에서 신경 Explant의 문화 Xenopus laevis

해부에서 배양 신경 explants

이 절차의 목적은 후속 고해상도 이미지 분석을 위해 Xenopus Lavis 성장 원뿔을 배양하는 것입니다. 이것은 먼저 암컷 개구리에게 호르몬을 주입하여 알 생산을 자극함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 난자를 채취하여 수정한 다음 mRNA 또는 기타 관심 구조를 주입

다음 날, 배아를 해부하고 신경관을 분리하고 절단하여 커버 슬립에 도금합니다. 마지막 단계는 자라는 축삭돌기와 성장원뿔을 이미지화하는 것입니다. 궁극적으로, 고해상도 형광 현미경 검사는 시간 경과에 따른 성장 원뿔의 단백질 국소화 변화를 보여주는 데 사용할 수 있습니다.

신경관 절제술은 기술을 직접 관찰하지 않고 방법 섹션을 읽는 것만으로는 배우기 어려울 수 있으므로 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이전에 융모막 성선 자극 호르몬 400 단위를 주입 한 암컷 개구리의 난자를 12-14 시간 전에 얻습니다. 계란을 하나의 X 표시 변형 링거 용액에 모읍니다.

그런 다음 수집된 X를 앞서 설명한 대로 다진 고환으로 시험관내에서 수정하고, 최소 20분 후에 0.1 XMMR을 첨가합니다. 배지를 제거하고 배아 젤리 코트를 제거하기 위해 3-5 분 동안 pH 7.8에서 하나의 XMMR에 2 % 시스테인으로 배아를 배양하십시오. 그런 다음 배아를 비커에 붓습니다.

다음으로, 최종 세척 후 0.1 XMMR 또는 0.1 x 변형 목욕 식염수로 배아를 3-5회 세척합니다. 주입 때까지 또는 원하는 경우 배아를 실온에서 0.1 XMMR로 유지하십시오. 주입 전에 발달을 늦추기 위해 배아를 섭씨 14도에서 18도에 놓습니다.

이전에 준비한 캡을 씌운 RNA를 이중 증류수로 50-200 피코그램 바나나 리터의 최종 농도로 희석한 다음 마이크로 주입할 때까지 얼음에 보관합니다. 다음으로, suter puller 또는 이와 유사한 기구를 사용하여 붕규산염 모세관을 당겨 주사 바늘을 준비합니다. 그런 다음 현미경으로 집게를 사용하여 바늘 끝을 비스듬히 부러뜨려 깃털과 같은 모양을 만들고 0.5-1마이크로리터의 희석된 RNA 용액으로 바늘을 다시 채웁니다.

마이크로 매니퓰레이터에 바늘 장착 여기에는 의료 시스템의 PLI 100 PICO 인젝터가 사용됩니다. 이제 1-4 세포 단계에서 수정된 배아를 0.1 XMMR에 5%fol이 들어 있는 플라스틱 접시에 넣습니다. 각각의 새로운 마이크로 피펫에 대한 주입량을 라디칼 또는 스테이지 마이크로미터를 사용하여 교정합니다.

그런 다음 각 주입에 대해 원하는 양의 RNA를 전달하도록 피코 주입기를 설정합니다. 여기서 1 나노 리터 주입량이 사용됩니다. 배아를 집게로 잡거나 원하는 경우 받침대에 놓고 원하는 양을 동물 블래스터에 주입합니다.

RNA의 균일한 분포를 얻기 위해 배아 전체의 여러 위치에 주사를 분배합니다. 4개의 세포 단계 배아에 대해 각 블래스터에 1-2회 주입하는 반면, 2개의 세포 단계 배아에는 2-4개의 주입이 사용됩니다. 주입 후 주입된 배아를 0.1 XMMR이 들어있는 플라스틱 접시에 옮기고 20-23단계까지 발달시킵니다.

원하는 발달 속도에 따라 배아를 섭씨 14-22도의 온도에서 배양하고 PLL 처리된 배양 접시에 PBS에서 밀리리터당 10마이크로그램의 라미닌을 코팅하고 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 놓습니다. 배양 시간이 경과하면 PBS로 플레이트를 세 번 세척하고 최종 세척 후 라미닌 코팅 표면이 공기에 노출되지 않도록 주의합니다. PBS를 배양 배지로 교체합니다.

마지막으로 배양 접시의 바닥을 0.1 XMMR에 1%aros로 코팅하고 굳게 하여 3개의 아그로스 코팅 접시를 준비합니다. 일단 굳어지면, 주입된 mRNA의 발현에서 steinberg의 배지 가변성으로 한 접시를 채우면 배아가 해부를 수행하기 전에 형광 모자이크를 나타낼 수 있습니다. 배아에서 형광의 존재를 스크리닝하고 신경관에서 형광 융합 단백질을 발현하는 배아를 식별합니다.

그런 다음 20-23단계의 형광 배아를 Steinberg's Media가 들어 있는 아그로스 코팅된 플라스틱 접시에 옮깁니다. 접시를 해부 현미경 아래에 놓고 미세한 집게를 사용하여 vitelline 멤브레인을 제거합니다. 그런 다음 한 집게로 배아를 제자리에 고정하는 동안 두 번째 집게를 사용하여 배아 측면을 절개하여 속이 빈 내부를 노출시킵니다.

다음으로, 두 세트의 집게를 사용하여 배아의 등쪽과 복부 절반 사이의 조직을 따라 꼬집어 배아를 반으로 자르고 신경관이 있는 등쪽 부분을 분리합니다. Steinberg의 배지에 콜라겐 분해 효소가 함유 된 밀리리터당 2 밀리그램의 마이크로 원심 분리 튜브에 등쪽 X 엑스플란을 놓고 15-20 분 동안 회전기에 놓습니다. 그런 다음 등쪽 엑스플랜을 신선한 steinberg의 배지로 채워진 농업 코팅 접시로 옮깁니다.

현미경으로 작업하는 동안 표피와 기저 조직 사이에 집게의 끝을 밀어 넣고 표피를 천천히 당겨 등쪽 표피와 배쪽 누르에서 신경관을 해부합니다. 그런 다음 한 집게를 사용하여 조직을 잡고 다른 집게를 사용하여 신경관을 둘러싼 조직을 제거합니다. 다음으로, 절개된 신경관을 신선한 배양 배지로 채워진 아그로스 코팅된 접시에 옮깁니다.

여러 개의 신경관을 채취한 후에는 텅스텐 바늘이나 집게를 날카롭게 하여 각 튜브를 약 20개의 조각으로 자릅니다. 그런 다음 라미닌으로 코팅된 배양 접시에 조각을 접시에 담아 가지를 일렬로 고르게 펼칩니다. 신경관을 도금한 후에는 세포의 부착을 방해할 수 있으므로 접시를 이동해서는 안 됩니다.

도금된 신경관을 섭씨 20도에서 22도까지 배양합니다. 이미지 뉴런과 성장 원뿔을 실온에서 도금한 후 12-24시간 후에 XUS lavis 뉴런을 배양하는 데는 세포 배양 incubator가 필요하지 않습니다. RNA의 다양한 발현으로 인해 성장 원뿔 사이의 형광 수준 범위가 달라질 수 있음을 명심하십시오.

이 DIC 이미지는 시야의 왼쪽 상단 모서리에 있는 X 엑스플랜 밖으로 자라는 축삭돌기와 신경돌기를 보여줍니다. 이 이미지와 다음 이미지의 배율 막대는 10미크론을 나타냅니다. 이 고배율 동영상은 성장하는 축삭돌기의 끝에 있는 성장 원뿔을 보여줍니다.

마지막으로, 이 형광 현미경 검사 동영상은 성장 원뿔에서 EB one GFP의 발현을 보여줍니다. 여기에서는 이미징의 예, 플러스 팁 융합 단백질 EB one GFP를 제공합니다. 이 신경 이식 방법은 신경돌기가 성장하는 동안 성장 원뿔 내에서 단백질의 행동을 설명하기 위해 여러 단백질에 적용할 수 있습니다.