Name: 에서 신경 Explant의 문화 Xenopus laevis (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 배우세요 Xenopus laevis 신경 explant 배양법을 통해 성장 원추 세포골격 역학을 형광 현미경으로 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 신경 발달 메커니즘 연구에 필수적인 고해상도 이미징을 가능하게 합니다.

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저자는 개구리 시설의 사용에 대한 교육과 Kirschner 연구실에 밥 프리먼을 감사하고, 지원 밴 Vactor 연구실의 구성원 것이다. 우리는 그림 1의 이미지에 빛을 현미경으로 도움이 하버드 의과 대학에서 니콘 이미징 센터를 감사합니다. 이 작품은 다음에 의해 추진하는 사업 : NRSA NIH 교제와 랄에 NIH K99 교제, 기초 과학 협력 기금 ( <a href="https://bsp.med.harvard.edu/" target="_blank">https://bsp.med.harvard.edu/</a> AEF에), 그리고 NIH RO1 NS035909을 DVV에

참고 : 자세한 정보와 함께 우수한 프로토콜이 그 초점을 더 구체적으로 다음 단계에서 (예 : 8-12) 다른 곳에서 출판 된대로 우리 만 간단한에서 처음 두 절에 나와있는 단계를 설명합니다. 또한, 라이브 세포 배양에 Xenopus 척추 뉴런 작업의 일반적인 프로토콜은 이전에 자세한 방법 제 8 조에서 출판되었습니다. 여기에 우리가 성공적으로 수행하고 3 단계에서 신경 튜브 해부 및 도금 프로토콜 문제를 해결하기에 충분한 정보를 제공 하긴하지만 우리는 매우,이 동영상에 대한 보완으로 그 문서를 검토하는 것이 좋습니다. Xenopus 계란 1.에서 체외 수정 <ol><li> 계란 수집하기 전에 chorionic 생식샘 자극 호르몬 (400 단위 / 개구리) 12-18 시간으로 주입 된 여성 개구리의 알을 얻습니다. 1X 마크의 수정 벨소리 솔루션 (MMR) (0.1 M NaCl, 2.0 MM KCl, 1.0 MM MgSO 4, 2.0 MM CaCl 2 알을 수집, 5.0 밀리미터 HEPES, pH를 7.4 9). </li><li> 이전 9 설명한 바와 같이, 다진 고환과 체외에 계란을 비옥. </li><li> 적어도 20 분 후, 3-5 분 동안 1X MMR의 2 % 시스테인 (NaOH로 pH를 7.8로 이동)에 배아를 잠복기에 의해 배아 젤리 코트를 제거합니다. 3 : 0.1X MMR (88 MM NaCl, 1 MM KCl, 0.7 MM CaCl 2, 1 MM MgSO 4, 2.5 MM NaHCO 3, 5 MM HEPES, pH를 7.8) 또는 0.1X MBS (수정 바스의 식염, 1X 조리법)로 씻어 원하는 경우 상온에서 -5 시간, 유지 배아 주사 할 때까지, 또는 14-18의 장소 배아는 ° C 개발을 느리게합니다. </li></ol> 2. RNA의 Microinjection 참고 : 우리가 여기에 RNA 분사를 사용하는 동안, 이러한 기술은 RNA에 국한되지이며, DNA, 단백질, 또는 유전자 조작에 대한 수정 핵산도 사용 할 수 있으며, 이전에 12 설명되어 있습니다. <ol><li> cytoskeletal 또는 기타 구조물에게 AR을 라벨에 대한 실험 RNAs 이전e는 mMessage mMachine 키트 (Ambion)를 사용하여 선형화 된 DNA 템플릿에서 베꼈. mRNAs는 번역을 촉진하고 태아의 저하를 방지하기 위해 5 &#39;캡과 3&#39;polyadenylation 꼬리를 필요로합니다. pCS2 +이 목적을 위해 일반적으로 사용되는 벡터이며, 전사 키트 합성 반응 중에 캡 아날로그이 포함되어 있습니다. 우리는 nuclease 무료 ddH 2 0에서 베꼈 mRNA를 다시 중지 500 2000 사이의 재고 농도에서 μl / NG, -80 ° C. 프롬프트 저장 한 다음 전에 주사에, 분사에 대한 적절한 농도로 ddH 2 0에서 RNA를 희석. 만 작은 볼륨 배아에 주입되므로, 버퍼에 resuspending하는 것은 필요하지 않습니다. 우리의 마지막 주입 농도는 구조에 따라, 일반적으로 50-200 PG / NL이며, 많은 실험실은 전통적으로 총 볼륨의 약 1 %에 10 NL, 최대 주입하지만 우리는 일반적으로 배아 당 4 NL까지 주입합니다 배아. RNA는 다량의 유독되고, 배아 장군 당 복용 할 수 있습니다최대 5 NG로는 특정 유전자와 순도에 따라 용납 할 수 있지만 베드로, 10 PG에서 1 NG 범위. 그러나, 이미징 단백질 현지화에 대해 가장 낮은 수준 이상의 표현의 유물을 피하기 위해 주입해야합니다. 이 프로토콜의 EB1-GFP를위한 RNA는 배아 당 250 PG의 최종 금액으로 사용됩니다. </li><li> ~ 0.2 μm의 팁 직경, 바늘 풀러 9 모세 혈관을 당겨 주입 바늘을 준비합니다. 열 644, 어서 125, 속도 70, 시간 250,하지만 이러한 매개 변수가 시스템에 따라 달라질 및 필라멘트 (현재 2.5 mm를 사용하여 변경 한 후 다시 조정해야합니다 : 셔터 P-87 풀러으로, 우리는 다음과 같은 설정을 사용 폭 2.5 mm)입니다 사각형 상자 필라멘트. 현미경에서 퀼 같은 모양을 생성하기 위해 각도로 집게로 바늘 끝을 부러. 가 주입 바늘 (예 : 11,12)을 깨고 작성을위한 다른 방법도 있지만, 우리는 작은 드롭 (0.5-1 μl)를 배치하여 RNA로 바늘을 작성의 뒤쪽 끝으로바늘. 태아에 microinjecting를 들어, 피코-주입기 (의료 시스템)되는 가장 일반적인 상업적으로 이용 가능한 분사 장치의 수, 두, 그리고 Nanoject (Drummond 과학)는 (자세한 내용은 11 참조)가 있습니다. 우리는 일관 nanoliter 볼륨을 제공하기 위해 시간을 디지털로 설정 한 기간 동안 압축 가스를 사용하는 의료 장비 PLI-100 피코 주사기를 사용합니다. 사출 볼륨은 스테이지 마이크로 미터를 사용하여 각각의 새로운 micropipette에 대해 보정하여야하며, 주입 시간은 주입 RNA의 원하는 금액을 달성하기 위해 조정해야합니다. </li><li> 장소는 1에서 수정 된 배아를 - 4 - 세포 단계에 0.1X MMR의 5 % Ficoll을 포함하는 플라스틱 그릇에. 포셉과 장소에 배아를 개최하거나 개최 플랫폼 (plasticine 또는 치과 왁스 함께 그릇의 바닥을 준수 ~ 1mm 눈금이있는 플라스틱 메쉬,)에 넣어, (단계 2.1 참조 동물 blastomeres에 원하는 볼륨을 주입 ) 사출 볼륨에 대한 자세한 내용은. 몇 LOC에 배포배아 전역 ations은 동물 blastomeres의 각에 적어도 하나의 분사는 (예를 들어, 4 셀 단계의 배아를 위해, 우리는 일반적으로 2 셀 단계에 반면, 각각의 blastomere에 1-2 번 주사 더 균일 한 분포를 구하는 방법 배아, 우리는)​​ 각 blastomere에 2-4 번 주입. 2-4 세포 단계까지 대기의 이점은 배아가 정상적으로 분열을 시작하기 때문입니다. 시간이 관건입니다 경우, 당신은 주입 할 필요가 더 많은 배아가 아닌 최종 결과에서 거의 차이가있는 1-세포 단계에서 시작할 수 있습니다. 이전 단계의 배아가 함께 사용 및 특정 세포 유형 주사를 대상으로하지만, 우리가 일반적으로 더 폭 넓은 표현을 선호으로, 우리는 더 많은 주사의 필요성을 줄이기 위해 젊은 배아에 주입하는 경우이 특히 유용합니다 수 있습니다. </li><li> 0.1X MMR을 포함하는 플라스틱 접시에 주입 배아를 전송하고 무대 20-23 13까지 개발 할 수 있습니다. 14 22 배아를 배양 ° C 원하는 SPE에 따라개발 거구나. (~ 14 ° C.를 사용 후 다음 날 신경 튜브를 해부를 들어, 하루를 ~ 22 ° C. 사용) </li></ol> 3. 신경 튜브 해부 및 도금 <ol><li> 이전 dissections을 수행하려면, 문화 요리 14 준비합니다. 첫째, Mattek 또는 랩 - 테크 문화 요리 중의 coverslip의 표면, 이상 수영장, 1 시간 (또는에 품다 200 μg / PBS에 ML 폴리 라이신의 충분한 솔루션을 코팅 coverslips는, 하나는 앉아 유리 coverslips를 사용할 수 이미징 및 immunocytochemistry 유리 슬라이드에 나중에 게재 위치에 대한 페트리 접시)의 나사가 빠진 것. 기음과 PBS 3 회의 초과로 씻어, 건조 보자. 그런 다음 10 μg / PBS에 ML laminin과 코트 요리 37도에서 한 시간 동안 (우리는 일반적으로 충분한 표면 위로 수영장을 coverslip 당 500 μl를 사용). laminin 솔루션을 기음과 PBS의 초과로 3 회 씻어, laminin 코팅 표면은 무선 인터페이스에 노출 될 수 있도록하지 않도록주의 것. Replac문화 미디어 전자 PBS (50 % 벨소리의, 49% L-15 미디어, 1 % 태아 소 혈청, 플러스 50 μg / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신과 gentamycin, 산도 7.4 및 필터는 소독). (벨소리의 미디어, 115 MM NaCl, 2.5 MM KCl, 2 MM CaCl 2, 10 밀리미터 Hepes의 산도 7.4, 0.5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). 우리의 프로토콜이 미디어를 사용하지만, 그것은이 뉴런이 에너지 보유 감소 나이가 Xenopus 망막 신경절 문화에 대한 일반적인 풍부한 미디어, 것에주의해야한다. 청소년 척추의 문화는 생존 및 추가 성장 요인없이 순수 Ringers의 미디어 이상의 24 시간을위한 성장,이 참이 시스템을 사용의 장점 중 하나입니다 것입니다. 선택 사항 : 추가 NT3와 BDNF 축삭의 가지를 높이기 위해 문화 미디어 (25 μl / NG 각각의 최종 농도까지). </li><li> 때문에 주입 mRNA의 표현의 다양성 때문에, 배아는 형광의 모자이크가 발생할 수 있습니다. 이전 EXP 그 배아를 식별하는 dissections, 형광의 존재에 대한 화면 배아를 수행하기신경 튜브의 형광 융합 단백질을 ress. Steinberg의 미디어 (58 MM NaCl, 0.67 MM KCl, 0.44 MM 칼슘 (NO 3) 2, 1.3 MM MgSO 4, 4.6 MM 트리스 후 7.8로 산도로 가득 아가로 오스 코팅 플라스틱 그릇에 무대 20-23에서 형광 배아를 배치 autoclaved) 5. 아가로 오스 코팅 요리, 0.1X MMR 그리고이 굳어에 녹인 1% 아가로 오스와 플라스틱 접시의 코트 바닥을 확인합니다. 손상은 이후의 분해 단계에서 사용되는 고급 집게와 텅스텐 바늘로 발생하지 않습니다 그래서이 부드러운 표면을 제공합니다. 단계 23 이후 배아의 해부가 가능하지만, 조직은 서로 밀접하게 준수하기 때문에 collagenase로 더 이상 치료를 필요로 더 도전합니다. </li><li> 박리 범위에서 고급 집게로 vitelline 멤브레인을 제거하고 절개 일련의하여, 배아의 전체 등쪽 부분을 분리. 한 포셉이 곳에서 배를 누른 상태 동안의 절개를 만들기 위해 두 번째를 사용하여중공 내부를 노출 할 수있는 배아의 측면. 그런 다음이를 신경 튜브를 포함하는 등쪽 부분을 분리 할 수​​ 반으로 배아를 절단, 배의 등쪽과 복부 반쪽 사이의 조직을 함께 공략하기 위해 두 집게를 사용합니다. </li><li> 조직을 느슨하게 할 수있는 회선 근에 15-20 분,하고 신선한 Steinberg의 솔루션과 플라스틱 아가로 오스 - 코팅 접시에 피펫 등의 explant에 대한 Steinberg의 미디어에 2 밀리그램 / ML collagenase있는 Eppendorf 튜브에 등쪽 explant를 놓습니다. 또는 explant은 전체 절개가 이후 수행 할 수 15 분에 대한 collagenase 솔루션을 포함하는 페트리 접시에 배치 할 수 있습니다. </li><li> 포셉 한 쌍의를 사용하여 부드럽게 등쪽 표피와 복부 notochord에서 신경 튜브를 해부. 표피와 기본 조직 사이의 집게의 끝을 밀어 천천히 신경 튜브 아래를 공개, 표피를 잡아. 그런 다음 사이에 팁을 슬라이드에 조직을 개최 한 집게를 사용하여 다른신경 튜브 및 notochord. 마지막으로, 관의 양쪽에 somites을 제거 포셉을 사용합니다. </li><li> 단계 3.1에서 설명한 바와 같이, 문화, 미디어로 가득한 아가로 오스 - 코팅 접시에 신경 튜브를 전송합니다. </li><li> 여러 신경 튜브의 수집 후, 밖으로 확산, 중간 (단계 3.1에서 작성)로 가득 한 후 날카롭게 텅스텐 바늘이나 포셉, 그리고 플레이트 문화 요리의 조각을 사용하여 수많은 조각 (약 20 전체 튜브가 분리되어있는 경우)으로 잘라 균등 행의 explants. </li><li> 이 연결 셀을 방해하기 때문에 도금 후, 요리를 이동하지 않습니다. 20-22 주위 도금 신경 튜브 explants를 품다 ° C. 우리는 일반적으로 하룻밤 실온에서 벤치에 세포의 요리를 두십시오. Xenopus laevis 뉴런의 장점 중 하나는 CO 2 수준 또는 온도를 조절 세포 배양을위한 특별 보육이 필요하지 않습니다 것입니다. Neurites과 성장 콘은 실온 12 준수하고 이미징 할 수 있습니다도금 후 -24 시간, 가지가 성장 요인의 추가로 가속 할 수는 있습니다. 일반적으로, RNA 또는 플라스미드 제품의 표정은 세포 사이의 변수 표현 될 것이고, 따라서 성장 콘 사이의 형광 표현 수준의 범위가있을 수 있습니다. 이 특정 구조에 따라 달라집니다 있지만 우리는 도금 후 48 시간 이상 지속하는 형광 단백질의 RNA 발현을 관찰했습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 그림 1A에 요약되어있는 프로토콜을 따라하면 건강 올바르게 - 해부 및 배양 신경 explants는 laminin / 그림 1b에 도시 된 바와 같이 폴리 라이신 기판에 모든 방향으로 다수의 axons 또는 neurites을 보내드립니다. axons의 끝을 성장 콘은 이오를 검사하기 위해 이미지 전체 운동성 역학에 그림 1C에서 볼 DIC 광학, 또는 고해상도 형광 현미경에 의해 이미징 할 수 있습니다휘황 태그 cytoskeletal 단백질의 calization 예를 들어, EB1-GFP는 그림 1D에 표시됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4232/4232fig1.jpg" /> 그림 1. 실험 프로토콜과 예상 결과의 요약. A) 프로토콜 흐름 차트입니다. 일 3 절개에 대한 자세한 내용은 동영상을 참조하십시오. 전체 신경 튜브는 약 20 동일 크기의 조각으로 잘라 coverslip에 행에 고르게 분산되어야한다. 이 만화에서, 가위는 훌륭한 포셉으로 조직을 절단 대표 그려져있다. CG chorionic 생식샘 자극 호르몬 B) explant (왼쪽 상단 모서리에있는 explant)에서 성장 axons 또는 neurites의 DIC 이미지입니다. 성장 축삭의 끝에서 성장 콘의 C) 높은 배율 이미지입니다. 성장 콘에서 EB1-GFP의 D) 형​​광 현미경 이미지입니다. 스케일 바는 10 μm이 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4232/4232fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

조건이 적절한 경우 Xenopus laevis 신경 explants는 laminin / 폴리 라이신 기판에 도금 후 24 시간으로 매우 강력한 방식으로 neurites을 보낼 수 있습니다. 일반적으로 길이가 100 μm 이상 있지만,이 기판과, 성장 콘은 높은 운동성하고 explant에서 바깥쪽으로 모든 방향으로 연장, 1 mm까지의 축삭의 길이를 얻을 수 있습니다. neurites 알아 성장하지 않으면 경우가이 이유 제한된 수의가 있습니다. 하나의 가능성은 신경 explants가 제대로 음식을 준수하지 않은 것입니다. 실수로 도금 한 후 요리를 이동하여 첨부 파일에 방해가되지해야합니다. 또한, laminin 및 폴리 라이신 - 코팅 요리는 모든 신선하게 조리 된 시약 제대로 만든 있는지 확인하십시오. 가지의 부족에 대한 또 다른 가능성은 세포 배양 미디어 조건이 최적이 아닐 수 있습니다. 모든 미디어 솔루션이 제대로 책정되었는지 확인하기 위해 프로토콜과 계산을 다시 확인. 마지막으로, 가능입니다배아는 신경 튜...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Chorionic 생식샘 자극 호르몬 </td><td> 은의 화학 연구소 </td><td> C-HCG-ON-10 </td></tr><tr><td> 시스테인 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 52-90-4 </td></tr><tr><td> mMessage mMachine 키트 </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td></tr><tr><td> Borosil의 바늘에게 1.2 mm를 모세관 (OD) × 0.9 mm (ID) </td><td> FHC </td><td> 30-31-0 </td></tr><tr><td> Ficoll </td><td> 시그마 </td><td> F2637 </td></tr><tr><td> 뒤몽 # 5 Biologie Inox 집게 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 9001-12-1 </td></tr><tr><td> Mattek 요리 </td><td> 매트 테크 주식회사 </td><td> P35G - 1.5-14-C </td></tr><tr><td> L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 21083-027 </td></tr><tr><td> 폴리-L-라이시NE </td><td> 시그마 </td><td> P-1399 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> 시그마 </td><td> L2020 </td></tr><tr><td> NT3 </td><td> 시그마 </td><td> N1905 </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> 시그마 </td><td> B3795 </td></tr></tbody></table>

에서 신경 explant의 문화<em&gt; xenopus laevis</em

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

축삭지도의 복잡한 과정은 크게 성장 축삭의 끝에서 동적 운동성 구조입니다 성장 콘에 의해 구동된다. 축삭의 가지 동안 성장 콘 앞으로의 성장 콘을 추진하고 정확하게 특정 목표 1을 (를) 찾을 수로 이동하기 위해 자사의 세포 골격을 조절하는 가이드 큐 정보를 여러 소스를 통합해야합니다. 이 통합은 cytoskeletal 수준에서 발생하는 방법을 계속 대두되고, cytoskeletal 단백질과 성장 콘에서 이펙터 역학 시험이 메커니즘의 해설을 할 수 있습니다. Xenopus laevis 성장 콘이됩니다 (직경 10-30 미크론) 충분히 큰 높은 수행 할 수 해상도 cytoskeletal 역학의 라이브 영상 (예 2-4)과는 다른 vertebrates에 비해 실험실 환경에서 분리하고 조작하기 쉽습니다. 개구리 성장 원뿔 마이크에 발달 신경 생물학 연구, 중요한 초기 분석을위한 고전 모델 시스템입니다rotubule 역학은 처음이 시스템은 5-7를 사용 발견되었습니다. 이 방법 8, 계란 수집하고 체외에서 수정 된, 유전자 발현을 조작하는 RNA 인코딩 휘황 태그 cytoskeletal 융합 단백질 또는 다른 구조로 주입 한 다음, 신경 튜브 단계로 발전 할 수있었습니다. 신경 튜브는 절개로 분리 한 후 배양하고 있으며, outgrowing neurites의 성장 콘은 이미징 있습니다. 이 문서에서는, 우리는이 방법 이후의 고해상도 이미지 분석을위한 문화 Xenopus laevis의 성장 콘에게있는 목표를 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 우리가 + TIP 융합 단백질 EB1-GFP의 예를 제공하지만,이 방법은 성장 콘 이내에 행동을 명료하게하다하는 단백질의 수에 적용 할 수 있습니다.

해부에서 배양 신경 explants<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 형광 융합 단백질을 표현하는 배아는 성장 콘 cytoskeletal 역학의 이미지 할 수 있습니다.

에서 신경 Explant의 문화<em&gt; Xenopus laevis</em

축삭 유도의 복잡한 과정은 주로 성장하는 축삭의 끝단에 위치한 동적인 운동 구조체인 성장 원추(growth cone)에 의해 주도됩니다. ... 동안

이 절차의 목적은 후속 고해상도 이미지 분석을 위해 Xenopus Lavis 성장 원추를 배양하는 것입니다. 이는 먼저 암컷 개구리에 호르몬을 주입하여 난자 생성을 촉진함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 난자를 수집하고 수정시킨 후, mRNA 또는 관심 있는 다른 컨스트럭트를 주입하는 것입니다.다음 날, 배아를 해부하여 신경관을 분리하고, 이를 절단하여 커버슬립 위에 도말합니다. 마지막 단계는 성장하는 축삭과 성장 원추를 이미징하는 것입니다. 최종적으로, 고해상도 형광 현미경을 사용하여 시간에 따른 성장 원추 내 단백질 국소화의 변화를 관찰할 수 있습니다.신경관 해부는 기법을 직접 관찰하지 않고 방법론 섹션만 읽어서는 배우기 어려울 수 있으므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 12~14시간 전에 400 units의 chorionic gonadotropin을 주입한 암컷 개구리로부터 알을 얻습니다. 알을 1X modified ringer solution에 수집합니다.그 다음, 이전에 설명한 대로 수집된 X를 mince testes를 사용하여 체외 수정시키고, 최소 20분 후에 0.1 XMMR을 첨가합니다. 배지를 제거하고 배아를 pH 7.8의 2% cysteine이 포함된 one XMMR에서 3~5분 동안 배양하여 배아의 젤리 코트를 제거합니다. 그런 다음 배아를 비커에 붓습니다.다음으로, 마지막 세척 후 배아를 0.1 XMMR 또는 0.1 x modified bath saline으로 3~5회 세척합니다. 주입 전까지 또는 원하는 시점까지 배아를 실온의 0.1 XMMR에 보관하십시오. 주입 전 발달 속도를 늦추려면 배아를 14~18 °C에 두십시오.이전에 준비한 캡핑된 RNA를 2회 증류수로 희석하여 최종 농도가 50에서 200 pg/mL가 되도록 한 후, 미세 주입 시까지 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 서터 풀러(sutter puller) 또는 유사한 장비를 사용하여 붕규산 유리 모세관을 당겨 주입용 바늘을 준비합니다. 그런 다음 현미경 하에서 핀셋을 사용하여 바늘 끝을 비스듬하게 부러뜨려 깃펜 모양으로 만든 후, 희석된 RNA 용액 0.5에서 1 µL를 바늘에 다시 채웁니다.마이크로 조작기에 바늘을 장착합니다. 여기서는 medical system의 PLI 100 PICO injector가 사용되었습니다. 이제 0.1 XMMR에 5%fol이 포함된 플라스틱 디시에 1~4세포 단계의 수정란을 놓습니다. 새로운 마이크로 피펫을 사용할 때마다 척도계 또는 스테이지 마이크로미터를 사용하여 주입량을 교정합니다.그 다음, 각 주입 시 원하는 양의 RNA가 투여되도록 피코 인젝터를 설정하십시오. 여기서는 1 nanoliter의 주입 부피가 사용되었습니다. 핀셋으로 배아를 잡거나, 선호하는 경우 홀딩 플랫폼 위에 놓은 후 동물극(animal blasters)에 원하는 부피를 주입하십시오.RNA가 균일하게 분포되도록 배아 전체의 여러 위치에 주입합니다. 4세포기 배아의 경우 각 할구에 1~2회 주입하며, 2세포기 배아의 경우에는 2~4회 주입합니다. 주입 후, 주입된 배아를 0.1 XMMR이 담긴 플라스틱 디쉬로 옮겨 20~23단계까지 발달하도록 둡니다.원하는 발달 속도에 따라 배아를 14~22 °C 온도에서 배양하고, PLL 처리된 배양 접시를 10 µg/mL의 PBS 내 라미닌으로 코팅한 후 37 °C에서 1시간 동안 둡니다. 배양 시간이 경과하면 접시를 PBS로 3회 세척하며, 마지막 세척 후에는 라미닌이 코팅된 표면이 공기에 노출되지 않도록 주의하십시오. PBS를 배양 배지로 교체합니다.마지막으로, 배양 접시 바닥에 0.1 XMMR에 희석한 1% agarose를 코팅하고 굳혀서 agarose 코팅 접시 3개를 준비합니다. 코팅이 굳으면 접시 하나에 steinberg's media를 채웁니다. 주입된 mRNA의 발현 가변성으로 인해 박리 전 배아에 형광 모자이크 현상이 나타날 수 있습니다. 배아의 형광 존재 여부를 스크리닝하여 신경관에서 형광 융합 단백질이 발현되는 배아를 식별합니다.그 다음, 20단계에서 23단계 사이의 형광 배아를 Steinberg's Media가 들어 있는 agros 코팅 플라스틱 접시에 옮깁니다. 접시를 해부 현미경 아래에 두고 미세 핀셋을 사용하여 난막을 제거합니다. 이어서, 한쪽 핀셋으로 배아를 고정한 상태에서 다른 쪽 핀셋으로 배아의 측면을 절개하여 내부의 빈 공간을 노출시킵니다.다음으로, 두 개의 핀셋을 사용하여 배아의 등쪽 절반과 배쪽 절반 사이의 조직을 집어 배아를 반으로 자르고, 신경관이 포함된 등쪽 부분을 분리합니다. 분리된 등쪽 조직편을 Steinberg 용액 내 2 mg/mL collagenase가 포함된 마이크로 원심분리 튜브에 넣고, 회전 혼합기에 15~20분 동안 둡니다. 그 후, 등쪽 조직편을 신선한 Steinberg 용액이 채워진 agar 코팅 접시로 옮깁니다.현미경 하에서 핀셋 끝을 표피와 하부 조직 사이에 밀어 넣고 표피를 천천히 뒤로 당겨, 등쪽 표피와 복측 Noor로부터 신경관을 박리합니다. 그다음 핀셋 하나로 조직을 고정하고 다른 핀셋으로 신경관 주변 조직을 제거합니다. 이어서 박리된 신경관을 신선한 배양액이 채워진 agros 코팅 디쉬로 옮깁니다.여러 개의 신경관을 수집한 후, 텅스텐 바늘이나 포셉을 날카롭게 하여 각 신경관을 약 20 조각으로 자릅니다. 그다음, 라미닌이 코팅된 배양 접시에 조각들을 분주하고, 절편들을 행 방향으로 고르게 펼쳐줍니다. 신경관을 분주한 후에는 세포의 부착이 방해될 수 있으므로 접시를 이동시켜서는 안 됩니다.플레이팅된 신경관 절편을 20~22°C에서 배양하십시오. *Xenopus laevis* 뉴런의 경우, 플레이팅 12~24시간 후에는 세포 배양 인큐베이터 없이 실온에서 뉴런과 성장 원추를 배양할 수 있습니다. RNA의 발현 정도가 다양하여 성장 원추 간의 형광 강도에 차이가 있을 수 있음을 유의하십시오.이 DIC 이미지는 시야의 왼쪽 상단 모서리에 있는 X explan에서 자라나오는 축삭과 신경돌기를 보여줍니다. 이 이미지와 이어지는 이미지들의 스케일 바는 10 microns를 나타냅니다. 이 고배율 영상은 성장 중인 축삭 끝부분의 성장 원추를 보여줍니다.마지막으로, 이 형광 현미경 영상은 성장 원추에서의 EB1 GFP 발현을 보여줍니다. 여기서는 플러스 말단 융합 단백질인 EB1 GFP의 이미징 사례를 제시하였으나, 이 신경 절편 배양법은 신경돌기 성장 과정 중 성장 원추 내에서 다양한 단백질들의 거동을 규명하기 위해 어떤 단백질에도 적용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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두개골 Mesenchyme의 셀룰러 행동을 평가하기위한 Explant 분석

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