Name: Zebrafish 배아 뇌 심실의 수동 배수 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 배우세요 제브라피쉬 배아 뇌 심실에서 뇌척수액을 수동으로 배수하는 방법입니다. 이 기술은 뇌척수액 구성 분석과 신경발생 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 정신 건강 연구소와 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 지원되었습니다. 박사 젠 Gutzman 박사 아만다 디킨스 많은 유용한 토론과 건설적인 비판에 대한 다른 Sive 연구소 회원, 전문 생선 축산을위한 올리비에 Paugois에 특별 감사드립니다.

1. Microinjection의 바늘과 셀 트램 준비 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 미네랄 오일과 함께 Eppendorf CellTram 오일 microinjector 장치를 입력합니다. </li><li> 셔터 계기 바늘 풀러를 사용하여 모세관 튜브를 당겨 microinjection의 바늘을 준비합니다. </li><li> Eppendorf CellTram에 연결 micromanipulator에 바늘을 탑재합니다. </li><li> 조심스럽게 바늘의 끝을 부러. 균일 팁 크기를 들어, 마이크로 미터로 측정하거나, 참조 바늘을 비교할 수 있습니다. </li><li> 모든 거품을 피하려면 조심하는 것 길이 아래로 기름을 밀어 CellTram을 사용하여 기름을 바늘의 길이를 입력합니다. </li></ol> 2. 태아 준비 <ol><li> 1-200 μl 피펫 팁과 1 % 아가로 오스 코팅 접시에 구멍을 찌르지하고, 아가로 오스 플러그를 제거합니다. 배아 미디어 (Westerfield 25에 따라 제작)으로 요리를 채 웁니다. </li><li> stereomicroscope에서 포셉, dechorionate 배아를 사용합니다. </li><li> dechorionated 배아를 전송아가로 오스 코팅 접시에. </li><li> 배아는 (Westerfield 25에 따라 변경) 이동 중지 할 때까지 배아를 마취시키기 위해서, 아가로 오스 요리에 Tricaine을 (0.1 밀리그램 / ML)를 추가합니다. </li></ol> 3. eCSF을 배수 <ol><li> 아가로 오스와 micromanipulator에 가장 가까운 자신의 뒤쪽 측면의 구멍에 꼬리와 동양의 배아, 뇌의 등 쪽의 시각화를 위해 수 있도록합니다. </li><li> rhombomere 0 / 1 힌지 지점 또는 hindbrain 뇌실 (그림 1A)의 가장 넓은 부분에 바늘을 배치합니다. </li><li> 난황에 뇌의 깊이 통과하지 않도록 것 hindbrain의 심실의주의 깊게 관통 지붕 판. </li><li> CellTram를 사용하여 eCSF을 배출하고 microinjection의 바늘에 유체를 수집합니다. 모든 세포를 방지 할주의하십시오. </li></ol> 4. 구성 분석에 대한 eCSF 수집 <ol><li> eCSF이 바늘에 수집되면, CellTram의 흡입을주의 깊게 중지합니다. </li><li> 모바늘 아래에서 음식을 같군 조심스럽게 원하는 버퍼를 포함하는 튜브에 바늘을 위치. </li><li> CellTram 사용하여 기름 솔루션을 오염을 막기 위해 노력하고 버퍼에 바늘의 eCSF을 배수한다. </li><li> 당신은 10,000 X g에서 eCSF, 스핀 eCSF와 함께 흡입 한 세포를 제거하기 위해. 수집 자세한 분석을 위해 -80에서 eCSF (표면에 뜨는) 및 저장 ° C까지 준비 오염. </li></ol> 5. 선택된 요소의 재 도입 <ol><li> 유체가 그 기간 내에 보충되어 있기 때문에, 원하는 시간 간격 동안 eCSF마다 2 시간을 배수한다. 온도를 배수 시간 포인트 사이에, 바늘을 제거하고 28.5 ° C에서 배아를 저장하거나 원하는. </li><li> 테스트 요소로 2 micropipette 바늘을로드합니다. </li><li> micromanipulator에 자리 바늘이 microinjector에 부착. </li><li> 오일과 조정 분사 시간 및 P의 방울 크기를 측정하여 한 NL로 사출 볼륨 조절ressure. </li><li> 이전과 같이 26 설명 뇌 심실에 1-2 NL를 삽입. </li></ol>

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<li>Parada, C., Escola-Gil, J. C., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoproteins+from+embryonic+cerebrospinal+fluid+are+required+for+neural+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoproteins from embryonic cerebrospinal fluid are required for neural differentiation.</a> J. Neurosci. Res. 86, 2674-2684 (2008).</li>
<li>Kramer-Zucker, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-driven+fluid+flow+in+the+zebrafish+pronephros%2C+brain+and+Kupffer%27s+vesicle+is+required+for+normal+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis.</a> Development. 132, 1907-1921 (2005).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

수동으로 zebrafish의 뇌 심실에서 eCSF을 배수하기 위해이 기술의 사용은 개발 중에 eCSF에 대한 요구 사항을 결정하는 데 유용합니다. 또한이 기술은 배아 발달의 과정을 통해 eCSF 단백질 프로파일의 설명을 할 수 있습니다. 이 시간 동안 다른 단백질의 식별은 CSF와 뇌 개발하는 동안 잠재적 인 역할의 기능에 추가로 조사를하게됩니다. amniotes에서 eCSF (IGF2, FGF2, retinoic 산, 그리고 apolipoproteins)에서 확인 일부 요소가 neuroepithelial 세포 생존, 증식과 neurogenesis 13,17,20,23,27,28에서 보여준 역할을합니다. 그러나, 시간 포인트는 여기에 시연 이후, 맥락막 얼기 형성 한 후 얻은 eCSF에 uncharacterized 단백질의 수백이있을 나타납니다. 또한, 우리 실험실과 다른 비정상적인 뇌 뇌실 크기 또는 뇌 결함 29-31, 5 월 근래에 zebrafish 돌연변이가 확인되었습니다eCSF ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Eppendorf CellTram 오일 </td><td> Eppendorf </td><td> 516 000.025 </td></tr><tr><td> 미네랄 오일 </td><td> 시그마 </td><td> M8410 </td></tr><tr><td> Tricaine 분말 </td><td> 시그마 </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> 모세관 튜브 </td><td> FHC 주식회사 </td><td> 30-30-1 </td></tr></tbody></table>

zebrafish 배아 뇌 심실의 수동 배수

Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

중추 신경계 (CSF)는 뇌 심실 내에 포함 된 단백질이 풍부한 액체이다. 이 초기 척추 동물의 배아 발달 동안 존재하며, 수명이 다할 때까지 지속된다. 성인 CSF는, 뇌를 쿠션 폐기물을 제거하고 분비 분자의 1,2를 운반 것으로 생각됩니다. 성인 세 이상 배아에서 CSF의 대부분은 맥락막 얼기, 뇌 심실 3-5에 인접 매우 vascularized의 분비 지역 일련의에 의해 이루어집니다. zebrafish에서 맥락막 얼기 완전히 144시간 게시물 수정을 (hpf) 6시 형성된다. 이전에, 마우스 배아 CSF (eCSF)의 상당한 금액 등 zebrafish 및 기타 모두 척추 동물의 배아에 존재합니다. 여자에서 이러한 데이터와 연구는 neuroepithelium 개발의 초기 분비하고 사전에 맥락막 얼기 개발 7 eCSF의 주요 원인 일 수 있습니다하는 것이 좋습니다. eCSF는 약 세 배 더 많은 단백질 t을 포함가 개발 8,9 동안 중요한 역할을 할 수 있다는 한 성인 CSF를 제안. 여자와 마우스의 연구 eCSF, 유체 압력, 또는 이들의 조합에 분비 요소 neuroepithelium 10-20에서 neurogenesis, 유전자 발현, 세포 증식 및 세포 생존을 위해 중요하다는 것을 보여줍니다. 인간, 쥐, 마우스 및 여자 eCSF의 Proteomic 분석은 CSF 기능에 필요한 수 있습니다 많은 단백질을 확인했습니다. 이러한 세포 죽음과 확산 21-24에 참여 세포 외 기질 구성 요소, apolipoproteins, 삼투압 조절 단백질, 그리고 단백질이 포함되어 있습니다. 그러나, eCSF의 복잡한 기능은 대부분 알 수없는 수 있습니다. 우리는 따라서 eCSF 구성 요소의 식별 및 개발 중에 eCSF 요구 사항 분석을위한 수 있도록 zebrafish의 뇌 심실에서 eCSF을 제거하는 방법을 개발했습니다. 더 eCSF은 다른 척추 동물의 시스템 w에서 수집 할 수 있지만i 번째 큰 배아, eCSF은 zebrafish 개발의 초기 단계에서 수집하고, 이상 뇌 뇌실 볼륨이나 형태로 이어질 유전 또는 환경 조건 하에서 할 수 있습니다. eCSF의 제거 및 수집 분석에 심실에 선택 요소의 질량 spectrometric 분석, eCSF 기능의 조사, 그리고 재 도입의 기능을 할 수 있습니다. 따라서 초기 zebrafish의 배아의 접근성 개발 중 eCSF 기능의 상세 분석 할 수 있습니다.

배수 뇌 뇌실의 예는 그림 1B-C에 표시됩니다. 그들은 eCSF (그림 1B 대 C) 부족으로 뇌 심실이 접혀 있습니다. 으로 등쪽 이미지 (그림 1B-C, 그리고 그림 2A-D) hindbrain의 neuroepithelium는 특성 형태를 유지하지하고 강력한 힌지 포인트에 가능성으로 인해 eCSF의 부족에도 불구하고 열려있는 것 같습니다.에서 볼 그러나, 측면 전망은 (그림 2A&#39;-D &#39;) ventrally 축소 가늘고 유연한 지붕 판 상피의 존재와 일치, hindbrain의 심실이 배출되었음을 보여줍니다. 야생 유형 배아에서 eCSF는 지속적으로 생산 뇌 2-3 시간 포스트 (그림 2) 배수를 심실 채우지 있습니다. 따라서, CSF는 지속적으로 관심을 시간이 지남에 따라 소진해야합니다. <p class="jove_con...

우리는 뇌척수 (CSF)를 수집하고 배아 zebrafish의 뇌 심실 시스템 내에서 CSF 부족 시스템을 구축 할 수있는 방법을 제시한다. 이 태아의 뇌 발달 동안 CSF 구성 및 요구 사항의 추가 검사를 할 수 있습니다.

Zebrafish 배아 뇌 심실의 수동 배수

뇌척수액(CSF)은 뇌실 내에 포함된 단백질이 풍부한 액체입니다. 이는 척추동물의 초기 배아 발달 과정 중에 존재하며...

이 절차의 전반적인 목표는 배아 뇌 뇌실 시스템 내에 뇌척수액(CSF)이 없는 시스템을 구축하는 것입니다. 이는 먼저 제브라피시 뇌실에서 배아 뇌척수액(ECSF)을 수동으로 배출함으로써 달성됩니다. 그 다음, 성분 분석을 위해 ECSF를 수집합니다.그 다음, 잠재적 인자들을 배액된 뇌실로 다시 주입합니다. 마지막으로, ECSF의 효과적인 제거와 뇌 발달 인자들의 재주입 결과가 분석됩니다. 최종적으로 세포 분열, 사멸 및 신경 발생과 같은 뇌 발달 양상을 모니터링함으로써 제브라피쉬 ECSF의 기능을 확인할 수 있습니다.또한, 질량 분석법을 통해 ECSF의 성분을 분석할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 발생 과정 중 배아 뇌척수액의 기능을 연구하기 시작할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 수두증과 같이 CSF의 성분과 양을 변화시키는 질병들을 더 깊이 이해하기 위해 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.먼저, 제조사의 지침에 따라 오일 주입 장치에 미네랄 오일을 채웁니다. 미세 주입 바늘을 뽑아낸 후, 오일 주입 장치와 연결된 마이크로 매니퓰레이터에 바늘을 장착합니다. 바늘 끝의 크기가 일정해지도록 조심스럽게 끝을 깨뜨려 줍니다.마이크로미터로 측정하거나 기준 바늘과 비교하십시오. 오일 인젝터를 사용하여 바늘의 길이를 따라 오일을 밀어 넣어 채웁니다. 200 µL 피펫 팁을 사용하여 1% agros 코팅 디쉬에 구멍을 뚫고, agros 플러그를 제거하십시오.실체 현미경 하에서 배양 접시에 배아 배지를 채웁니다. 포셉을 사용하여 배아의 난막을 제거하고 agarose가 코팅된 접시로 옮깁니다. 접시에 tricaine을 첨가하여 배아를 마취시키고 ECSF를 배출합니다.배아의 꼬리가 아가로스의 구멍에 들어가고 후측이 마이크로 매니퓰레이터와 가장 가깝게 위치하도록 하여 뇌의 등쪽 면이 보이게 배치합니다. 바늘을 Therom OMERE zero slash one 힌지 지점 또는 후뇌 뇌실의 가장 넓은 지점에 위치시킵니다. 그다음, 뇌의 깊은 곳까지 들어가 난황에 도달하지 않도록 주의하며 후뇌 뇌실의 지붕판을 조심스럽게 뚫습니다.오일 인젝터 장치를 사용하여 ECSF를 배출하고 마이크로인젝션 바늘에 액체를 수집하십시오. 세포가 섞이지 않도록 주의하십시오. 바늘에 ECSF가 수집되면 오일 인젝터의 흡입을 조심스럽게 중단하십시오.배출 시점 사이의 원하는 시간 간격 동안 2시간마다 보충된 ECSF를 배출하십시오. 바늘을 제거하고 배아를

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

신경 튜브 형성 후, neuroepithelium은 수축과 튜브가 배아 두뇌 심실을 형성하기 위해 배아 뇌척수 (eCSF)로 채우고 동안 주름. 우리는 더 나은 라이브 배아에서 neuroepithelial 모양 대조적으로 액체 채워진 공간을 시각화이 뇌실 주입 기술을 개발했습니다.

Zebrafish의 두뇌 뇌실 주입

우리는 배아 zebrafish의 뇌의 투자율의 라이브 전체 동물 양적 측정을 설명합니다. 기술은 신경 튜브 내강 내에서 서로 다른 분자 무게의 중추 신경계와 분자를 보유 할 수있는 능력을 분석하고 심실의 움직임을 단정 지을. 이 방법은 개발과 질병 중 상피 투자율과 성숙의 차이를 결정하는 데 유용합니다.

Zebrafish 배아 Neuroepithelium의 투과율에 대한 분석

이 비디오는 성인 제브라피시의 뇌를 미세 해부하는 기술을 설명합니다. 이 방법은 더 자세히 연구할 수 있는 전체 뇌 유래 중성구를 얻는 데 도움이 됩니다.

제브라피쉬 뇌 해부: 물고기 신경생물학 기법

이 비디오는 1차 신경구의 생성과 분화를 보여줍니다. 제브라피시의 신경줄기세포는 성장인자(growth factor)가 존재할 때 자기재생능력을 가진 자유롭게 떠다니는 신경구체(neurosphere)로 증식하고, 나중에 신경교세포(glial cell)와 뉴런(neuron)으로 분화합니다.

Generation and Differentiation of Primary Neurospheres from Zebrafish Neural Stem Cells(제브라피시 신경 줄기세포에서 1차 신경구의 생성과 분화)

출처: Schramm, P. et al. 두개골 및 피부 제거에 의한 깨어 있는 제브라피시 유충 및 청소년의 완전 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오는 Purkinje 뉴런에서 형광 단백질을 발현하는 형질전환 제브라피시 유충의 소뇌 뉴런의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 이 과정에는 유충을 마취하고, 아가로스로 고정시키고, 착색된 피부를 조심스럽게 제거하여 빛 투과와 형광 강도를 향상시키는 것이 포함됩니다. 마지막으로, 준비된 표본을 컨포칼 현미경으로 이미지화하여 표지된 뉴런을 명확하게 시각화합니다.

소뇌 뉴런 시각화를 위한 제브라피시 애벌레 뇌의 생체 내 이미징

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

이러한 확산, 패턴, 차별화, 그리고 축삭지도 등의 발달 과정은 쉽게 제브라 피쉬의 척수에서 모델링 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 이러한 이벤트의 시각화를 최적화하는 제브라 피쉬 배아에 대한 설치 절차를 설명합니다.

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

여기에서 우리는 전체 뇌 또는 telencephalic, tectal 또는 성인 zebrafish의 뇌의 소뇌 영역 중 하나에서 파생 neurosphere 분석을 사용하여 성인 신경을 검사 할 수있는 재생 가능한 방법을 제공한다. 또한, 우리는 제브라 피쉬 neurosphere를 유전자 발현을 조작하는 절차를 설명한다.

성인 Zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를의 분리 및 문화

이 원고는 제브라 피쉬 배아 및 유충의 척수 신경 세포에서 전기 생리 녹음하는 방법을 설명합니다. 준비는 현장에서 뉴런을 유지하고 자주 최소 절개를 포함한다. 이 방법은 초기 애벌레 단계를 통해 초기 전기 흥분의 인수, 척추 신경의 다양한 전기 생리학 연구 할 수 있습니다.

Zebrafish의<em&gt; 시츄</em&gt; 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비

생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

배우세요 제브라피쉬 배아 뇌 심실에서 뇌척수액을 수동으로 배수하는 방법입니다. 이 기술은 뇌척수액 구성 분석과 신경발생 연구에 활용됩니다.

Zebrafish 배아 뇌 심실의 수동 배수

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