Name: Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 배우세요 식물 세포벽 글리칸 프로파일링을 위한 종합 마이크로어레이 폴리머 프로파일링(CoMPP) 기법을 활용한 방법입니다. 단클론 항체와 마이크로어레이 플랫폼을 결합하여 다양한 생물학적 맥락에서 글리칸 발생을 선별 분석할 수 있습니다.

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IEM은 자금 덴마크 연구위원회 (FTP 및 FNU)을 인정하고 싶습니다. ERL은 ARC DP 교부금의 지원을 인정합니다. AB는 식물 세포 벽의 부여에 우수의 ARC 센터의 지원을 인정한다.

1. 조직 수집 및 준비 <ol><li> 관심의 각 조직 최소한 세중의에 식물 조직의 100 밀리그램 신선한 무게를 (10 MG 건조 중량의 최소)를 수집합니다. 다음 단계는 식물 조직으로부터 세포 벽 재료의 준비에 대해 설명합니다. 저장 조직의 경우, 해제 - 원하는 녹말은 효소 이전에 13에 설명 된대로 세포 벽 고분자의 추출을하기 전에 제거됩니다. </li><li> 24 튜브 어댑터 세트와 3 밀리미터 텅스텐 카바이드 비즈 (30 Hz에서, 2 X 30 초)로, Qiagen TissueLyser II를 사용하여 액체 질소로 고급 분말로 샘플을 균질화. 몇 샘플을 처리하는 경우 또는 박격포와 유봉이 사용됩니다. </li><li> 10 ML 플라스틱 원뿔 튜브에 homogenates를 전송합니다. </li><li> RT 10 ML 80% 브이 / v 에탄올에 homogenates을 닦고 2 분 동안 힘차게 vortexing하여 세포벽 자료를 준비합니다. </li><li> 3500 XG에서 샘플을 원심 분리기와 표면에 뜨는 폐기. 표면에 뜨는 명확 때까지 70 % 에탄올 특히 엽록소를 포함하는 조직을 위해, 또는 적어도 세 번 씻어 반복합니다. </li><li> 100 % 아세톤과 최종 세척을 수행하고 밤새 공기 건조에 알코올 불용성 잔류 물 (AIR)를 포함하는 알약을 둡니다. </li><li> 체 공기 좋은, 균일 한 분말을 달성하고 제대로, 언젠가는 homogenate에 남아있는 지상 입자를 큰 제거하는 0.4 mm 2 메쉬와 샘플. </li><li> microtubes, 샘플의 혼합을 지원하기 위해 3mm 유리 구슬을 포함하는 각에 10 MG의 AIR 샘플 무게. </li></ol> 2. 세포 벽 Glycans의 추출 <ol><li> pectins과 관련된 Pectins, 그리고 고분자는 각 샘플의 50 μM C​​DTA (산도 7.5) 500 μl를 추가하여 샘플에서 추출됩니다. </li><li> 간단히 소용돌이 튜브는 용매는 샘플 소재와 접촉을 보장하고 8 Hz에서 3 시간 동안 TissueLyser를 사용하여 혼합합니다. </li><li> 주의 깊게 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 연구4 ° C.에서 supernatants과 상점을 emove </li><li> 13,000 X g에서 남아있는 용매, 소용돌이와 원심 분리기를 희석 및 제거 할 드 - 이온화 물 1 ML에 알약을 씻으십시오. 펠렛을 방해하지 않으면이 단계를 반복하고 다음 단계로 진행하기 전에 튜브에서 모든 액체를 제거합니다. </li><li> 교차 연결 glycans는 순차적으로 0.1 %로 4M NaOH의 500 μl로 남아있는 세포 벽 펠렛에서 추출됩니다 단계 2.1에서 설명한 동일한 절차를 사용 w / v를 NaBH4 - CDTA 추출을 위해 2.4. NaBH 4함으로써 다당류의 필링베이스를 방지 알코올로 다당류의 감소 끝에 알데히드 (또는 케토) 그룹을 줄이기 위해 추가됩니다. </li><li> 원심 분리 후, supernatants는 다시 제거됩니다 4 ° C에 저장하고, 산탄은 다음 추출을하기 전에 드 - 이온화 물에 두 번 세척. </li><li> 선택적 단계로서, 이러한 셀룰로오스 등의 잔류 고분자는, 500 μl cadoxen (31 % V / V 1,2 - diami으로 압축이 풀립니다2.4 - 2.1 단계에 설명 된대로 동일한 절차를 사용하여 0.78 M CDO와 noethane). 또한, 남은 펠릿의 절대 셀룰로오스 내용은 아세트산 / 질소 assays을 (토론 참조)를 사용하여 결정될 수있다. </li></ol> 3. 인쇄 Microarrays <ol><li> 원심 분리기의 supernatants는 미립자를 제거 13,000 XG에서 세포 벽 고분자를 추출 포함하는. </li><li> 잘 폴리 프로필렌 384 샘플 조직 유형 및 추출 종류에 따라 배열되어 사전 정의 된 사용자 정의 레이아웃을 사용하여 microtiter 접시에 각 샘플의 50 μl를로드합니다. </li><li> 탈 이온수와 0, 5, 25 × 시리얼 희석 시리즈의 세포벽 폴리머 샘플을 희석. </li><li> 이러한 핀 높이 수집 및 시간을 머물러 있으며, 세척 단계와 같은 매개 변수가 microarrayer를 제어하는​​ 소프트웨어에 설정되어 있습니다. </li><li> 인쇄 챔버의 습도는 샘플 증발을 방지 60 %로 제어됩니다. </li><li> 인쇄 작업이 LabNEXT softwa를 사용하여 시작됩니다재와 microarray 레이아웃에 해당하는 프로그램입니다. </li><li> 로봇은 기계의 평면 판에 부착되어 20 X 20cm의 니트로 셀룰로스 막에 샘플 판에서 솔루션을 인쇄 할 모세관 채널 핀을 사용합니다. 배열의 각 지점이 솔루션의 15 NL를 포함하고 세중의에 인쇄됩니다. </li><li> 인쇄 작업이 완료되면 동일한 microarrays는 개별 배열에 막과 컷에 서로 옆에 인쇄됩니다. </li><li> 각 실험에서 배열을 더 많거나 적은 샘플, dilutions 또는 복제를 수용하기 위해 수정할 수 있습니다. </li></ol> 4. Glycan Microarrays의 프로빙 <ol><li> 인쇄 후, 비 특​​정 바인딩을 줄이기 위해 인산에 용해 w / V 무 지방 우유 분말은 2 시간 동안 실온에서 (MPBS) 생리 버퍼 5 %의 개별 microarrays를 차단합니다. </li><li> MPBS에서 2 시간에 세포 벽 glycan epitopes에 대한 특정 단클론 항체와 프로브 microarrays. 단클론 antib의 대부분세포 벽 glycans에 대한 오디 세 회사의 상업적 사용할 수 있습니다, Biosupplies ( <a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">www.biosupplies.com.au</a> ), Carbosource 서비스 ( <a href="http://www.carbosource.net" target="_blank">www.carbosource.net</a> )와 PlantProbes ( <a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">www.plantprobes.net</a> ). </li><li> 부정적인 컨트롤 만 MPBS도없고, 1 차 항체와 incubated microarray를 포함합니다. </li><li> 인산 3 회가 아닌 특정 바인딩을 제거 할 5 분에 (PBS) 생리 버퍼 microarrays을 씻는다. </li><li> 2 시간에 MPBS에 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 (HRP)에 복합 이차 항체와 microarrays를 조사. 세포 벽 glycans에 대한 대부분의 단클론 항체 안티 마우스 또는 안티 쥐 보조 항체가 필요합니다. </li><li> 비 특정 바인딩을 제거하는 5 분에 3 회 PBS 버퍼로 세척 단계를 반복합니다. </li><li> chromogenic (3,3-Diaminobenzidine) 또는 chemil를 사용하여 microarrays를 개발uminecent (루미놀) 기판. </li></ol> 5. 양을 정함 <ol><li> 개발 후, 고해상도 (1,200 dpi의) 바탕 화면 스캐너를 사용하여 개별 microarrays를 검색 및 제외, 16 비트 TIFF 파일 (그림 3)로 이미지를 저장합니다. </li><li> 자동 격자 도구가 구비 이미지 처리 소프트웨어 (LabNEXT) Xplore 사용하여 각 영역의 핵심 강도를 계산할 수 있습니다. 통합 현장 강도는 각 지점을 둘러싼 그리드 영역에서 픽셀의 합계에서 파생됩니다. </li><li> 각 microarray에 대한 그리드 데이터는 txt 파일로 내보낼 수 있습니다 수동으로 분석을 위해 Excel 스프레드 시트로 가져올 수 있습니다. 온라인 도구 ( <a href="http://arraytemplates.charliehart.com.au/" target="_blank">http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/가</a> ) 자동으로 번역 및 개인 txt 파일에서 데이터를 처리하기 위해 개발되었습니다. </li><li> 통합 현장 강도가 인쇄 복제에서 평균과 &#39;비열한 자리를 얻기 위해 dilutions 수 있습니다각 샘플에 대한 강도 &#39;값 (그림 2). 또한, 배열에 하나의 희석 가치에 상응하는 현물 신호는 각 샘플에 대한 상대적 glycan의 에피토프의 풍요 로움을 수량화하는 데 사용됩니다. </li><li> 다른 샘플 사이의 상대적인 평균 스폿 농도는 Excel 또는 온라인 heatmapper 도구 (에서 조건부 서식 사용하는 히트 맵 (그림 4)로 제공됩니다 <a href="http://bar.utoronto.ca/welcome.htm" target="_blank">http://bar.utoronto.ca/welcome.htm을</a> ). 각 항체 유형에 대한 데이터는 100 수정되어 5 %의 컷오프 값은 배경 신호 탐지를 제거하는 부과됩니다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

CoMPP는 단 몇일 만에 수백 개의 공장 파생 샘플 glycan 구성을 프로파일에 대한 신속하고 민감한 방법입니다. 이 방법은 lectins, 수용체, 그리고 항체 16와 같은 glycan 결합 단백질과 탄수화물의 상호 작용 높은 처리량 검사에 대해 이미 사용 가능한 박테리아 나 포유류의 glycan 배열 플랫폼을 보완합니다. 세포 벽 glycans를 검출하기위한 가능한 프로브의 큰 다양성으로,이 식물 세포 벽의 8,9의 다당류의 모든 주요 클래스에 속하는 glycan의 epitopes에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나 이것들은 8,9를 확인 된 glycan 구조의 단지 작은 비율을 차지할, 일부 상황에서 CoMPP의 comprehensibility을 제한 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고,이 기능은 최근 공장 glycans 17에 대한 탄수화물 구속력이 모듈의 사용 (CBMs)에 의해 확장, 또한 비 glycosyl 해상도가 특징...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 3mm의 텅스텐 카바이드 비즈 </td><td> Qiagen </td><td> 69,997 </td><td></td></tr><tr><td> 컬렉션 microtubes (1.2 mm) </td><td> Qiagen </td><td> 19,560 </td><td> 1.5 ML의 microfuge 튜브도 사용할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> Qiagen TissueLyser II </td><td> Qiagen </td><td> 85,300 </td><td></td></tr><tr><td> 3mm 유리 구슬 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> Z143928 </td><td></td></tr><tr><td> CDTA </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 34,588 </td><td></td></tr><tr><td> 산화 카드뮴 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 202894 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2 - diaminoethane </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 03,550 </td><td></td></<html> TR&gt; <tr><td> 니트로 셀룰로스 막 (0.22 μm의 기공 크기) </td><td> GE 물 및 공정 기술 </td><td> EP2HY00010 </td><td> 다른 기공 크기의 멤브레인은 다른 핀 유형에 적합합니다 </td></tr><tr><td> Xact II microarrayer 로봇 </td><td> Labnext </td><td> 001A </td><td> Xact II 로봇은 니트로 셀룰로스 막가 연결되어 할 수있는 사용자 정의 20 X 20cm 세라믹 플레이트가 장착 된 </td></tr><tr><td> RM microarray 핀을 Xtend </td><td> Labnext </td><td> 0037-350 </td><td> 핀은 멤브레인에 야생에 적합해야합니다 </td></tr><tr><td> 384 잘 microtiter 플레이트 (폴리 프로필렌) </td><td> Greiner </td><td> 781207 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 glycan 단클론 항체 </td><td> / 공장 프로브 CarboSource / Biosupplies </td><td></td><td> 웹 사이트, PlantProbes ( <a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">www.plantprobes.net</a> ), Carbosource (ww.carbosource.net &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; www.carbosource.net)와 Biosupplies ( <a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">www.biosupplies.com.au</a> ). </td></tr><tr><td> 안티 쥐 IgG (전체 분자) - 염소에서 생산 퍼 옥시 데이즈 항체. </td><td> 시그마 </td><td> A9037 </td><td> 이차 항체의 종류 (예 : 쥐, 마우스, 염소 등의 제기)를 사용하는 기본 항체에 따라 달라집니다. </td></tr><tr><td> 시그마 FAST 3,3 &#39;- Diaminobenzidine의 정제 </td><td> 시그마 </td><td> D4293 </td><td> 시약을 개발의 유형은 사용 보조 항체를 검출 방법 (colourmetric, 또는 chemiluminecent)에 따라 달라집니다. </td></tr><tr><td> SuperSignal 서 피코 Chemiluminescent 기판 </td><td> Thermoscientific </td><td> 34,080 </td><td> 위의 내용을 참조 </td></tr><tr><td> 이미지 처리 소프트웨어의 Xplore </td><td> LabNext </td><td> 008 </td><td> 자동 gridding 도구와 많은 소프트웨어 종류를 사용할 수 있습니다microarray 명소의 픽셀 값을 측정합니다. </td></tr><tr><td> 식물 다당류 </td><td> 시그마 / Megazyme </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 glycan 프로파일

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays 

식물 세포의 벽은 생리학과 식물의 개발에 중요한 역할을하고 인간 사회 (예 : 나무, 종이, 섬유 및 바이오 연료 산업) 1,2의 원료를 제공 이기종 glycans의 복잡한 matrixes 있습니다. 그러나, 이러한 구성 요소의 생합성과 기능을 이해하는 것은 도전 남아있다. 세포 벽 glycans는 화학적 및 빌딩 블록, glycosyl 잔류의 복잡성으로 인해 conformationally 다양합니다. 이러한 형태의 여러 위치에서 연계 및 링 구조에서 차이가이 이성질체 또는 anomeric 구성 할 수 있으며,뿐만 아니라, 비 설탕 잔류의 배열로 대체됩니다. Glycan 구성도 다른 셀 및 / 또는 조직 유형 또는 단일 셀 벽 3의 하위 도메인에 따라 다릅니다. 또한, 자신의 구성은 개발 한 동안, 또는 환경 단서 사에 대한 응답으로 수정됩니다. 예에2000 유전자의 운은 식물 세포 벽 이기종 glycans의 복잡한 matrixes Arabidopsis 5 세포벽 glycan 생합성 및 수정에 참여 할 것으로 예상 했었 있습니다. 그러나, biosynthetic 유전자의 비교적 적은은 기능적으로 4,5 특징되었습니다. 유전자는 종종 differentially 세포 유형 6 시까 종종 낮은 수준에서 표현되기 때문에 역 유전학 방법이 어렵습니다. 또한, 돌연변이 연구는 종종 적절한 세포벽 기능이 7 유지하기 위해 유전자 중복이나 보상 메커니즘에 의해 방해되어 있습니다. 따라서 소설 접근 방식은 빠르게 glycan 구조의 다양한 범위를 특징하고 이해 세포벽 생합성 및 수정에 기능 유전체학 접근을 촉진하기 위하여 필요합니다. 단클론 항체 (mAbs)는 8,9 식물의 glycan 구조와 분포를 결정하는 중요한 도구로 부각되었습니다. 이러한 지구 인식pectins, xyloglucans, xylans, mannans, 글루칸과 arabinogalactans 등의 식물 세포의 벽 glycans의 주요 클래스, 내 현재 inct의 epitopes. 최근의 사용은 공장 및 조직 유형 동시에 9,10,11의 넓은 범위에서 glycans의 상대적 풍부한을 결정하기 위해 대규모 심사 실험으로 확장되었습니다. 여기 감소 시약 및 샘플 볼륨과 소형화 microarray 플랫폼을 사용하여 상영 할 (100 초) 여러 샘플을 수 종합 Microarray 폴리머 프로파일 (CoMPP) (그림 1 &amp; 2) 10,11라는 microarray 기반 glycan 검사 방법을 제시한다. microarray의 현장 신호 공식적으로 glycan 에피토프의 발생에 대한 반 정량 데이터를 제공하기 위해 정량화 할 수 있습니다. 이 방법은 잘 복잡한 생물학적 시스템 12 glycan 변경 사항을 추적하고 세포벽 성분의 글로벌 개요를 제공하는 데 적합합니다 특히 때 사전 지식 OF이 사용할 수 없습니다.

Nicotiana alata 꽃부터 6 조직 유형 (약의 필라멘트, 꽃가루, 난소, 꽃잎, sepals 및 오명)에서 glycans의 상대적인 풍요 로움은 CoMPP를 사용하여 결정되었다. 그림 3A은 부분적으로 (저) methylesterified homogalacturonan (HG), pectic 다당류 14 일 발생 에피토프에 대한적인 mAb JIM5 특정와 탐색 된 대표 microarray를 보여줍니다. JIM5 에피토프가 모든 꽃 조직의 CDTA 추출물에서 발견하는 것은 stigmatic 조직 (그림 3A 및 4A)에서 꽃가루와 최저에 최고입니다. 흥미롭게도, JIM5의 에피토프는 화분에 NaOH 추출물에서 발견되지만 다른 조직의 (그림 3A). 관심 glycan의 발생에 대한 양적 정보는 microarray의 내부 기준 (그림 3B) 등의...

라고 기술<strong&gt; C</strong&gt; omprehensive<strong&gt; M</strong&gt; icroarray<strong&gt; P</strong식물 세포의 벽 glycans의 특성에 대한&gt; olymer 프로파일 (CoMPP)이 설명되어 있습니다. 이 방법은 생물학적 상황의 넓은 범위에서 glycan 발생의 검사를 허용하는 소형 microarray 분석 플랫폼으로 정의 glycan - epitopes로 이동 단클론 항체의 특이성이 조화를 이루고 있습니다.

Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일

식물 세포벽은 식물의 생리와 발달에 중요한 역할을 하며 ...을(를) 제공하는 이질적인 글리칸의 복잡한 매트릭스입니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 글리칸 마이크로어레이를 사용하여 광범위한 식물 또는 조직 유형에 걸쳐 세포벽 폴리머 조성을 비교하는 것입니다. 먼저, 관심 있는 식물 조직을 수확합니다. 균질화 후 알코올 불용성 잔류물을 준비합니다.그 다음 CDTA와 수산화나트륨을 사용하여 세포벽 글리칸을 순차적으로 추출합니다. 이어서 로봇을 이용하여 세포벽 글리칸 추출물을 마이크로어레이에 프린팅합니다. 세포벽 글리칸을 표적으로 하는 단클론 항체로 마이크로어레이를 프로빙하고, 마이크로어레이상의 스폿 신호를 정량화합니다.궁극적으로, 이 결과는 관심 있는 샘플 세트 전반에 걸쳐 당쇄 에피토프의 상대적 풍부도를 결정하는 데 사용될 수 있습니다. 우리는 여러 식물 조직 유형 전반에 걸쳐 세포벽 당쇄의 발생 현황을 동시에 전역적으로 파악하고 구성 성분의 차이를 검출해야 할 필요성을 인식하여 이 마이크로어레이 방법을 개발했습니다. 따라서 단당류 분석과 같은 전통적인 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 수백 개의 샘플을 동시에 스크리닝할 수 있는 마이크로어레이 기반 플랫폼이라는 점입니다. 이는 세포벽 조성을 프로파일링하는 빠르고 포괄적인 방법입니다. 분석 대상인 각 조직에 대해, 액체 질소를 사용하여 생체중 100 milligrams의 식물 조직 샘플을 3반복으로 준비하십시오.샘플을 고운 가루가 되도록 균질화한 다음, 균질물을 10 milliliter 플라스틱 원추형 튜브로 옮겨 세포벽 물질을 준비합니다. 균질물을 실온에서 10 milliliters의 80% ethanol에 재현탁하고 2분 동안 강하게 볼텍싱합니다. 샘플을 3, 500 times G에서 원심분리하고 상층액을 제거합니다.70% ethanol 세척을 상층액이 투명해질 때까지 최소 3회 반복합니다. 그 다음 100% acetone으로 최종 세척을 수행합니다. 알코올 불용성 잔류물을 팔레트에 펴 바르고 하룻밤 동안 공기 건조하여 미세하고 균일한 분말로 만듭니다. 알코올 불용성 잔류물 샘플을 0.4 millimeter squared 메쉬로 체 칩니다.다음으로, 혼합을 위해 3 mm 유리 비드가 각각 들어 있는 마이크로 튜브에 알코올 불용성 잔류물 샘플 10 mg을 정밀하게 잽니다. 펙틴 및 펙틴 관련 폴리머를 추출하기 위해, 각 샘플에 50 mM CDTA 500 µL를 추가하고 튜브를 짧게 볼텍싱한 후, 티슈라이저(tissueizer)를 사용하여 8 Hz에서 3시간 동안 혼합합니다. 샘플을 12,000 ×g에서 원심분리합니다.G. 상층액을 조심스럽게 제거하고 4°C에서 보관하십시오. 펠렛을 1mL의 탈이온수로 두 번 세척하십시오. 남은 세포벽 펠렛이 담긴 튜브에서 모든 액체를 제거하십시오.0.1% 수소화나트륨이 포함된 4 M 수산화나트륨 500 µL를 사용하여 가교 글리칸을 추출하십시오. 앞서 설명한 추출 과정을 사용하여, 가교 글리칸이 포함된 상층액을 4 °C에서 보관하십시오. 펠렛을 탈이온수로 2회 세척하십시오.그다음 500 µL의 Cain을 사용하여 셀룰로오스와 같은 잔류 폴리머를 추출한 후, 원심분리하여 추출된 세포벽 폴리머가 포함된 상층액에서 모든 입자성 물질을 제거합니다. 이어서 조직 유형 및 추출 유형에 따라 샘플이 배치된 사전 설계된 맞춤형 레이아웃을 사용하여, 각 샘플 50 µL를 폴리프로필렌 384 웰 마이크로타이터 플레이트에 로딩합니다.다음으로, 탈이온수로 세포벽 폴리머 샘플을 희석하여 0배, 5배 및 25배의 연속 희석액을 준비합니다. 마이크로어레이의 핀 높이, 수집 및 체류 시간, 세척 단계와 같은 파라미터를 설정합니다. 샘플의 증발을 방지하기 위해 프린팅 챔버의 습도를 60%로 유지합니다.이제 프린팅을 시작합니다. 로봇은 모세관 채널 핀을 사용하여 샘플 플레이트의 용액을 기기 내 평평한 플레이트에 부착된 질산 셀룰로오스 막 위에 프린팅합니다. 어레이의 각 스팟에는 15 nanoliters의 용액이 포함되며, 3회 반복하여 프린팅합니다.동일한 마이크로어레이를 멤브레인 상에 서로 인접하게 프린트한 후 개별 어레이로 절단합니다. 비특이적 결합을 줄이기 위해, 각 마이크로어레이를 5% skim milk powder 용액에 담가 실온에서 2시간 동안 블로킹합니다.세포벽 글라이칸 및 에피토프에 특이적인 단클론 항체를 첨가하고 2시간 동안 배양합니다. 비특이적 결합을 제거하기 위해 마이크로어레이를 PBS로 5분씩 3회 세척합니다. 다음으로, PBS로 5분씩 3회 세척한 후 horse radish peroxidase가 접합된 2차 항체로 마이크로어레이를 2시간 동안 프로빙합니다.발색 또는 화학발광 기질을 사용하여 마이크로어레이를 현상합니다. 고해상도 데스크탑 스캐너를 사용하여 개별 마이크로어레이를 스캔합니다. 이미지를 16비트 네거티브 TIFF 파일로 저장합니다.자동 그리드 도구가 장착된 explore 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용하여 각 스폿의 적분 강도를 계산합니다. 그런 다음 각 마이크로어레이의 그리드 데이터를 텍스트 파일로 내보냅니다. 분석을 위해 해당 데이터 파일을 Excel 스프레드시트로 수동으로 가져옵니다.인쇄 반복 횟수 및 희석 배수 전체에 걸쳐 적분 스폿 강도를 평균하여 각 샘플의 평균 스폿 강도 값을 구합니다. Excel의 조건부 서식이나 온라인 히트맵 제작 도구를 사용하여 서로 다른 샘플 간의 상대적 평균 스폿 강도를 히트맵으로 나타냅니다. 각 항체 유형별 배경 신호와 위양성을 제거하고, 데이터를 100으로 보정하며, 5% 컷오프 값을 적용하는 도구를 사용하십시오.포괄적인 마이크로어레이 폴리머 프로파일링을 사용하여 Nicotiana의 수술대, 화분, 씨방, 꽃잎, 꽃받침, 그리고 암술머리 등 6가지 조직 유형의 글라이칸 상대 풍부도를 측정하였습니다. 다양한 꽃 조직을 대상으로, 펙틴 다당류의 에피토프에 특이적인 단일클론 항체인 JIM 5로 마이크로어레이를 프로빙하였습니다. JIM 5 에피토프는 모든 꽃 조직의 CDTA 추출물에서 검출됨에 유의하십시오.그러나 이는 화분에서 가장 높고 암술머리 조직에서 가장 낮게 나타납니다. 흥미롭게도, JIM five 에피토프는 화분의 수산화나트륨 추출물에서는 검출되었으나, 다른 조직에서는 검출되지 않았습니다. 정량적 정보는 난소 조직의 마이크로어레이에서 내부 표준물질로 처리된 서로 다른 정제 다당류의 표준 곡선을 생성하여 얻습니다.각 샘플에는 JIM 5 에피토프를 포함하는 hoog가 약 157 µg 포함되어 있었으며, 이는 전체 세포벽 잔여물의 약 1.5%에 해당했습니다. 반면, 화분 조직에는 JIM 5 에피토프를 포함하는 hoog Ronin이 625 µg 포함되어 있었으며, 이는 전체 세포벽 잔여물의 약 6.25%에 해당했습니다. 모든 조직 유형에 걸친 15가지 글리칸 에피토프의 상대적 풍부함은 히트맵으로 요약되었습니다. 색상 막대의 강도는 각 샘플의 보정된 평균 스폿 강도에 비례합니다.이 데이터의 도식적 표현을 통해 서로 다른 꽃 조직 간의 글리칸 에피토프 발생 차이를 신속하게 해석할 수 있습니다. 이러한 결과는 개별 글리칸 에피토프가 다양한 꽃 유형 사이에 고유하게 분포되어 있음을 나타냅니다. 예를 들어, LM 13 에피토프는 다른 조직에 비해 수술 꽃밥과 SE L 조직에서 가장 풍부하게 나타납니다.이러한 패턴은 MAB LM six에 의해 우선적으로 검출되는 짧은 사슬 에피토프의 패턴과 뚜렷한 대조를 이룹니다. 가교 결합된 글라이칸 또한 여러 꽃에서 서로 다른 발생 패턴을 보입니다. 예를 들어, LM 10 에피토프는 다른 조직에 비해 암술머리 조직에 풍부하게 존재하지만, 씨방 조직에서는 나타나지 않습니다.LM 15 xog 글리칸 에피토프는 다른 조직에 비해 꽃잎과 꽃밥 수술대에서 가장 높게 나타나는 반면, hetero manin은 수술대에서 가장 높게 나타납니다. 이 영상을 시청하고 나면, 광범위한 식물 및 조직 유형에서 세포벽 글리칸을 추출하고 상대적 함량을 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 마이크로어레이 사용법을 숙달하면 이 기술은 3일 안에 완료할 수 있습니다.본 절차에 따라 각 단계에서 시료와 반복구들을 일관되게 처리하는 것이 중요합니다. 추가적인 질문에 답하기 위해 초산 질산 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, CDTA와 수산화나트륨을 사용하여 펙틴과 콘스 글리칸을 순차적으로 추출한 후 남아 있는 절대 셀룰로스 함량은 얼마인가 하는 점입니다.이 기술은 Arabidopsis 및 Fisca, Nutella와 같은 모델 식물뿐만 아니라 면화, 밀, 유칼립투스, 담배 등 다른 식물에서의 글라이칸 발생을 빠르게 비교할 수 있어 식물 세포 생물학 분야에서 광범위하게 적용 가능합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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