Lipoaspirate에서 수확 지방 - 파생 Stromal 셀을 사용하여 임계 크기 Calvarial 결함 모델의 수리

이 실험 절차의 전반적인 목표는 생쥐의 체내 두개골 결손 모델을 사용하여 골분화를 목적으로 지방 조직에서 다분화능 기질 세포를 수확하는 것입니다. 이는 먼저 지방 흡입술 후 얻을 수 있는 지방 조직의 기질 혈관층에서 전구 세포를 분리함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 3차원 골격(backbone)을 준비한 후 해당 지지체(scaffold)에 세포를 파종하는 것입니다.

마지막 단계는 쥐 모델의 두개골에 임계 크기의 결손 부위를 생성하고, 그곳에 스캐폴드와 세포를 배치하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 지방 조직에서 분리한 다분화능 중간엽 줄기세포가 체내(in vivo)에서 골 재생 능력을 갖추고 있음을 보여줍니다. 이 기술은 골 재생에 사용할 수 있는 조직이 부족하기 때문에 광범위한 임상 적용 가능성을 가지고 있습니다.

자가골 이식술이 표준 치료법이지만, 공여 부위의 부족과 공여 부위의 합병증으로 인해 이 방법의 선택이 제한됩니다. 동종이식물이나 외래 물질을 사용할 수 있으나, 이는 비용 문제, 낮은 생체 통합성 및 잠재적인 감염 위험으로 인해 제한적입니다.

골격 조직 공학을 위한 전구 세포 분리를 위해 지방 조직을 활용할 수 있다는 점은 매우 흥미로운 연구 분야입니다. 실험 과정 시연은 저와 Long Anchor 연구실의 Michael Chung이 진행하겠습니다. 먼저, 선택적 지방 흡입술을 통해 인간의 피하 지방 조직을 확보합니다.

지방 흡입물 내의 두 층을 확인하십시오. 상층액에는 처리된 세포 물질의 대부분이 포함되어 있습니다. 하층은 주로 주입된 식염수입니다.

지방 유래 기질 세포는 두 층 모두에서 수확할 수 있지만, 상층액에서의 수율이 훨씬 더 높습니다. 기질 혈관 분획 또는 SVF를 분리하려면, 1x 인산완충생리식염수(PBS) 또는 2.5% Betadine이 포함된 1x PBS와 동일한 부피로 지방 흡입물을 충분히 세척한 후, Betadine이 없는 1x PBS와 동일한 부피로 다시 흡입하십시오. 세척물이 침전될 때까지 기다립니다.

처리된 인간 조직으로 인한 오염을 방지하기 위해 전 과정 동안 무균 기술을 반드시 유지하십시오. 다음으로, 각 세척 단계 후 하층액을 흡입하여 제거하십시오. 그런 다음 15 milliliters의 지방 조직을 50 milliliter Falcon 원심 분리 튜브에 넣으십시오. 이어서 15 milliliter의 필터링된 0.075% 필터링 용액으로 지방 조직을 소화시키십시오.

Hank's balance salt solution(HBSS)에 2형 콜라게나제(Type two collagenase)를 넣고 37 °C 워터배스에서 지속적으로 교반하며 60분 동안 반응시키며, 15분마다 튜브를 환기시켜 줍니다. 그 다음 10% 태아 송아지 혈청(FBS)이 함유된 15 mL PBS를 사용하여 효소 활성을 중화시킨 후 원심분리합니다. 고밀도의 SVF 펠렛을 얻으며, 이 펠렛은 지방 유래 줄기세포와 적혈구가 혼합된 상태가 됩니다.

먼저 상층부의 지방층을 제거한 다음, 펠릿이 흐트러지지 않게 주의하며 상층액을 제거합니다. 펠릿을 10 milliliters의 일반 배양 배지에 다시 현탁합니다. 그 후 100 micron 필터를 통해 세 개의 튜브 내용을 하나의 깨끗한 50 milliliter 원심분리관에 합치고 원심분리합니다.

펠릿이 손상되지 않도록 상층액을 제거한 후, 펠릿을 재현탁합니다. 10 cm 플레이트 한 장당 50 mL 원뿔형 튜브 2개에, 또는 15 cm 플레이트 한 장당 5 mL 원뿔형 튜브 5개에 일반 배양액 5 mL를 각각 넣습니다. 37 °C, 21% oxygen 및 5% carbon dioxide 조건에서 밤새도록 1차 배양을 수행합니다.

하룻밤 동안 배양한 후, 플레이트를 PBS로 세척하여 부착되지 않고 남아 있는 적혈구를 제거합니다. 이렇게 얻은 세포군은 지방 유래 줄기세포입니다. 자발적인 분화를 방지하기 위해 세포를 하부 합류(sub confluent) 수준으로 유지하십시오.

37°C, 21% 산소 및 5% 이산화탄소 조건에서 배양합니다. 성장 배지에서 세포는 일반적으로 3~4일마다 정기적으로 계대 배양해야 합니다. 세포 밀도가 50% confluence에 도달했을 때, 함께 제공된 원고에 설명된 대로 스캐폴드를 준비합니다.

세포가 sub confluence 수준에 도달하면, PBS로 세포를 두 번 세척하고 trypsin을 처리합니다. 세포 수를 측정하여 정량화하십시오. 파종을 위해, 미리 절단된 지름 4mm의 스캐폴드에 1.5 × 10⁵개의 세포를 파종할 준비를 합니다.

96-웰 플레이트의 한 웰에 개별 스캐폴드를 넣은 다음, 배지 20 µL당 약 1.5 × 10⁵ cells의 농도로 일반 성장 배지에 세포를 재현탁합니다. 20 µL의 용액을 스캐폴드에 직접 피펫팅하여 세포를 파종하고, 이를 세포 배양 인큐베이터에 30분 동안 둡니다.

30분 후, 200 µL의 배지를 추가하고 세포를 스캐폴드 위에서 하룻밤 동안 배양합니다. 수술 전에는 세포 배양 시와 같이 세포의 스캐폴드 부착 여부를 반드시 확인할 필요는 없습니다. 충분한 수의 세포를 접종하면 대부분의 세포가 스캐폴드에 부착될 것입니다.

60일 된 성체 CD-1 nude 마우스에 마취를 시행한 후, 베타딘과 알코올로 수술 부위를 3회 소독하고 마우스의 눈 위에 윤활제를 도포합니다. 그다음 마우스 두피의 정중선 방향으로 시상 절개술을 시행하여 우측 두정골을 노출시킵니다. 둔탁한 긁어내기(blunt scraping) 방식으로 우측 두정골에서 골막을 제거합니다.

다음으로, 오른쪽의 봉합선과 관련 없는 두정골에 4 mm 크기의 일측성 전층 결손을 만듭니다. 다이아몬드 코팅 틴 드릴 비트를 사용하되, 이식 전 생쥐 두개골의 두께가 0.3 mm 미만이므로 하층의 경막이 손상되지 않도록 각별히 주의하십시오. 배지 유래 성장 인자의 전이를 방지하기 위해 스캐폴드를 멸균 PBS로 헹굽니다.

결손 부위에 스캐폴드를 배치합니다. 마지막으로 피부를 봉합하고 확립된 수술 후 프로토콜에 따라 동물을 모니터링합니다. 마우스에 대해 micro CT를 수행하고 microview 소프트웨어를 사용하여 3D 재구성 이미지를 얻습니다.

Adobe Photoshop을 사용하여 이미지의 높이를 표준 크기로 조정합니다. 일반적으로 두 주 간격으로 두개골 재생 정도를 측정합니다. 장기 추적 관찰을 위한 스캔 과정에서 마우스는 마취되며, 최종적으로 안락사시킵니다.

조직학적 분석을 위해, 매직 완드(magic wand) 기능을 사용하여 두개골 결손 부위의 픽셀을 측정하십시오. 이후 CT 스캔을 통해 결손 부위의 치유 백분율을 결정하십시오. 두개골 결손 영역을 측정하여 픽셀 수를 구한 뒤 이를 원래 결손 부위의 픽셀 수로 나누고, 골 형성을 나타내기 위해 아닐린 블루(aniline blue) 및 펜아로(pen aro)와 같은 조직학적 염색약을 사용하여 결손 범위 전체를 따라 여러 절편을 염색하십시오.

Adobe Photoshop을 사용하여 두개골 결손 부위가 아닌 모든 영역을 잘라내고, 자동 선택 도구(magic wand)를 사용하여 결손 부위 내의 신생골 형성 픽셀 수를 측정하며, 이를 대조군 또는 다른 변수와 비교하십시오. 여기는 지방 유래 줄기세포의 분리부터 증식, 분화, 그리고 in vitro 및 in vivo 활용까지 지방 흡입물의 채취 및 적용에 대한 개요입니다. 아래쪽 행에는 하이드록시아파타이트 지지체를 통해 ASC를 적용하여 임계 크기의 두개골 결손이 in vivo에서 치유된 모습을 보여주는 micro CT 영상이 있습니다.

상단 행에 표시된 대조군은 스캐폴드와 결손이 모두 없는 군을 포함합니다. 중간 행은 세포 없이 스캐폴드만 배치한 결손 모델을 보여줍니다. 여기에 표시된 LS는 micro CT를 통한 골 치유의 정량적 분석 결과이며, A SC 군에서 치유가 유의미하게 증가했음을 보여줍니다.

이것은 andal을 통해 A SC 그룹의 골 형성 증가를 보여주는 조직학적 이미지입니다. 파란색은 al에 대한 AROM 염색을 나타냅니다. 파란색에서, osteoid는 pen arom에 대해 진한 파란색으로 염색됩니다.

여기에 표시된 노란색으로 염색된 osteoid는 GFP로 표지하여 스캐폴드에 파종한 후 2주 차에 희생시킨 인간 ASCs입니다. 결손 부위의 재생에 기여하는 인간 세포를 보여주기 위해 GFP 표지 항체로 염색을 수행하였습니다. 여기에는 2주 차 결손 부위 내 인간 세포의 우세함을 보여주는 인간 핵 항원 면역화학 염색 결과가 나타나 있습니다.

숙달되면 지방 조직 처리는 4시간 이내에 완료할 수 있으며, 수술 절차는 마우스 한 마리당 약 10분이 소요됩니다. 두정골은 둥근 반면 드릴은 평평하므로, 4mm 결손 부위의 전체 둘레를 모두 뚫어내도록 주의해야 한다는 점을 기억하십시오. 뇌의 경막이 손상되지 않도록 천천히 진행하십시오.

이 영상을 시청한 후에는 지방 조직에서 전구 세포를 분리하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 세포들을 지지체에 파종하고 마우스에 이식하십시오.