Bioorthogonal 클릭 화학을 통해 바이러스성 표면 Chemoselective 변경

이 절차의 전반적인 목표는 클릭 화학을 통해 바이러스 표면을 재설계하는 유연한 방법을 제시하는 것입니다. 이 절차의 첫 번째 단계에서는 인간 배아 신장 세포를 5형 아데노바이러스로 감염시키고, 비천연 아미노산인 homo alanine 또는 아세토 당 기생체인 N acetoacetyl glucosamine이 존재하는 환경에서 배양합니다. 2일 후, 아지드(azide)로 라벨링된 아데노바이러스 입자를 수확하고 정제합니다.

다음으로, 형광 프로브를 이러한 입자의 표면에 결합시키기 위해 화학 선택적 아지드-알카인 환형 첨가 반응(Azi Aine cyclo edition)을 사용합니다. 서면 프로토콜에 설명된 바와 같이, 이는 변형 촉진(strain promoted) 또는 구리 촉매(copper catalyzed) 아지드-알카인 환형 첨가 반응이라는 두 가지 가능한 결합 방법 중 하나를 사용하여 수행됩니다.

치료적 응용 분야에서 이러한 부착물에는 폴리펩타이드 폴리머 또는 저분자 화합물이 포함될 수 있습니다. 본 실험에서는 형광 프로브를 사용하여 캡시드 단백질에 프로브가 결합되었음을 SDS page를 통해 증명합니다. 특히 치료제, 유전자 전달, 종양 치료, 백신 기술의 관점에서 바이러스를 유전자 전달체로 개발하는 것에 대한 상당한 관심이 있습니다.

이러한 맥락에서, 치료용 조직 표적 면역 자극에 적합한 특성을 확보하기 위해서는 바이러스-숙주 인터페이스를 조정하는 것이 특히 중요합니다. 숙주-바이러스 인터페이스를 조정하는 데 있어 다른 여러 요인 또한 중요합니다. 이에 따라, 저희는 2단계 표지 프로토콜을 개발하였습니다.

첫 번째 단계는 비천연 아미노산 또는 비천연 당의 대사적 도입입니다. 이를 통해 앵커 포인트를 설치하면, 이후 매우 선택성이 높은 화학 반응을 통해 바이러스의 감염력이나 전반적인 적합성을 크게 저해하지 않으면서 원하는 거의 모든 기능성을 부가할 수 있으며, 이는 해결해야 할 주요한 난제입니다. 후드와 실험 장비를 멸균한 후, 37°C의 HEK 성장 배지에서 배양된 HEK 293 세포가 담긴 100mm 배양 접시 11개를 준비하십시오.

세포 배양액의 밀도가 80~90%에 도달하면, 디쉬 중 하나의 배양액을 제거하고 TD 버퍼로 한 번 세척합니다. 1 mL의 trypsin EDTA를 넣어 세포를 분리하고 1분 동안 배양합니다. 9 mL의 성장 배지를 추가하고, 해당 디쉬에서 수확한 세포의 수를 측정합니다.

hemo cytometer를 사용하여 남은 10개의 배양 접시 각각의 감염에 필요한 아데노바이러스 입자 수를 계산하십시오. 성장 배지를 천천히 제거한 다음, 5 mL의 TD buffer로 세척하십시오. 1 mL의 감염 버퍼를 추가하고 이 기간 동안 1시간 동안 배양하십시오.

감염 후 15분마다 접시를 좌우로 살살 흔들어 줍니다. 각 접시에 HEK 성장 배지 9 mL를 조심스럽게 첨가하고 18시간 동안 더 배양합니다. Sistine 내의 HA 농축 스톡 용액으로부터.

작성된 프로토콜에 따라 HA 라벨링 배지를 준비하십시오. 먼저 이 스톡 솔루션들을 0.2 µm 시린지 필터로 여과해야 합니다. 대조군을 위한 메티오닌 스톡 솔루션도 동일한 방식으로 멸균하고, 성장 배지를 조심스럽게 제거한 후 각 배양 접시를 5 mL의 TD 버퍼로 세척하십시오.

이를 10 milliliters의 HA 표지 배지로 교체하고 감염된 세포를 6시간 동안 추가로 배양합니다. 이제 바이러스 캡시드 단백질이 methionine이 없고 azo homo alanine이 존재하는 환경에서 번역됩니다. 표지 배지를 10 milliliters의 신선한 성장 배지로 조심스럽게 교체하고 18시간 동안 추가로 배양합니다.

이 단계가 완료되면 비디오의 세 번째 단계에 기술된 정제 절차를 진행하십시오. 또는, 비천연 아미노산인 HA 대신 azi가 포함된 당을 통해 azi 태그를 도입할 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 UDPN Acetoacetyl Glucosamine의 대사 전구체인 기생충 관련 n acetoacetyl galacto가 사용되었으며, 이 aceto 당이 존재하는 환경에서 배양되었습니다.

당 표지를 수행하기 위해 5형 아데노바이러스의 파이버에만 azi 그룹이 나타나게 합니다. 먼저 화면에 프롬프트가 나타날 때까지 비디오의 1단계를 따르십시오. 이는 서면 프로토콜의 1.5단계에 해당합니다.

먼저 Falcon 튜브에 ATO 당 표준 용액 100 µL를 피펫으로 넣고 메탄올을 증발시켜 당 표지 용액을 준비합니다. 다음으로, HEK 성장 배지 100 mL를 추가합니다. 각 디쉬의 세포에 이 당 표지 배지 10 mL를 덮고 37 °C에서 44시간 동안 배양합니다.

정제를 위해 3단계로 진행하십시오. 배양 접시에서 감염된 세포와 함께 배지를 원심분리관 2개로 옮기고, 4°C에서 2000 G로 10분 동안 원심분리하십시오.

상층액을 제거하고, 37°C 항온 수조와 액체 질소를 이용하여 각 펠릿을 4 mL의 TD buffer에 재현탁합니다. 감염된 세포를 용해하기 위해 동결-해동 사이클을 3회 반복합니다. 각 사이클 사이에 볼텍스 믹서를 사용하여 현탁액을 혼합합니다.

해동 현탁액을 2000 G에서 10분 동안 원심 분리하여 세포 잔해를 침전시킵니다. 1단계 감염에 사용된 아데노바이러스는 GFP 전이유전자를 포함하고 있으며, 이 단계에서 형광 활성을 확인하면 바이러스 DNA의 형질 도입 및 발현이 입증됩니다. 1.25 g/mL에서 1.4 g/mL 농도의 염화세슘 밀도 구배를 조심스럽게 준비합니다. 용해된 세포 상청액을 밀도 구배 위에 파이펫으로 분주하고 15 °C에서 126,000 G로 1시간 동안 원심 분리합니다.

원심분리 후, 원심분리 튜브에 두껍고 넓은 밴드가 형성되어야 합니다. 이것이 azi 변형 바이러스입니다. star L 바늘을 사용하여 튜브 바닥을 찌르고 내용물이 한 방울씩 떨어지게 하여 이 바이러스를 조심스럽게 수집하십시오.

두 가지 결합 방법의 밴드가 스트레인을 보여주었습니다. 촉진 경로(Promoted route)는 반응 조건이 더 간단하지만, 스트레인 촉진 결합을 수행하는 데 사용할 수 있는 상용 프로브의 선택 폭이 더 좁다는 단점이 있습니다. 바이러스 저장 완충액에 들어 있는 azi 변형 바이러스 50 µL와 Tamara BCN 표지 솔루션 0.25 µL를 혼합하고, 호일로 덮인 튜브 바닥을 쳐서 섞은 후 실온에서 하룻밤 동안 회전시키십시오.

중심 하단 겔 여과법(centris sub gel filtration)을 사용하여 클릭 바이러스를 정제합니다. 스핀 컬럼을 바이러스 저장 완충액으로 평형화합니다. 탈산소 구리(I) 촉매 사이클로첨가 반응은 프로브의 가용성이 더 높으나, 탈산소 분위기를 유지하기 위해 특수 장비가 필요하다는 단점이 있습니다.

구리 촉매 결합 반응을 수행하려면, 먼저 모든 반응 물질과 용액을 질소 글로브 백 내에서 6시간 동안 탈산소화합니다. 이 시간이 지난 후, 반응을 시작하기 위해 글로브 백 내에서 구리(I) 촉매 표준 용액을 준비합니다. 바이러스 프로브와 킬레이트제가 들어있는 50 µL 용액에 이 구리 표준 용액 1 µL를 첨가합니다.

글러브 백 내에서 표지 반응이 하룻밤 동안 진행되도록 둡니다. 단계 4와 같이 수용성 여과를 통해 정제하십시오. 끓인 후, 정제된 클릭 바이러스와 라이시스 샘플 버퍼를 10분 동안 처리합니다.

선택한 바이러스와 대조군을 웰에 로딩하고 전기영동을 수행합니다. 형광 프로브를 빛으로부터 보호하기 위해 탱크를 호일로 덮어 둡니다. 1시간 후, 형광 겔 스캐너를 사용하여 겔을 스캔합니다.

손상되지 않았거나 I-표지되지 않은 바이러스는 HA 표지를 위한 유의미한 형광 표지를 대체해서는 안 된다는 점에 유의하십시오. 더 높은 농도의 HA에서 생성된 바이러스는 더 높은 수준의 HA 통합으로 인해 더 강한 형광 표지를 나타냅니다. 또한, 당 표지 바이러스는 파이버 캡시드 단백질에서만 azi 태그를 발현한다는 점에 유의하십시오. 80% 합류도(Confluence) 세포부터 시작하여 azi 표지를 위한 감염에 이틀, 표지된 바이러스의 수확 및 정제에 5시간, 클릭 반응에 하룻밤, 그리고 SDS page 분석에 2시간이 소요되어 총 3.5일이 걸립니다. 요약하자면, 두 가지 유형의 azi 표지 방법과 두 가지 azid alkin 클릭 화학 반응이 입증되었습니다.

귀하의 응용 분야와 가용 자원에 따라 목적에 가장 적합한 방법 또는 방법들을 결정해야 합니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료는 상업적으로 구입 가능하지만, HA aceto sugars 및 INE probe를 직접 합성하는 것이 비용 효율성이 훨씬 높으며 바이러스 표면 수식에 있어 더 큰 유연성을 제공한다는 것을 확인하였습니다.