Name: Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 배우세요 식물 세포벽 글리칸 프로파일링을 위한 종합 마이크로어레이 폴리머 프로파일링(CoMPP) 기법을 활용한 방법입니다. 단클론 항체와 마이크로어레이 플랫폼을 결합하여 다양한 생물학적 맥락에서 글리칸 발생을 선별 분석할 수 있습니다.

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IEM은 자금 덴마크 연구위원회 (FTP 및 FNU)을 인정하고 싶습니다. ERL은 ARC DP 교부금의 지원을 인정합니다. AB는 식물 세포 벽의 부여에 우수의 ARC 센터의 지원을 인정한다.

1. 조직 수집 및 준비 <ol><li> 관심의 각 조직 최소한 세중의에 식물 조직의 100 밀리그램 신선한 무게를 (10 MG 건조 중량의 최소)를 수집합니다. 다음 단계는 식물 조직으로부터 세포 벽 재료의 준비에 대해 설명합니다. 저장 조직의 경우, 해제 - 원하는 녹말은 효소 이전에 13에 설명 된대로 세포 벽 고분자의 추출을하기 전에 제거됩니다. </li><li> 24 튜브 어댑터 세트와 3 밀리미터 텅스텐 카바이드 비즈 (30 Hz에서, 2 X 30 초)로, Qiagen TissueLyser II를 사용하여 액체 질소로 고급 분말로 샘플을 균질화. 몇 샘플을 처리하는 경우 또는 박격포와 유봉이 사용됩니다. </li><li> 10 ML 플라스틱 원뿔 튜브에 homogenates를 전송합니다. </li><li> RT 10 ML 80% 브이 / v 에탄올에 homogenates을 닦고 2 분 동안 힘차게 vortexing하여 세포벽 자료를 준비합니다. </li><li> 3500 XG에서 샘플을 원심 분리기와 표면에 뜨는 폐기. 표면에 뜨는 명확 때까지 70 % 에탄올 특히 엽록소를 포함하는 조직을 위해, 또는 적어도 세 번 씻어 반복합니다. </li><li> 100 % 아세톤과 최종 세척을 수행하고 밤새 공기 건조에 알코올 불용성 잔류 물 (AIR)를 포함하는 알약을 둡니다. </li><li> 체 공기 좋은, 균일 한 분말을 달성하고 제대로, 언젠가는 homogenate에 남아있는 지상 입자를 큰 제거하는 0.4 mm 2 메쉬와 샘플. </li><li> microtubes, 샘플의 혼합을 지원하기 위해 3mm 유리 구슬을 포함하는 각에 10 MG의 AIR 샘플 무게. </li></ol> 2. 세포 벽 Glycans의 추출 <ol><li> pectins과 관련된 Pectins, 그리고 고분자는 각 샘플의 50 μM C​​DTA (산도 7.5) 500 μl를 추가하여 샘플에서 추출됩니다. </li><li> 간단히 소용돌이 튜브는 용매는 샘플 소재와 접촉을 보장하고 8 Hz에서 3 시간 동안 TissueLyser를 사용하여 혼합합니다. </li><li> 주의 깊게 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 연구4 ° C.에서 supernatants과 상점을 emove </li><li> 13,000 X g에서 남아있는 용매, 소용돌이와 원심 분리기를 희석 및 제거 할 드 - 이온화 물 1 ML에 알약을 씻으십시오. 펠렛을 방해하지 않으면이 단계를 반복하고 다음 단계로 진행하기 전에 튜브에서 모든 액체를 제거합니다. </li><li> 교차 연결 glycans는 순차적으로 0.1 %로 4M NaOH의 500 μl로 남아있는 세포 벽 펠렛에서 추출됩니다 단계 2.1에서 설명한 동일한 절차를 사용 w / v를 NaBH4 - CDTA 추출을 위해 2.4. NaBH 4함으로써 다당류의 필링베이스를 방지 알코올로 다당류의 감소 끝에 알데히드 (또는 케토) 그룹을 줄이기 위해 추가됩니다. </li><li> 원심 분리 후, supernatants는 다시 제거됩니다 4 ° C에 저장하고, 산탄은 다음 추출을하기 전에 드 - 이온화 물에 두 번 세척. </li><li> 선택적 단계로서, 이러한 셀룰로오스 등의 잔류 고분자는, 500 μl cadoxen (31 % V / V 1,2 - diami으로 압축이 풀립니다2.4 - 2.1 단계에 설명 된대로 동일한 절차를 사용하여 0.78 M CDO와 noethane). 또한, 남은 펠릿의 절대 셀룰로오스 내용은 아세트산 / 질소 assays을 (토론 참조)를 사용하여 결정될 수있다. </li></ol> 3. 인쇄 Microarrays <ol><li> 원심 분리기의 supernatants는 미립자를 제거 13,000 XG에서 세포 벽 고분자를 추출 포함하는. </li><li> 잘 폴리 프로필렌 384 샘플 조직 유형 및 추출 종류에 따라 배열되어 사전 정의 된 사용자 정의 레이아웃을 사용하여 microtiter 접시에 각 샘플의 50 μl를로드합니다. </li><li> 탈 이온수와 0, 5, 25 × 시리얼 희석 시리즈의 세포벽 폴리머 샘플을 희석. </li><li> 이러한 핀 높이 수집 및 시간을 머물러 있으며, 세척 단계와 같은 매개 변수가 microarrayer를 제어하는​​ 소프트웨어에 설정되어 있습니다. </li><li> 인쇄 챔버의 습도는 샘플 증발을 방지 60 %로 제어됩니다. </li><li> 인쇄 작업이 LabNEXT softwa를 사용하여 시작됩니다재와 microarray 레이아웃에 해당하는 프로그램입니다. </li><li> 로봇은 기계의 평면 판에 부착되어 20 X 20cm의 니트로 셀룰로스 막에 샘플 판에서 솔루션을 인쇄 할 모세관 채널 핀을 사용합니다. 배열의 각 지점이 솔루션의 15 NL를 포함하고 세중의에 인쇄됩니다. </li><li> 인쇄 작업이 완료되면 동일한 microarrays는 개별 배열에 막과 컷에 서로 옆에 인쇄됩니다. </li><li> 각 실험에서 배열을 더 많거나 적은 샘플, dilutions 또는 복제를 수용하기 위해 수정할 수 있습니다. </li></ol> 4. Glycan Microarrays의 프로빙 <ol><li> 인쇄 후, 비 특​​정 바인딩을 줄이기 위해 인산에 용해 w / V 무 지방 우유 분말은 2 시간 동안 실온에서 (MPBS) 생리 버퍼 5 %의 개별 microarrays를 차단합니다. </li><li> MPBS에서 2 시간에 세포 벽 glycan epitopes에 대한 특정 단클론 항체와 프로브 microarrays. 단클론 antib의 대부분세포 벽 glycans에 대한 오디 세 회사의 상업적 사용할 수 있습니다, Biosupplies ( <a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">www.biosupplies.com.au</a> ), Carbosource 서비스 ( <a href="http://www.carbosource.net" target="_blank">www.carbosource.net</a> )와 PlantProbes ( <a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">www.plantprobes.net</a> ). </li><li> 부정적인 컨트롤 만 MPBS도없고, 1 차 항체와 incubated microarray를 포함합니다. </li><li> 인산 3 회가 아닌 특정 바인딩을 제거 할 5 분에 (PBS) 생리 버퍼 microarrays을 씻는다. </li><li> 2 시간에 MPBS에 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 (HRP)에 복합 이차 항체와 microarrays를 조사. 세포 벽 glycans에 대한 대부분의 단클론 항체 안티 마우스 또는 안티 쥐 보조 항체가 필요합니다. </li><li> 비 특정 바인딩을 제거하는 5 분에 3 회 PBS 버퍼로 세척 단계를 반복합니다. </li><li> chromogenic (3,3-Diaminobenzidine) 또는 chemil를 사용하여 microarrays를 개발uminecent (루미놀) 기판. </li></ol> 5. 양을 정함 <ol><li> 개발 후, 고해상도 (1,200 dpi의) 바탕 화면 스캐너를 사용하여 개별 microarrays를 검색 및 제외, 16 비트 TIFF 파일 (그림 3)로 이미지를 저장합니다. </li><li> 자동 격자 도구가 구비 이미지 처리 소프트웨어 (LabNEXT) Xplore 사용하여 각 영역의 핵심 강도를 계산할 수 있습니다. 통합 현장 강도는 각 지점을 둘러싼 그리드 영역에서 픽셀의 합계에서 파생됩니다. </li><li> 각 microarray에 대한 그리드 데이터는 txt 파일로 내보낼 수 있습니다 수동으로 분석을 위해 Excel 스프레드 시트로 가져올 수 있습니다. 온라인 도구 ( <a href="http://arraytemplates.charliehart.com.au/" target="_blank">http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/가</a> ) 자동으로 번역 및 개인 txt 파일에서 데이터를 처리하기 위해 개발되었습니다. </li><li> 통합 현장 강도가 인쇄 복제에서 평균과 &#39;비열한 자리를 얻기 위해 dilutions 수 있습니다각 샘플에 대한 강도 &#39;값 (그림 2). 또한, 배열에 하나의 희석 가치에 상응하는 현물 신호는 각 샘플에 대한 상대적 glycan의 에피토프의 풍요 로움을 수량화하는 데 사용됩니다. </li><li> 다른 샘플 사이의 상대적인 평균 스폿 농도는 Excel 또는 온라인 heatmapper 도구 (에서 조건부 서식 사용하는 히트 맵 (그림 4)로 제공됩니다 <a href="http://bar.utoronto.ca/welcome.htm" target="_blank">http://bar.utoronto.ca/welcome.htm을</a> ). 각 항체 유형에 대한 데이터는 100 수정되어 5 %의 컷오프 값은 배경 신호 탐지를 제거하는 부과됩니다. </li></ol>

<ol><li>Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+models+of+primary+cell+walls+in+flowering+plants%3A+consistency+of+molecular+structure+with+the+physical+properties+of+the+walls+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth.</a> Plant J. 3, 1-30 (1993).</li>
<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofuels.</a> Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).</li>
<li>Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+degree+and+pattern+of+methyl-esterification+of+pectic+homogalacturonan+in+plant+cell+walls.+implications+for+pectin+methyl+esterase+action%2C+matrix+properties%2C+and+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion.</a> J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).</li>
<li>Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cell+walls%3A+the+skeleton+of+the+plant+world%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant cell walls: the skeleton of the plant world.</a> Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).</li>
<li>Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+the+plant+cell+wall%3A+searching+for+the+genes+that+define+structure%2C+architecture+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics.</a> Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).</li>
<li>Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+family+of+Arabidopsis+genes+related+to+xyloglucan+fucosyltransferase1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1.</a> Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).</li>
<li>Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward a systems approach to understanding plant cell walls.</a> Science. 306, 2206-2211 (2004).</li>
<li>Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillats%2C+WGT+%22The+Plant+Cell+Wall%22">The Plant Cell Wall</a>. Rose, J. K. C. , Blackwell. 92-110 (2003).</li>
<li>Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Toolkit+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies.</a> Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).</li>
<li>Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+cell-wall+polymers+within+and+between+plants+using+novel+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays.</a> The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).</li>
<li>Sørensen, I., Willats, W. G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+characterization+of+plant+cell+walls+using+carbohydrate+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).</li>
<li>Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+plant+cell-wall+polysaccharide+decomposition+in+leaf-cutting+ant+fungus+gardens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens.</a> PLoS One. 6 (3), e17506(2011).</li>
<li>Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+procedures+for+the+determination+of+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature Protocols. , In Press (2012).</li>
<li>Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+methyl+hexagalacturonate+hapten+inhibitors+of+anti-homogalacturonan+monoclonal+antibodies+LM7%2C+JIM5+and+JIM7%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7.</a> Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).</li>
<li>Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+complexity+of+arabinan+polysaccharides+and+their+processing+in+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls.</a> Plant J. 59, 413-425 (2009).</li>
<li>Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNIT+12.10+Preparation+and+Analysis+of+Glycan+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2011).</li>
<li>McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+plant+cell+walls+by+microbial+xylan-specific+carbohydrate-binding+modules%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules.</a> PNAS. 103, 4765-4770 (2006).</li>
<li>Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eli1+mutation+reveals+a+link+between+cell+expansion+and+secondary+cell+wall+formation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 127, 3395-3405 (2000).</li>
<li>Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-Function+Mutation+of+REDUCED+WALL+ACETYLATION2+in+Arabidopsis+Leads+to+Reduced+Cell+Wall+Acetylation+and+Increased+Resistance+to+Botrytis+cinerea%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea.</a> Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).</li>
<li>Updegraff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).</li>
<li>21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+monoclonal+antibodies+against+plant+cell+wall+glycans+by+hierarchial+clustering+of+their+carbohydrate+microarray+binding+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles.</a> Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).</li>
<li>Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+linkage+%281%E2%86%923%29%2C%281%E2%86%924%29-%CE%B2-D-glucan+is+not+unique+to+the+Poales+and+is+an+abundant+component+of+Equisetum+arvense+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls.</a> Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).</li>
<li>Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cell+wall+polymers+during+antheridium+development+and+spermatogenesis+in+the+Charophycean+green+alga%2C+Chara%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara.</a> 2104, 1045-1056 (2009).</li>
<li>Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+outer+layer+of+the+primary+cell+wall+joins+elongating+cotton+fibers+into+tissue-like+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles.</a> Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).</li>
<li>Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+Erwinia+chrysanthemi+pectin+methylesterase+variants+using+carbohydrate+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays.</a> Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

CoMPP는 단 몇일 만에 수백 개의 공장 파생 샘플 glycan 구성을 프로파일에 대한 신속하고 민감한 방법입니다. 이 방법은 lectins, 수용체, 그리고 항체 16와 같은 glycan 결합 단백질과 탄수화물의 상호 작용 높은 처리량 검사에 대해 이미 사용 가능한 박테리아 나 포유류의 glycan 배열 플랫폼을 보완합니다. 세포 벽 glycans를 검출하기위한 가능한 프로브의 큰 다양성으로,이 식물 세포 벽의 8,9의 다당류의 모든 주요 클래스에 속하는 glycan의 epitopes에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나 이것들은 8,9를 확인 된 glycan 구조의 단지 작은 비율을 차지할, 일부 상황에서 CoMPP의 comprehensibility을 제한 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고,이 기능은 최근 공장 glycans 17에 대한 탄수화물 구속력이 모듈의 사용 (CBMs)에 의해 확장, 또한 비 glycosyl 해상도가 특징...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 3mm의 텅스텐 카바이드 비즈 </td><td> Qiagen </td><td> 69,997 </td><td></td></tr><tr><td> 컬렉션 microtubes (1.2 mm) </td><td> Qiagen </td><td> 19,560 </td><td> 1.5 ML의 microfuge 튜브도 사용할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> Qiagen TissueLyser II </td><td> Qiagen </td><td> 85,300 </td><td></td></tr><tr><td> 3mm 유리 구슬 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> Z143928 </td><td></td></tr><tr><td> CDTA </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 34,588 </td><td></td></tr><tr><td> 산화 카드뮴 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 202894 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2 - diaminoethane </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 03,550 </td><td></td></<html> TR&gt; <tr><td> 니트로 셀룰로스 막 (0.22 μm의 기공 크기) </td><td> GE 물 및 공정 기술 </td><td> EP2HY00010 </td><td> 다른 기공 크기의 멤브레인은 다른 핀 유형에 적합합니다 </td></tr><tr><td> Xact II microarrayer 로봇 </td><td> Labnext </td><td> 001A </td><td> Xact II 로봇은 니트로 셀룰로스 막가 연결되어 할 수있는 사용자 정의 20 X 20cm 세라믹 플레이트가 장착 된 </td></tr><tr><td> RM microarray 핀을 Xtend </td><td> Labnext </td><td> 0037-350 </td><td> 핀은 멤브레인에 야생에 적합해야합니다 </td></tr><tr><td> 384 잘 microtiter 플레이트 (폴리 프로필렌) </td><td> Greiner </td><td> 781207 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 glycan 단클론 항체 </td><td> / 공장 프로브 CarboSource / Biosupplies </td><td></td><td> 웹 사이트, PlantProbes ( <a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">www.plantprobes.net</a> ), Carbosource (ww.carbosource.net &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; www.carbosource.net)와 Biosupplies ( <a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">www.biosupplies.com.au</a> ). </td></tr><tr><td> 안티 쥐 IgG (전체 분자) - 염소에서 생산 퍼 옥시 데이즈 항체. </td><td> 시그마 </td><td> A9037 </td><td> 이차 항체의 종류 (예 : 쥐, 마우스, 염소 등의 제기)를 사용하는 기본 항체에 따라 달라집니다. </td></tr><tr><td> 시그마 FAST 3,3 &#39;- Diaminobenzidine의 정제 </td><td> 시그마 </td><td> D4293 </td><td> 시약을 개발의 유형은 사용 보조 항체를 검출 방법 (colourmetric, 또는 chemiluminecent)에 따라 달라집니다. </td></tr><tr><td> SuperSignal 서 피코 Chemiluminescent 기판 </td><td> Thermoscientific </td><td> 34,080 </td><td> 위의 내용을 참조 </td></tr><tr><td> 이미지 처리 소프트웨어의 Xplore </td><td> LabNext </td><td> 008 </td><td> 자동 gridding 도구와 많은 소프트웨어 종류를 사용할 수 있습니다microarray 명소의 픽셀 값을 측정합니다. </td></tr><tr><td> 식물 다당류 </td><td> 시그마 / Megazyme </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 glycan 프로파일

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays 

식물 세포의 벽은 생리학과 식물의 개발에 중요한 역할을하고 인간 사회 (예 : 나무, 종이, 섬유 및 바이오 연료 산업) 1,2의 원료를 제공 이기종 glycans의 복잡한 matrixes 있습니다. 그러나, 이러한 구성 요소의 생합성과 기능을 이해하는 것은 도전 남아있다. 세포 벽 glycans는 화학적 및 빌딩 블록, glycosyl 잔류의 복잡성으로 인해 conformationally 다양합니다. 이러한 형태의 여러 위치에서 연계 및 링 구조에서 차이가이 이성질체 또는 anomeric 구성 할 수 있으며,뿐만 아니라, 비 설탕 잔류의 배열로 대체됩니다. Glycan 구성도 다른 셀 및 / 또는 조직 유형 또는 단일 셀 벽 3의 하위 도메인에 따라 다릅니다. 또한, 자신의 구성은 개발 한 동안, 또는 환경 단서 사에 대한 응답으로 수정됩니다. 예에2000 유전자의 운은 식물 세포 벽 이기종 glycans의 복잡한 matrixes Arabidopsis 5 세포벽 glycan 생합성 및 수정에 참여 할 것으로 예상 했었 있습니다. 그러나, biosynthetic 유전자의 비교적 적은은 기능적으로 4,5 특징되었습니다. 유전자는 종종 differentially 세포 유형 6 시까 종종 낮은 수준에서 표현되기 때문에 역 유전학 방법이 어렵습니다. 또한, 돌연변이 연구는 종종 적절한 세포벽 기능이 7 유지하기 위해 유전자 중복이나 보상 메커니즘에 의해 방해되어 있습니다. 따라서 소설 접근 방식은 빠르게 glycan 구조의 다양한 범위를 특징하고 이해 세포벽 생합성 및 수정에 기능 유전체학 접근을 촉진하기 위하여 필요합니다. 단클론 항체 (mAbs)는 8,9 식물의 glycan 구조와 분포를 결정하는 중요한 도구로 부각되었습니다. 이러한 지구 인식pectins, xyloglucans, xylans, mannans, 글루칸과 arabinogalactans 등의 식물 세포의 벽 glycans의 주요 클래스, 내 현재 inct의 epitopes. 최근의 사용은 공장 및 조직 유형 동시에 9,10,11의 넓은 범위에서 glycans의 상대적 풍부한을 결정하기 위해 대규모 심사 실험으로 확장되었습니다. 여기 감소 시약 및 샘플 볼륨과 소형화 microarray 플랫폼을 사용하여 상영 할 (100 초) 여러 샘플을 수 종합 Microarray 폴리머 프로파일 (CoMPP) (그림 1 &amp; 2) 10,11라는 microarray 기반 glycan 검사 방법을 제시한다. microarray의 현장 신호 공식적으로 glycan 에피토프의 발생에 대한 반 정량 데이터를 제공하기 위해 정량화 할 수 있습니다. 이 방법은 잘 복잡한 생물학적 시스템 12 glycan 변경 사항을 추적하고 세포벽 성분의 글로벌 개요를 제공하는 데 적합합니다 특히 때 사전 지식 OF이 사용할 수 없습니다.

Nicotiana alata 꽃부터 6 조직 유형 (약의 필라멘트, 꽃가루, 난소, 꽃잎, sepals 및 오명)에서 glycans의 상대적인 풍요 로움은 CoMPP를 사용하여 결정되었다. 그림 3A은 부분적으로 (저) methylesterified homogalacturonan (HG), pectic 다당류 14 일 발생 에피토프에 대한적인 mAb JIM5 특정와 탐색 된 대표 microarray를 보여줍니다. JIM5 에피토프가 모든 꽃 조직의 CDTA 추출물에서 발견하는 것은 stigmatic 조직 (그림 3A 및 4A)에서 꽃가루와 최저에 최고입니다. 흥미롭게도, JIM5의 에피토프는 화분에 NaOH 추출물에서 발견되지만 다른 조직의 (그림 3A). 관심 glycan의 발생에 대한 양적 정보는 microarray의 내부 기준 (그림 3B) 등의...

라고 기술<strong&gt; C</strong&gt; omprehensive<strong&gt; M</strong&gt; icroarray<strong&gt; P</strong식물 세포의 벽 glycans의 특성에 대한&gt; olymer 프로파일 (CoMPP)이 설명되어 있습니다. 이 방법은 생물학적 상황의 넓은 범위에서 glycan 발생의 검사를 허용하는 소형 microarray 분석 플랫폼으로 정의 glycan - epitopes로 이동 단클론 항체의 특이성이 조화를 이루고 있습니다.

Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일

식물 세포벽은 식물의 생리와 발달에 중요한 역할을 하며 ...을(를) 제공하는 이질적인 글리칸의 복잡한 매트릭스입니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 글리칸 마이크로어레이를 사용하여 광범위한 식물 또는 조직 유형에 걸쳐 세포벽 폴리머 조성을 비교하는 것입니다. 먼저, 관심 있는 식물 조직을 수확합니다. 균질화 후 알코올 불용성 잔류물을 준비합니다.그 다음 CDTA와 수산화나트륨을 사용하여 세포벽 글리칸을 순차적으로 추출합니다. 이어서 로봇을 이용하여 세포벽 글리칸 추출물을 마이크로어레이에 프린팅합니다. 세포벽 글리칸을 표적으로 하는 단클론 항체로 마이크로어레이를 프로빙하고, 마이크로어레이상의 스폿 신호를 정량화합니다.궁극적으로, 이 결과는 관심 있는 샘플 세트 전반에 걸쳐 당쇄 에피토프의 상대적 풍부도를 결정하는 데 사용될 수 있습니다. 우리는 여러 식물 조직 유형 전반에 걸쳐 세포벽 당쇄의 발생 현황을 동시에 전역적으로 파악하고 구성 성분의 차이를 검출해야 할 필요성을 인식하여 이 마이크로어레이 방법을 개발했습니다. 따라서 단당류 분석과 같은 전통적인 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 수백 개의 샘플을 동시에 스크리닝할 수 있는 마이크로어레이 기반 플랫폼이라는 점입니다. 이는 세포벽 조성을 프로파일링하는 빠르고 포괄적인 방법입니다. 분석 대상인 각 조직에 대해, 액체 질소를 사용하여 생체중 100 milligrams의 식물 조직 샘플을 3반복으로 준비하십시오.샘플을 고운 가루가 되도록 균질화한 다음, 균질물을 10 milliliter 플라스틱 원추형 튜브로 옮겨 세포벽 물질을 준비합니다. 균질물을 실온에서 10 milliliters의 80% ethanol에 재현탁하고 2분 동안 강하게 볼텍싱합니다. 샘플을 3, 500 times G에서 원심분리하고 상층액을 제거합니다.70% ethanol 세척을 상층액이 투명해질 때까지 최소 3회 반복합니다. 그 다음 100% acetone으로 최종 세척을 수행합니다. 알코올 불용성 잔류물을 팔레트에 펴 바르고 하룻밤 동안 공기 건조하여 미세하고 균일한 분말로 만듭니다. 알코올 불용성 잔류물 샘플을 0.4 millimeter squared 메쉬로 체 칩니다.다음으로, 혼합을 위해 3 mm 유리 비드가 각각 들어 있는 마이크로 튜브에 알코올 불용성 잔류물 샘플 10 mg을 정밀하게 잽니다. 펙틴 및 펙틴 관련 폴리머를 추출하기 위해, 각 샘플에 50 mM CDTA 500 µL를 추가하고 튜브를 짧게 볼텍싱한 후, 티슈라이저(tissueizer)를 사용하여 8 Hz에서 3시간 동안 혼합

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 콘텐츠와 벽 파생 탄수화물의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 2 부 : 탄수화물

빠른 방법은 세포외 기질에서 다당류의 구조에 대한 통찰력을 얻을 수 설명되어 있습니다. 방법은 glycosylhydrolases의 특이성과 물질의 미세한을 분석 수 있도록 질량 분석계의 감도 활용합니다. 이 기술은 조직 자체에서 직접 사용할 수 적용할 수 있습니다.

세포외 다당류의 OLIgo 질량 프로파일 (OLIMP)

결정질 셀룰로오스는 식물 세포벽의 중요한 구성 성분입니다. 그러나 세포 분해능에서 정량화하는 것은 기술적으로 어렵습니다.  여기에서는 시공간 해상도에서 세포벽 구성에 대한 정보를 얻기 위해 편광 기술과 뿌리 단면을 사용하는 방법을 보고합니다.

에서 결정 셀룰로오스 축적의 높은 해상도 정량<em&gt; 애기 장대</em&gt; 뿌리 조직 특이 세포 벽 수정을 모니터링하는

이 프로토콜은 효소(엔톡실라나아제) 가수분해 전에 RE에 2개의 아미노벤즈아미드를 태그한 다음 질량 분석법(MS) 및 핵 자기 공명(NMR)을 사용하여 결과 올리고당을 분석함으로써 헤테록실란의 말단(RE) 및 내부 영역 글리코실 서열의 구조적 특성화에 사용되는 특정 기술을 설명합니다.

효소 적, 화학 (메틸화) 및 물리 (질량 분석, 핵 자기 공명) 기법을 사용하여 공장 벽 Heteroxylans의 연속

다 당 류 젤 전기 이동 법 (속도), 예를 들어, mannan를 사용 하 여 구조 분석을 위한 프로토콜을 설명 합니다.

속도 사용 하 여 식물에 Mannan 세포 벽 다 당 류 구조 특성

우리는 준비 및 N-glycans 무 (Raphanus sativus)의 다른 재배에서의 분석을 위한 간단 하 고 빠른 방법을 설명합니다.

N-glycans Raphanus sativus Cultivars 사용 PNGase H+ 에서 분석

다차원 고체 NMR 분광학 및 동적인 핵 분극 (DNP) 조사 13C,15N 표시 된 곰 팡이 및 식물 견본을 준비 하기 위한 프로토콜 제공 됩니다.

곰 팡이의 준비 및 동적인 핵 분극 고체 NMR을 사용 하 여 구조 설명에 대 한 식물 재료

이 프로토콜은 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 면역지역화를 위한 식물 물질이 어떻게 고정되는지, 친수성 아크릴 수지에 내장되어, 단면화및 유리 슬라이드에 장착되는지 자세히 설명합니다. 우리는 세포벽 관련 전형이 특정 항체로 검출될 것임을 보여준다.

식물 조직의 세포 벽에 있는 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 형광 면역 국소화

마이크로어레이 폴리머 프로파일링(MAPP)은 생물학적 샘플에서 글라이칸의 조성 분석을 위한 고처리량 기술입니다.

고처리량 글라이칸 분석을 위한 마이크로어레이 폴리머 프로파일링(MAPP)

Microarrays을 사용하여 세균의 유전자 발현 분석

배우세요 식물 세포벽 글리칸 프로파일링을 위한 종합 마이크로어레이 폴리머 프로파일링(CoMPP) 기법을 활용한 방법입니다. 단클론 항체와 마이크로어레이 플랫폼을 결합하여 다양한 생물학적 맥락에서 글리칸 발생을 선별 분석할 수 있습니다.

Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일

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