Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일

이 실험 절차의 전반적인 목표는 글리칸 마이크로어레이를 사용하여 광범위한 식물 또는 조직 유형에 걸쳐 세포벽 폴리머 조성을 비교하는 것입니다. 먼저, 관심 있는 식물 조직을 수확합니다. 균질화 후 알코올 불용성 잔류물을 준비합니다.

그 다음 CDTA와 수산화나트륨을 사용하여 세포벽 글리칸을 순차적으로 추출합니다. 이어서 로봇을 이용하여 세포벽 글리칸 추출물을 마이크로어레이에 프린팅합니다. 세포벽 글리칸을 표적으로 하는 단클론 항체로 마이크로어레이를 프로빙하고, 마이크로어레이상의 스폿 신호를 정량화합니다.

궁극적으로, 이 결과는 관심 있는 샘플 세트 전반에 걸쳐 당쇄 에피토프의 상대적 풍부도를 결정하는 데 사용될 수 있습니다. 우리는 여러 식물 조직 유형 전반에 걸쳐 세포벽 당쇄의 발생 현황을 동시에 전역적으로 파악하고 구성 성분의 차이를 검출해야 할 필요성을 인식하여 이 마이크로어레이 방법을 개발했습니다. 따라서 단당류 분석과 같은 전통적인 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 수백 개의 샘플을 동시에 스크리닝할 수 있는 마이크로어레이 기반 플랫폼이라는 점입니다. 이는 세포벽 조성을 프로파일링하는 빠르고 포괄적인 방법입니다. 분석 대상인 각 조직에 대해, 액체 질소를 사용하여 생체중 100 milligrams의 식물 조직 샘플을 3반복으로 준비하십시오.

샘플을 고운 가루가 되도록 균질화한 다음, 균질물을 10 milliliter 플라스틱 원추형 튜브로 옮겨 세포벽 물질을 준비합니다. 균질물을 실온에서 10 milliliters의 80% ethanol에 재현탁하고 2분 동안 강하게 볼텍싱합니다. 샘플을 3, 500 times G에서 원심분리하고 상층액을 제거합니다.

70% ethanol 세척을 상층액이 투명해질 때까지 최소 3회 반복합니다. 그 다음 100% acetone으로 최종 세척을 수행합니다. 알코올 불용성 잔류물을 팔레트에 펴 바르고 하룻밤 동안 공기 건조하여 미세하고 균일한 분말로 만듭니다. 알코올 불용성 잔류물 샘플을 0.4 millimeter squared 메쉬로 체 칩니다.

다음으로, 혼합을 위해 3 mm 유리 비드가 각각 들어 있는 마이크로 튜브에 알코올 불용성 잔류물 샘플 10 mg을 정밀하게 잽니다. 펙틴 및 펙틴 관련 폴리머를 추출하기 위해, 각 샘플에 50 mM CDTA 500 µL를 추가하고 튜브를 짧게 볼텍싱한 후, 티슈라이저(tissueizer)를 사용하여 8 Hz에서 3시간 동안 혼합합니다. 샘플을 12,000 ×g에서 원심분리합니다.

G. 상층액을 조심스럽게 제거하고 4°C에서 보관하십시오. 펠렛을 1mL의 탈이온수로 두 번 세척하십시오. 남은 세포벽 펠렛이 담긴 튜브에서 모든 액체를 제거하십시오.

0.1% 수소화나트륨이 포함된 4 M 수산화나트륨 500 µL를 사용하여 가교 글리칸을 추출하십시오. 앞서 설명한 추출 과정을 사용하여, 가교 글리칸이 포함된 상층액을 4 °C에서 보관하십시오. 펠렛을 탈이온수로 2회 세척하십시오.

그다음 500 µL의 Cain을 사용하여 셀룰로오스와 같은 잔류 폴리머를 추출한 후, 원심분리하여 추출된 세포벽 폴리머가 포함된 상층액에서 모든 입자성 물질을 제거합니다. 이어서 조직 유형 및 추출 유형에 따라 샘플이 배치된 사전 설계된 맞춤형 레이아웃을 사용하여, 각 샘플 50 µL를 폴리프로필렌 384 웰 마이크로타이터 플레이트에 로딩합니다.

다음으로, 탈이온수로 세포벽 폴리머 샘플을 희석하여 0배, 5배 및 25배의 연속 희석액을 준비합니다. 마이크로어레이의 핀 높이, 수집 및 체류 시간, 세척 단계와 같은 파라미터를 설정합니다. 샘플의 증발을 방지하기 위해 프린팅 챔버의 습도를 60%로 유지합니다.

이제 프린팅을 시작합니다. 로봇은 모세관 채널 핀을 사용하여 샘플 플레이트의 용액을 기기 내 평평한 플레이트에 부착된 질산 셀룰로오스 막 위에 프린팅합니다. 어레이의 각 스팟에는 15 nanoliters의 용액이 포함되며, 3회 반복하여 프린팅합니다.

동일한 마이크로어레이를 멤브레인 상에 서로 인접하게 프린트한 후 개별 어레이로 절단합니다. 비특이적 결합을 줄이기 위해, 각 마이크로어레이를 5% skim milk powder 용액에 담가 실온에서 2시간 동안 블로킹합니다.

세포벽 글라이칸 및 에피토프에 특이적인 단클론 항체를 첨가하고 2시간 동안 배양합니다. 비특이적 결합을 제거하기 위해 마이크로어레이를 PBS로 5분씩 3회 세척합니다. 다음으로, PBS로 5분씩 3회 세척한 후 horse radish peroxidase가 접합된 2차 항체로 마이크로어레이를 2시간 동안 프로빙합니다.

발색 또는 화학발광 기질을 사용하여 마이크로어레이를 현상합니다. 고해상도 데스크탑 스캐너를 사용하여 개별 마이크로어레이를 스캔합니다. 이미지를 16비트 네거티브 TIFF 파일로 저장합니다.

자동 그리드 도구가 장착된 explore 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용하여 각 스폿의 적분 강도를 계산합니다. 그런 다음 각 마이크로어레이의 그리드 데이터를 텍스트 파일로 내보냅니다. 분석을 위해 해당 데이터 파일을 Excel 스프레드시트로 수동으로 가져옵니다.

인쇄 반복 횟수 및 희석 배수 전체에 걸쳐 적분 스폿 강도를 평균하여 각 샘플의 평균 스폿 강도 값을 구합니다. Excel의 조건부 서식이나 온라인 히트맵 제작 도구를 사용하여 서로 다른 샘플 간의 상대적 평균 스폿 강도를 히트맵으로 나타냅니다. 각 항체 유형별 배경 신호와 위양성을 제거하고, 데이터를 100으로 보정하며, 5% 컷오프 값을 적용하는 도구를 사용하십시오.

포괄적인 마이크로어레이 폴리머 프로파일링을 사용하여 Nicotiana의 수술대, 화분, 씨방, 꽃잎, 꽃받침, 그리고 암술머리 등 6가지 조직 유형의 글라이칸 상대 풍부도를 측정하였습니다. 다양한 꽃 조직을 대상으로, 펙틴 다당류의 에피토프에 특이적인 단일클론 항체인 JIM 5로 마이크로어레이를 프로빙하였습니다. JIM 5 에피토프는 모든 꽃 조직의 CDTA 추출물에서 검출됨에 유의하십시오.

그러나 이는 화분에서 가장 높고 암술머리 조직에서 가장 낮게 나타납니다. 흥미롭게도, JIM five 에피토프는 화분의 수산화나트륨 추출물에서는 검출되었으나, 다른 조직에서는 검출되지 않았습니다. 정량적 정보는 난소 조직의 마이크로어레이에서 내부 표준물질로 처리된 서로 다른 정제 다당류의 표준 곡선을 생성하여 얻습니다.

각 샘플에는 JIM 5 에피토프를 포함하는 hoog가 약 157 µg 포함되어 있었으며, 이는 전체 세포벽 잔여물의 약 1.5%에 해당했습니다. 반면, 화분 조직에는 JIM 5 에피토프를 포함하는 hoog Ronin이 625 µg 포함되어 있었으며, 이는 전체 세포벽 잔여물의 약 6.25%에 해당했습니다. 모든 조직 유형에 걸친 15가지 글리칸 에피토프의 상대적 풍부함은 히트맵으로 요약되었습니다. 색상 막대의 강도는 각 샘플의 보정된 평균 스폿 강도에 비례합니다.

이 데이터의 도식적 표현을 통해 서로 다른 꽃 조직 간의 글리칸 에피토프 발생 차이를 신속하게 해석할 수 있습니다. 이러한 결과는 개별 글리칸 에피토프가 다양한 꽃 유형 사이에 고유하게 분포되어 있음을 나타냅니다. 예를 들어, LM 13 에피토프는 다른 조직에 비해 수술 꽃밥과 SE L 조직에서 가장 풍부하게 나타납니다.

이러한 패턴은 MAB LM six에 의해 우선적으로 검출되는 짧은 사슬 에피토프의 패턴과 뚜렷한 대조를 이룹니다. 가교 결합된 글라이칸 또한 여러 꽃에서 서로 다른 발생 패턴을 보입니다. 예를 들어, LM 10 에피토프는 다른 조직에 비해 암술머리 조직에 풍부하게 존재하지만, 씨방 조직에서는 나타나지 않습니다.

LM 15 xog 글리칸 에피토프는 다른 조직에 비해 꽃잎과 꽃밥 수술대에서 가장 높게 나타나는 반면, hetero manin은 수술대에서 가장 높게 나타납니다. 이 영상을 시청하고 나면, 광범위한 식물 및 조직 유형에서 세포벽 글리칸을 추출하고 상대적 함량을 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 마이크로어레이 사용법을 숙달하면 이 기술은 3일 안에 완료할 수 있습니다.

본 절차에 따라 각 단계에서 시료와 반복구들을 일관되게 처리하는 것이 중요합니다. 추가적인 질문에 답하기 위해 초산 질산 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, CDTA와 수산화나트륨을 사용하여 펙틴과 콘스 글리칸을 순차적으로 추출한 후 남아 있는 절대 셀룰로스 함량은 얼마인가 하는 점입니다.

이 기술은 Arabidopsis 및 Fisca, Nutella와 같은 모델 식물뿐만 아니라 면화, 밀, 유칼립투스, 담배 등 다른 식물에서의 글라이칸 발생을 빠르게 비교할 수 있어 식물 세포 생물학 분야에서 광범위하게 적용 가능합니다.