot;적목 그린 -&quot;사분면의 결정. </li><li> 21.5 psi의 피복 압력, 43,400 물방울 / 초의 비말 주파수, 그리고 20.5 PSI의 샘플 압력 정렬 세포. </li><li> 초기 정렬 ( &quot;복구 모드&quot;) : CSM-포도당 찬 250 ML를 포함하는 차가운 Eppendorf 튜브에 샘플을 수집합니다. 냉장 microfuge의 최고 속도 (Tomy MRX-150, 15,000 RPM)에서 침전 10 초와 흐름 솔루션 (유동 세포 계측법의 피복 솔루션 (1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 PBS) BioSure 카탈로그 번호 1027)를 대기음. 500 ML 추위 CSM-포도당을 Resuspend. </li><li> 둘째 정렬 ( &quot;순도 모드&quot;) : &quot;순결 모드&quot;옵션을 사용하여 초기 정렬에 대한로 정렬을 실시한다. 침전 세포를 정화 500 ML-1.0 ML의 CSM-포도당의 알약을 resuspend. 신진 대사 복구 할 수 있도록 23 ° C에서 24 잘 플레이트에서 15 분 동안 흔들어. </li></ol> 5. DeltaVision의 현미경 <ol><li> 다음과 같은 아가로 오스 패드를 준비 : (UltraPure 1.5 % 아가로 오스의 정지 가져아가로 오스, Invitrogen 다음 종기에 CSM-포도당의 카탈로그 # 15510-07), 와류 짧게, 그리고 수평 표준 유리 슬라이드의 표면에 아가로 오스 솔루션의 0.3 ML 샘플을 적용하고 두 번째 슬라이드를 한 번에 커버 (없이 ) 압력을 가해. </li><li> 10 분 동안 냉각 후, 부드럽게, 수평 슬라이딩하여 상단 슬라이드를 제거 부드러운 표면을 떠날 돌봐하고 아가로 오스 레이어를 방해하지. (상단 슬라이드가 제거되면, 세포의 샘플은 1-2 분 내에 적용해야합니다. 위의 슬라이드를 제거하지 않고 실온에서 습한 챔버에 보관하면 패드는 사용하기 전에 하루에에 저장할 수 있습니다.) </li><li> 침전 샘플 및 보증금 아가로 오스 패드에있는 펠릿의 1 ML의 aliquots (표면을 만지지 않고). 즉시 정사각형 제 1 coverslip으로 샘플을 다룹니다. 단일 깨끗 razorblade을 초과 아가로 오스를 멀리 트림. 주사기에서 투여 바세린과 준비를 밀봉합니다. </li><li> Deltavision (응용 Precisio를 사용하여 이미지∞ / 0.17/FN26.5), binning없이 100x 기름 침지 목표 (올림푸스 UPlanApo 100x/1.40과 n)이. </li><li> softWoRx 5.0.0 프로그램 사용 (Z-스택 Deconvolve <a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp을</a> )를 최소한 처리 할 수 있습니다. 연속 Z-비행기는 일반적으로 0.2-0.4 미크론 간격에서 수집되었다. </li></ol> 6. 대표 결과 변환 haploid 세포의 형광 강도 수준은 : haploids에 형광의 수준은 그림 S1에 도시된다. 십자가, epifluorescent 시험은 본질적으로 모든 GFP의 transformants가 녹색이었고 모든 mCherry의 transformants은 종종 희미하지만, 붉은 색 있다는 것을 보여 주었다 전에. 십자가에 사용 된 모든 세포가 실제로 형광 있다는 보장하기 위해, 우리는 가장 밝은 형광 신호 subpopulation를 사용했습니다. 완성 된 요리 :fter은 초기 정렬, 레드 + 그린 + 샘플 (그림 S2) 일반적으로 8-20 셀의 입력 번호의 %와 지속적인 세포 세포 접착으로 인해 아마도 haploid 세포의 과도한 숫자가 포함되어 있습니다. 높은 농축이 하나의 정렬을 달성되지 않기 때문에, 부분적으로 정화 예제는 탐사선이 다시 정렬에 이어 60 %의 진폭에 두 번 sonicated해야합니다. 세포의 두 번째 종류의 대상 (두 번째 종류는 불과 15 분. 필요 동안 1-2 시간 사이에 일반적으로 마지막으로 복구 정렬), 레드 + 그린 + 샘플은 입력 셀의 23-52%이 포함되어 있습니다. 단계 현미경 검사 : 검사 상 대비 현미경으로는 최종 접합자 준비의 순도는 21 준비 (86 %에서 91%에 이르기까지)을 통해 약 90 %를 평균 것으로 나타났다. 오염 물질은 서로 연락을했다 haploids의 녹색 또는 빨간색 haploids, 또는 쌍 중이었다. 그림 3은이 zygotes의 비율을 tabulates노 새싹, 중간 꽃 봉오리 (메드), 측면 봉오리 (LAT) 또는 터미널 꽃 봉오리 (기간), 같은 색의 짝을 haploids 수 ( &quot;2Same&quot;) 또는 다른 색 ( &quot;2Hap&quot;)뿐만 아니라, 개인 haploids ( 누군가에게). 세포가 1.75 시간 이후에 수확 때, 50 % 이상이 unbudded되었으며 다른 하위 카테고리가 (중간, 옆, 또는 터미널 꽃 봉오리 포함) 동등하게 표현되었다. 2.5 시간 후에는 4 가지 범주의 각 (unbudded, 안쪽, 옆 또는 터미널 꽃 봉오리 포함)에 zygotes의 약 같은 숫자가있었습니다. 현미경 관찰 (그림 4) : zygotes의 구조는 정화 동안 변함에 나타납니다. 십자가의 기간에 따르면, 인구는 위에서 설명한 unbudded 및 budded zygotes의 다른 비율을했다. 녹색과 붉은 haploids 모두 형광 신호 강도에 상당한 차이를 보여 주었다 때문에 comparin에 의해 관찰되기 때문에 다른 사람들이, 주로 녹색있을 때, 일부 zygotes는 주로 붉은 색이었다g 그림 4에 결합 된 이미지의 단일 컬러 이미지. GFP (MW 26kDa)은 핵을 입력하고 핵이 융합하지 않아도 핵에서 발견 할 수도 있습니다. 액포는 검은 색이 아닌 형광 분야로 눈에 띄는. 정화의 최종 제품 개발의 여러 단계에서 다양한 인구를 산출. Zygotes은 공사를하지 않은 퓨전이라는. B 형 zygotes는 unbudded 있습니다. C 형은 작은 꽃 봉오리가 있습니다. 형식은 큰 꽃 봉오리가 D 및 타입 E의 zygotes는 cytokinesis를 받아야하려고합니다. 이전 zygotes의 많은 여전히 비 형광 중간 부 라인 (*)를 전시하고, vacuolar &quot;상속 구조&quot;(I) 12 종종 꽃 봉오리에 접합자에서 확장 할 볼 수 있다는 것 또한 있습니다. 어떤 경우에는 녹색 신호가 빨간색 신호 그 훨씬 더 범위 파트너로 배포하고 있습니다. 이 (Tartakoff, 준비) polysom​​es의 특징 전송의 지연을 반영합니다. 6 zygotes를 복구합니다. 우리가 세포의 수와 RNA의 약 1.5 밀리그램의 압축을 풉니 다 페놀 - 클로로포름 절연 프로토콜을 사용합니다. 정화 zygotes은 사전에 자세한 분석, 냉각 된 이후 우리는 ° C 성장 매체 23에서 부화하는 것이 좋습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" /> 1 그림. 접합자 형성 연혁. haploids와 diploids 사이의 중간으로 Zygotes. 이 다이어그램은 고전 haploids의 활성화 (shmooing)의 융합, 그리고 초기 꽃 봉오리의 형성을 보여줍니다. 봉오리가 (T)하거나, (M) 안쪽 측면 (L) 또는 터미널 될 수 있습니다. <imgALT = &quot;그림 1&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2. 접합자 정화 프로토콜의 개략도. 포도당을 갖춘 중간에 한천 플레이트의 표면에 부화 후, 세포 혼합물은 세척에 의해 복구 된 후 &quot;순도 모드에서 두 번째 종류의 다음&quot;복구 모드 &quot;의 초기 정렬을 받게. &quot; 노란 색은 mCherry와 GFP 신호 모두 zygotes에서 볼 수 있다는 의미합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" /> 그림 3. 분수를 정화. 짝짓기 혼합물의 zygotes의 종류는 1.75 또는 상대적으로 초기 대 상대적으로 더 성숙 zygotes에 풍부한 분수를 복구 2.5 시간 후에 수확했다. 독특한 색상이 지정 여덟 독립적 인 실험은, 때마다 포인트를 수행했다. 그래프 zygotes의 상대적인 숫자를 나타내는 헥타르꽃 봉오리 형성 spatially 독특한 패턴이 있어요. 부화의 간단한 기간을 감안할 때 (상온에서 이하 2.5 시간) 관찰 모든 버드는 초기 접합자의 신진 행사입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" /> 4 그림. 풍부한 분수의 DeltaVision 시험. 일반적인 필드가 Deltavision 현미경으로 조사되었다. 그림도 붉은 색과 녹색 또는 하나의 두 색상을 보여줍니다. 빨간색은 polysom​​al 라벨 (Rpl25p - mCherry)과 cytosolic GFP의 녹색에 해당합니다. 액포 (V), 꽃 봉오리 (B), 핵 (n)이, vacuolar &quot;상속 구조&quot;은 (i), 그리고 부모를 구분하기 위해 나타나는 파티션 (*) : zygotes의 높은 농축하고, 지정된 subcellular 기능을합니다 비교적 초기 zygotes의 도메인. 이들의 변수 전체 색상이 융합 haploids의 상대 강도를 반영합니다. 두 부모 도메인이 유지되는 경우독특한 색상은 마커 (세포질 GFP, mCherry 태그 polysom​​es)의 평균은 불완전했다. 진행 시간 경과 연구 전에 polysomes에 용해 GFP를 redistributes는.을 보여 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 보충 전설 <img alt="그림 S1" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" /> 그림 S1. haploid 세포의 형광 맨 왼쪽 :. mCherry 태그 polysomes을 표현 셀은 녹색 신호를 감지하기 위해 조사되었다. 직사각형 창은 부정적인 세포를 피하기 위해 설정되었습니다. 중앙 그래프 : cytosolic GFP를 표현 세포가 분석 탐지의 분명한 밝은 주요 인구를 보여주는되었습니다. 맨 오른쪽 : mCherry 태그 polysom​​es을 표현 세포를 분석 하였다. 직사각형은 (맨 왼쪽에있는 것과 동일) 밝은 세포를 포함하고 모든 수네거티브는 피해야합니다. 지정 &quot;R2&quot;는 지정된 사각형 안에 회수 세포의 비율을 나타냅니다. <img alt="S2 그림" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" /> S2 그림. 첫 번째와 두 번째 정렬에서 셀 유통.이 두 색상의 플롯은 오른쪽 상단의 구역 (R5)에 그린 + 레드 + 세포의 비율을 나타냅니다. 이 비율은 두 번째 종류에서 52 %로 증가한다. 가로 축 : 녹색 신호. 수직 축 : 적색 신호.

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</ol>

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정화 zygotes의 가용성 zygotes는 또한 세포주기 재입국, 세포 벽 개조, 신진 및 상속 특성 등을 받아야하는가 transcriptomics, 단백질 체학 및 lipidomics뿐만 아니라, 메커니즘에 대한 조사를 포함 생화학 연구를 촉진해야 zygotes가 시작 생성 할 수 하나 또는 둘 모두 부모의 특성 변이를 들고 긴장을 갖추고 있습니다. 또한, 정화 zygotes은 haploid 또는 diploid 세포로, 중간 15 % 글리세롤을 포함하는 동안 얼어있을 수 있으며, 나중에 재발 신진의 측면을 모니터링 할 해동. 미세한 목적에 적합한 다른 형광 마커 (예를 들면 태그 histones 또는 mitochondrial 단백질)를 사용하여 예비 실험 zygotes의 신뢰성 회복을 허용하지 않은,하지만, 비교 정화는 누구의 세포벽 haploid 세포로 시작하는 달성 할 수있을 것입니다 또는 빨간색에 연결되었습니다 녹색 fluorophores. 우리는 S...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비 </td><td> 출처 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, 인코딩 세포질 GFP 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, mCherry에 융합 인코딩 RPL25 </td><td> A. 존스턴 </td><td></td></tr><tr><td> 피셔 FB120의 sonicator </td><td> 피셔 과학 </td><td></td></tr><tr><td> 스트레이너 캡과 폴리 프로필렌 관 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 참조 352,235 </td></tr><tr><td> 냉장 microfuge </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> 유동 세포 계측법의 피복 솔루션 </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> iCyt의 반사 모델 흐름 Cytometer </td><td> 소니 </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision의 deconvolution 현미경 </td><td> 응용 Precision </td><td></td></tr><tr><td> 입식 epifluorescence 현미경 </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure 아가로 오스 </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> CSM 포도당 제제 참고 사항 : 한천 플레이트의 경우는 단순히 2 % 한천 (Difco)를 포함 </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

의 흐름 세포 계측법 기반 정화<em&gt; s. cerevisiae</em&gt; zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes는 효모 등 여러 생물의 수명주기의 haploid와 diploid 상태 사이의 중요한 중간체, (그림 1) 1. S. 아르 cerevisiae는 별개의 결합 유형 (마타, MATalpha)의 haploid 세포의 융합에서 결과를 zygotes과 연속의 놀랍도록 비대칭 mitotic 부문이의 결과로 많은 20로 diploid의 자손을 생성하는 해당 안정 diploids에 상승을 제공합니다. 접합자 형성은 사건의 복잡한 순서에 의해 조율되어 있습니다 :이 과정에서 용해 결합 요소는 세포 세포 융합에 세포주기와 절정에 달하다 중단을 촉진 수용체 - 매개 신호 폭포를 게재하고, 수용체 기원하기 위해 바인딩합니다. Zygotes는 전구 또는 줄기 세포 기능의 모델로 간주 될 수 있습니다. 대부분 zygotes의 형성에 대해 알게되었지만 및 zygotes는 일반 signif의 휴대 분자 질문을 조사하는 데 사용되었습니다 있지만,icance는 거의 모든 연구 zygotes가 3-8 haploid 세포의 과반수 인구 함유되어있는 결합 혼합물의 사용을 만들었습니다. 접합자 형성 생화학의 여러 측면과 접합자의 지속적인 삶을 따라서 uninvestigated 남아있다. 효모 zygotes의 정화의 보고서는 침강 특성 9 일 기준으로 프로토콜을 설명하지만,이 침전 기반 절차는 우리의 손에 약 90 % 순도를 얻을 수 없습니다. 또한,이 세포는 hypertonic sorbitol에 노출되는 단점이 있습니다. 따라서 우리는 다양한 정화 절차를 개발했습니다. 이러한 목적을 위해, 빨간색 또는 녹색 형광 단백질을 표현 ha​​ploid 세포의 쌍 접합자 형성, 다양한 시간에 수확하고, 결과 zygotes이 흐름 세포 계측법 기반 정렬 프로토콜을 사용하여 정제 된 수 있도록 공동 incubated했다. 이 기술은 결함과 성숙의 편리한 시각적 평가를 제공합니다. 평균 순도분수의 약 90 %이다. 수확의 타이밍에 따르면, 성숙의 학위를 변화의 zygotes은 복구 할 수 있습니다. 정화 샘플 초기 자손의 복구를 위해,이 전구 세포의 체계적 조사에 대해 &quot;omic&quot;연구에 대한 출발의 편리한 점을 제공합니다.

의 zygotes을 정화하려면<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;, 반대 결합 유형의 haploid 세포는 흐름 세포 계측법 기반 프로토콜을 사용하여 빨간색 또는 녹색 형광 접합자 형성을 허용 공동 incubated 단백질, 그리고 fractionated을 표현하도록 설계되었습니다. 높은 강화 분율은 초기 자손의 후속 &quot;omic&quot;연구, 복구 및 접합자 morphogenesis의 체계적인 조사를 할 수 있습니다.

의 흐름 세포 계측법 기반 정화<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

접합자는 효모(그림 1)를 포함한 많은 생물의 생애 주기에서 반수체 상태와 이배체 상태 사이의 필수적인 중간 단계입니다 1. S. cerevisiae ...

다음 실험의 전반적인 목표는 정제된 효모 접합자 집단을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 서로 다른 교배형의 반수체 세포에서 세포질 GFP 또는 M cherry가 태그된 poly zones를 발현시킴으로써 달성됩니다. 세포를 대수 성장기까지 배양한 후, 이를 결합하고 함께 배양하여 접합자가 형성되도록 합니다.그 다음 교배 혼합물을 수집하고 회복 모드(recovery mode)의 유세포 분석법으로 분류하여 적색-녹색 이중 양성 세포를 분리합니다. 이 하위 집단에는 접합 전 단계 및 접합 후 단계의 개체가 모두 포함되어 있습니다. 샘플을 더욱 정제하기 위해, 적색-녹색 이중 양성 집단을 대상으로 2차 유세포 분석 분류를 수행합니다.순도 모드 사용. 이 절차는 육안 검사와 형광 현미경을 이용한 세포 정량 분석을 기준으로 평균 90%의 접합자 순도를 얻을 수 있게 합니다. 침강 기반 정제와 같은 기존 방법 대비 이 기술의 장점은 다음과 같습니다.첫째, 이 기술은 접합자의 순도와 성숙도를 편리하게 시각적으로 평가할 수 있게 해줍니다. 둘째, 본 연구진의 결과에 따르면 접합자 분획의 평균 순도는 약 90%로, 기존 방법들보다 훨씬 높습니다. 본 정제 방법은 진핵세포의 반수체에서 이배체로의 전환과 관련된 핵심적인 생물학적 질문에 대해 분자 수준에서 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있으며, 하등 진핵생물과 고등 진핵생물 사이에 상당한 보존성이 존재합니다.따라서 효모 접합자를 연구하는 것은 접합자 생물학에 대한 일반적인 이해를 증진할 수 있습니다. 또한 접합자는 전구세포 또는 줄기세포 기능의 모델로 간주될 수도 있습니다. BY 47 41의 Matt A 및 Matt alpha VCA, Grow s cera 효모 세포를 동결 보관된 효모 스트레스를 고체 한천 성장 배지에 스트리킹하고, 접합자 정제 전날까지 콜로니가 형성될 때까지 실온 또는 30 °C에서 배양판을 배양합니다. 형질전환된 soluble GFP 및 RPL 25 M.Cherry tabloids를 배양하기 위해 50 mL 원추형 튜브 두 개에 라벨을 붙입니다. 하나의 배양 튜브에는 세포질에서 soluble GFP를 발현하는 형질전환된 tabloids를 접종하고, 다른 하나에는 단일 리보솜 단백질을 발현하는 형질전환된 tabloids를 접종합니다.mCherry가 융합된 RPL 25입니다. A 600 수치가 1.0을 초과하지 않을 때까지 23 °C에서 하룻밤 동안 진탕 배양합니다. 다음으로 교배를 수행하기 위해, 각 샘플의 광학 밀도를 신선한 배지에서 1.0(약 3 × 10⁷ cells/mL에 해당)으로 조정하는 것으로 시작합니다.다음으로, 50 milliliter 원추형 튜브에 두 배양액을 동일한 부피로 신선한 배지와 함께 혼합합니다. 짧게 세 번 볼텍싱한 후, 10 seconds 동안 볼텍싱합니다. 피펫 팁을 표면 위 1 centimeter 높이에 위치시킵니다.온도 CSM 포도당 플레이트입니다. 30분 카운트다운 타이머를 시작하고, 혼합 배양액 40 µL 방울을 플레이트의 둘레를 따라 주변부에 즉시 분배합니다. 플레이트의 뚜껑을 연 상태로 벤치탑 위에서 약 30분 동안 건조시킵니다.액체가 모두 흡수되면 플레이트를 덮고 실온에서 1.75~2.5시간 동안 그대로 둡니다. 편향 성장 과정은 특징적인 schmo와 같은 형태를 만들어냅니다. schmo 단계 동안, 두 개의 haid 세포는 세포 간 접촉이 이루어질 때까지 서로를 향해 계속 성장합니다.이후의 세포 융합은 접합자의 형성으로 이어집니다. 생성된 접합자는 다시 유사분열 세포 주기에 진입하여 첫 번째 이배체 출아를 생성합니다. 배양 후, 플레이트를 얼음 위에 두고 개별 건조 액적 부위를 150 µL의 차가운 CSM glucose로 10~20회 세척하여 샘플을 수확합니다.세척액을 얼음 위에 놓인 15 milliliter 원추형 튜브에 수집합니다. 그다음, 샘플을 얼음 위에 유지한 상태에서 각 튜브를 60% amplitude로 10회 프로브 초음파 처리(probe sonicate)합니다. 초음파 처리 후 위상차 현미경으로 확인하여 응집체가 거의 또는 전혀 남아 있지 않은지 확인하며, 세포의 15~50%가 접합자를 형성했을 것으로 예상됩니다. 이 시점에서 남아 있는 응집체가 가라앉을 수 있도록 예방 조치로 세포 튜브를 얼음 위에 세운 상태로 10분 동안 그대로 둡니다.부피의 상층 90%를 회수하고 거름망 캡이 있는 나일론 메쉬 폴리프로필렌 튜브로 여과합니다. 일반적인 실험에서는 플레이트 하나당 10⁷개의 세포와 4 mL의 CSM. Glucose를 회수합니다. 세포 분류는 100 µm 팁이 장착된 HAPS 1이 포함된 Sony eyesight reflection 모델 유세포 분석기를 사용하여 수행합니다.먼저 win list 3D 소프트웨어에서 GFP 여기(excitation)를 위한 여기 레이저를 선택하십시오. M cherry 여기를 위해서는 488 nanometers의 청색 Argonne 이온 500 milliwatt 레이저를 사용하십시오. HAPS 제어 소프트웨어에서는 561 nanometers의 100 milliwatt 레이저를 사용하십시오.회수 모드(recovery mode)가 선택되었는지 확인하고, 소팅을 위한 시스 압력(sheath pressure)은 21.5 pounds per square inch, 액적 빈도는 초당 43, 400 drops per second, 샘플 압력은 20.5 pounds per square inch로 설정하십시오. 생존 세포를 게이팅하기 위해 전방 산란(forward scatter) 대 후방 산란(back scatter) 플롯을 기준으로 소팅 파라미터를 설정하십시오. 여기서 사용된 Sony eyesight 장비는 특이하게 측방 산란(side scatter) 플롯을 후방 산란으로 표시하지만, 이 후방 산란은 기능적으로 측방 산란과 동일합니다. 이벤트를 4개의 사분면으로 나누기 위해 M cherry 대 GFP의 방출 플롯을 생성하십시오.빨간색 양성, 녹색 음성, 빨간색 양성, 녹색 양성, 빨간색 음성, 녹색 음성, 그리고 빨간색 음성, 녹색 양성. 빨간색 음성 녹색 음성 사분면을 결정하기 위한 표준으로 비형광 세포를 사용하십시오. 초기 분류를 위해.회복 모드를 선택하고, 250 milliliters의 차가운 CSM glucose가 들어있는 냉각된 마이크로 원심분리 튜브에 샘플을 수집하십시오. 수집 후, 냉장 마이크로 원심분리기를 사용하여 최고 속도로 10초 동안 세포를 침전시킵니다. 원심분리 후, 유동액을 흡입하여 제거하고 500 microliters의 차가운 CSM glucose로 재현탁하십시오.단 한 번의 분리로는 높은 농축도를 얻을 수 없으므로, 부분적으로 정제된 시료를 60% 진폭으로 짧게 두 번 프로브 초음파 처리합니다. 이번에는 생존 세포에 대한 purity mode 옵션 게이트를 사용하여 세포를 다시 분리하고, M cherry 대 GFP의 방출 플롯을 생성하여 정제된 세포인 침전물을 확인한 후, 펠렛을 0.5~1.0 mL의 CSM glucose에 재부유시킵니다. 원심분리 후 24웰 플레이트의 각 웰에 0.5 mL씩 옮긴 다음, 세포를 15분 동안 흔들어 섞어줍니다.대사 회복을 위해 23 °C에서 24-well plate에 배양합니다. agros 패드를 준비하려면, 15 mL conical tube에 1.5% agros의 CSM glucose 현탁액을 넣고 끓입니다. 용액을 짧게 vortexing한 후, agro 용액 0.3 mL를 최소 2~3개의 표준 유리 슬라이드 표면에 도포하고, 즉시 다른 슬라이드로 덮어줍니다.압력을 가하지 마십시오. 슬라이드를 10분 동안 식힙니다. aros 패드를 즉시 사용하지 않을 경우, 상단 슬라이드를 제거하지 않은 상태로 상온의 습윤 챔버에 보관하십시오.이들은 최대 하루 동안 보관할 수 있습니다. 그 후 상단 슬라이드를 수평으로 밀어 조심스럽게 제거합니다. 표면을 매끄럽게 유지하고 aros 층을 흐트러뜨리지 않도록 주의하며, 1~2분 이내에 침전된 세포 1 µL씩을 표면에 닿지 않게 aros 패드 위에 분주합니다.단면 면도날로 다듬은 정사각형 커버 슬립으로 샘플을 즉시 덮습니다. 과도한 부분은 제거하고, 주사기를 사용하여 커버 슬립의 가장자리를 따라 바세린을 도포합니다. binning 없이 100x 오일 침수 렌즈가 장착된 DeltaVision을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 이상적인 시야는 개별 세포를 구분할 수 있도록 세포 사이에 충분한 공간이 있는 단일 세포층이 보이는 상태입니다. 이미지 캡처가 완료되면 0.2 내지 0.4 micron 간격으로 촬영합니다.SoftWorks 5.0 0.0 프로그램을 사용하여 Zacks를 디컨볼루션(deconvolve)하고, 20사이클의 표준 디컨볼루션을 통해 최소한으로 처리합니다. DeVol 이미지에서 배경 신호를 최소화하기 위해 적색 대 녹색 형광의 강도를 조정하여 형질전환된 세포의 형광 단백질 발현을 평가합니다. 교잡 전후에 유세포 분석(flow cytometry)을 통해 세포를 분석하였습니다. 기본적으로 모든 M cherry 형질전환체는 적색이었고, 모든 GFP 형질전환체는 녹색이었습니다.M cherry 신호가 GFP 신호보다 덜 강했지만, 세포 분석법과 형광 현미경 모두에서 검출되었음에 유의하십시오. 세포를 분리하여 R 2 사분면에 나타나는 가장 밝은 세포들을 선택했으며, 여기에서 볼 수 있듯이 GFP 형질전환체와 함께 2.5시간 동안 배양하였습니다. 교배 후 적색 및 녹색 양성 샘플은 전체 집단의 8.89%를 차지했습니다.첫 번째 회수 분리 후 52.4%까지 농축되었으며, 이후 위상차 현미경으로 적색 양성 및 녹색 양성 세포의 유사한 표본 21개를 검토한 뒤 두 번째 순도 분리를 통해 추가로 농축하였습니다. 접합자의 수를 평가한 결과, 평균 순도는 90%였습니다. 오염물은 녹색 또는 적색 단배체, 혹은 접촉하고 있는 단배체 쌍이었습니다. 이는 초기 접합자 출아의 역학뿐만 아니라, 중앙, 측면 및 말단 접합자 출아 위치의 발생 빈도와 분포를 결정하기 위함이었습니다. 단배체들을 1.75시간 또는 2.5시간 동안 교배시킨 후 유세포 분석기로 분리하여 에피 형광 현미경으로 검토하였습니다.1.75시간 후에 세포를 수확했을 때, 50% 이상이 무아(unbuttered) 상태였으며 중앙(medial)에 위치했습니다. 2.5시간 후에는 측아(lateral buds)와 정아(terminal buds)가 동일한 비율로 나타났습니다. 그러나 무아, 중앙아, 측아, 정아의 네 가지 범주 각각에서 접합자의 수가 거의 동일하게 관찰되었습니다.정제 과정 동안 접합자의 구조는 변하지 않는 것으로 보입니다. GFP는 핵 내부로 들어가며, 핵이 융합되지 않은 상태에서도 핵에서 발견될 수 있음에 유의하십시오. ES는 형광을 띠지 않는 검은색 구체로 뚜렷하게 나타납니다.정제 과정의 최종 산물은 다양한 발달 단계의 다양한 개체군을 생성합니다. A로 표시된 접합자는 융합이 일어나지 않은 상태입니다. B 유형 접합자는 버터 처리가 되지 않은 상태입니다.C형은 작은 출아를 가지고 있고, D형은 더 큰 출아를 가지며, E형 접합자는 세포질 분열을 일으키기 직전의 상태입니다. 또한 초기 접합자의 상당수가 여전히 형광이 없는 중앙 분열선을 보이며, 벨러 유전 구조가 접합자에서 출아로 뻗어 나가는 것을 흔히 관찰할 수 있다는 점에 유의하십시오. 이 절차를 수행할 때 회복 분류와 그 뒤를 잇는 순도 분류를 모두 포함하는 것이 중요합니다. 최종 생성물의 접합자 순도를 높이는 데는 두 번째 분류 작업이 핵심적이라는 것을 확인하였습니다.이 영상을 시청한 후, 유세포 분석법을 통해 정제된 접합자를 생성하는 방법, 현미경 방법을 통해 순도를 평가하는 방법, 그리고 형광 디컨볼루션 현미경을 사용하여 접합자를 마운트하고 촬영하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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